專利名稱：用增強代謝活性的丹參衍生物治療肥胖和代謝綜合癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療代謝綜合癥的組合物，所述組合物含有作為有效組分的丹參酮衍生物。更具體地，本發(fā)明涉及預(yù)防和治療代謝綜合癥的組合物，含有作為有效成分，在提高代謝活性中表現(xiàn)出優(yōu)良活性的丹參酮衍生物。
背景技術(shù)：
代謝綜合癥是指包括健康危險因子，例如高甘油三酯血癥，高血壓，糖代謝紊亂，血凝紊亂和肥胖的綜合癥。代謝綜合癥本是并不是致命的，但卻指示了對諸如糖尿病和缺血性心血管疾病的嚴重疾病的傾向，并演變成了現(xiàn)代人群眾最具威脅性的疾病。由于缺乏對這種綜合癥的病因的了解，代謝綜合癥一度是通過包括綜合癥X的多種其他名稱為人所知的，通過由WHO和NIH國立心臟，肺和血液研究所實施的成年治療計劃III(Adult Treatment Plan ATP III)，現(xiàn)將其正式地稱為代謝綜合癥或抗胰島素綜合癥。
由國立膽固醇教育計劃(NCEP)專家委員會對成年人中高血液膽固醇(成年治療委員會III)的測定、評估和治療的第三次報告在2001年公開的建議標準，是最近和最廣泛地用于診斷所述代謝綜合癥的標準。根據(jù)所述ATP III的標準，可通過以下三種或更多種成分的存在診斷個體患有代謝綜合癥1)男人的腰圍為40英寸(102cm)或更多，女人的腰圍為35英寸(88cm)或更多(通過腰部周長測定中度肥胖)，2)甘油三酸酯水平高于150mg/dl，3)高密度脂蛋白水平(HDL)低于40mg/dl(男人)或50mg/dl(女人)，4)血壓130/85mm Hg或更高和5)快速血液葡萄糖(糖)水平高于110mg/dl。對東方人而言，可將中度肥胖的標準略微調(diào)節(jié)成男人的腰圍為90cm或更多，而女人的腰圍為80cm或更多。近來的研究表明，在這些條件下，大約25％的韓國人都患有代謝綜合癥。胰島素耐受是指這樣的現(xiàn)象，其中即使胰島素正常體內(nèi)分泌，胰島素也不能誘導對細胞的足量葡萄糖供給。因此，血液中的葡萄糖不能進入細胞，由此引起了高血糖癥，細胞由于缺乏葡萄糖不能行使正常功能，導致了代謝綜合癥的出現(xiàn)。
目前，還沒有可用的藥物治療代謝綜合癥。已使用過治療糖尿病、高血脂癥和高血壓的藥物進行過治療代謝綜合癥的嘗試，但這些藥物在治療代謝綜合癥中的藥物作用有限。作為目前可用的藥物，可用于治療糖尿病的二甲雙胍，屬于TZD(噻唑烷二酮類)家族的藥物，葡萄糖苷酶抑制劑，雙PPARγ/α激動劑和DDP(二肽基肽酶)IV抑制劑，其受到了作為最有希望治療代謝綜合癥藥物的極大關(guān)注。此外，還有大量的關(guān)注致力于作為抗血壓藥和抗高血脂癥藥，以及CETP(膽固醇酯轉(zhuǎn)運蛋白)抑制劑的靶的apo A-I及其相關(guān)肽的異構(gòu)體。
公知的直接或間接與代謝綜合癥的病因和治療相關(guān)的因素包括物理鍛煉，飲食習慣和類型，體重，血液葡萄糖，甘油三酸酯水平，膽固醇水平，胰島素耐受，adiponectin，瘦蛋白，AMPK活性，諸如雌激素的性激素，遺傳因素和體內(nèi)丙二酰CoA濃度。
目前，對抗與代謝綜合癥相關(guān)病癥的最有效方法是多作鍛煉，減肥和飲食控制。目前所有對抗代謝綜合癥方法的共同之處在于促進能量代謝，由此導致體內(nèi)多余能量的最大消耗從而阻止能量積累。由于從加工食品和快餐中攝取的高卡路里，與不充分的鍛煉相比，多余能量以脂肪的形式進行了累積，并由此變成了包括代謝紊亂的多種疾病的根本原因。有效的消除這些多余能量可考慮作為治療代謝紊亂的方法。提高代謝活性對有效地消除多余能量至關(guān)重要。出于這一目的，一般認為必須抑制脂肪合成，抑制糖原異生，協(xié)助葡萄糖消耗，協(xié)助脂肪氧化，協(xié)助能量代謝中心細胞器線粒體的生物發(fā)生，以及活化參與代謝活化的因子。與促進代謝相連的活化因子包括，例如，AMP-活化的蛋白激酶(AMPK)，過氧物酶體擴增子活化受體γ共活化劑1α(PGC-1α)，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1和4(GLUT 1和4)，肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶I(CPT I)，解偶聯(lián)蛋白1，2和3(UCP-1，2和3)，以及乙酰-CoA羧化酶I和II(ACC I和II)，其在能量代謝中具有重要作用。
這些因子在與代謝紊亂的能量代謝中具有以下主要功能。
1、糖代謝在肌肉組織和心肌組織中，AMPK促進肌肉收縮并因此協(xié)助葡萄糖的攝取，其依次活化了GLUT 1，或誘導GLUT 4向質(zhì)膜的遷移，而不考慮胰島素的作用，從而導致了葡萄糖向細胞的輸送增加(Arch.Biochem.Biophys.380，347-352，2000，J.Appl.Physiol.91，1073-1083，2001)。在葡萄糖攝入增加之后，AMPK可激活己糖激酶，由此增加糖代謝處理的流量并同時抑制糖原合成。眾所周知在缺血性條件下，在心肌組織中，AMPK能通過磷酸化過程活化6-磷酸果糖-2-激酶(PFK-2)，由此導致代謝級聯(lián)的激活從而增加了糖代謝的流量(Curr.Biol.10，1247-1255，2000)。此外，在肝臟中AMPK的活化抑制了葡萄糖從肝細胞中的釋放。與此同時，現(xiàn)已確定用作糖異生用酶的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶可被AMPK所抑制(Diabetes 49，896-903，2000)，說明無論是否存在胰島素，AMPK都可獨立地抑制葡萄糖從肝臟中的釋放，由此參與血糖水平的調(diào)控。
2、線粒體的生物生成線粒體的一個重要功能是進行氧化磷酸化，其可將從諸如葡萄糖和脂肪酸的燃料代謝物產(chǎn)生的能量轉(zhuǎn)化成ATP。功能性的線粒體變化會影響到與衰老相關(guān)的退行性疾病，例如糖尿病，心血管疾病，帕金森氏癥和老年性癡呆的發(fā)病機制(Curr.Opin.Cell Biol.15，706-716，2003)。Peterson等人(Science 300，1140-1142，2003)報道了線粒體的氧化磷酸化功能在老年人中降低了約40％，暗示了線粒體功能的削弱很可能是胰島素耐受綜合癥的致病原因。Lee等人(Diabetes Res.CLin.Pract.42，161-167，1998)證實了在外周血中線粒體DNA含量的降低發(fā)生在糖尿病之前。公知在肌肉中線粒體的生物生成可由適應(yīng)反應(yīng)得以提高，其中肌肉細胞中氧化磷酸化的代謝活性是由持續(xù)的能量消耗和鍛煉提高的。
同時，公知過氧物酶體擴增子活化的受體γ共活化劑1α(PGC-1α)是促進核DNA轉(zhuǎn)錄的共活化劑，并且在葡萄糖代謝，線粒體生物生成，肌肉纖維特化和適應(yīng)性生熱作用中具有重要功能。已知PGC-1α的較高表達促進線粒體DNA拷貝數(shù)的升高和線粒體增殖(Cell，98，115-124，1999)。
需要注意的是在小鼠模型中UCP-2和UCP-3的過量表達導致了脂肪細胞數(shù)量的降低，代謝率升高和氧氣消耗的升高，因此UCP-2和UCP-3在能量代謝和肥胖控制中具有重要的作用(Nutrition，20，139-144，2004)。
3、脂肪代謝的控制在涉及AMPK參與的脂肪代謝的機理中，公知AMPK能夠誘導乙酰-CoA羧化酶的磷酸化，結(jié)果抑制脂肪酸的合成，因此導致作為脂肪酸合成過程中的中間體和作為肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶I(CPT I)抑制劑的丙二酰Co-A在細胞內(nèi)的濃度降低，從而增強了脂肪酸氧化。CPT I是在脂肪酸進入線粒體和被氧化過程中的關(guān)鍵酶，并公知受到丙二酰Co-A細胞內(nèi)濃度的調(diào)控。此外，公知AMPK能夠通過磷酸化對參與膽固醇和三酰甘油合成過程中的HMG-CoA還原酶和甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)的活性進行抑制(J.Biol.Chem.277，32571-32577，2002，J.Appl.Physiol.92，2475-2482，2002)。與此同時，還發(fā)現(xiàn)在肝臟中AMPK的活化通過糖反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(ChREBP)的磷酸化抑制了丙酮酸激酶、脂肪酸合成酶和ACC的活性(J.Biol.Chem.277，3829-3835，2002)。
