專利名稱：納米細胞藥物遞送系統(tǒng)的制作方法
相關(guān)申請本申請要求在2004年3月2日提交的題名為“納米細胞藥物遞送系統(tǒng)”的美國臨時申請USSN 60/549,280的優(yōu)先權(quán)，其在此引作參考。
背景技術(shù)：
合理的藥物治療的前提是準確的診斷，疾病病理生理學知識，正常人和病人中基本藥物療法的知識，和對這些關(guān)系的合理期望使得可以預料藥物的效果(DiPiro等編輯，Pharmacotherapy-A pathophysiologicapproach，第二版)。生物醫(yī)學科學的進展，就基因組、蛋白質(zhì)組或糖組而言，已經(jīng)解開了許多疾病的分子機制，并且暗示著明顯改變了的信號級聯(lián)反應、轉(zhuǎn)錄組和糖組的復雜網(wǎng)絡(luò)。在大多數(shù)病理生理情況下，這可以顯示為對恢復或喪失功能的調(diào)節(jié)的有效靶，產(chǎn)生治療效果。然而，復雜性在于涉及患病組織中不同的途徑，或甚至患病組織中空間差異的靶細胞，或在表現(xiàn)于最終表型的患病組織中發(fā)生的短暫事件。合理的策略是在多水平靶向疾病，該策略可以通過組合多種活性劑或藥物而實現(xiàn)。然而，在大多數(shù)情況下，這常常不是最適的策略，其受到患者愿意吸收太多藥物的限制，或受到在藥物動力學(吸收，分布，生物轉(zhuǎn)化，和排泄)水平藥物之間相互作用的限制和藥效學(藥物的生物化學或生理性作用和它們的作用機制)的限制，或毒理學(Goodman和Gilman，The Pharmacological Basis of Therapeutics，第9版)的限制。這種相互作用可以降低活性試劑的實際治療效果或增加其毒性，其比例被定義為治療指數(shù)。對于上述限制的創(chuàng)造性解決方案將無疑是對醫(yī)學和治療的革命。
為更好地理解現(xiàn)代醫(yī)學的限制，合適的例子是腫瘤的治療。美國全部人口中1/3會發(fā)展癌癥。盡管由于早期診斷和治療的進展五年存活率已經(jīng)大大提高至接近50％，在美國癌癥仍是僅次于心臟病的死因。20％的美國人死于癌癥，其中一半是由于肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌。
設(shè)計對患癌癥的病人有效的治療是巨大的挑戰(zhàn)。目前的手術(shù)切除方案，外部光照射治療，和/或全身化療已經(jīng)在某些類型的惡性腫瘤中取得部分成功，但是在其他腫瘤還沒有產(chǎn)生滿意的結(jié)果。在一些惡性腫瘤，例如腦惡性腫瘤，該方案產(chǎn)生少于一年的中值存活率。例如，90％切除的惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤在一年內(nèi)在原發(fā)腫瘤位置2厘米之內(nèi)復發(fā)。
盡管在一些類型的癌癥中有效，使用全身化療在治療結(jié)腸-直腸癌，食道癌，肝癌，胰腺癌和腎癌以及皮膚癌中只有較小的成功。用于治療這些類型的癌癥的全身化療主要的問題是達到對腫瘤生長的控制所需的全身劑量通常導致不可接受的全身毒性。改進化療劑遞送到腫瘤位置的努力導致器官導向的化療的進展，例如，通過持續(xù)全身灌注。然而，持續(xù)灌注抗癌藥物相對于脈沖或短期灌注通常不顯示明確的優(yōu)點。目前在臨床使用的抗腫瘤劑或化療劑包括(a)烷基化試劑，例如氮芥、環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，美法侖，瘤可寧，六甲密胺，硫替派，白血福恩，卡莫司汀，環(huán)己亞硝脲，賽氮芥，鏈脲霉素，甲氮咪胺等；(b)抗代謝物，例如氨甲蝶呤，5-FU，F(xiàn)udR，阿糖胞苷，6MP，硫鳥嘌呤，噴司他丁等；(c)天然產(chǎn)物，例如紫杉醇，長春堿，長春新堿，依托泊甙，替尼泊甙等；(d)抗生素，例如放線菌素，柔紅霉素，阿霉素，爭光霉素，普卡霉素，絲裂霉素C等；(e)酶，例如L-天冬酰胺酶，肝素酶，軟骨素酶等；(f)干擾素和白介素，例如干擾素-α，干擾素-γ，腫瘤壞死因子等；(g)鉑配位絡(luò)合物，例如順鉑，卡鉑或它們的衍生物；和(h)其它各種試劑，例如米托蒽醌，雙氯乙基亞硝基脲，羥基脲，氯乙基-環(huán)己基亞硝基脲，強的松，二乙基己烯雌酚，甲羥基孕酮，他莫昔芬，米托坦，普魯芐肼，氨基苯乙哌啶酮，孕激素，雄激素，抗雄激素，亮丙瑞林等。
抗腫瘤治療最新的進展是發(fā)現(xiàn)血管生成是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵步驟。血管生成，從現(xiàn)有的血管床產(chǎn)生新的血管，是腫瘤快速擴張和發(fā)展遠程轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)(Follcman，Nat Med，1995 Jan；127-31)。當腫瘤體積達到1-2mm3的階段，它需要營養(yǎng)以進一步生長。腫瘤核心的細胞開始死亡導致富含生長因子和前血管生成信號的核心壞死，上述因子和信號引起來自最近的血管的內(nèi)皮細胞的召集。血管生成以清楚的順序步驟進行，其是由多種介質(zhì)的相互影響引起的腫瘤細胞、細胞外基質(zhì)和內(nèi)皮細胞之間空間-時間相互作用的積累(Griffoen和Molema，Pharmacol.Review，2000 Jun；52237-68)。對這一復雜過程下事件的理解和弄清了一些介質(zhì)的作用機制開啟了將血管生成作為新型腫瘤管理策略的治療靶的令人振奮的可能性，超過60種化合物處于臨床開發(fā)階段。
目前有兩類血管生成抑制劑-直接的和間接的。直接的血管生成抑制劑，例如Vitaxin，血管他丁，內(nèi)皮他丁，combretastatin，2-甲氧雌甾二醇，avastin，canstatin等，阻止內(nèi)皮細胞增殖，遷移或形成管道，或允許細胞避免響應于腫瘤分泌的血管生成因子的細胞死亡。間接的血管生成抑制劑通常阻止活化血管生成的腫瘤蛋白的表達或阻斷其活性，或阻斷內(nèi)皮細胞上其受體的表達(Kerbel和Follunan，NatureReviews Cancer，Oct 2002；727-739)。在上述兩種情形中抗血管生成療法的最終結(jié)果是關(guān)閉對生長腫瘤的血管供應導致腫瘤饑餓。因此，抗血管生成療法導致腫瘤中組織缺氧(Yu JL等，Science，F(xiàn)eb 2002；Vol2951526-1528)。為克服這種組織缺氧情況，腫瘤開始產(chǎn)生生長因子，生長因子也發(fā)揮與腫瘤小得多的時候的血管生成作用相似的血管生成作用。在臨床中，一旦抗血管生成治療結(jié)束，這轉(zhuǎn)化為腫瘤出現(xiàn)生長的爆發(fā)(Boehm等，Nature 390404-407，Nov.1997)。相同的生長因子也可以防止一些腫瘤細胞發(fā)生凋亡或細胞死亡。此外，由于實體瘤內(nèi)部區(qū)域內(nèi)的異常或緩慢的血流導致的腫瘤組織缺氧可以產(chǎn)生微環(huán)境介導的輻射和化療藥物抗性(Yu等，Differentiation，Dec 2002Vol70599-609)。還有可能較少依賴血管的突變腫瘤細胞可以通過成功的抗血管生成療法隨時間發(fā)展而篩選。這將導致對更傳統(tǒng)形式的化療的反應喪失或減弱。這可以通過將生物還原性的組織缺氧細胞細胞毒性藥物和抗血管生成劑(antiangiogenics)組合使用而克服(Yu JL，Differentiation 2002 Dec；70599-609)。使用抗腫瘤劑或化療劑與抗血管生成劑組合的療法用于治療癌癥/腫瘤在很多專利申請中公開(參見，例如，U.S.專利6,147,060；6,140,346；和5,856,315；5,731,325；5,710,134和5,574,026；其各自在此引為參考；U.S.專利申請20020041880；20020107191；20020128228；20020111362；其各自在此引為參考)。然而，還存在對于遞送組合療法的藥物遞送系統(tǒng)的需要，以便各試劑提供所需的最佳效果。這樣的系統(tǒng)不僅在治療癌癥而且在治療其他疾病例如自身免疫疾病(例如，類風濕性關(guān)節(jié)炎)，炎性疾病(例如，哮喘)，神經(jīng)學疾病(例如，癲癇)，和眼科疾病(例如，糖尿病視網(wǎng)膜病變)中會有用。
