專利名稱：具有治療前列腺疾病的黃酮類天然產(chǎn)物活性成分的分離、提取和藥用制劑的制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有預(yù)防和治療作用的黃酮類衍生物的分離、提取、制備方法及其在治療前列腺疾病方面的臨床應(yīng)用。
背景技術(shù)：
最常見的前列腺疾病包括前列腺炎、前列腺增生和前列腺癌。前列腺癌是男性最常見的癌癥之一。美國1997年癌癥統(tǒng)計顯示，在男性腫瘤中，前列腺癌居發(fā)病率之首，占41％，居癌癥死亡的第二位，占14％，50歲以上男性尸解前列腺癌發(fā)生率高達30％。在我國，自70年代起前列腺癌發(fā)病率顯著上升。隨著我國人口的老年化和前列腺癌普查的開展，將會出現(xiàn)越來越多的前列腺癌患者，前列腺癌已成為越來越影響公眾健康的問題。
前列腺增生是前列腺組織的良性增生，與前列腺癌沒有必然聯(lián)系，但二者都與體內(nèi)激素失調(diào)有非常密切的關(guān)系。男性的前列腺在25歲時發(fā)育成熟，正常情況下不再生長。據(jù)美國的調(diào)查顯示，50％的60歲男性有前列腺增生，而在80歲男性中，這個數(shù)字上升到80％。
前列腺增生和前列腺癌這兩類前列腺疾病的治療目前都以手術(shù)摘除為主，對于前列腺癌早期患者可獲得較高的存活率，但是由于缺乏有效的藥物治療，中晚期患者存活率較低。近年來的研究表明，前列腺除分泌前列腺液參與精液的組成外，還能產(chǎn)生多種免疫球蛋白，合成具有抗菌作用的含鋅多肽，而且前列腺還具有保護生殖系統(tǒng)免遭細菌和其他病原微生物侵襲的局部免疫功能。因此，有人主張在可能的情況下前列腺應(yīng)盡量予以保留。非手術(shù)的藥物療法亦顯得更有吸引力。
目前，臨床用于前列腺增生治療藥物主要有4類(1)抗雄激素，直接抑制二氫睪酮的作用；(2)5α-還原酶抑制劑，間接地抑制二氫睪酮的作用；(3)α1腎上腺素能受體阻滯劑，主要為抑制平滑肌的收縮和緊張度；(4)天然產(chǎn)物制劑。它們中部分也用于前列腺癌的治療。由于前列腺疾病藥物治療療程較長，因此藥物的毒副作用令人關(guān)注。在我國的中草藥寶庫中，有很多治療前列腺增生和前列腺癌的藥材和藥方，其中有不少藥物經(jīng)臨床驗證具有較好的療效。采用現(xiàn)代化的生物和化學(xué)方法，從這些中藥材中提取并篩選出活性成分，有望獲得安全高效的抗前列腺疾病的新藥，這將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益和社會效益。
前列腺特異性抗原(PSA)是目前臨床上用于前列腺癌早期診斷的最重要的指標(biāo)，主要由前列腺上皮細胞在雄激素及其它生長因子如TGFβ的誘導(dǎo)下表達。正常人血清中PSA含量在1-4ng/ml，前列腺癌患者血清中PSA含量通常則遠遠超過這個數(shù)值，且前列腺增生患者血清中PSA含量一般也高于正常值。這些病患者血清中PSA含量的升高主要是因為前列腺細胞中PSA的過量表達。如果患者經(jīng)治療，血清中PSA含量明顯下降，則可以初步認為治療是有效的。因此PSA含量的變化，可以作為這兩類前列腺疾病療效的一個指標(biāo)。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明目的之一在于公開一類基于黃酮類衍生物的天然產(chǎn)物藥用制劑；本發(fā)明目的之二在于公開這一類所述天然產(chǎn)物活性成份的分離、提取及制備方法；本發(fā)明目的之三在于公開這一類所述的天然產(chǎn)物活性成份及其組合在預(yù)防和治療前列腺相關(guān)疾病的臨床應(yīng)用。