如上所述，與代謝相關(guān)的活化劑公知地在體外和體內(nèi)葡萄糖、蛋白和脂肪能量代謝中具有中心的作用。Neil等人(Nature drug discovery，3(April)，340，2004)證實了AMPK和丙二酰Co-A是治療代謝綜合癥和治療患有具有胰島素耐受、肥胖、高血壓、血脂異常、胰腺β細胞功能紊亂，II型糖尿病和動脈硬化表現(xiàn)的代謝綜合癥的患者的靶點?？杉俣ㄅc多種異常相連的共有特征是AMPK/丙二酰CoA燃料感應(yīng)和信號網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控異常。一般認為這樣的調(diào)控異常導致了細胞脂肪酸代謝的改變，其隨后引起了異常的脂肪積累、細胞功能紊亂和最終的疾病。已有證據(jù)表明，活化AMPK和/或降低丙二酰CoA水平的因子能夠逆轉(zhuǎn)這些異常和綜合癥，或預(yù)防它們發(fā)生。
Genevieve等人(J.Biol.Chem.279，20767-74，2004)報道了AMPK的活化抑制了iNOS酶的活性，其是在慢性炎癥病癥或包括與肥胖相關(guān)的糖尿病的內(nèi)毒素休克中的炎癥介質(zhì)，并因此可有效地用來開發(fā)具有提高胰島素敏感性的機理的新藥。此外，他們還報道了對iNOS活性的抑制是由AMPK的活化造成的，因此這一發(fā)現(xiàn)對諸如敗血病、多發(fā)性硬化、心肌梗塞、炎性腸病和胰腺β-細胞功能紊亂的疾病具有臨床應(yīng)用性。Zing-ping等人(FEBS Letters 443，285-289，1999)報道了AMPK通過磷酸化，在存在Ca-調(diào)鈣蛋白的大鼠肌肉細胞和心肌細胞中活化了內(nèi)皮NO合成酶。這說明AMPK與包括心絞痛的心臟疾病相關(guān)。Alan D等人(Nature genetics，34(3)，244，2003)證明了肌肉線粒體呼吸代謝是由衰老或糖尿病降低的，由此導致了在所述氧化磷酸化過程中所涉及到的基因表達的協(xié)同改變，同時他們還報道了PGC-1α主導了基因表達的這種改變。Mary等人(PNAS 100，8466，2003)報道了PGC-1α較低水平的表達是糖尿病患者中胰島素耐受和代謝失調(diào)的主要原因。Isabella等人(Am.J.Physiol.Cell Physiol.284，c1669，2003)報道了PGC-1α是刺激線粒體適應(yīng)于由甲狀腺激素、T3和肌肉收縮引起的環(huán)境改變的主要因素。Kim等人(The Korean Journal of Biochemistry & Molecular Biology，11，16，2004)報道了通過葡萄糖/脂肪酸代謝中的偶然關(guān)聯(lián)，線粒體數(shù)量和質(zhì)量的異常誘導了胰島素耐受，不僅如此，其還是代謝綜合癥的主要原因。
基于能夠活化代謝的物質(zhì)都可有效地用于治療代謝綜合癥疾病這一假設(shè)，本發(fā)明人對代謝活化藥物進行了深入研究，結(jié)果證明了丹參酮衍生物是有效的治療劑成分。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明旨在解決上述問題，以及之前希望解決的技術(shù)問題。
本發(fā)明人進行了多種廣泛和深入的研究和實驗。作為這些廣泛研究的結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，從丹參(Salivia miltiorrhiza)提取的丹參酮衍生物能夠有效的激活細胞和組織中的代謝，本發(fā)明人還進一步發(fā)現(xiàn)，當對用丹參酮衍生物治療ob/ob小鼠、由降低的瘦蛋白分泌引起的肥胖模型，db/db小鼠、肥胖/糖尿病模型，以及由高脂肪膳食導致的DIO(膳食誘導的肥胖)小鼠時，這些材料可有效地預(yù)防和治療包括肥胖和糖尿病的代謝綜合癥?；谶@些發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的目的是提供預(yù)防和治療代謝綜合癥的組合物，其包括在成肌細胞C2C12和脂肪細胞以及動物疾病模型中，通過激活代謝活化劑，對這樣的代謝綜合癥具有預(yù)防和治療效果的作為有效成分的丹參酮衍生物。
發(fā)明的詳細描述如本發(fā)明的一個方面，可通過提供包括有來自丹參(Saliviamiltiorrhiza)提取物的治療和/或預(yù)防有效量的丹參酮衍生物作為有效成分的預(yù)防或治療肥胖和代謝綜合癥疾病的組合物來實現(xiàn)以上和其他目的。
迄今為止，已知的丹參酮衍生物生理活性如下。Toshiyuki等人(Planta Med.2002.68，1103-1107)報道了丹參酮VI減弱了心肌細胞肥大并且通過成心肌纖維細胞抑制了膠原的合成，由此阻礙了成心肌纖維細胞的纖維化。Choi等人(Planta Med.2004，70，178-180)建議了通過抑制肥大細胞脫顆粒來將丹參酮衍生物用作抗過敏劑的可能性。Ip等人(Planta Med.2002.68，1077-1081)證明了二氫異丹參酮I在肝細胞中對甲萘醌誘導的細胞毒性的護肝作用。Ren等人(Planta Med.2004，70，201-204)證明了丹參酮衍生物抑制乙酰膽堿酯酶的酶活性。Kyoto等人(Biochemical Pharmacolgy，64，745-750(2002))報道了丹參酮IIA磺酸鹽能夠減弱由血管緊張素II誘導的心肌細胞肥大。Lee等人(Biosci.Biotechnol.Biochem.63(12)，2236-2239，1999)報道了丹參酮衍生物能夠產(chǎn)成過氧化物，并由此表現(xiàn)出抗菌活性。Kang等人(Immunopharmacology，49，355-361，2000)報道了丹參酮衍生物能夠在免疫細胞中抑制IL-12和INF-γ的產(chǎn)生。Ko等人(Arch.Pharm.Res.25，446-448，2002)報道了丹參酮衍生物能夠抑制DGAT的酶活性。Zhou等人(Biochemical Pharmacology，65，51-57，2003)報道了丹參酮IIA磺酸鹽促進線粒體中的電子傳遞反應(yīng)。Wang等人(Antimicrobial Agent &Chemotherapy，June，1836-1841，2003)報道了丹參酮衍生物能夠抑制氨基葡糖苷誘導的自由基形成。Yun等人(Korean Patent PublicationLaid-open No.2000-0027306)證明了丹參酮衍生物可作為治療乙型肝炎的有效治療劑。Sohn等人(Korean Patent Publication Laid-open No.2004-0084482)公開了含有丹參酮I作為有效成分的治療肝纖維化或肝硬化的治療組合物。然而，上述出版物和專利中并未公開或暗示如本發(fā)明所述的通過提高AMPK的活性來預(yù)防和治療肥胖和代謝綜合癥。
在本發(fā)明組合物中被用作有效成分的丹參衍生物，主要存在于被用作諸如丹參(Salivia miltiorrhiza)和(Perovskia abrotanoides)的生藥材丹參中。丹參衍生物可廣泛地分成四氫菲衍生物和菲衍生物。優(yōu)選地，如本發(fā)明所述的組合物包括選自上述衍生物及其混合物中的一種或多種化合物。
優(yōu)選地，四氫菲衍生物是選自隱丹參酮(通式1)和丹參酮IIA(通式2)的一種或多種化合物。
通式1 通式2 優(yōu)選地，菲衍生物是選自丹參酮I(通式3)和15，16-二氫丹參酮I(通式4)的一種或多種化合物。
通式3 通式4 包含于丹參(丹參根)中的丹參衍生物由0.29％的丹參酮IIA，0.23％的隱丹參酮，0.11％的丹參酮I和0.054％的15，16-二氫丹參酮I組成。作為丹參的主要成分，所述丹參衍生物是雙萜o-醌化合物。這些化合物的生物合成方法是通過從雙萜進行隱丹參酮的生物合成，和通過諸如隱丹參酮的脫甲基化或脫氫化的氧化方法對丹參的丹參酮衍生物，例如丹參酮IIA，15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I的生物合成實現(xiàn)的。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)這些丹參酮衍生物能激活代謝，因此促進了體內(nèi)葡萄糖、蛋白和脂類的代謝并抑制了體內(nèi)脂肪的積累，由此能夠治療代謝綜合癥。這些發(fā)現(xiàn)和事實都可通過以下實施例得以證明。特別地，本發(fā)明人測定了丹參酮衍生物對代謝激活子活性的影響，成肌細胞(C2C12)中蛋白和基因的表達，以及前成脂肪細胞(3T3-L1和F442A細胞)細胞分化的抑制，作為結(jié)果，還驗證了這些化合物表現(xiàn)出的極高的代謝活化。正如通過丹參酮衍生物對蛋白和基因表達的影響所觀察到的，這些丹參酮化合物可單獨或以其任意組合的方式表現(xiàn)出對代謝活化的優(yōu)良活性。與此同時，本發(fā)明人還證實了脂肪酸合成的抑制、脂肪酸氧化和線粒體生物發(fā)生因子表達水平的促進都與丹參酮衍生物的結(jié)構(gòu)相關(guān)。