發(fā)明概述本發(fā)明來自于這樣的認識許多用于組合療法中的藥物通過不同的機制和/或不同的時標起作用。因此，如果組合療法中的藥物不能到達其靶或不能在合適的時間到達其靶，則會喪失藥物的大部分藥效，如果不是全部的話。例如，在利用更傳統(tǒng)的抗腫瘤劑和抗血管生成劑組合治療癌癥時，理想的是抗腫瘤劑應該在抗血管生成劑阻止攜帶抗腫瘤劑的血流達到腫瘤細胞之前到達腫瘤以發(fā)揮其作用。如果抗腫瘤劑沒有在起作用的血管系統(tǒng)被抗血管生成劑關(guān)閉之前到達腫瘤，患者將遭受抗腫瘤劑的副作用而得不到其任何好處。因此，在癌癥以及許多其他疾病中，需要可以以不同的時間間隔遞送多種試劑的藥物遞送系統(tǒng)。
本發(fā)明提供一種藥物遞送系統(tǒng)，其中一種試劑可以在組合療法的另一種試劑之前或之后遞送。該藥物遞送系統(tǒng)基于氣球中氣球(balloonin balloon)的概念。含有藥劑的納米核心(例如，納米顆粒，納米管，納米線，量子點等)被包囊在含有其他藥劑的脂囊泡、基質(zhì)或殼中以形成納米細胞。納米細胞外部(例如，脂囊泡、殼或基質(zhì))中的藥劑首先釋放，隨后隨著納米核心溶解和/或降解釋放第二藥劑。本發(fā)明的納米細胞的最大直徑范圍從10nm到500μm，優(yōu)選最大直徑從80nm到50μm。
例如，在治療癌癥時，抗血管生成劑被負載到脂囊泡內(nèi)并且在納米顆粒內(nèi)部的抗腫瘤/化療劑之前釋放。這導致供給腫瘤營養(yǎng)的血管崩潰，并且還導致負載了抗腫瘤劑的納米核心捕獲在腫瘤內(nèi)部而沒有逃逸的途徑?？鼓[瘤劑緩慢釋放殺死營養(yǎng)饑餓的腫瘤細胞。換句話說，這種雙氣球藥物遞送系統(tǒng)允許以抗腫瘤劑負載腫瘤然后切斷對腫瘤的血液供應。這種順序方法導致有毒的化療/抗腫瘤劑捕獲在腫瘤內(nèi)，導致針對腫瘤細胞的選擇毒性增強，而更少的藥物會出現(xiàn)在全身循環(huán)系統(tǒng)中，因為這些有毒藥物不會從功能上無血管的腫瘤位置泄漏，從而使副作用減少。這種技術(shù)還克服了組織缺氧警告，因為腫瘤捕獲的細胞毒性化療細胞殺死在由于血管并關(guān)閉而產(chǎn)生的富含組織缺氧的生長因子的環(huán)境中存活的腫瘤細胞。
內(nèi)部納米顆粒(也稱作納米核心)其最大尺寸大約10-20000nm并包含包囊在聚合物基質(zhì)中的第一治療劑。這些納米核心使用例如脂類，蛋白質(zhì)，糖，簡單的結(jié)合物和聚合物(例如PLGA，聚酯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚(β-氨基酯)，聚尿素，聚氨基甲酸酯，蛋白質(zhì)等)的任何材料和本領(lǐng)域已知的方法(例如，雙乳化，噴霧干燥，相轉(zhuǎn)換等)制備。藥物或診斷劑可以裝載在納米核心上，或是共價連接，或是通過靜電荷結(jié)合，或是電共價結(jié)合，或是通過接頭結(jié)合。結(jié)果是試劑從納米核心緩慢，持續(xù)，和/或延遲釋放。優(yōu)選地，如果該試劑共價結(jié)合到納米核心，該接頭或鍵是在生理條件下可生物降解的或可水解的，例如對酶分解敏感。納米核心可以是基本上球形的納米顆粒，納米脂質(zhì)體，納米線，量子點，或納米管。
為形成納米細胞，納米核心可以涂布有分配在液相中的第二治療劑。納米細胞還可以通過用具有第二治療劑的獨特聚合物組合物涂布納米核心而形成。優(yōu)選地，納米細胞的納米殼或周圍的基質(zhì)應當包括允許其捕獲的試劑快速釋放的組合物。因此，在某些實施方案中，該試劑在裝載在納米核心中的活性劑達到治療水平以前起作用。因此，第二治療劑在納米核心的外部但是在納米細胞的脂質(zhì)膜的內(nèi)部，納米細胞最大直徑大約50-20000nm。納米細胞可以進一步涂布以穩(wěn)定顆?；?qū)邢騽┨砑拥皆擃w粒的外面。
使用本發(fā)明的納米細胞可以遞送任何兩種或更多種藥劑。優(yōu)選地，一種試劑或試劑的組合被優(yōu)選在第二試劑或試劑的組合之前遞送。在某些實施方案中，試劑的作用模式或靶可以不同。例如，在某些實施方案中，納米核心中的試劑可以抑制信號途徑，納米細胞外部隔室中的試劑產(chǎn)生不同的途徑或相同的途徑中不同的信號。這兩種試劑可以協(xié)同作用。在其他實施方案中，這些試劑的藥物動力學可能不同。例如，在治療關(guān)節(jié)炎時，氨甲蝶呤或秋水仙堿被包囊在納米核心中，而抗血管生成劑位于納米細胞的外側(cè)脂質(zhì)部分。在治療哮喘或慢性阻塞性肺疾病(COPD)時，抗炎劑(例如，皮質(zhì)類固醇，脂加氧酶抑制劑，肥大細胞穩(wěn)定劑)提供在納米核心中，而支氣管擴張劑(例如，β-激動劑)被提供在納米細胞的外部隔室。在遞送試劑到腦時，為跨越血腦屏障，在顆粒的外側(cè)部分提供允許藥物跨越血腦屏障的離液劑或其他試劑，以及神經(jīng)活化劑，例如在納米核心中提供抗癲癇發(fā)作劑。在一些實施方案中，納米細胞可以用于治療具有囊性纖維病變的患者。例如，納米細胞可以用于遞送抗生素或抗炎劑。在一些實施方案中，納米細胞用作遞送疫苗的載體，例如，抗原可以裝載在納米核心，炎性劑例如佐劑可以包含在納米細胞的外側(cè)部分。
在另一方面，本發(fā)明提供具有本發(fā)明納米細胞的藥物組合物。這些組合物還可以包含其他藥物可接受的賦形劑。這些組合物可以采取片劑、懸液、溶液、膠囊、乳劑等形式。
本發(fā)明還提供通過給藥裝載有合適藥劑的納米細胞到患某種疾病的患者而治療各種疾病的方法。這些方法包括治療癌癥，炎癥疾病，眼科疾病，神經(jīng)疾病，感染性疾病和自身免疫疾病的方法。納米細胞被裝載有一定量的試劑以遞送治療有效量的試劑并獲得所需的結(jié)果。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，納米細胞中使用的試劑和劑量以及賦形劑將取決于被治療的患者(包括腎和肝功能)，被治療的疾病，待遞送試劑的各種藥理學和藥物動力學特征，臨床環(huán)境，給藥模式等。納米細可以使用已知的任何給藥途徑給藥。在某些實施方案中，納米細胞被腸胃外遞送。在一些實施方案中，納米細胞被吸入遞送，例如，使用噴霧器，轉(zhuǎn)動推進器(spinhaler)，或盤式推進器(diskhaler)。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種分析系統(tǒng)，其允許在類似體內(nèi)環(huán)境的條件下共同或單獨地篩選抗血管生成劑和化療劑。這包括在細胞外基質(zhì)上生長的細胞，和準確模擬體內(nèi)條件。在該分析中，接種內(nèi)皮細胞并允許在腫瘤細胞接種到該組織培養(yǎng)板上之前在細胞外基質(zhì)上生長。為檢測腫瘤細胞，它們被轉(zhuǎn)染以表達熒光基因產(chǎn)物，例如綠色熒光蛋白(GFP)。內(nèi)皮細胞用熒光染料染色。本發(fā)明還提高實施本發(fā)明分析方法所需的具有必須試劑的試劑盒。
