專利名稱：S－腺苷同型半胱氨酸的醫(yī)學(xué)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在生物體氨基酸代謝過程中，S-腺苷蛋氨酸在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移給其他物質(zhì)，參與生成多種含甲基的重要生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。更具體地說是體內(nèi)的S-腺苷蛋氨酸通過上述反應(yīng)提供甲基后，轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸(S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine，AdoHcy)，而S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷蛋氨酸依賴的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)強(qiáng)大的抑制劑。
背景技術(shù)：
在生物體氨基酸代謝過程中，S-腺苷蛋氨酸在甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下，將甲基轉(zhuǎn)移給其他物質(zhì)，參與生成多種含甲基的重要生物活性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸。體內(nèi)的S-腺苷蛋氨酸通過上述反應(yīng)提供甲基后，轉(zhuǎn)變?yōu)镾-腺苷同型半胱氨酸(S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine，AdoHcy)，而S-腺苷同型半胱氨酸是S-腺苷蛋氨酸依賴的轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)強(qiáng)大的抑制劑。
蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸(尤其是mRNA)等生物分子的甲基化對(duì)于維持細(xì)胞的活性是必需的，一些細(xì)胞膜信號(hào)分子的翻譯后加工也需要甲基化的參與。以前的研究表明，甲基化抑制劑S-腺苷同型半胱氨酸能影響腦內(nèi)神經(jīng)物質(zhì)代謝，防治神經(jīng)細(xì)胞缺血壞死，具有誘導(dǎo)睡眠和抗驚厥的作用。文獻(xiàn)也表明S-腺苷同型半胱氨酸是一個(gè)安全無毒的甲基化抑制劑。但是迄今為止，S-腺苷同型半胱氨酸在體內(nèi)對(duì)于免疫系統(tǒng)的影響一直沒有研究。我們?cè)诖诉M(jìn)行了大量的S-腺苷同型半胱氨酸體內(nèi)免疫抑制活性研究。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)的醫(yī)學(xué)用途。
S-腺苷同型半胱氨酸是生物體氨基酸代謝過程中的代謝中間產(chǎn)物。本發(fā)明對(duì)S-腺苷同型半胱氨酸在體內(nèi)的藥效藥理學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)并證明，AdoHcy體內(nèi)給藥能產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗炎免疫抑制活性作用。AdoHcy作為新型抗炎免疫抑制藥物有非常好的研究和開發(fā)應(yīng)用前景，將有可能用于治療自身免疫性疾病、嚴(yán)重過敏性疾病、糖尿病等與機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能及反應(yīng)狀態(tài)異常有關(guān)疾病，以及用于預(yù)防器官等移植后的排斥反應(yīng)。
經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)證明，S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)具有如下免疫抑制活性(一)AdoHcy能夠抑制DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)(二)AdoHcy能夠抑制卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)(三)AdoHcy能夠阻止髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白35-55肽段(MOG 35-55)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎(四)AdoHcy能夠改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀


圖1是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能抑制OVA免疫誘導(dǎo)小鼠的淋巴細(xì)胞對(duì)抗原特異性刺激的增殖反應(yīng)。A是抑制脾淋巴細(xì)胞對(duì)OVA的反應(yīng)；B是抑制淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)OVA的反應(yīng)。