因此，如本發(fā)明所述的衍生物是由選自隱丹參酮、丹參酮IIA，丹參酮I和15，16-二氫丹參酮I中的一種或多種丹參酮衍生物組成的。
這樣的組合物包括以下所有情況(i)含有以隱丹參酮作為主要成分的組合物；(ii)含有以丹參酮IIA作為主要成分的組合物；(iii)含有以丹參酮I作為主要成分的組合物；(iv)含有以15，16-二氫丹參酮I作為主要成分的組合物；(v)含有以隱丹參酮作為主要成分，且任選，含有選自丹參酮IIA，丹參酮I和15，16-二氫丹參酮I中的一種或多種化合物的組合物；(vi)含有以丹參酮IIA作為主要成分，且任選，含有選自隱丹參酮，丹參酮I和15，16-二氫丹參酮I中的一種或多種化合物的組合物；(vii)含有以丹參酮I作為主要成分，且任選，含有選自隱丹參酮，丹參酮IIA，和15，16-二氫丹參酮I中的一種或多種化合物的組合物；
(viii)含有以15，16-二氫丹參酮I作為主要成分，且任選，含有選自隱丹參酮，丹參酮IIA和丹參酮I中的一種或多種化合物的組合物；如果需要的話，以上所述組合物還可包括選自1β-羥基隱丹參酮，1-氧基隱丹參酮，丹參醇B，丹參醇IIB，紫丹參甲素，二氫異丹參酮I，丹參酮IIA磺酸鹽，1，2-二氫丹參酮I和丹參酮VI中的一種或多種丹參酮衍生物。
更加令人驚奇的是，本發(fā)明人還證實了隱丹參酮，丹參酮IIA和15，16-二氫丹參酮I對AMPK活性的增強效果可通過兩種或更多種這些化合物的組合使用得到顯著的增強。這樣明顯的協(xié)同作用并不能完全預(yù)測得到，但卻能確定，無論是這四種丹參酮衍生物那些類型，都能表現(xiàn)出這樣的效果。因此，在以上所述的組合物的組合方式中，組合物(v)至(viii)是特別優(yōu)選的。
作為組合物(v)至(viii)的特別實例，包括以下類型-含有隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I的組合物；-含有隱丹參酮和丹參酮IIA的組合物；-含有丹參酮IIA和15，16-二氫丹參酮I的組合物；-含有丹參酮IIA和丹參酮I的組合物；-含有15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I的組合物；以及-含有丹參酮I和隱丹參酮的組合物。
在以上所述的組合物中，所述兩種組分的比例優(yōu)選在10∶1-1∶10(w/w)的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在5∶1-1∶5的范圍內(nèi)。
含在天然存在的丹參中的丹參酮衍生物的組合物可根據(jù)其收獲季節(jié)或種植區(qū)域而表現(xiàn)出不同的分布情況?？紤]到上述協(xié)同效果，有必要具有在丹參酮衍生物之間的最佳的組合物比例從而一致地發(fā)揮其效用。本發(fā)明人還證實了丹參酮衍生物對基因和蛋白表達活性及其間不同結(jié)構(gòu)差異特征的效果。通過任意地控制在這些結(jié)果上的組合物比例，本發(fā)明人證實了通過調(diào)節(jié)丹參酮衍生物之間的比例對降低體重的效果，并隨后嘗試獲得最佳組合物比例。
如上所述，當如本發(fā)明所述的組合物中包含選自四氫菲衍生物和菲衍生物中的一種或多種化合物，且優(yōu)選地含有兩種衍生物時，其間的優(yōu)選比例可在10∶1-1∶10(重量比)的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在5∶1-1∶5的范圍內(nèi)，特別優(yōu)選在2.5∶1-1∶2.5的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，所述四氫菲衍生物成分中含有隱丹參酮和丹參酮IIA，且其比例在5∶1-1∶5的范圍內(nèi)。此外，所述氫菲衍生物成分中含有15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I，且其比例在5∶1-1∶5的范圍內(nèi)。
本發(fā)明人還通過在ob/ob小鼠，肥胖模型，db/db小鼠，肥胖/糖尿病模型，以及由較高脂肪膳食引起的DIO(膳食誘導的肥胖)小鼠的體內(nèi)廣泛的代謝綜合癥預(yù)防和治療實驗，進一步證實了丹參酮衍生物對代謝綜合癥極其優(yōu)良的預(yù)防和治療效果。
結(jié)果，含有作為有效成分的丹參酮衍生物的預(yù)防和治療代謝綜合癥的組合物能夠通過活化代謝預(yù)防和治療代謝綜合癥，并由此可預(yù)測其可被開發(fā)成為針對與代謝綜合癥相關(guān)的多種疾病的多種治療劑。如本發(fā)明所述的預(yù)防和治療代謝綜合癥的所述組合物中包括了作為有效成分的上述丹參酮衍生物或其任意的混合物，并可在需要的時候，與可藥用的載體一起被配制成代謝綜合癥的預(yù)防和治療劑。
1、藥理學特性如本發(fā)明所述的組合物可用來預(yù)防和/或治療與代謝綜合癥相關(guān)的臨床病癥。這些臨床病癥包括，但不限于，普通肥胖，腹部肥胖，高血壓，動脈硬化，高胰島素血癥，高血糖癥，II型糖尿病和表現(xiàn)出胰島素耐受特征的血脂異常。血脂異常，也稱為表現(xiàn)型B的致動脈粥樣化的脂蛋白分布，且特征在于明顯升高的非酯化脂肪酸，升高的富含極低密度脂蛋白(VLDL)甘油三酯的顆粒，較高的ApoB值，存在有較小的、密集的、低密度脂蛋白(LDL)顆粒，在表現(xiàn)型B存在時較高的ApoB值，以及與低值A(chǔ)poAI顆粒相關(guān)的低值的高密度脂蛋白(HDL)。
可以預(yù)測如本發(fā)明所述的組合物可用來治療患有或不還有其他代謝綜合癥信號的混合或組合的血脂異常或高甘油血癥的患者，和在飯后罹患多種程度的血脂異常的患者。
可以預(yù)測如本發(fā)明所述的組合物可具有抗炎特性，并能夠降低由血脂異常引起的與動脈硬化相關(guān)的心血管發(fā)病率和死亡率。這些心血管疾病包括引起心肌梗塞的多種內(nèi)部器官的大血管病變，心機能不全，腦血管疾病和下肢的外周動脈機能不全。因為其胰島素敏感效果，可以期待本發(fā)明的組合物可以在代謝綜合癥和懷孕過程中的糖尿病發(fā)展中預(yù)防或延緩II型糖尿病的發(fā)展。因此，也可以預(yù)測本發(fā)明的組合物能夠延緩糖尿病中臨床高血糖癥相關(guān)的慢性并發(fā)癥的發(fā)展，例如引起腎病的大血管病變，視網(wǎng)膜損傷和下肢的外周血管疾病。此外，無論是否與胰島素耐受相關(guān)，本發(fā)明的組合物可用來治療除心血管系統(tǒng)之外的多種病癥，例如多囊卵巢綜合癥，肥胖，癌癥，炎癥疾病，和諸如輕度認知缺損(MCI)，阿爾茨海默氏病，帕金森氏癥和多發(fā)性硬化的神經(jīng)退行性疾病。
本發(fā)明的組合物在肝臟中表現(xiàn)出了對脂肪肝(肝脂質(zhì)沉著癥)發(fā)展的抑制效果，并且還能夠激活脂肪酸的β-氧化，從而在降低三甘油濃度中具有一定的作用，并由此可預(yù)測用來預(yù)防或治療由酒精肝和非酒精肝的脂代謝障礙引起的脂肪肝和肝炎。
本發(fā)明的所述組合物可在不同組織中改變脂成分。此外，其還可改變脂肪含量和分布，并且降低血漿膽固醇和三酰甘油水平。
本發(fā)明的所述組合物還在內(nèi)皮細胞中NO的形成有非常有效，并因此可預(yù)期其可用來預(yù)防或治療心臟疾病，血管疾病，高血壓和勃起功能障礙。作為引起高血壓的疾病，還應(yīng)該提到心臟機能不全，心肌梗塞，腦血管系統(tǒng)破裂，血栓癥和腎臟損傷。
本發(fā)明的組合物是在末梢組織中促進脂肪酸氧化和引起能量消耗的物質(zhì)，并由此預(yù)測其可用來治療或預(yù)防普通性肥胖，并用來去除諸如皮下和腹部脂肪的局部脂肪沉積。因此，當需要從脂肪局部沉積的特定區(qū)域去除脂肪時，諸如從眼瞼，手臂和臀部的突出部分去除皮下脂肪，去除腹部脂肪以及去除例如脂肪團的特定區(qū)域的脂肪時，可預(yù)測本發(fā)明的組合物可用來以藥膏，包括抗炎癥貼片的貼片，以及乳膏的形式遞送藥物。
而且，本發(fā)明的所述組合物通過降低血糖水平可用作抗糖尿病制劑。此外，還證實了本發(fā)明的所述組合物改善了對胰島素的降低的敏感性，并由此增強了胰島素的效果。