定義“佐劑”術(shù)語佐劑指免疫反應的非特異性調(diào)節(jié)劑的任何化合物。在一些優(yōu)選實施方案中，佐劑刺激免疫反應。任何佐劑可用于本發(fā)明中。大量佐劑化合物是已知的；NIH準備了許多這樣的化合物的有用的概要(也可參見Allison Dev.Bio1.Stand.923-11，1998；Unkeless等Annu.Rev.Immunol.6251-281，1998；和Phillips等，Vaccine10151-158，1992，各自在此引作參考)。
“動物”此處使用的術(shù)語動物指人以及非人的動物，包括，例如，哺乳動物，鳥，爬行動物，兩棲動物和魚。優(yōu)選地，非人動物是哺乳動物(例如，嚙齒動物，小鼠，大鼠，兔，猴，狗，貓，靈長動物或豬)。動物可以是轉(zhuǎn)基因動物。
“抗體”術(shù)語抗體指免疫球蛋白，不管是天然的或全部或部分合成制備的。其所有維持特異性結(jié)合能力的衍生物也包含在該術(shù)語中。該術(shù)語還覆蓋任何具有與免疫球蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源或大部分同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的蛋白。這些蛋白可以衍生自天然來源，或部分或全部合成制備。抗體可以是單克隆或多克隆的?？贵w可以是任何免疫球蛋白類別的成員，包括人的類型IgG，IgM，IgA，IgD，和IgE的任意成員。然而IgG類的衍生物在本發(fā)明中是優(yōu)選的。
“抗體片段”術(shù)語抗體片段指抗體的任何小于全長的衍生物。優(yōu)選地，抗體片段至少保留全長抗體的特異性結(jié)合能力的重要部分?？贵w片段的例子包括，但是不限于，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′)2，scFv，F(xiàn)v，dsFv抗體，和Fd片段?？贵w片段可以通過任何方法產(chǎn)生。例如，抗體片段可以通過使完整的抗體片段化而酶法或化學方法產(chǎn)生，或者其可以從編碼部分抗體序列的基因重組制備。替代地，抗體片段可以完全或部分合成制備?？贵w片段可以任選是單鏈抗體片段。替代地，片段可以包括多種連接在一起的鏈，例如通過二硫鍵連接。片段還可以任選是多分子復合物。功能抗體片段將通常包括至少大約50個氨基酸和更通常包括至少大約200個氨基酸。
單鏈Fvs(scFvs)是只由可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)通過肽接頭彼此共價連接組成的重組抗體片段。VL或VH可以是NH2-末端結(jié)構(gòu)域。多肽接頭長度和組成可變，只要兩個可變結(jié)構(gòu)域被橋聯(lián)而沒有嚴重的空間位阻。通常，接頭主要包括一段甘氨酸和絲氨酸殘基，而一些谷氨酸或賴氨酸殘基分布于其中以提高溶解性。
二聚抗體(Diabodies)是二聚體scFvs。二聚抗體的成分通常具有比大多數(shù)scFvs更短的肽接頭，并且它們顯示偏愛連接成為二聚體。
Fv片段是由一個VH和一個VL結(jié)構(gòu)域通過非共價相互作用連接在一起組成的抗體片段。術(shù)語dsFv此處用于表示具有工程化的分子間二硫鍵以穩(wěn)定VH-VL配對的Fv。
F(ab′)2片段是基本等同于從免疫球蛋白(通常IgG)通過用胃蛋白酶在pH4.0-4.5消化而獲得的抗體片段。該片段還可以通過重組產(chǎn)生。
Fab片段是基本等同于通過還原F(ab′)2片段中連接兩條重鏈部分的二硫橋而獲得的抗體片段。Fab′片段可以通過重組產(chǎn)生。
Fab片段是基本等同于通過用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常是IgG)而獲得的抗體片段。Fab片段可以通過重組產(chǎn)生。Fab片段的重鏈區(qū)段是Fd部分。
“與...連接”如本發(fā)明所述，當兩個實體彼此“連接”時，它們通過直接的或間接的共價或非共價的相互作用連接。優(yōu)選地，這種連接是共價的。理想的非共價相互作用包括氫鍵，范德華氏相互作用，疏水相互作用，磁性相互作用和靜電相互作用等。
“生物相容”術(shù)語“生物相容”在此用于描述對細胞無毒的化合物。如果化合物被添加到體外細胞產(chǎn)生小于或等于30％，20％，10％，5％，或1％的細胞死亡并且不誘導炎癥或其他體內(nèi)這種不期望的副作用，則化合物是“生物相容”的。
“生物可降解”此處使用的“生物可降解”化合物是那些可以當導入細胞內(nèi)時被細胞機構(gòu)分解成為或是細胞可以重新利用或是可以處置而不對細胞具有顯著毒性(即，少于大約30％，20％，10％，5％，或1％的細胞被殺死)的那些化合物。
“有效量”總的來說，活性試劑或微顆粒的“有效量”指引發(fā)所需的生物反應所需的量。正如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員可以理解的，微顆粒的有效量可以根據(jù)諸如所需的生物終點(endpoint)，待遞送的試劑，包囊基質(zhì)的組成，靶組織等因素而變化。例如，含有待遞送的抗癲癇試劑的微顆粒的有效量是導致疾病嚴重程度或癲癇發(fā)作頻率和/或不期待的電活性下降的量。在其他的例子中，含有待遞送到個體心臟的抗心律失常藥劑的微顆粒的有效量是產(chǎn)生不期待的電活性的量或頻率下降的量，或產(chǎn)生心律失常臨床指征(例如，ECG發(fā)現(xiàn))或癥狀(例如，暈厥事件)下降的量。
“納米細胞”根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“納米細胞”指其中納米核心被包圍或包囊在基質(zhì)或殼中的顆粒。換句話說，較大的顆粒中較小的顆粒，或氣球中的氣球。納米細胞優(yōu)選在納米核心具有試劑，在納米細胞的外側(cè)部分具有不同的試劑。在一些優(yōu)選實施方案中，納米細胞是脂質(zhì)體內(nèi)的納米核心。在一些實施方案中，納米核心被聚合物基質(zhì)或殼(例如，多糖基質(zhì))包圍。
“納米核心”此處使用的術(shù)語“納米核心”指納米細胞內(nèi)的任何顆粒。納米核心可以是微顆粒，納米顆粒，量子點，納米裝置，納米管，納米殼或包含在納米細胞內(nèi)合適大小的任何其他組成。優(yōu)選地，納米核心包括待更緩慢釋放的試劑或在納米細胞的外側(cè)部分的試劑釋放之后釋放的試劑。