預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)通式(I)的化合物組成。
通式(I)
其中R1OH，OCH3，氧葡萄糖基，氧鼠李糖基；R2H，OH，OCH3；R3H，OH(羥基)，烷氧基，或者為-Q1-Q2-(Q3)n，其中Q1為O，S，N，Q2為鼠李糖基或葡萄糖基，Q3為桂皮酸基，含羥基苯丙烯酸基，含多羥基苯甲酸基，n為0~5的整數(shù)。
R4OH(羥基)，烷氧基；R5OH(羥基)，烷氧基，氧葡萄糖基，氧鼠李糖基；當(dāng)通式I中的X為單鍵，R2、R3為-H， R1、R4、R5為-OH時，通式I所代表的化合物為柚皮素。
當(dāng)通式I中的X為雙鍵，R3為-H，R1、R2、R4、R5為-OH時，通式I所代表的化合物為木犀草素。
當(dāng)通式I中的X為雙鍵，R2為-H，R1、R3、R4、R5為-OH時，通式I所代表的化合物為山奈酚。
當(dāng)通式I中的X為雙鍵，R2為-H，R1、R4、R5為-OH，R3為Q1-Q2-(Q3)n，其中Q1為O，Q2為鼠李糖基，Q3為桂皮?；?，n＝1，通式I所代表的化合物為山奈酚3-O-(3”-O-桂皮?；?-α-L-鼠李吡喃糖苷[kaemferol3-O-(3”-O-cinnamoyl)-α-L-rhamnopyranoside]。
當(dāng)通式中的X為雙鍵，R2為-H，R1、R4、R5為-OH，R3為Q1-Q2-(Q3)n，其中Q1為O，Q2為鼠李糖基，Q3為桂皮?；?，n＝2，通式I所代表的化合物為山奈酚3-O-(2”，3”-O-二桂皮酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷[kaemferol3-O-(2”，3”-O-dicinnamoyl)-α-L-rhamnopyranoside]柚皮素是柚皮苷的苷元，分布在西柚汁及其皮中，還分布在櫻花、梅花、桃花的花蕾，具有抗菌、抗炎、抗癌、解痙和利膽作用。但是還沒有關(guān)于將柚皮素及以上植物用于預(yù)防和治療前列腺疾病的報道。
木犀草素分布在多種植物的花和葉中，如金銀花、野菊花、雪蓮花、夏枯草、紫珠葉、筋骨草等植物都有分布，另外在落花生果實的外殼中也有分布。具有抗菌、抗炎、解痙、祛痰、抗癌、利尿利膽作用。還沒有關(guān)于將木犀草素用于預(yù)防和治療前列腺疾病的報道。
山奈酚在植物中分布廣泛，如紅花、燈盞花、銀杏葉、鳳仙花、貓眼草、山奈等。具有抗癌、抑制生育、抗癲癇、抗炎、抗氧化、解痙、抗?jié)儭⒗懤?、止咳作用。也沒有關(guān)于將山奈酚用于用于預(yù)防和治療前列腺疾病的報道。
有文獻報道，芫荽(Coriandrum sativum)中含有山奈酚3-O-(”-O-桂皮酸基)-α-L-鼠李吡喃糖苷，但有關(guān)的藥理作用及活性未見有有報道。山奈酚3-O-(2”，3”-O-二桂皮酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷為新化學(xué)結(jié)構(gòu)體。