本發(fā)明所述的組合物促進了線粒體的生物合成，由此增強了線粒體的活性，與此同時誘導了肌肉組織向運動組織的轉(zhuǎn)化，從而增加了患者的運動力，提高了耐力，改善了能量生產(chǎn)力，疲勞恢復(fù)，增強了體力，通過提高去除活性氧(ROS)和自由基的能力降低了氧化脅迫，因此預(yù)期所述組合物可有效地治療所關(guān)心的疾病。
提到由活性氧(ROS)引起的疾病，還應(yīng)該提到動脈硬化，糖尿病，神經(jīng)系統(tǒng)疾病，腎臟疾病，肝硬化，關(guān)節(jié)炎，早熟性視網(wǎng)膜病，眼葡萄膜炎，老年白內(nèi)障，由放療引起的副作用病癥，由于吸煙導致的支氣管損傷，由抗癌劑引起的副作用病癥，腦水腫，肺水腫，足部水腫，腦梗塞，溶血性貧血，早衰癥，癲癇癥，阿爾茨海默氏病，唐氏綜合癥，克羅恩氏病和膠原病。
如上所述，通過調(diào)節(jié)葡萄糖和脂體內(nèi)平衡，本發(fā)明所述組合物表現(xiàn)出了能為所有的上述病癥和疾病提供有益的效果。因此，可以看出本發(fā)明的所述組合物是控制代謝綜合癥的適合物質(zhì)。
本發(fā)明涉及使用化合物來制備治療和/或預(yù)防多種代謝綜合癥(代謝綜合癥)，即表現(xiàn)出高胰島素血癥，胰島素耐受，肥胖，葡萄糖耐受，II型糖尿病，血脂異常，心血管疾病或尤其是高血壓的特征的代謝綜合癥。
2、藥物制劑含有作為有效成分的丹參酮衍生物的預(yù)防和治療代謝綜合癥的所述組合物能夠通過活化代謝來預(yù)防和治療代謝綜合癥，因此，一般認為可將其開發(fā)作為適于與代謝綜合癥相關(guān)的多種疾病的不同藥物。如本發(fā)明所述的預(yù)防和治療代謝綜合癥的所述組合物包括作為有效成分的上述丹參酮衍生物，并且，如果需要的話，其可與可藥用的載體一起被配制成代謝綜合癥的預(yù)防和治療劑。
本發(fā)明所述藥物組合物的適當劑量可隨諸如配制方法，給藥類型，年齡，體重和患者的性別，病理狀況，飲食，給藥時間，給藥方式，排泄率和對反應(yīng)的敏感性的多種因素進行改變。如本發(fā)明所述的代謝綜合癥的預(yù)防和治療劑的藥物組合物包括作為有效成分的丹參酮衍生物?？赏ㄟ^口服或腸胃外途徑的臨床給藥對所述丹參酮衍生物進行給藥，且其可以普通形式的藥物制劑使用。換句話說，可通過多種口服和腸胃外制劑，經(jīng)過實際的臨床給藥方式對如本發(fā)明所述的組合物進行給藥。當進行配制時，可使用傳統(tǒng)的填充劑，補充劑，粘合劑，濕潤劑，崩解劑，諸如表面活性劑的稀釋劑，或賦型劑進行所述配制。用于口服給藥的固體制劑包括，例如片劑，丸劑，粉劑，顆粒和膠囊，并通過與諸如淀粉，碳酸鈣，蔗糖，乳糖和明膠的一種或多種賦型劑和丹參酮衍生物混合進行制備。除了簡單的賦型劑，還可以使用諸如硬脂酸鎂和滑石的潤滑劑。作為口服給藥的液體制劑，還應(yīng)該提到懸液，內(nèi)服的溶液，乳液和糖漿。除了通常使用的諸如水和液體石蠟的簡單稀釋劑，上述制劑還可包括多種賦型劑，例如濕潤劑，甜味劑，芳香劑和防腐劑。用于腸胃外給藥的制劑包括無菌的水溶液，非水溶性溶劑，懸液，乳劑，凍干的制劑和栓劑。作為非水溶性溶劑和懸液，還可以使用丙二醇，聚乙二醇，植物油，例如橄欖油，可注射的酯，例如油酸乙酯(ethylolate)，等等。作為栓劑的基本材料，可以使用Witepsol，聚乙二醇(macrogol)，Tween 61，可可油脂，月桂精油脂，甘油和明膠。
劑量單位可以包含1倍，2倍，3倍或4倍量的單劑量，或1/2，1/3或1/4倍量的單劑量。優(yōu)選地，一份單劑量含有給藥一次的有效藥物量，并通常對應(yīng)于一天的總給藥量，或其1/2，1/3或1/4倍的量。盡管有效量的丹參酮衍生物是濃度依賴性的，但其優(yōu)選的范圍是0.1-1,000mg/kg，更優(yōu)選為0.4-500mg/kg，并可一天給藥1-6次。因此，對成年人而言，可以0.1-6,000mg/天/kg體重的范圍給藥丹參酮衍生物。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有作為有效成分的丹參酮衍生物的預(yù)防和治療代謝綜合癥的健康和功能性食品組合物。
在本發(fā)明的整個說明書中使用的術(shù)語“健康和功能性食品”是指在普通食品中添加了丹參酮衍生物以改善其功能的食品?？梢韵蚱胀ㄊ称分刑砑拥⑼苌?，或可將其制備稱膠囊，粉末，懸液等形式。攝入這種含有丹參酮衍生物的健康和功能性食品為健康提供了有益的效果，且其優(yōu)點在于并未表現(xiàn)有藥物的長期使用所引起的副作用，因為食品材料是被用作原材料，而不是常規(guī)的藥物。
如果希望將本發(fā)明的丹參酮衍生物用作食物添加劑，這些衍生物可被單獨地添加，或可與其他食物或食物組分一同使用，或可基于其他常規(guī)的方法進行適當?shù)厥褂??？筛鶕?jù)使用的目的(預(yù)防、健康或治療性處理)適當?shù)卮_定混合量的有效成分。一般地，在使用混合的丹參酮衍生物生產(chǎn)食物或飲料時，相對于原材料的總重量，可以0.0001-10％重量比的量，且優(yōu)選為1-5％量比的量加入這些衍生物。然而，當為了健康目的和衛(wèi)生或為了健康控制進行長期攝入時，可將所述的丹參酮衍生物的量調(diào)節(jié)至低于所述的范圍。此外，當將其用作藥物組合物時，本發(fā)明的健康食物優(yōu)選地含有在測定的毒性范圍之內(nèi)的丹參酮衍生物。
對上述的食物種類并沒有特定的限制。作為可向其中添加丹參酮衍生物的食物的例子，還應(yīng)該提到肉，香腸，面包，巧克力，糖果，快餐，甜食，比薩餅，Ramen，其他的面條，口香糖，脫脂乳，干燥食物，未加工的食物，包括乳酸細菌發(fā)酵的乳品和冰激凌的乳制品，各種湯類，飲料，茶，飲品，酒精飲料和多種維生素制品。特別地，作為含有丹參酮衍生物的健康食品的例子，還應(yīng)該提到以丹參酮衍生物作為主要成分的健康食品和特別風味的制品，例如榨汁，茶，果凍和飲料。此外，還應(yīng)該提到治療以水腫，腎炎和尿道炎為目的的民間醫(yī)藥。
當需要將本發(fā)明的丹參酮衍生物用為化妝品原材料時，可用這些衍生物本身進行添加或可與其他化妝品組分一起使用，或可根據(jù)其他現(xiàn)有方法進行適當?shù)厥褂??？筛鶕?jù)其使用的目的適當?shù)卮_定有效成分的混合量。一般地，在使用丹參酮衍生物生產(chǎn)化妝品的過程中，相對于原材料的總重量，可以按重量計0.0001-10％的量，且優(yōu)選為0.1-5％的量加入這些衍生物。化妝品包括，但不限于須后水，洗液，乳膏，小包化妝品和彩妝。
可以將丹參(Salvia miltiorrhiza)作為干藥材或生藥材，提取到如本發(fā)明所述的丹參酮衍生物或通過有機化學方法進行合成。
從丹參提取丹參酮衍生物的方法包括a)將丹參進行水或有機溶劑提取從而獲得粗提物，b)過濾所述粗提物，然后進行(真空)濃縮，以及c)任選地，去除溶劑。
例如，可是用甲醇提取丹參，真空濃縮，然后用二氯甲烷再次進行提取從而獲得濃縮的溶液。通過硅石柱層析純化所述溶液從而得到純的丹參酮衍生物。將通過以下實施例對本發(fā)明進行更詳細的描述。


參考以下的發(fā)明詳述以及對附圖的說明，可對本發(fā)明上述和其他目的，特征以及其他有點進行更清楚地了解，其中圖1所示為用丹參(Salvia miltiorrhiza)提取物和丹參酮衍生物處理成肌細胞系C2C12之后，在處理組和對照組之間AMPK(AMP-活化的蛋白激酶)活性比較的柱狀圖；圖2所示為用丹參酮衍生物處理成肌細胞系C2C12之后，測定丹參酮衍生物對總AMPK，p-AMPK，p-ACC和GLUT4的蛋白表達的作用效果的Western印跡結(jié)果；圖3所示為用丹參酮衍生物處理成肌細胞系C2C12之后，測定丹參酮衍生物對ACC1和2，UCP-2，CPT1，PGC-1α和GLUT1基因表達的作用效果的Western印跡結(jié)果；圖4所示為用丹參酮衍生物處理成肌細胞系C2C12之后，在處理組和對照組之間，丹參酮衍生物對細胞葡萄糖攝入效果的比較圖；圖5所示為用丹參酮衍生物處理前成脂肪細胞系F442A之后，丹參酮衍生物對成脂肪細胞分化的影像效果結(jié)果的顯微圖；圖6所示為用丹參酮衍生物處理成肌細胞系C2C12之后，在處理組和對照組之間丹參酮衍生物對胰島素敏感度效果的比較圖；圖7所示為用隱丹參酮對肥胖，DIO(飲食誘導肥胖)小鼠的動物模型進行處理之后，隱丹參酮對隨時間體重變化影響的結(jié)果；圖8和圖9所示分別為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠進行處理之后，丹參酮衍生物對隨時間體重變化影響的圖和表格；圖10所示為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后，在處理組和對照組之間成脂肪細胞尺寸變化的比較圖；