“肽”或“蛋白質(zhì)”根據(jù)本發(fā)明，“肽”或“蛋白質(zhì)”包括一串至少三個通過肽鍵連接在一起的氨基酸。術(shù)語“肽”和“蛋白質(zhì)”可以互換使用。肽可以指單獨的肽或肽的集合。本發(fā)明的肽優(yōu)選只含有天然氨基酸，盡管也可以替代的采用本領(lǐng)域已知的非天然氨基酸(即，在自然界不存在但是可以摻入到肽鏈中的化合物)和/或氨基酸類似物。此外，本發(fā)明肽中的一個或多個氨基酸也可以被修飾，例如，通過添加化學實體例如糖基團，磷酸基團，法尼基基團，異法尼基基團，脂肪酸基團，用于結(jié)合、官能化或其他修飾等的接頭。在優(yōu)選的實施方案中，肽的修飾導致肽更穩(wěn)定(例如，體內(nèi)的半壽期更長)。這些修飾可以包括肽的環(huán)化，D-氨基酸的摻入等。這些修飾基本不應當干擾肽所需的生物活性。
“小分子”此處使用的術(shù)語“小分子”指具有相對低分子量的有機化合物，不管是天然存在的還是人工產(chǎn)生的(例如，通過化學合成)，并且不是蛋白質(zhì)，肽或核酸。通常，小分子的分子量小于大約1500g/mol。此外，小分子通常具有多個碳碳鍵。已知的天然存在的小分子包括但是不限于，青霉素，紅霉素，紫杉醇，環(huán)孢素和雷帕霉素。已知的合成小分子包括但是不限于，氨芐青霉素，甲氧西林，磺胺甲唑，和磺酰胺。
附圖簡述

圖1是納米細胞顆粒的示意圖。納米細胞在含有第二試劑的脂囊泡內(nèi)包括裝載有第一試劑的納米核心。
圖2顯示替代的組合治療策略。具有第一試劑的靶向納米顆粒與含有第二試劑的單層脂囊泡聯(lián)合使用以達到納米細胞的緩慢和快速的藥物動力學。
圖3顯示combretastatin-阿霉素納米細胞的合成及其特征。(A)阿霉素和PLGA 5050之間結(jié)合反應的示意圖。(B)使用乳劑-溶劑蒸發(fā)技術(shù)合成的納米顆粒的掃描電子顯微圖(Jeol JSM5600，3700x)，顯示異源大小的球形結(jié)構(gòu)。(C)combretastatin的結(jié)構(gòu)，其被包囊在脂質(zhì)雙層中。(D)三種納米細胞的橫截面投射電子顯微鏡圖像，獲得方法是以厚度70nm切片，用2.0％乙酸雙氧鈾染色隨后用0.1％醋酸鉛染色，然后用Philips EM410檢查。通過這一技術(shù)，納米顆粒(深色球)看起來被磷脂嵌段共聚物的白色冠狀物包圍的核。(E)使用動態(tài)激光散射篩分顯示限定大小的納米顆粒可以通過連續(xù)的超離心步驟分離，用于包囊在磷脂共聚物包膜中。(F)combretastatin和阿霉素的物理化學的釋放速率動態(tài)譜顯示combretastatin首先從納米細胞釋放，隨后游離的阿霉素釋放。地塞米松被用作內(nèi)標。顯示的數(shù)據(jù)用n＝4表示成平均值±SE。沒有可見的誤差條的數(shù)據(jù)點表示誤差小并被圖表所隱藏。***P＜0.002；#P＜0.001vs同一時間點的combretastatin濃度。
圖4顯示VEGF和HGF對體外腫瘤血管生成的影響，和PTK787(VEGF-受體拮抗劑)對體外腫瘤血管生成的影響。
圖5顯示在B16/F10骨髓瘤細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)分析中，阿霉素，沙利度胺，和combretastatin對VEGF-誘導的反應的影響。
圖6顯示在B16/F10骨髓瘤細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)分析中，阿霉素，沙利度胺，和combretastatin對HGF-誘導的反應的影響。
圖7顯示在B16/F10骨髓瘤細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞的共培養(yǎng)分析中，當鋪在膠原上時，阿霉素，沙利度胺，和combretastatin對VEGF-誘導的反應的影響。
圖8顯示在B16/F10骨髓瘤細胞和人臍靜脈內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)分析中，當鋪在膠原上時，阿霉素，沙利度胺，和combretastatin對HGF-誘導的反應的影響。
圖9顯示來自納米細胞的藥劑的短暫釋放和活性的生物分析。在3維matrigel基質(zhì)上建立GFP+黑色素瘤內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)。共培養(yǎng)物與不同的處理組孵育確定的時間段。用多聚甲醛固定細胞，用碘丙錠染色，然后用Zeiss LSM510共聚焦顯微鏡分析。用488nm和543nm激光束激發(fā)熒光染料，用505-530BP和565-615BP濾鏡以512×512象素分辨率捕獲圖像。(A)顯微圖顯示來自不同處理組的合并圖像。黑色素瘤細胞呈黃色，而成血管內(nèi)皮細胞為紅色。(B)該圖顯示被各細胞類型覆蓋的區(qū)域的立體定量。用納米細胞(NC)處理導致血管系統(tǒng)的短暫快速切除，隨后是遲發(fā)的腫瘤細胞丟失。作為對比，用脂質(zhì)體-combretastatin(250μg/ml)(L[C])或阿霉素-結(jié)合的納米顆粒(ND)(20μg/ml的阿霉素)處理的對照組分別產(chǎn)生血管系統(tǒng)或腫瘤細胞選擇性地丟失。30h NC處理的圖像被特定地選擇以顯示少數(shù)成圓形的細胞以加強共培養(yǎng)的切除，盡管在大多數(shù)圖像中明顯丟失全部細胞。從各重復試驗捕獲四個隨機圖像。數(shù)據(jù)代表來自3組獨立實驗的平均值±SEM。(C)濃度-影響曲線顯示游離阿霉素和PLGA-結(jié)合的阿霉素對B16/F10細胞的影響。[Dox]表示作為游離藥物或處于納米細胞中的藥物添加到培養(yǎng)物中的濃度。顯示的數(shù)據(jù)是重復兩個獨立試驗的平均值±SE。***P＜0.001(ANOVA，Bonferroni在post-hoc檢驗)。
圖10顯示納米細胞療法抑制B16/F10黑色素瘤和Lewis肺癌的生長。黑色素瘤和癌在C57/BL6小鼠中建立隨后皮下注射3×105GFP+BL6/F10或2.5×105Lewis肺癌細胞至脅側(cè)。(A，B)切除的腫瘤顯示納米細胞(NC)的影響對只具有阿霉素-結(jié)合的納米顆粒的納米細胞NC[D]的影響，脂質(zhì)體-combretastatin(L[C])的影響，共同注射NC[D]+L[C]的影響，包囊combretastatin和阿霉素(L[CD])的簡單脂質(zhì)體制劑的影響，和低劑量(ld)NC的影響。對照組用鹽水處理。荷有癌和黑色素瘤(50mm3)的小鼠被隨機分成6-8組，每隔一天分別用等同于50mg/kg和500□g/kg combretastatin和阿霉素的不同媒介物處理。(C，D)圖顯示不同的處理組根據(jù)對癌和黑色素瘤的最長和最短直徑的測量值計算的平均(SE)腫瘤體積。(E)圖顯示不同處理對白細胞計數(shù)的影響。在納米細胞-處理的組觀察到最小的毒性。用納米細胞(NClt)長期處理與短期處理相比沒有額外的毒性。(F)隨著時間在第5，10和24小時測量染料的水平而定量交織有熒光染料的納米細胞的分布。在第24小時，與其他血管化的組織相比，納米細胞偏愛積累在癌中是明顯的，伴隨著血液中其水平的降低。所有的數(shù)據(jù)是平均值±SEM，取決于時間點每組n＝3-5。其中誤差條不可見的數(shù)據(jù)點表示誤差小并且被圖表所隱藏。