圖2是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能抑制OVA免疫誘導(dǎo)小鼠的淋巴細(xì)胞對(duì)抗原特異性刺激的細(xì)胞因子產(chǎn)生。A是抑制脾淋巴細(xì)胞對(duì)OVA的反應(yīng)；B是抑制淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)OVA的反應(yīng)。
圖3是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能抑制抗OVA特異性抗體的產(chǎn)生。
圖4是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能有效抑制MOG 35-55誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎的發(fā)病嚴(yán)重程度。
實(shí)心園圈代表EAE模型組，空心圓圈代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸給藥組圖5是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能有效抑制MOG 35-55誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎的淋巴細(xì)胞對(duì)抗原特異性刺激的增殖反應(yīng)。A是抑制脾淋巴細(xì)胞對(duì)MOG 35-55的反應(yīng)；B是抑制淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)MOG 35-55的反應(yīng)。
黑色條圖代表EAE模型組，灰色條圖代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸給藥組圖6是S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能有效抑制MOG 35-55誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎的淋巴細(xì)胞對(duì)抗原特異性刺激的細(xì)胞因子產(chǎn)生。左面兩圖抑制脾淋巴細(xì)胞對(duì)MOG 35-55的反應(yīng)；右面兩圖抑制淋巴結(jié)細(xì)胞對(duì)MOG 35-55的反應(yīng)。
黑色條圖代表EAE模型組，灰色條圖代表5mg/kg S-腺苷同型半胱氨酸給藥組
具體實(shí)施例方式
實(shí)驗(yàn)藥物、動(dòng)物及材料藥物名稱S-腺苷同型半胱氨酸S-(5’-Adenosyl)-L-homocysteine)，MW384.4。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)采用Balb/c小鼠，C57BL/6小鼠，6-8周齡，全為雌性小鼠，購于中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證書號(hào)中科滬動(dòng)管第99-003號(hào)。MRL-lpr/lpr小鼠從日本引進(jìn)，由中科院上海藥物研究所SPF級(jí)動(dòng)物房繁育提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于中科院上海藥物所清潔級(jí)動(dòng)物房，12小時(shí)光/暗循環(huán)，24℃室溫，50-60％濕度。
試劑百日咳毒素(Pertussis toxin，PTX)和Ovalbumin(grade V)購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)。
完全弗氏佐劑(Complete Freund’s adjuvant，CFA)和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis H37Ra)購自Difco公司(Detroit，MI，USA)。MOG 35-55由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成(Shanghai，P.R.China)。
ELISA試劑盒為Pharmegen公司產(chǎn)品。
RPMI-1640培養(yǎng)液及小牛血清為GIBCOL公司產(chǎn)品。
-胸腺嘧啶核苷為上海原子能研究所產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。
實(shí)驗(yàn)方法[一]遲發(fā)性超敏反應(yīng)動(dòng)物模型(DTH)1.Day0，Balb/c小鼠(雌性，6-8周齡)每只后腳以20ul 0.5％DNFB致敏。次日加強(qiáng)。(DNFB溶于[丙酮∶橄欖油＝4∶1]油劑中)；2.Day(7-9)，鼠左耳內(nèi)外兩側(cè)各10ul 0.4％DNFB進(jìn)行攻擊；3.攻擊前1小時(shí)腹腔注射一次。12小時(shí)后，再給藥一次；4.攻擊后24-48小時(shí)，檢測(cè)各指標(biāo)。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表1.