圖11所示為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后，在處理組和對照組之間對不同器官以數(shù)值描述的脂肪分布比較圖；圖12所示為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后對肝臟進行染色，在處理組和對照組之間肝內(nèi)脂肪組織分布和脂肪積累的比較圖；圖13所示為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后，在處理組和對照組之間肝臟組織中脂質(zhì)和抗氧化指示劑變化的比較表；圖14所示為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后，在處理組和對照組之間血脂和血糖變化的比較表；圖15所述為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后，在處理組和對照組之間比較小鼠內(nèi)臟脂肪分布變化的顯微圖；圖16所示為用丹參酮衍生物對肥胖的動物模型，Lepr db/Lepr db小鼠進行處理之后，丹參酮衍生物對血糖變化的作用效果的表；圖17所示為通過本發(fā)明所述丹參酮衍生物雙重組合對組合物活性進行比較的表格；圖18所示為隨著本發(fā)明組合物成分比例的改變導致活性變化的表；圖19所示為通過本發(fā)明所述丹參酮衍生物的三重組合對組合物的AMPK活性進行比較的表；以及圖20所示為以多種組合比例對肥胖的動物模型，C57BL/6JL Lepob/Lep ob小鼠進行處理之后，在丹參酮衍生物的四氫菲衍生物組和菲衍生物組之間的組合比例對體重改變效果結(jié)果的表。
實施例參照以下實施例，對本發(fā)明進行更詳細地描述。這些實施例僅用于對本發(fā)明進行說明，而不應(yīng)該被認為是對本發(fā)明范圍和精神的限制。
實施例1丹參酮衍生物的分離從中藥店購買5kg丹參(Salvia miltiorrhiza)，并從田野和山脈收集或從中藥店購買其他的必須材料。用50L甲醇洗提丹參24小時，并在減壓下濃縮。向所得的材料中加入1500mL水。然后，加入等量的正己烷，二氯甲烷(CH2Cl2)和乙酸乙酯(EtOAc)，然后順序提取兩次從而獲得凝膠狀的紅色提取物。當在此得到的不同分層上的活性進行測定時，在二氯甲烷層中的活性最高。
用100％正己烷將硅膠(Kieselgel 60，230-460目，Merck)充分膨脹，然后裝入柱(530cm高)中。將從所述CH2Cl2層得到的50g提取物溶解于痕量的EtOAc和正己烷中，并將所得的樣品上樣于所述柱子。在上樣和充分洗提所述樣本之后，用10-20％的EtOAc梯度洗提所得的洗提物，然后用0/100(v/v)→50/50(v/v)的MeOH/CHCl3梯度進行順序洗提從而獲得丹參酮衍生物。通過測定AMPK的活性，將活性級分混合并在減壓下濃縮。
使用硅膠(Kieselgel 60，230-460目，Merck)，對在第一個柱子中表現(xiàn)出活性的材料進行再次分離。然后再用100％正己烷將硅膠充分膨脹，然后裝入柱(425cm高)中。將EtOAc/正己烷＝0/100(v/v)→20/80(v/v)用作展開溶劑。將表現(xiàn)出抑制活性的級分合并并在減壓下濃縮。
然后，在EtOAc/正己烷＝30/70(v/v)的展開溶劑下進行Prep-TLC。在每一步中都進行TLC，并觀察各個組分的分離程度。作為展開溶劑，可以正常相使用EtOAc/正己烷＝80/20(v/v)?？赏ㄟ^加熱和使用對甲氧基苯甲醛染色溶劑(5％H2SO4，2.5％乙酸，5％對甲氧基苯甲醛和87.5％乙醇)在加熱盤中展開TLC板對各材料進行搜索。以這種方式對丹參酮衍生物進行提取，分離和純化。
實施例2各種活性材料的結(jié)構(gòu)分析使用NMR分析分別對實施例1中的隱丹參酮，丹參酮I，丹參酮IIA和15，16-二氫丹參酮I的結(jié)構(gòu)進行測定。
隱丹參酮1H-NMR(CDCl3)δ7.42(2H，ABq，J＝8.0Hz)，4.83(1H，t，J＝9.2Hz)，4.31(1H，dd，J＝9.2和6.0Hz)，3.55(1H，m)，3.17(2H，br t)，1.65(4H，m)，1.40(3H，d，J＝6.8Hz)，1.28(6H，s)13C-NMR(CDCl3)δ9.58(C-1)，19.00(C-2)，37.73(C-3)，34.76(C-4)，143.57(C-5)，132.48(C-6)，122.43(C-7)，128.30(C-8)，126.19(C-9)，152.28(C-10)，184.16(C-11)，175.59(C-12)，118.21(C-13)，170.66(C-14)，81.38(C-15)，34.54(C-16)，18.74(C-17)，31.85(C-18)，31.80(C-19)丹參酮IIA1H-NMR(CDCl3，300.40MHz)δ7.63(1H，d，J＝8.2Hz)，7.54(1H，d，J＝8.2Hz)，7.22(1H，s)，3.18(2H，t，J＝6.6Hz)，2.26(3H，s)，1.78(2H，m)，1.65(2H，m)，1.31(6H，s)。
13C-NMR(CDCl3，75.45MHz)δ184.29，176.43，162.38，150.80，145.14，141.96，134.13，128.12，127.16，121.81，120.91 120.57，38.52，35.33，32.51，30.56，19.79，9.46。
15，16-二氫丹參酮I1H-NMR(CDCl3，300.40MHz)δ9.24(1H，d，J＝10.6Hz)，8.24(1H，d，J＝10.3Hz)，7.69(1H，d，J＝10.3Hz)，7.54(1H，dd，J＝10.6，8.4Hz)，7.41(1H，d，J＝8.4Hz)，4.95(1H，t，J＝11.3Hz)，4.41(1H，dd，J＝11.3Hz，7.5Hz)，3.62(1H，m)，2.66(3H，s)，1.38(3H，d，J＝8.1Hz)。
13C-NMR(CDCl3，75.45MHz)δ184.26，175.67，170.56，142.00，134.95，134.72，132.06，131.90，130.38，128.81，128.18，126.01，124.99，120.28，118.32，114.06，81.62，34.68，19.85，18.81。
丹參酮I1H-NMR(CDCl3，300.40MHz)δ9.19(1H，d，J＝10.6Hz)，8.23(1H，d，J＝10.3Hz)，7.73(1H，d，J＝10.3Hz)，7.50(1H，dd，J＝10.6，8.5Hz)，7.30(1H，d，J＝8.5Hz)，7.26(1H，q，J＝1.3Hz)，2.64(3H，s)，2.25(3H，d，3Hz)。
13C-NMR(CDCl3，75.45MHz)δ183.38，175.55，161.13，142.00，135.18，133.58，132.90，132.69，130.63，129.57，128.31，124.73，123.03，121.72，120.43，118.69，19.84，8.79。
實施例3AMPK活性的測定將成肌細胞，C2C12，培養(yǎng)于含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。當細胞密度達到約85％-90％時，用1％小牛血清的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，從而誘導細胞的分化。然后如下測定AMPK的酶活性。將C2C12細胞裂解從而得到蛋白提取物，然后加入硫酸銨至終濃度為30％，然后沉淀蛋白。將蛋白沉淀溶解于緩沖液(62.5mM Hepes，pH 7.2，62.5mM NaCl，62.5mM NaF，1.25mM丙酮酸鈉，1.25mM EDTA，1mM DTT，0.1mM PMSF和200μM AMP)中。然后，向其中加入200μMSAMS肽(HMRSAMSGLHLVKRR下劃線的絲氨酸殘基是磷酸化位點，作為乙酰CoA羧化酶的AMPK磷酸化位點)和[γ-32P]ATP，并在30℃將所述反應(yīng)物反應(yīng)10分鐘。然后將所得反應(yīng)溶液噴點于p81磷酸纖維素紙上。用3％磷酸溶液洗滌所述p81紙，并測定放射性。對每一種反應(yīng)條件而言，還進行了并未涉及SAMS多肽的反應(yīng)，并從總值中減去基本值。
如從圖1中所看到的，當用丹參提取物和丹參酮衍生物處理成肌細胞C2C12時，可導致AMPK酶活性的升高。