圖11顯示納米細胞治療對腫瘤血管系統(tǒng)和調(diào)亡的影響。從接受納米細胞(NC)，只具有阿霉素-結(jié)合的納米顆粒的納米細胞NC[D]，脂質(zhì)體-combretastatin(L[C])，共注射NC[D]+L[C]，或包囊combretastatin和阿霉素(L[CD])的簡單脂質(zhì)體制劑處理的荷Lewis肺癌的動物切除腫瘤。對照組接受鹽水。在10天內(nèi)每隔一天分別使用等同于50mg/kg和500μg/kg的combretastatin和阿霉素的不同媒介物進行治療。(A)上半部分顯示用冷的甲醇固定和免疫顯色yon Willebrand因子(vWF)，血管內(nèi)皮標記物的腫瘤的橫截面。下半部分顯示不同的治療對誘導腫瘤調(diào)亡的影響。切片在10％福爾馬林中固定，并使用Texas紅標記的核苷酸處理用于TUNEL+陽性染色。相同的切片被共標記上針對HIF-1□的抗體，和使用FITC-標記的二級抗體檢測。NC治療組中合并圖像中黃色的信號顯示HIF-1α的核定位，因為TUNEL染色檢測DNA鏈斷裂，其是調(diào)亡的標記。該圖表明使用標準立體測量學技術(shù)對腫瘤橫截面計算的(B)腫瘤血管密度，(C)組織缺氧細胞百分數(shù)，和(D)調(diào)亡細胞百分數(shù)。使用Zeiss LSM510共聚焦顯微鏡捕獲所有的圖像。用488nm和543nm激光束激發(fā)熒光團，使用505-530BP和565-615BP濾鏡以512×512象素分辨率捕獲圖像。數(shù)據(jù)表示為來自三個獨立腫瘤樣品的平均值±SEM，各樣品具有多個隨機圖像。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001對對照(ANOVA，Newman-Keul氏Post Hoc檢驗)。(E)western印跡顯示不同的治療對HIF 1α和VEGF水平的影響，并且在(F&G)圖中分別定量歸一化到β-肌動蛋白。*P＜0.05對其他combretastatin-治療組。
圖12顯示脂質(zhì)體和納米細胞combretastatin和長期納米細胞治療對腫瘤生長的影響。(A)圖顯示脂質(zhì)體combretastatin和納米細胞(構(gòu)成為只包囊combretastatin和PLGA核心)被給藥到荷黑色素瘤-小鼠中的影響。當腫瘤體積達到50mm3時開始治療并且每隔一天持續(xù)5輪給藥。各制劑每次注射給藥的總combretastatin為50mg/kg。在另外的實驗中，一旦腫瘤體積達到50mm3，對荷黑色素瘤的小鼠用7個NC治療循環(huán)處理。對照動物用PBS媒介物處理，并且在第17天當腫瘤變得過大時處死小鼠。在長期治療的組中，50％的動物顯示腫瘤在28天后幾乎完全衰退，并且如圖(B)所示，剩余的動物與未治療的動物相比腫瘤體積顯著更小。
圖13顯示納米細胞治療對原發(fā)性GFP+黑色素瘤轉(zhuǎn)移到肺和肝的影響。(A)上部顯示來自不同治療組相同水平肺組織的橫截面。(B)這部分顯示來自不同治療組相同水平肝的橫截面。從用納米細胞(NC)，阿霉素-結(jié)合的納米顆粒NC[D]，脂質(zhì)體-combretastatin(L[C])，或共注射NC[D]+LC，或包囊在脂質(zhì)體中的阿霉素和combretastatin(L[CD])治療的小鼠切除上述器官。對照組用鹽水治療。組織在冰上固定于4％多聚甲醛，并用標準H&E染色。使用Zeiss LSM510共聚焦顯微鏡捕獲圖像。用488nm和543nm激光束激發(fā)熒光染料，使用505-530BP和565-615BP濾鏡以512×512象素分辨率捕獲圖像。此處顯示的合并圖像表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)移灶，其呈黃色。該圖顯示各視場的轉(zhuǎn)移灶的定量。表示的數(shù)據(jù)為來自n＝3的平均值±SEM。***P＜0.001對對照(ANOVA，Newman-Keul氏Post Hoc檢驗)。
圖14是顯示涉及阿霉素結(jié)合到PLGA 5050的詳細合成步驟的示意圖。
圖15顯示開發(fā)用于治療哮喘的納米細胞的結(jié)構(gòu)和釋放動力學譜。電子顯微圖顯示這些納米細胞的外部基質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)，其中基質(zhì)是乳糖殼。皮質(zhì)類固醇(抗炎劑)可以捕獲在納米核心內(nèi)，而支氣管擴張劑被捕獲在包圍納米核心的乳糖基質(zhì)中。該圖顯示的事實是支氣管擴張劑(沙丁胺醇)在數(shù)分鐘內(nèi)首先釋放，而皮質(zhì)類固醇(地塞米松)以緩慢持久的方式釋放。這種時序釋放可以使哮喘中狹窄的細支氣管首先被擴張使得納米核心可以滲入到更深的肺中。隨后的緩慢釋放將阻斷在急性哮喘期之后的慢性炎癥，而沙丁胺醇的快速釋放可以減輕直接癥狀。
本發(fā)明一些優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)來自于這樣的認識給藥多種試劑以治療疾病，也許有利的是在第二種試劑或試劑組合被遞送之前遞送一種試劑或試劑的組合。使用本發(fā)明的顆粒在不同的時間釋放的試劑可以具有不同作用模式，不同的靶，和/或不同的藥物動力學譜。本發(fā)明包括本發(fā)明的顆粒(納米細胞)，具有納米細胞的藥物組合物，制備納米細胞和其藥物組合物的方法，和納米細胞和藥物組合物的用法。納米細胞概念上是氣球中的氣球或顆粒(例如，脂質(zhì)體)中的顆粒(例如，納米顆粒)。
在一個實施方案中，納米細胞包含裝載有第一試劑或試劑組合的內(nèi)部(納米核心)，內(nèi)部被具有第二試劑或試劑組合的脂囊泡或基質(zhì)/殼外部包圍。外部的試劑在內(nèi)部納米核心的試劑釋放以前釋放。優(yōu)選地，納米細胞包含一個納米核心。然而在某些實施方案中，納米細胞包含一個或多個納米核心，優(yōu)選一個到一百個納米核心，更優(yōu)選一個到十個納米核心，更優(yōu)選一個到三個納米核心。在另外的實施方案中，納米細胞是內(nèi)部核心涂有外殼或基質(zhì)的顆粒。
本發(fā)明的納米細胞的核心包含至少一種包囊在基質(zhì)中的試劑?；|(zhì)優(yōu)選是生物可降解和生物相容的聚合物基質(zhì)。用于制備納米核心的聚合物包括合成聚合物和天然聚合物。用于本發(fā)明的聚合物的例子包括聚酯，聚酰胺，聚醚，聚硫醚，聚脲，聚碳酸酯，聚尿素，蛋白質(zhì)，多糖，聚芳酯等。用于納米核心的聚合物具有平均分子量從100g/mol到100,000g/mol，優(yōu)選500g/mol到80,000g/mol。在優(yōu)選實施方案中，所述聚合物是從選自下列單體合成的聚酯D，L-丙交酯，D-丙交酯，L-丙交酯，D，L-乳酸，D-乳酸，L-乳酸，乙交酯，乙醇酸，ε-己內(nèi)酯，ε-羥基己酸，γ-丁內(nèi)酯，γ-羥基丁酸，δ-戊內(nèi)酯，δ-羥基戊酸，羥丁酸，和蘋果酸。更優(yōu)選地，生物可降解聚酯是從選自下列單體合成的聚酯D，L-丙交酯，D-丙交酯，L-丙交酯，D，L-乳酸，D-乳酸，L-乳酸，乙交酯，乙醇酸，ε-己內(nèi)酯，和ε-羥基己酸。最優(yōu)選地，生物可降解聚酯是從選自下列單體合成的聚酯D，L-丙交酯，D-丙交酯，L-丙交酯，D，L-乳酸，D-乳酸，L-乳酸，乙交酯，和乙醇酸。共聚物也可以用于納米核心。共聚物包括ABA型三嵌段，BAB型三嵌段共聚物，和AB型二嵌段共聚物。所述嵌段共聚物可以具有疏水性的A嵌段(例如，聚酯)和親水性的B嵌段(例如，聚乙二醇)。