本發(fā)明用于預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份制備方法具體步驟如下制備方法一1、溶劑提取原植物粉碎后，用水、甲醇、乙醇或含水甲醇、乙醇(30～95％)、丙酮、含水丙酮或乙酸乙酯，加熱提取(包括回流)或超聲提取，所用溶劑量與原植物重量比為8～15∶1可重復(fù)提取1～3次，除去藥渣，濾液在常壓下或減壓條件下濃縮至相對密度1.10～1.15。
2、有機溶劑脫脂將上述濃縮液加適量水溶解后，用正己烷、環(huán)己烷、氯仿、石油醚或乙醚中的一種溶劑提取，棄去有機溶劑。
3、柱層析將上述脫脂后的水層濃縮至相對密度1.10～1.15，進行硅膠(100～140目)柱層析，用石油醚-醋酸乙酯、環(huán)己烷-醋酸乙酯、正己烷-醋酸乙酯、石油醚-丙酮、環(huán)己烷-丙酮或正己烷-丙酮中的任意一種混合溶劑進行洗脫，收集上述混合溶劑8∶2～6∶4洗脫部分，將溶劑蒸干。
4、純化將上述步驟所得的產(chǎn)物進行葡聚糖凝膠(sephadex LH20)柱層析，用氯仿-甲醇6∶4洗脫，收集各個洗脫部分，揮干溶劑得化合物。
制備方法二1、用有機溶劑脫脂原植物粉碎后，用正己烷、環(huán)己烷、氯仿、石油醚或乙醚中的任一種溶劑加熱回流提取或超聲提取，棄去有機溶劑。
2、溶劑的提取脫脂后的藥渣用水、甲醇、乙醇或含水甲、乙醇(30～95％)、丙酮、含水丙酮或乙酸乙酯中的任何一種溶劑，加熱(包括回流)或室溫浸泡提取，所用溶劑量與原植物重量比為8～15∶1，可重復(fù)提取1～3次，除去藥渣，濾液在常壓下或減壓條件下濃縮至相對密度1.10～1.15。
3、柱層析將上述水層濃縮至相對密度1.10～1.15，進行硅膠(100～140目)柱層析，用石油醚-乙酸乙酯、環(huán)己烷-乙酸乙酯、正己烷-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、環(huán)己烷-丙酮或正己烷-丙酮中的任一種溶劑進行洗脫，收集上述混合溶劑8∶2～6∶4洗脫部分，將溶劑蒸干。
4、純化將上述步驟所得產(chǎn)物進行葡聚糖凝膠(sephadex LH20)柱層析，用氯仿-甲醇洗脫，收集各個洗脫部分，揮干溶劑，得化合物。
本發(fā)明所述預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份的含量介于0.01～1000mg之間。
本發(fā)明所述預(yù)防和治療前列腺疾病的活性成份的應(yīng)用為在各單一活性成份或由兩個及兩個以上活性成份組成的混合物中加入相關(guān)的賦形劑，制成片劑、膠囊、軟膠囊、液體制劑、顆粒劑、煎膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、栓劑、注射劑。其中的賦形劑包括粘合劑，如聚乙烯吡咯烷酮、羥丙甲纖維素等；崩解劑，如羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙纖維素等；稀釋劑，如淀粉、糖粉、糊精、微晶纖維素、甘露醇、乳糖、大豆油等；潤滑劑，如硬脂酸鎂、滑石粉；甜味劑，如蔗糖、果糖、天冬甜素等；穩(wěn)定劑，如羧甲基纖維素鈉、環(huán)糊精等；防腐劑，如對羥基苯甲酸乙酯、苯甲酸鈉等。


圖1為本發(fā)明實施例中幾種黃酮對雄激素丙睪的抑制作用示意圖；圖2為本發(fā)明實施例中幾種黃酮物質(zhì)對ER-alpha受的誘導(dǎo)作用示意圖；圖3為本發(fā)明實施例中幾種黃酮物質(zhì)對ER-beta受的誘導(dǎo)作用示意圖.