實施例4t-AMPK，p-AMPK，p-ACC和GLUT4酶表達水平的測定將成肌細胞，C2C12培養(yǎng)于含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。當細胞密度達到約85％-90％時，用1％小牛血清的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，從而誘導細胞分化。用30μM丹參酮衍生物分別處理分化細胞。通過裂解C2C12細胞測定AMPK的酶活性，獲得了蛋白提取物，并將蛋白提取物進行Western印跡分析，從而測定總AMPK，p-AMPK(磷酸化AMPK)，p-ACC(磷酸化乙酰CoA羧化酶)和GLUT4(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4)蛋白的量。
從圖2可看出，盡管在AMPK蛋白的總量上沒有變化，當與對照組進行比較時，丹參酮衍生物處理的細胞表現(xiàn)出了增加的磷酸化AMPK蛋白的量，增加的磷酸化ACC蛋白的量和增加的GLUT4蛋白表達水平。
實施例5丹參酮衍生物對脂肪酸代謝和線粒體生物合成的作用將成肌細胞，C2C12培養(yǎng)于含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。當細胞密度達到約85％-90％時，用1％小牛血清的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，從而誘導細胞的分化。用30μM丹參酮衍生物分別處理分化細胞。從細胞中提取RNA，并進行了RT-PCR來觀察各種丹參酮衍生物對ACC-1(乙酰CoA羧化酶-1)，ACC-2，CPT1(肉毒堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶-1)，PGC1α(過氧物酶體增殖子活化的受體γ共活化子1α)，GLUT1(葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1)和UCP-2(非偶聯(lián)蛋白-2)基因表達的作用效果。
如從圖3可看出，當與對照組進行比較時，丹參酮衍生物處理的細胞表現(xiàn)出了對ACC-1，ACC-2，CPT1，PGC-1α，UCP-2和GLUT1基因增加的表達水平。
實施例6對葡萄糖攝入水平的分析將成肌細胞，C2C12，培養(yǎng)于含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。當細胞密度達到約85％-90％時，用1％小牛血清的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，從而誘導細胞的分化。將完全分化的細胞進一步在含有5μM葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液中再培養(yǎng)2小時。用丹參酮衍生物對細胞處理預(yù)定的時間，加入0.2μCi 2-脫氧葡萄糖，并靜置2分鐘。在去除KRB緩沖液之后，用冰預(yù)冷的生理鹽水緩沖液洗滌細胞，用0.5NNaOH裂解細胞，然后使用放射計數(shù)器測定每分鐘的計數(shù)(cpm)。在這種情況下，可使用含有10μM細胞松弛素B的KRB緩沖液測定葡萄糖的非特異性攝入，并從總值中減去。
如圖4所示，當用30μM丹參酮衍生物分別處理C2C12細胞時，與對照組相比較，所處理的細胞表現(xiàn)出了增加的葡萄糖攝入。
實施例7成脂肪細胞分化抑制活性的測定在含有10％小牛血清的DMEM中培養(yǎng)前成脂肪細胞，3T3-L1和F442A。當分別的前成脂肪細胞密度達到約90％時，用地塞米松，IBMX和胰島素處理3T3-L1細胞約48-55小時，從而誘導脂肪細胞的分化。然后每2天用含有小牛血清和胰島素的培養(yǎng)基更換原來的培養(yǎng)基。在F442A細胞的情況下，當前成脂肪細胞的細胞密度達到約90％時，用含有10％小牛血清和胰島素的培養(yǎng)基更換原來的培養(yǎng)基，每2天更換一次，從而誘導脂肪細胞的分化。為了測定脂肪細胞分化的抑制性效果，用從丹參提取的，濃度為5-30μM的丹參酮衍生物對處于脂肪細胞分化早期的細胞進行處理，并與對照組進行比較。約12-15天后有超過90％的細胞分化成了脂肪細胞。為了研究各個級分的活性，與對細胞進行與對照組相同的時間處理，并在顯微鏡下觀察從而測定丹參酮衍生物處理的效果。
圖5是根據(jù)脂肪細胞分化誘導時間，在丹參酮衍生物處理組和對照組之間脂肪細胞分化能力比較的顯微圖。在對照組的情況下，80-90％的F442A細胞分化成脂肪細胞需要約11天。然而，在丹參酮衍生物處理組的情況下，當用濃度為30μM的丹參酮衍生物從分化的早期對細胞進行處理時，在相同時間內(nèi)僅有5-10％的細胞分化成脂肪細胞。
實施例8丹參酮衍生物對肌肉細胞中胰島素敏感性的作用將成肌細胞，C2C12，培養(yǎng)于含有10％小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。當細胞密度達到約85％-90％時，用1％小牛血清的培養(yǎng)基替換所述培養(yǎng)基，從而誘導細胞的分化。通過用胰島素和丹參酮衍生物分別或其組合處理分化的成肌細胞，測定了對于不同丹參酮衍生物濃度的葡萄糖攝入水平，并由此測定了丹參酮衍生物對胰島素敏感性的作用效果。
如圖6所示，在存在胰島素的情況下以不同濃度給藥丹參酮衍生物時，這表現(xiàn)出了葡萄糖對進入肌肉細胞的促進性濃度依賴性攝入，正如與單獨給藥的組和對照組進行的比較。
實施例9在肥胖的動物模型，DIO小鼠中對肥胖預(yù)防和治療性效果的分析作為最常用的膳食誘導的肥胖(DIO)的小鼠模型，用高脂肪膳食(D12451，45％kcal脂肪，Research Diests，New Brunswick，NJ)飼喂4周齡的C57BL/6雄性小鼠。
結(jié)果，脂肪在動物體內(nèi)過量累積，在出生約3個月后，小鼠隨后保持了超過31-32g的體重，相當于正常小鼠的1.4倍體重。為了測定丹參酮衍生物對脂肪代謝的作用，將3月齡、重量為31-32g的DIO小鼠(16只)分成兩組，一個實驗組和一個對照組，各具有8只動物。在預(yù)定的時間點，對實驗組的8只小鼠以100mg/kg的濃度給藥丹參酮衍生物30天。與此同時，以相等量的蒸餾水單獨對對照組進行給藥。在給藥30天之后對實驗組和對照組的體重進行測定，給藥了丹參酮衍生物的實驗組表現(xiàn)出了明顯降低的體重，正如與對照組相比的那樣，如圖7所示。
實施例10丹參酮衍生物給藥對肥胖小鼠(ob/ob)的作用效果從Daehan Biolink公司(Chungchongbuk-do，Korea)購買10周齡、具有肥胖特征的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob雄性小鼠。將動物飼養(yǎng)于溫度為23℃、濕度為55％、照明為300-500lux，光-暗循環(huán)為1212小時，以及每小時通風10-18次的飼養(yǎng)室中。對動物飼喂Purina RodentLaboratory Chow 5001(購買自Purina Mills Inc.，St.Louis，MO，美國)的鼠料和隨意的水。允許小鼠在飼養(yǎng)室的新環(huán)境中適應(yīng)兩周，并給藥300mg/kg的丹參酮衍生物26天。根據(jù)給藥的時間點，對體重、血糖和膳食攝入的變化進行觀察。在給藥完成之后，進行計算斷層照相法(CT)對動物的脂肪組織分布變化，多種器官中脂肪的組織分布變化，脂肪細胞體積的變化，血液和肝臟中的葡萄糖，以及脂肪和酶的變化進行測定。圖9所示的表顯示給藥丹參酮衍生物對體重損失的作用效果。
圖8是在給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠和對照組之間隨時間體重變化的比較圖。如圖8所示，與對照組相比，丹參酮衍生物的給藥導致了體重的明顯降低。
圖10是在給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠和對照組之間脂肪細胞大小數(shù)值的比較圖。如圖10所示，與對照組相比，給藥了丹參酮衍生物的實驗組顯示脂肪細胞大小超過60％的降低。
圖11是在給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠和對照組之間不同器官的脂肪分布的數(shù)值的比較圖。如圖11所示，與對照組相比，給藥了丹參酮衍生物的實驗組顯示所有器官的組織的脂肪含量的明顯降低，和升高的褐色脂肪含量，說明了脂肪代謝的明顯增強。
圖12是通過H&E染色和油紅O染色，在正常小鼠，肥胖小鼠和給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠的肝臟中脂肪組織分布的比較圖。如圖12所示，與肥胖小鼠的對照組相比較，通過脂肪組織的染色證實了丹參酮衍生物的給藥導致了肝臟中脂肪積累的明顯降低。