納米核心的聚合物的選擇基于活性劑的捕獲和釋放動力學。在某些實施方案中，所述納米核心上的活性劑共價聯(lián)合到納米核心的聚合物。為將待遞送的試劑共價連接到聚合物基質(zhì)，可以使用任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)通過化學法活化聚合物。活化的聚合物然后與試劑在合適的條件下混合以允許在聚合物和試劑之間形成共價鍵。在優(yōu)選實施方案中，試劑上的親核試劑，例如硫醇，羥基，或氨基進攻聚合物上的親電子試劑(例如，活化的羰基)以產(chǎn)生共價鍵。
在其他實施方案中，活性劑與納米核心的基質(zhì)通過非共價相互作用例如范德華相互作用，疏水性相互作用，氫鍵，偶極-偶極相互作用，離子相互作用和π堆積而連接。
可以使用本領(lǐng)域已知的用于制備納米顆粒的任何方法制備納米核心。這樣的方法包括噴霧干燥，乳劑-溶劑蒸發(fā)，雙乳劑，和相轉(zhuǎn)化。此外，任何的納米級顆粒，基質(zhì)，或核心可以用作納米細胞內(nèi)的納米核心。納米核心可以是，但是不限于納米殼(參見美國專利6,685,986，此處引作參考)；納米線(參見美國專利5,858,862，此處引作參考)；納米晶體(參見美國專利6,114,038，此處引作參考)；量子點(參見美國專利(6,326,144，此處引作參考)和納米管(參見美國專利6,528,020，此處引作參考)。
在制備納米核心后，它們可以通過過濾，篩分，壓擠，或超離心法以回收特定大小范圍的納米核心而被級分。一種有效的篩分方法包括擠壓納米核心的水懸浮液通過一系列具有選擇的均勻孔徑大小的聚碳酸酯膜；膜的孔徑大小將大致對應于通過膜壓擠產(chǎn)生的納米核心的最大尺寸。參見，例如美國專利4,737,323，此處引作參考。另外的優(yōu)選的方法是以規(guī)定的速度(例如，8,000，10,000，12,000，15,000，20,000，22,000和25,000rpm)連續(xù)超離心以分離規(guī)定大小的級分。在某些實施方案中，制備的納米核心在選擇的粒度范圍之內(nèi)大小基本上均勻。納米核心最大的直徑優(yōu)選在10nm到10,000nm的范圍。更優(yōu)選，納米核心最大的直徑從20到8,000nm，最優(yōu)選從50到5,000nm?？梢酝ㄟ^動態(tài)光散射和/或掃描電子顯微術(shù)分析納米核心以測定顆粒的大小。納米核心也可以測試用于裝載試劑進入納米核心。納米核心包括納米顆粒以及納米殼，納米線，量子點，和納米管。
一旦納米核心已經(jīng)制備并任選被表征，用外層例如脂質(zhì)，聚合物，糖類等涂布納米核心以形成納米細胞。納米核心可以使用本領(lǐng)域描述的任何方法涂有合成或天然存在的大分子，例如脂質(zhì)，糖類，多糖，蛋白質(zhì)，聚合物，糖蛋白，糖脂等。制備脂囊泡的各種方法已經(jīng)描述在美國專利4,235,871，4,501,728，4,837,028，PCT申請WO 96/14057，New RRC，脂質(zhì)體實用方法(LiposomesA practical approach)，IRLPress，Oxford(1990)，第33-104頁；Lasic DD，脂質(zhì)體從物理到應用(Liposomes from physics to applications)，Elsevier Science PublishersBV，Amsterdam，1993；Szoka等，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)；脂質(zhì)體(Liposomes)，Marc J.Ostro，編輯，Marcel Decker，Inc.，New York，1983，第一章；Hope等，Chem.Phys.Lip.4089(1986)；各自在此處引作參考。
任何含有本領(lǐng)域已知表面活性劑和乳化劑的脂質(zhì)適用于制造本發(fā)明的納米細胞。脂質(zhì)成分也可以是不同脂質(zhì)分子的混合物。這些脂質(zhì)可以從天然的來源提取和純化或可以在實驗室合成制備。在優(yōu)選實施方案中，所述脂質(zhì)是市場上可買到的。用于涂布納米核心的脂質(zhì)包括天然的以及合成的脂質(zhì)。所述脂質(zhì)可以化學法或生物學法改變。用于制備本發(fā)明納米細胞的脂質(zhì)包括但是不限于磷酸甘油酯；磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油酰氧基丙基三乙基銨(DOTMA)；二油酰磷脂酰膽堿；膽固醇；膽固醇酯；甘油二酯；二乙酰甘油基琥珀酸酯；心磷脂(DPPG)；hexanedecanol；脂肪醇例如聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性的脂肪酸，例如棕櫚酸或油酸；脂肪酸；脂肪酸酰胺；去水山梨糖醇三油酸酯(Span85)甘膽酸酯；表面活性素；poloxomer；山梨糖醇酐脂肪酸酯例如去水山梨糖醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷酯酰乙醇胺(腦磷酯)；心脂；磷脂酸；腦糖苷；二十六烷基磷酸酯；二棕櫚酰磷脂酰甘油；十八胺；十二烷胺；十六烷基胺；乙酰棕櫚酸酯；甘油蓖麻醇酸酯；十六烷基硬脂酸酯；十四烷酸異丙酯；泰洛沙泊；聚(乙二醇)5000-磷酯酰乙醇胺；和磷脂。所述脂質(zhì)可以是帶正電荷的，帶負電荷的，或中性的。在某些實施方案中，所述脂質(zhì)是脂質(zhì)的組合。用于制備納米細胞的磷脂包括帶負電荷的磷脂酰肌醇，磷脂酰絲氨酸，磷脂酰甘油，磷脂酸(phosphatic acid)，雙磷脂酰甘油，聚(乙二醇)-磷脂酰乙醇胺，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，二油酰磷脂酰甘油，二月桂酰磷脂酰甘油，二棕櫚酰磷脂酰甘油，二硬脂酰磷脂酰甘油，二肉豆蔻酰磷脂酸(phosphatic acid)，二棕櫚酰磷脂酸，二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸，二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸，磷脂酰絲氨酸，和其混合物。有用的兩性離子的磷脂包括磷脂酰膽堿，磷脂酰乙醇胺，鞘磷脂，卵磷脂，溶血卵磷脂，溶血磷脂酰乙醇胺，腦糖苷，二肉豆寇酰磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿，二硬脂酰磷脂酰膽堿，二反油酰磷脂酰膽堿，二油酰磷脂酰膽堿，二月桂酰磷脂酰膽堿，1-肉豆寇酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿，1-棕櫚酰-2-肉豆蔻酰磷脂酰膽堿，1-棕櫚酰-磷脂酰膽堿，1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿，二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺，二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺，腦鞘磷脂，二棕櫚酰鞘磷脂，二硬脂酰鞘磷脂，和其混合物。兩性離子的磷脂構(gòu)成任何具有可電離基團的磷脂，其中凈電荷是零。在某些實施方案中，所述脂質(zhì)是磷脂酰膽堿。