下列實施例將進一步說明本發(fā)明，實施例不應(yīng)被視為限制本發(fā)明的范圍。
實施例1取油菜花粉3Kg，粉碎，加18L氯仿加熱回流提取1小時，放冷，濾過棄去濾液。藥渣加24L乙酸乙酯加熱回流提取兩次，濾過，合并乙酸乙酯提取液，減壓回收溶劑，加入兩倍量柱層析硅膠拌勻，真空干燥，研細，裝入層析柱，以環(huán)己烷-丙酮(9∶1～6∶4)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，收集8∶2～6∶4洗脫組分，繼用Sephadex LH-20柱分離純化得到九個化合物。
實施例2取桃花3Kg，加石油醚回流提取1小時，濾過，藥渣各用80％乙醇24L室溫浸泡48小時，共提取三次，合并提取液，減壓回收乙醇，并濃縮至無醇味，加入兩倍量柱層析硅膠拌勻，真空干燥，研細，裝入層析柱，以石油醚-乙酸乙酯(9∶1～6∶4)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，收集8∶2～6∶4洗脫組分，繼用Sephadex LH-20柱分離純化得柚皮素和山奈酚。
實施例3取桃葉3Kg，粉碎，加80％乙醇30L加熱回流，共提取兩次，濾過。合并提取液，減壓回收乙醇，并濃縮至無醇味。濃縮液用2倍量水溶解，加石油醚萃取，棄去石油醚。水液揮去溶劑，減壓濃縮至相對密度1.20，加入兩倍量柱層析硅膠拌勻，真空干燥，研細，裝入層析柱，以石油醚-乙酸乙酯(9∶1～45∶4)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，收集8∶2～6∶4洗脫組分，繼用Sephadex LH-20柱分離純化得柚皮素和山奈酚。
實施例4取筋骨草3Kg，粉碎，加80％乙醇30L加熱回流，共提取兩次，濾過。合并提取液，減壓回收乙醇，并濃縮至無醇味。濃縮液干燥后，加氯仿加熱回流提取1小時，濾過，棄去氯仿。藥渣加入兩倍量柱層析硅膠拌勻，真空干燥，研細，裝入層析柱，以石油醚-乙酸乙酯(9∶1～6∶4)溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，收集8∶2～6∶4洗脫組分，繼用Sephadex LH-20柱進一步分離純化得木犀草素。
實施例5柚皮素、山奈酚和木犀草素在體外實驗中顯示出抑制PSA(前列腺特異抗原)分泌的活性；見表一.
采用酶聯(lián)免疫實驗測定上述幾種黃酮物質(zhì)對LNCaP細胞分泌PSA的影響。首先將包被多抗稀釋至4ug/ml，加入酶標(biāo)板中，每孔100ul，4℃放置12小時以上。用PBST洗后加封閉液封閉，37℃1小時。加入藥物作用上清，37℃溫浴2小時。洗滌后加入一抗溶液，200ng/ml，37℃溫浴1小時。洗滌后加入1∶8000稀釋的二抗溶液，室溫1小時，避光。洗滌后加入顯色液，避光溫浴10min后加入2N硫酸，于492nm測量光吸收值。
實施例6柚皮素、山奈酚和木犀草素在體外實驗中顯示出抗雄激素的活性。圖1為幾種黃酮對雄激素丙睪的抑制作用示意圖.螢火蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)對雄激素受體AR激活活性的分析。用PCR的方法從人的脂肪組織中克隆到全長的AR cDNA，所用的引物序列1為5′-cgggatcctggaagattcagccaagctcaagg-3′，序列2為5′-gctctagaatgggagggttagatagggaggga-3′，將擴增到的PCR產(chǎn)物插入表達載體后測序鑒定。報告基因用Promega公司的熒光素酶檢測載體pGL3-Promoter構(gòu)建，在它上游插入了三個拷貝的AR反應(yīng)元件(序列3為5′-gatctggctctttcagttctaggaagaactgaaagagcctttgggctctttcagttctaggaagaactgaaagagcctttg-3′)。轉(zhuǎn)染實驗用U2OS細胞在96孔板中進行，在轉(zhuǎn)報告基因的同時共轉(zhuǎn)AR基因，轉(zhuǎn)染24小時后每孔加入10nM丙睪及待檢測的藥物，并使溶劑DMSO的終濃度保持在0.1％。藥物作用24小時后裂解細胞并進行熒光素酶活性的檢測。