圖13是在給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠和對照組之間肝臟組織中脂類和抗氧化指示劑材料變化結(jié)果的表。如圖13所示，與對照組相比，給藥了丹參酮衍生物的組表現(xiàn)出了在肝臟中總脂肪含量，甘油三酯，膽固醇，GOT和GPT的明顯降低。
圖14是在給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠和對照組之間血液中的脂類和葡萄糖變化的比較表。如圖14所示，與對照組相比，給藥了丹參酮衍生物的組表現(xiàn)出了在血液中甘油三酯，膽固醇，GOT和葡萄糖的明顯降低。
圖15是在給藥了丹參酮衍生物的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob小鼠的計算斷層照相法(CT)的分析結(jié)果。如圖15所示，與對照組相比，給藥了丹參酮衍生物的實驗組表現(xiàn)出了內(nèi)臟脂肪分布的明顯降低。
實施例11在糖尿病的動物模型，Lepr db/Lepr db小鼠中對糖尿病預(yù)防和治療效果的分析Lepr db/Lepr db雄性小鼠缺乏瘦蛋白受體，并由于其不受控制的胃口，因而連續(xù)和過量地消費食物。結(jié)果，脂肪在動物體內(nèi)過量累積，且血糖水平升高，導致了在出生后約10-11周后約350-400mg/dl的血糖水平。為了測定丹參酮衍生物對糖尿病的預(yù)防和治療效果，將血糖水平約350-400mg/dl的成年Lepr db/Lepr db小鼠分成了兩組，一個實驗組和一個對照組，每組各有10只動物。以300mg/kg濃度的丹參酮衍生物給藥實驗組的10只小鼠12天。與此同時，以等量的蒸餾水而不是丹參酮衍生物對對照組的10只小鼠進行給藥。圖16是顯示丹參酮衍生物給藥階段的血糖變化的表，并可以看出由丹參酮衍生物引起的血糖的降低效果。
實施例12關(guān)于丹參酮衍生物間組合比例對AMPK活性的協(xié)同效果使用肌肉細胞，進行了本實施例，從而確認了含有作為主要成分的丹參酮I，丹參酮IIA，隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I的衍生物之間組合比例對AMPK活性的協(xié)同效果。換言之，我們嘗試確認如實施例5中所示根據(jù)基因表達衍生物之間的相互互補功能，并通過AMPK活性對任一的丹參酮衍生物組合引起的協(xié)同效果進行了確認。
可將不同成分的丹參酮I，丹參酮IIA，隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I雙倍或三倍組合從而制備不同的組合物。將所制備的組合物的AMPK活性與包含于那些組合物中不同組分的AMPK活性進行比較從而確認協(xié)同作用。此外，通過改變所述組合物中成分之間的比例，我們試圖確認隨著所述組合物比例改變的AMPK活性，并通過丹參酮衍生物的任一組合獲得活性的協(xié)同效應(yīng)。
圖17是通過丹參酮衍生物的雙重組合對組合物活性進行比較的表，圖18是顯示關(guān)于雙重組合中成分比例改變的活性變化的表，而圖19則是通過丹參酮衍生物的三重組合對組合物的AMPK活性進行比較的表。
首先，如圖17和圖18所示，在相同濃度下，與分別組分的AMPK活性相比，含有兩種或三種丹參酮衍生物組分組合的組合物具有明顯較高的AMPK活性?？梢钥闯鲇捎谘苌锍煞纸M合的這種協(xié)同效果是與組分的種類沒有關(guān)系的非常獨特的現(xiàn)象。與此同時，正如圖18所示，在相同組合物中不同組分之間的組合比例的差異導致了依賴于成分種類的特別不同的AMPK活性。
實施例13關(guān)于丹參酮衍生物間的組合比例對體重降低的協(xié)同效果從Daehan Biolink公司(Chungchongbuk-do，Korea)購買10周齡、具有肥胖特征的C57BL/6JL Lep ob/Lep ob雄性小鼠。將動物飼養(yǎng)于溫度為23℃、濕度為55％、照明為300-500lux，光-暗循環(huán)為1212小時，以及每小時通風10-18次的飼養(yǎng)室中。對動物飼喂Purina RodentLaboratory Chow 5001(購買自Purina Mills Inc.，St.Louis，MO，美國)的鼠料和隨意的水。允許小鼠在飼養(yǎng)室的新環(huán)境中適應(yīng)兩周，并給藥丹參酮衍生物。將包含于丹參提取物中的丹參酮衍生物分成兩組四氫菲衍生物組(1∶1的隱丹參酮和丹參酮IIA)和菲衍生物組(2∶1的丹參酮I和15，16二氫丹參酮I)，并可對丹參酮衍生物之間的比例進行適當調(diào)節(jié)。以這種方式，我們試圖測定組分比例改變對體重的效果，并由此確定了內(nèi)部互補作用的效果。四氫菲衍生物組和菲衍生物組之間的組合比例可以從10∶1-1∶10，并以300mg/kg的劑量對動物給藥26天。測定了伴隨衍生物給藥體重的改變，關(guān)于組分比例改變對體重降低的效果可見于圖20。如圖20所示，在四氫菲衍生物和菲衍生物間的組合比例改變導致了體重降低(％)的改變。尤其是，當組合比例(四氫菲衍生物∶菲衍生物)在5∶1-1∶5范圍內(nèi)且更優(yōu)選在2.5∶1-1∶2.5范圍時，證實了極好的協(xié)同效果。
實施例14急性毒性測試1、口服給藥將23±2g的IRC小鼠和250±7g的Sprague-Dawley(Jung-Ang LabAnimal Inc.，Seoul，Korea)大鼠分成4組，每組10只，并分別以100，500和1,000mg/kg的劑量口服給藥本發(fā)明的丹參酮衍生物?？诜o藥后觀察2周看是否表現(xiàn)出毒性，在所有四個分組中沒有動物死亡，并且與對照組(除體重降低以外)相比也未觀察到可見的癥狀。
2、腹膜給藥將25±3g的IRC小鼠和255±6g的Sprague-Dawley(Jung-Ang LabAnimal Inc.，Seoul，Korea)大鼠分成4組，每組10只，并分別以10，50和100mg/kg的劑量腹膜給藥本發(fā)明的丹參酮衍生物。腹膜給藥后觀察2周看是否表現(xiàn)出毒性，在所有四個分組中沒有動物死亡，并且與對照組(除體重降低以外)相比也未觀察到可見的癥狀。
從上述結(jié)果證實了本發(fā)明的丹參酮衍生物沒有急性毒性。
在下文中描述了如本發(fā)明所述藥物組合物的制備實施例。所提供的這些實施例僅為了對本發(fā)明進行說明，而不應(yīng)該被認為是對本發(fā)明范圍和精神的限制。
實施例15片劑的制備丹參酮衍生物200g乳清蛋白640g結(jié)晶纖維素 140g硬脂酸鎂10g羥丙基甲基纖維素10g實施例16粉劑制劑的制備丹參酮衍生物10g大豆蛋白50g羧基纖維素 40g總計100g實施例17將丹參酮衍生物應(yīng)用于乳品中乳品99.9％丹參酮衍生物0.1％實施例18將丹參酮衍生物應(yīng)用于橙汁中液體果糖5％聚葡萄糖1％檸檬酸 5％維生素C 0.02％丹參酮衍生物0.1％橙汁濃縮物 25％蔗糖脂肪酸酯0.2％水 63％
實施例19制備飲料乳酸鈣50mg檸檬酸5mg尼克酰胺 10mg核黃素鹽酸鈉 3mg鹽酸吡哆素2mg精氨酸10mg蔗糖脂肪酸酯 10mg丹參酮衍生物 10mg水200ml實施例20將丹參酮衍生物應(yīng)用于化妝品乳液1，3-丁二醇5％甘油 5％EDTA-2Na 0.02％三甲基甘氨酸 2.0％十六烷醇 1.0％甘油基單硬脂酸乳化劑 1.0％聚山梨酸酯60 1.2％失水山梨糖醇倍半油酸酯 0.3％己酸-十六烷基2-乙基酯 4.0％角鯊?fù)?5.0％二甲基硅油 0.3％硬脂酸甘油酯 0.5％卡波姆 0.15％三乙醇胺 0.5％咪唑烷基脲 0.2％丹參酮衍生物 1％純凈水 71.8％
實施例21將丹參酮衍生物應(yīng)用于化妝護膚品1，3-丁二醇 4.0％二丙二醇 5.0％EDTA-2Na 0.02％Octyldodeceth-16 0.3％PEG60氫化蓖麻油 0.2％丹參酮衍生物 0.1％純凈水90％工業(yè)應(yīng)用如上所述，本發(fā)明所述的組合物可有效地通過代謝活化降低體重，阻止體內(nèi)的脂肪積累，降低血糖水平，并有效地降低膽固醇和甘油三酯的量，因此可有效地預(yù)防和治療代謝綜合癥。此外，所述組合物可阻止體內(nèi)的脂肪積累，并增強胰島素敏感性，從而控制血糖水平，因此可用來開發(fā)能夠預(yù)防或治療由脂肪和葡萄糖代謝功能紊亂導致的與代謝綜合癥相關(guān)的多種疾病的食品，化妝品和藥物組合物。