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能抑制DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)(抑制耳腫脹程度)

S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)抑制DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)(DTH)我們選用了經(jīng)典的小鼠DTH反應(yīng)模型。DTH實(shí)驗(yàn)是一種體內(nèi)檢測(cè)細(xì)胞介導(dǎo)免疫功能的方法，與接觸性超敏反應(yīng)相似。DTH也包括致敏和觸發(fā)兩個(gè)階段。致敏約需要6天，在觸發(fā)后的24～48小時(shí)DTH的炎癥反應(yīng)達(dá)到高峰。在初始的致敏階段有記憶性的抗原特異性細(xì)胞分布到外周各淋巴組織，在任何局部的抗原刺激會(huì)使這些細(xì)胞迅速活化引起DTH。結(jié)果顯示，體內(nèi)腹腔給藥AdoHcy劑量在0.2，1和5mg/kg時(shí)，能顯著抑制耳腫脹程度，與對(duì)照組相比抑制率分別22.9％，28.5％和39.1％(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)將OVA(2mg/ml)與等體積的CFA充分乳化，給雌性C57BL/6小鼠背部皮下注射(100μl/只)。為了探討S-腺苷同型半胱氨酸的免疫抑制作用，我們將OVA免疫的小鼠隨機(jī)分成4組①模型對(duì)照組腹腔注射等體積的PBS，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸低劑量組(0.2mg/kg/d，i.p.)；③S-腺苷同型半胱氨酸中劑量組(1mg/kg/d，i.p.)；④S-腺苷同型半胱氨酸高劑量組(5mg/kg/d，i.p.)。
免疫后21天處死小鼠，無菌取脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞(腋窩和腹股溝)，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中(100μl)，RPMI 1640和OVA(終濃度100μg/ml)分別加入，終體積200μl，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞于含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用3H摻入法測(cè)細(xì)胞增殖；培養(yǎng)2天收上清，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2、INF-γ和IL-4。
免疫后第21天摘眼球取血，用ELISA檢測(cè)血清中OVA特異性IgG、IgG1、IgG2a和IgG3。結(jié)果用OD570±S.E.M表示。
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)抑制OVA誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)卵清蛋白(OVA)免疫的小鼠，體外用100μg/ml OVA能誘導(dǎo)脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞抗原特性增殖，產(chǎn)生細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)、γ-干擾素(INF-γ)和白介素-4(IL-4)。S-腺苷同型半胱氨酸(1和5mg/kg/d)給藥21天明顯抑制脾細(xì)胞和淋巴細(xì)胞OVA特異性增殖反應(yīng)(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖1A和1B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；S-腺苷同型半胱氨酸對(duì)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生Th1型細(xì)胞因子(IL-2和INF-γ)的抑制作用明顯強(qiáng)于Th2型細(xì)胞因子(IL-4)(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖2A和2B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；對(duì)降低血中抗體總IgG的水平，IgG2a和IgG3的抑制作用也明顯強(qiáng)于IgG1(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖表3)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
MOG 35-55誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎將MOG 35-55(4mg/ml)與等體積的CFA(含4mg/ml Mycobacterium tuberculosisH37Ra)充分乳化，給雌性C57BL/6小鼠背部皮下注射(100μl/只)。在免疫當(dāng)天和免疫后48小時(shí)腹腔注射PTX(400ng/只)。免疫后按體重年齡將小鼠隨機(jī)分成2組①模型對(duì)照組(9只)腹腔注射等體積的磷酸緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸給藥組(10只)腹腔注射5mg/kg AdoHcy，每天1次。
實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎的臨床評(píng)分采用常用的5分制。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下0分，沒有明顯疾病癥狀；1分，尾巴張力消失或者后肢無力；2分，尾巴張力消失和后肢無力；3分，后肢部分癱瘓；4分，后肢完全癱瘓；5分，瀕死狀態(tài)或者死亡。免疫后每天觀察小鼠的狀態(tài)和臨床評(píng)分。
實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死小鼠，無菌取脾臟和淋巴結(jié)細(xì)胞(腋窩和腹股溝)，制成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。調(diào)細(xì)胞濃度為5×106/ml，加入96孔培養(yǎng)板中(100μl/Well)，RPMI1640和MOG 35-55(終濃度10μg/ml)分別加入，終體積200μl，每實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞于含5％CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用3H摻入法測(cè)細(xì)胞增殖；培養(yǎng)2天收上清，用ELISA檢測(cè)細(xì)胞因子IL-2和INF-γ。