膽固醇和其它甾醇也可以引入到本發(fā)明納米細胞的脂質(zhì)外側(cè)部分以改變脂囊泡的物理性質(zhì)。用于摻入納米細胞的甾醇包括膽固醇，膽固醇衍生物，膽固醇酯，維生素D，植物固醇，麥角醇，類固醇激素，和其混合物。有用的膽固醇衍生物包括膽固醇-磷酸膽堿，膽固醇聚乙二醇，和膽固醇-SO4，而植物固醇可以是谷固醇，菜油固醇和豆固醇。甾醇有機酸衍生物的鹽形式描述于美國專利4,891,208，其在此處引作參考，可以用于本發(fā)明的納米細胞。
納米細胞的脂囊泡部分可以是多層或單層的。在某些實施方案中，所述納米核心涂布有多層脂質(zhì)膜例如脂雙層。在一些實施方案中，納米核心涂有單層脂質(zhì)膜。
衍生化的脂質(zhì)也可以用于納米細胞。添加衍生化的脂質(zhì)改變納米細胞的藥物動力學。例如，添加具有靶向劑的衍生化的脂質(zhì)可以允許納米細胞靶向到特定的細胞，腫瘤，組織，器官，或器官系統(tǒng)。在某些實施方案中，納米細胞的衍生化的脂質(zhì)組分包括不穩(wěn)定脂質(zhì)聚合物連接，例如肽，酰胺，醚，酯，或二硫連接，其能夠在選擇性的生理條件下，例如在有肽酶或酯酶或還原劑參與的情況下被切割。使用這種連接將聚合物偶聯(lián)到磷脂上，允許在給藥數(shù)小時后獲得高血液水平，此外其可能易于被RES系統(tǒng)迅速攝取。參見，例如，美國專利5,356,633，此處引作參考。納米細胞的藥物動力學和/或靶向還可以通過改變脂質(zhì)組成和比例而改變表面電荷來修飾。通過引入熱敏感的或pH敏感的脂質(zhì)(例如，基于二棕櫚酰-磷脂膽堿∶二硬脂酰磷脂膽堿(DPPC∶DSPC)的混合物)作為脂囊泡的成分，在納米細胞可以建立熱釋放或pH釋放特征。使用熱或pH敏感的脂質(zhì)允許納米細胞的脂囊泡膜成分可控的降解。
另外，本發(fā)明的納米細胞可以包含結(jié)合到外部的非聚合的分子，例如半抗原，酶，抗體或抗體片段，細胞因子，受體和激素(參見，例如，美國專利5,527,528，此處引作參考)，和其他小蛋白，多肽或非蛋白分子，其給予脂制劑以特定的酶特征或表面識別特征。用于將表面分子偶聯(lián)到脂質(zhì)的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的(參見，例如，美國專利4,762,915，此處引作參考)。
在一個實施方案中，所述脂質(zhì)溶解在合適的有機溶劑或溶劑系統(tǒng)中，并在真空或惰性氣體下干燥以形成薄的脂質(zhì)膜。任選地，膜可以復溶在合適的溶劑中，例如叔丁醇，然后凍干以形成更均勻的脂質(zhì)混合物，其處于更容易水化的粉末狀形式。所得到的膜或粉末覆蓋納米核心的含水緩沖懸浮液，并允許攪動下水化15-60分鐘。通過在更劇烈攪動條件下水化或通過添加增溶去污劑例如脫氧膽酸，所得到的多層(multiamellar)囊泡的大小分布可以轉(zhuǎn)變到較小尺寸。
在另外的實施方案中，納米核心的涂層的制備方法可以通過將用親水聚合物衍生化的脂質(zhì)擴散進入預形成的囊泡，例如將預形成的囊泡暴露于由脂質(zhì)接枝聚合物組成的納米核心/微團，其中脂質(zhì)濃度相當于納米細胞中所需的衍生化脂質(zhì)的最終克分子百分數(shù)。所述圍繞納米核心的含有親水聚合物的基質(zhì)還可以通過勻漿，脂質(zhì)場水化，或擠壓技術(shù)形成。
在另一個實施方案中，納米核心首先通過超聲波作用分散在低CMC表面活性劑，例如溶血卵磷脂，包括容易溶解疏水性分子的聚合物-接枝的脂質(zhì)。所得到的納米核心的膠束懸浮液然后用于再水化包含合適摩爾百分數(shù)的聚合物接枝的脂質(zhì)或膽固醇的干燥脂質(zhì)樣品。然后使用本領(lǐng)域已知的擠壓技術(shù)將基質(zhì)/殼和納米核心懸浮液形成進入納米細胞。通過標準柱層析將所得到的納米細胞與未包囊的納米核心分離。
在另外的優(yōu)選實施方案中，形成囊泡的脂質(zhì)被吸收在合適的有機溶劑或溶劑系統(tǒng)中，并在真空中或在惰性氣體下干燥或凍干以形成脂質(zhì)膜。待摻入到納米細胞外部室的活性劑優(yōu)選包含在形成膜的脂質(zhì)中。藥物在脂質(zhì)溶液中的濃度可以為藥物在納米細胞中的最終最大過量摩爾濃度，以使得藥物捕獲在納米細胞中的量最大化。用于水化干燥的脂質(zhì)或脂質(zhì)/藥物的含水介質(zhì)是生理相容的介質(zhì)，優(yōu)選無熱原的生理鹽水或5％葡萄糖水，用于胃腸外的補液。在水化步驟前，納米核心以均勻的方式懸浮在含水介質(zhì)中，納米核心中其它的活性劑處于所需濃度。溶液還可以與任何附加的溶質(zhì)組分以所需的溶質(zhì)濃度混合，例如水可溶性鐵螯合劑，和/或可溶性第二化合物。允許在迅速的條件(使用攪動)或緩慢條件(不攪動)下水化脂質(zhì)。脂質(zhì)水化以形成多層囊泡的懸浮液，其粒度范圍通常在大約0.5微米到10微米或更大之間。通常，泡囊的大小分布通過振動更快速水化脂質(zhì)膜可以轉(zhuǎn)變到較小的尺寸。所得到的膜雙層的結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)的疏水性(非極性的)“尾巴”朝向雙層的中心，而親水性的(極性的)“頭”朝向水相。
在另外的實施方案中，干燥的形成泡囊的脂質(zhì)，含有試劑的納米核心，和所述試劑(待裝載到納米細胞的外部室內(nèi))以合適的比例混合，被溶解在水可混溶的有機溶劑或溶劑的混合物中，如有必要則進行加溫。這種溶劑的例子是不同比例的乙醇，或乙醇和二甲亞砜(DMSO)。然后將混合物添加到足夠體積的含水受體相以致使自發(fā)形成納米細胞。如有必要含水受體相可以加溫以保持所有的脂質(zhì)在熔化狀態(tài)。所述受體相可以快速攪拌或溫和地攪拌?；旌衔锟梢酝ㄟ^小開口快速注射，或直接傾倒。在溫育數(shù)分鐘到數(shù)小時后，通過減壓，透析或滲濾除去有機溶劑，留下適于人給藥的納米細胞懸浮液。
在另外的實施方案中，以合適的量混合的干燥的形成泡囊的脂質(zhì)，待裝載到納米細胞的外部室的試劑，和裝載試劑的納米核心被溶解在具有足夠高的蒸氣壓和冰點以允許通過冷干燥(凍干)除去的合適的有機溶劑中，如有必要則進行加溫。這種溶劑的例子是叔丁醇和苯。然后所述藥物/脂質(zhì)/溶劑混合物被冷凍和置于高真空下。用于冷凍的方法的例子包括“殼-冷凍”，其中含有混合物的容器被施動或旋轉(zhuǎn)以使液體與容器壁的接觸最大化，容器置于冷卻的物質(zhì)例如液氮或與溶劑例如醇或丙酮混合的干冰中。因此混合物被快速冷凍而沒有藥物/脂質(zhì)/溶劑混合物成分的分離現(xiàn)象。通過凍干去除溶劑得到蓬松的干燥粉末。藥物/脂質(zhì)粉末在降低成分的化學降解或吸濕的條件下可以存儲延長的時間。這種條件的例子包括在干燥的惰性氣體(例如氬氣或氮氣)大氣壓下密封所述粉末，并貯材在冷處。當需要給藥所述材料時，通過添加生理性相容的含水介質(zhì)優(yōu)選無熱原的生理鹽水或5％葡萄糖水溶液而復溶。如果第二活性劑是親水性的，其還可以在這個階段添加。復溶導致自發(fā)形成納米細胞，其可以通過此處詳述的方法包括超離心，過濾和篩分改進其大小。
正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，任何的藥劑，診斷劑或預防劑可以使用本發(fā)明的藥物遞送系統(tǒng)給藥。被裝載進入納米細胞的兩個隔室的試劑將取決于不同因素包括被治療的疾病，患者，臨床環(huán)境，給藥方式，和本領(lǐng)域技術(shù)人員例如許可執(zhí)業(yè)的醫(yī)生或藥劑師所理解的其它因素。