盡管在此已公開了說明性的本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，但本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員都應(yīng)理解在不偏離所附權(quán)利要求公開的本發(fā)明的范圍和精神的前提下，仍然可進行多種修飾，添加和替換。
權(quán)利要求
1.預(yù)防或治療肥胖和代謝綜合癥疾病的組合物，包括作為有效成分的治療和/或預(yù)防有效量的丹參(Salivia miltiorrhiza)提取物。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述丹參提取物包括選自四氫菲衍生物和菲衍生物中的一種或多種化合物。
3.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述四氫菲衍生物包括選自隱丹參酮和丹參酮IIA中的一種或多種化合物。
4.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述菲衍生物包括選自丹參酮I和15，16-二氫丹參酮I中的一種或多種化合物。
5.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所丹參提取物包括選自隱丹參酮，丹參酮IIA，15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I中的一種或多種化合物。
6.如權(quán)利要求5所述的組合物，進一步包括選自1β-羥基隱丹參酮，1-氧代隱丹參酮，丹參醇B，丹參醇IIB，紫丹參甲素，二氫異丹參酮I，丹參酮IIA磺酸鹽，1，2-二氫丹參酮I和丹參酮VI中的一種或多種化合物。
7.如權(quán)利要求2-6任一所述的組合物，其中四氫菲衍生物∶菲衍生物的比率在10∶1-1∶10(w/w)的范圍內(nèi)。
8.如權(quán)利要求7所述的組合物，其中四氫菲衍生物∶菲衍生物的比率在5∶1-1∶5的范圍內(nèi)。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其中四氫菲衍生物∶菲衍生物的比率在2.5∶1-1∶2.5的范圍內(nèi)。
10.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述四氫菲衍生物包括隱丹參酮和丹參酮IIA，其比率在1∶5-5∶1(w/w)的范圍內(nèi)。
11.如權(quán)利要求2所述的組合物，其中所述菲衍生物包括15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I，其比率在1∶5-5∶1(w/w)的范圍內(nèi)。
12.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為主要成分的隱丹參酮。
13.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為主要成分的15，16-二氫丹參酮I。
14.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為主要成分的丹參酮IIA。
15.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為主要成分的丹參酮I。
16.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為基本成分的隱丹參酮，且任選，包括選自丹參酮IIA，15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I中的一種或多種化合物。
17.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為基本成分的丹參酮IIA，且任選，包括選自隱丹參酮，15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I中的一種或多種化合物。
18.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為基本成分的15，16-二氫丹參酮I，且任選，包括選自隱丹參酮，丹參酮IIA和丹參酮I中的一種或多種化合物。
19.如權(quán)利要求5所述的組合物，其中所述組合物包括作為基本成分的丹參酮I，且任選，包括選自隱丹參酮，丹參酮IIA和15，16-二氫丹參酮I中的一種或多種化合物。
20.如權(quán)利要求16或18所述的組合物，其中所述組合物包括隱丹參酮和15，16-二氫丹參酮I。
21.如權(quán)利要求16或17所述的組合物，其中所述組合物包括隱丹參酮和丹參酮IIA。
22.如權(quán)利要求17或18所述的組合物，其中所述組合物包括丹參酮IIA和15，16-二氫丹參酮I。
23.如權(quán)利要求17或19所述的組合物，其中所述組合物包括丹參酮IIA和丹參酮I。
24.如權(quán)利要求18或19所述的組合物，其中所述組合物包括15，16-二氫丹參酮I和丹參酮I。
25.如權(quán)利要求16或19所述的組合物，其中所述組合物包括丹參酮I和隱丹參酮。
26.如權(quán)利要求20-25任一項所述的組合物，其中兩種組分的混合比率在10∶1-1∶10(w/w)的范圍內(nèi)。
27.如權(quán)利要求26所述的組合物，其中所述混合比率在5∶1-1∶5的范圍內(nèi)。
28.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述代謝綜合癥疾病是選自肥胖癥，糖尿病，動脈硬化，高血壓，高脂血，肝病，腦溢血，心肌梗塞，局部缺血疾病和心血管疾病中的至少一種。
29.如權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述組合物提高5’AMP活化的蛋白激酶(AMPK)的活性。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物提高AMPK的活性從而促進細胞血糖的吸收，由此降低血糖水平。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物提高AMPK的活性從而表現(xiàn)出抑制肥胖的活性。
32.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物提高AMPK的活性從而表現(xiàn)出降低血脂的活性。
33.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物提高AMPK的活性從而表現(xiàn)出抑制肝細胞損傷和脂肪肝形成的活性。
34.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述組合物提高AMPK的活性從而表現(xiàn)出對動脈硬化，高血壓，腦溢血，缺血性疾病和心血管疾病的治療活性。
35.預(yù)防和/或治療肥胖和代謝綜合癥疾病的藥物制劑，包括作為活性組分的權(quán)利要求1的組合物和一種或多種可藥用的載體或賦型劑。
36.如權(quán)利要求35所述的制劑，其中所述活性組分的含量在按重量計0.0001-10％的范圍內(nèi)。
37.如權(quán)利要求35所述的制劑，其中的制劑為適于口服或腸胃外給藥的多劑型或單位劑型，包括片劑，粉劑，硬或軟膠囊，懸液，可注射制品和乳液。
38.如權(quán)利要求35所述的制劑，其中對成人以0.1-6,000mg/天/kg體重的范圍施用所述制劑中的活性組分。
39.如權(quán)利要求35所述的制劑，其中所述制劑包括可藥用的賦型劑，因此可將其制成飲料、食品或化妝品的形式。
40.制備丹參提取物的方法，包括將丹參(Salivia miltiorrhiza)進行水或有機溶劑提取從而得到粗提物；過濾所述粗提物，然后進行(真空)濃縮；以及任選，去除溶劑。
41.如權(quán)利要求40所述的制劑，其中所述丹參是干藥材或生藥材。
全文摘要
本發(fā)明涉及預(yù)防和治療代謝綜合癥的組合物，所述組合物含有作為有效成分的丹參酮衍生物。更具體地，本發(fā)明涉及預(yù)防和治療代謝綜合癥的組合物，所述組合物含有在提高代謝活性中表現(xiàn)出較高活性的作為有效成分的丹參酮衍生物。
文檔編號A61P3/04GK1901900SQ200480039408
公開日2007年1月24日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月30日
發(fā)明者郭泰煥, 樸明奎 申請人:Md白奧阿爾法有限公司, 韓國煙草人參公事