實施例7柚皮素、山奈酚和木犀草素在體外實驗中顯示出激活雌激素受體的作用。圖2為幾種黃酮物質(zhì)對ER-alpha受的誘導(dǎo)作用示意圖。圖3為幾種黃酮物質(zhì)對ER-beta受的誘導(dǎo)作用示意圖.螢火蟲熒光素酶報告基因系統(tǒng)對雌激素受體ER激活活性的分析。用PCR的方法從人的脂肪組織中克隆到全長的ERα和ERβcDNA，所用的引物序列4為5′-ggggtacccctctaacctcgggctgtgct-3′，序列5為5′-ggaattcgggaatcctcacgcttagtaacata-3′，序列6為5′-cccaagcttaatgacctttgtgcctcttcttgc-3′，序列7為5′-gctctagaggcgtcactgagactgtgggtt-3′，將擴增到的PCR產(chǎn)物插入表達載體后測序鑒定。報告基因用Promega公司的熒光素酶檢測載體pGL3-Promoter構(gòu)建，在它上游插入了三個拷貝的ER反應(yīng)元件(序列8為5′-tcgagtcaggtcacagtgacctgatc-3′)。轉(zhuǎn)染實驗用U2OS細胞在96孔板中進行，在轉(zhuǎn)報告基因的同時共轉(zhuǎn)ER基因，轉(zhuǎn)染24小時后每孔加入待檢測的藥物及陽性對照藥物雌二醇，并使溶劑DMSO的終濃度保持在0.1％。藥物作用24小時后裂解細胞并進行熒光素酶活性的檢測。
表一

注nd表示該濃度沒有測試活性。
權(quán)利要求
1.一種由黃酮類衍生物組成的天然產(chǎn)物藥用制劑，其特征在于，該藥用制劑的活性成份為由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)通式的化合物所組成，化學(xué)結(jié)構(gòu)通式為 其中X為單鍵或雙鍵；R1為OH(羥基)，烷氧基，氧葡萄糖基，氧鼠李糖基；R2為H，OH(羥基)，烷氧基；R3為H，OH(羥基)，烷氧基，或者為-Q1-Q2-(Q3)n，其中Q1為O，S，N，Q2為鼠李糖基或葡萄糖基，Q3為桂皮?；?，含羥基苯丙烯?；?，含多羥基苯甲?；?，n為0~5的整數(shù)；R4為OH(羥基)，烷氧基；R5為OH(羥基)，烷氧基，氧葡萄糖基，氧鼠李糖基。
2.如權(quán)利要求1所述通式結(jié)構(gòu)的化合物，其上取代基分別為X為單鍵；R1為OH(羥基)；R2為H；R3為H；R4為OH(羥基)；R5OH(羥基)；該化合物為柚皮素。
3.如權(quán)利要求1所述通式結(jié)構(gòu)的化合物，其上的取代基分別為X為雙鍵；R1為OH(羥基)；R2為H；R3為OH(羥基)；R4為OH(羥基)；R5為OH(羥基)；該化合物為山奈酚。
4.如權(quán)利要求1所述通式結(jié)構(gòu)的化合物，其上的取代基為X為雙鍵R1為OH(羥基)；R2為OH(羥基)；R3為H；R4為OH(羥基)；R5為OH(羥基)；該化合物為木犀草素。
5.如權(quán)利要求1所述通式結(jié)構(gòu)的化合物，其上的取代基分別為R1為OH(羥基)；R2為H；R3為Q1-Q2-Q3，其中Q1為O(氧)，Q2為鼠李糖基；Q3為桂皮?；琻為1；R4為OH(羥基)；R5為OH(羥基)；該化合物為山奈酚3-O-(3”-O-桂皮?；?-α-L-鼠李吡喃糖苷。