AdoHcy抑制MOG 35-55誘導(dǎo)小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎3.1.AdoHcy抑制MOG 35-55誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎在MOG 35-55免疫C57BL/6小鼠當(dāng)天腹腔注射AdoHcy(5mg/kg/d)，能明顯降低EAE的發(fā)病率(模型組發(fā)病率8/9，AdoHcy給藥組發(fā)病率3/10)，延遲EAE的發(fā)病時(shí)間(模型組7天開始發(fā)病，平均發(fā)病時(shí)間為12天；AdoHcy給藥組14天開始發(fā)病，平均發(fā)病時(shí)間為15天)。如(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖4)所示，AdoHcy能明顯降低平均臨床評(píng)分，減輕疾病的嚴(yán)重程度。
3.2AdoHcy抑制MOG 35-55誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖和Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生MOG 35-55免疫的小鼠，體外用10μg/ml MOG 35-55能誘導(dǎo)脾細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞抗原特性增殖以及Th1型細(xì)胞因子IL-2和INF-γ的產(chǎn)生；而AdoHcy給藥24天能明顯抑制淋巴細(xì)胞MOG 35-55特異性增殖反應(yīng)(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖5A和5B)，(*P＜0.05；**P＜0.01)；AdoHcy給藥24天能明顯抑制淋巴細(xì)胞MOG 35-55特異性IL-2和INF-γ的產(chǎn)生(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖6)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病將16周雌性MRL-lpr/lpr小鼠隨機(jī)分成2組①模型對(duì)照組(10只)腹腔注射等體積的磷酸緩沖液(Phosphate-buffered saline，PBS)，每天1次；②S-腺苷同型半胱氨酸給藥組(10只)腹腔注射5mg/kg AdoHcy，每天1次。連續(xù)給藥8周致24周左右，處死小鼠。稱體重，取脾臟和淋巴結(jié)、稱重并計(jì)數(shù)。
AdoHcy改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀S-腺苷同型半胱氨酸(5mg/kg/d，i.p.)給藥8周對(duì)MRL-lpr/lpr小鼠體重沒有明顯影響，提示其在體內(nèi)沒有明顯的毒性。S-腺苷同型半胱氨酸明顯降低取脾臟和淋巴結(jié)的重量，減少脾細(xì)胞計(jì)數(shù)，抑制自發(fā)性紅斑狼瘡模型動(dòng)物過渡激活的免疫系統(tǒng)，改善疾病的癥狀(見實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)下表)，(*P＜0.05；**P＜0.01)。
S-腺苷同型半胱氨酸(AdoHcy)體內(nèi)給藥能有效改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀

結(jié)論在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中S-腺苷同型半胱氨酸對(duì)于DTH反應(yīng)模型的小鼠的耳腫脹程度都具有顯著的抑制作用，能夠抑制卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)，防治實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎，改善MRL-lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀。試驗(yàn)證明一種S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應(yīng)用?？梢赃M(jìn)一步將其開發(fā)成為高效低毒的免疫抑制藥物，如在無菌條件下被制成液體劑型如針劑、溶液，或者是口服劑型如片劑和膠囊等。由于這些技術(shù)都是藥物研發(fā)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)手段，因此不再贅述。
權(quán)利要求
1.一種S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于在制備預(yù)防、治療自身免疫疾病的藥物中應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的S-腺苷同型半胱氨酸及含S-腺苷同型半胱氨酸的組合物在制備免疫抑制藥物中應(yīng)用，其特征在于免疫性疾病為多發(fā)性硬化癥，系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性腎炎、糖尿病。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種S－腺苷同型半胱氨酸的醫(yī)學(xué)用途，通過對(duì)AdoHcy能夠抑制DNFB誘導(dǎo)的小鼠遲發(fā)性超敏反應(yīng)，AdoHcy能夠抑制卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的抗原特異性免疫反應(yīng)，AdoHcy能夠阻止髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白35－55肽段(MOG 35－55)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓膜炎，AdoHcy能夠改善MRL－lpr/lpr小鼠自發(fā)性紅斑狼瘡疾病的癥狀實(shí)驗(yàn)，證明S－腺苷同型半胱氨酸具有明顯的免疫抑制作用，具有高效低毒的優(yōu)點(diǎn)，可用于制備免疫抑制劑。
文檔編號(hào)A61P37/00GK1939332SQ20051010846
公開日2007年4月4日 申請(qǐng)日期2005年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月30日
發(fā)明者左建平, 付云峰 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海藥物研究所