6.如權(quán)利要求1所述通式結(jié)構(gòu)的化合物，其上的取代基分別為R1為OH(羥基)；R2為H；R3為Q1-Q2-Q3，其中Q1為O(氧)，Q2為鼠李糖基，Q3為桂皮酸基，n為2；R4為OH(羥基)；R5為OH(羥基)；該化合物為山奈酚3-O-(2”，3”-O-二桂皮酰基)-α-L-鼠李吡喃糖苷。
7.如權(quán)利要求1所述的藥用制劑，其特征在于，該藥物制劑由黃酮類衍生物活性成份或組分以及藥用載體或稀釋劑組成。
8.如權(quán)利要求7所述的藥用制劑，其特征為該藥物制劑由黃酮類衍生物活性成份或組分制成的片劑、膠囊、軟膠囊、液體制劑、顆粒劑、煎膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、注射劑。
9.如權(quán)利要求7所述的藥用制劑的用途，其特征在于，所述藥用制劑用于預(yù)防和治療前列腺增生、前列腺炎及前列腺腫瘤。
10.如權(quán)利要求7所述的藥用制劑，其特征在于，其所含活性成份的含量介于0.01～1000mg之間。
11.如權(quán)利要求7所述的藥用制劑，其特征在于，其所含活性組份的含量介于0.50～500mg之間。
12.如權(quán)利要求1所述的活性成份，其特征在于，這些活性成份的制備方法為原植物粉碎，加溶劑提取。提取物經(jīng)有機溶劑脫脂后，藥渣加溶劑提取、并經(jīng)柱層析分離純化制備而成。
13.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，提取溶劑為下列物質(zhì)的一種水、甲醇、乙醇、含水甲醇、乙醇(30-95％)、丙酮、含水丙酮、醋酸乙酯，加熱回流或超聲提取。
14.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，用于脫脂的有機溶劑為正己烷或環(huán)己烷或氯仿或石油醚或乙醚。
15.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其特征在于，柱層析可用硅膠柱層析、聚胺柱層析及葡聚糖凝膠柱層析中的一種。
16.如權(quán)利要求13所述的制備方法，其特征在于硅膠柱層析可用由以下任何兩種溶劑組成的混合溶劑進行梯度洗脫石油醚、醋酸乙酯、環(huán)己烷、丙酮、正己烷。
全文摘要
一種具有預(yù)防和治療前列腺疾病的黃酮類天然產(chǎn)物活性成分的分離、提取和藥用制劑的制備和用途。該藥用制劑的活性成分為由以下化學(xué)結(jié)構(gòu)通式的化合物所組成其中X為單鍵或雙鍵；R1OH(羥基)，烷氧基，氧葡萄糖基，氧鼠李糖基；R2為H，OH(羥基)，烷氧基；R3為H，OH(羥基)，烷氧基，或者為－Q1－Q2－(Q3)n，其中Q1為O，S，N，Q2為鼠李糖基或葡萄糖基，Q3為桂皮?；?，含羥基苯丙烯酰基，含多羥基苯甲?；?，n為0~5的整數(shù)；R4為OH(羥基)，烷氧基；R5為OH(羥基)，烷氧基，氧葡萄糖基，氧鼠李糖基.該藥物制劑可制成片劑、膠囊、軟膠囊、液體制劑、顆粒劑、煎膏劑、丸劑、粉劑、懸浮劑、分散劑、糖漿劑、注射劑。制備方法為原植物粉碎，加溶劑提取。提取物經(jīng)有機溶劑脫脂后，藥渣加溶劑提取、并經(jīng)柱層析分離純化制備而成。
文檔編號A61P13/00GK1640873SQ20041002712
公開日2005年7月20日 申請日期2004年5月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年5月3日
發(fā)明者魯先平, 姚新生, 山松, 韓慧英, 李志斌, 王乃利, 羅艷萍, 張雪, 寧志強, 高昊 申請人:深圳微芯生物科技有限責(zé)任公司, 深圳中藥及天然藥物研究中心