在某些實施方案中，納米細胞的內(nèi)部部分納米核心中的試劑，比納米細胞外部部分中的試劑的釋放動力學要更緩慢。以這種方法，外部部分中的試劑被首先釋放以允許在納米核心中的試劑開始發(fā)揮作用以前發(fā)揮其作用。例如，在治療癌癥時，納米細胞的外部脂囊泡部分裝載有常規(guī)的化療劑例如甲氨蝶呤，而納米核心裝載有抗血管生成劑例如combretastatin。甲氨蝶呤被首先從納米細胞中釋放，給腫瘤的血液供應在combretastatin切斷到腫瘤的血液供應之前攜帶細胞毒性的試劑到腫瘤細胞。以這種方法，細胞毒性的試劑允許到達細胞并在抗血管生成劑切斷到腫瘤的血液供給之前發(fā)揮其細胞毒性的作用。順序遞送細胞毒性試劑繼之以抗血管生成劑優(yōu)選是協(xié)同作用的，由于用于本發(fā)明系統(tǒng)的藥物劑量更低而降低副作用。
使用本發(fā)明的納米細胞遞送的試劑包括治療劑，診斷劑或預防劑?？梢允褂眉{米細胞遞送任何待給藥到個體的化合物。所述試劑可以是小分子，有機金屬化合物，核酸，蛋白質(zhì)，肽，金屬，同位素標記的化合物，藥物，疫苗，免疫試劑等。
在優(yōu)選實施方案中，所述試劑是具有藥物活性的有機化合物。在本發(fā)明另外的實施方案中，所述試劑是一種臨床使用的藥物。在另外的實施方案中，所述試劑已經(jīng)經(jīng)美國食品藥品管理局批準用于人或其它的動物。在特別優(yōu)選實施方案中，所述藥物是抗生素，抗病毒劑，麻醉劑，類固醇試劑，抗炎劑，抗腫瘤劑，抗原，疫苗，抗體，解充血劑，抗高血壓藥，鎮(zhèn)靜劑，節(jié)育劑，孕前劑，抗膽堿能藥物，鎮(zhèn)痛劑，抗抑郁劑，抗精神病劑，β-腎上腺素能阻滯劑，利尿劑，心血管活化劑，血管作用試劑，非類固醇的抗炎劑，營養(yǎng)劑等。例如，本發(fā)明的納米細胞可以被制備以便包括一種或者多種化合物，選自以下的在突出和神經(jīng)效應劑連接位點作用的藥物(例如乙酰膽堿，醋甲膽堿，匹魯卡品，阿托品，東茛菪堿，毒扁豆堿，琥珀酰膽堿，腎上腺素，去甲腎上腺素，多巴胺，多巴酚丁胺，異丙基腎上腺素，舒喘寧，萘異丙仲胺，血清素)；對中樞神經(jīng)系統(tǒng)起作用的藥物(例如clonazepam，地西泮，氯羥去甲安定，苯佐卡因，丁哌卡因，利度卡因，四卡因，ropivacaine，阿米替林，氟苯氧丙胺，paroxetine，丙戊酸，氨甲酰氮卓，溴麥角環(huán)肽，咖啡，芬太奴，naltrexone，鈉洛酮)；調(diào)節(jié)炎性反應的藥物(例如，阿斯匹林，茚甲新，布洛芬，naproxen，類固醇，色甘酸鈉，茶堿)；影響腎和/或心血管功能的藥物(例如，速尿，thiazide，氨氯吡脒，螺旋內(nèi)酯，captopril，enalapril，lisinopril，地爾硫卓，心痛定，異搏停，地高辛，異山梨醇硝酸酯，多巴酚丁胺，利度卡因，奎尼丁，腺苷酸，洋地黃，美伐他汀，洛弗斯特丁，simvastatin，甲羥戊酸鹽酯)；影響胃腸道功能的藥物(例如，奧梅普拉佐耳，sucralfate)；抗生素(例如，四環(huán)素，林大霉素，兩性霉素B，奎寧，甲氧西林，萬古霉素，青霉素G，阿莫西林，正泰霉素，紅霉素，ciprofloxacin，細力霉素，acyclovir，疊氮胸苷(AZT)，ddC，ddI，ribavirin，氯頭孢菌素，先鋒霉素，鏈霉素，正泰霉素，托布拉霉素，氯霉素，異煙肼，fluconazole，金剛胺，干擾素)；抗癌劑(例如，環(huán)磷酰胺，甲氨蝶呤，氟尿嘧啶，阿拉伯胞嘧啶糖苷，巰基嘌呤，長春花堿，長春新堿，阿霉素，爭光霉素，絲裂霉素C，羥基脲，強的松，三苯氧胺，順鉑，decarbazine)；免疫調(diào)節(jié)劑(例如，白介素，干擾素，GM-CSF，TNFα，TNFβ，環(huán)孢素，F(xiàn)K 506，硫唑嘌呤，類固醇)；作用于血液和/或形成血液的器官的藥物(例如，白介素，G-CSF，GM-CSF，促紅細胞生成素，維生素，鐵，銅，維生素B12，葉酸，肝素，抗血凝性殺鼠劑，香豆精)；激素(例如，生長激素(GH)，促乳素，促黃體生成素，TSH，ACTH，胰島素，F(xiàn)SH，CG，抑生長素，雌激素，雄激素，孕酮，促性腺激素-釋放因子(GnRH)，甲狀腺素，三碘甲狀腺原氨酸)；激素拮抗劑；影響鈣化和骨轉(zhuǎn)化的試劑(例如，鈣，磷酸鹽，甲狀旁腺激素(PTH)，維生素D，雙膦酸酯，降鈣素，氟)，維生素(例如，核黃素，煙酸，吡哆醇，泛酸，生物素，膽堿，肌醇，肉堿，維生素C，維生素A，維生素E，維生素K)，基因治療試劑(例如，病毒載體，帶有核酸的脂質(zhì)體，DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合物，反義試劑)；或其它的試劑例如靶向劑等。
預防劑包括疫苗。疫苗可以包含分離的蛋白或肽，滅活的生物體和病毒，死的生物體和病毒，遺傳學改變的生物體或病毒，和細胞抽提物。預防劑可以與白介素，干擾素，細胞因子，和佐劑組合，所述佐劑例如霍亂菌毒素，明礬，弗氏佐劑等。預防劑包括細菌，病毒，真菌，原生動物和寄生蟲的抗原。這些抗原可以是完全殺死的生物，肽，蛋白質(zhì)，糖蛋白，糖類，或其組合的形式。
試劑可以表示已經(jīng)組合并裝載進入納米核心或納米細胞的外部脂質(zhì)部分的試劑的組合。可以使用任意的試劑組合。例如藥劑可以與診斷劑組合，藥劑可以與預防劑組合，藥劑可以與其它的藥劑組合，診斷劑可以與預防劑組合，診斷劑可以與其它的診斷劑組合，以及預防劑可以與其它的預防劑組合。在用于治療癌癥的某些實施方案中，至少兩種常規(guī)的化療劑被裝載進入納米細胞的其它脂質(zhì)部分。
在本發(fā)明的一個方面，納米細胞被制備為具有基本上均勻的在選擇的粒度范圍內(nèi)的大小。納米細胞可以被過濾，篩分，離心，超速離心，通過柱層析而分選，或擠壓以收集一定大小的顆粒。一種有效的篩分方法包括擠壓納米細胞的水懸浮液通過一系列具有選擇的均勻孔徑大小的聚碳酸酯膜；膜的孔徑大小將大致對應于經(jīng)壓擠通過膜產(chǎn)生的納米細胞的最大尺寸。參見，例如美國專利4,737,323，此處引作參考。另外的優(yōu)選的方法是通過連續(xù)超離心法以規(guī)定的速度分離規(guī)定大小的級分。
盡管納米細胞組合物優(yōu)選的使用將是腫瘤治療，不論是實體瘤還是骨髓瘤，在治療其它的基于異常血管生成的病變時包含了相同的原理。其它的病變可以包括關(guān)節(jié)炎，視網(wǎng)膜病變，銀屑癬，實體瘤，良性腫瘤，卡博氏肉瘤，和血液學惡性腫瘤。這可以包括早先描述的藥物；或例如就關(guān)節(jié)炎而論，其可以在納米核心包含疾病修飾藥物(DMARDs)，非類固醇抗炎性藥物(NSAIDS)，秋水仙堿，甲氨蝶呤等，而在圍繞的脂囊泡或聚合物殼內(nèi)包含抗血管生成劑。此外，利用納米細胞實現(xiàn)了兩種無關(guān)的活性劑之間的空間時間的釋放動力學以及藥效的協(xié)同作用，打開其用于其他病理生理狀況的可能性，在所述狀況中治療劑的這種時間的或空間的活性是需要的。這種狀況的例子可以是哮喘，其中抗痙攣的或松弛的藥物被裝載在納米殼的外側(cè)部分，而抗炎劑，例如類固醇或NSAID，被裝載在納米核心用于針對與哮喘有關(guān)的遲發(fā)炎癥反應的遲發(fā)活性，并在從納米細胞的外側(cè)部分快速釋放的活化劑已經(jīng)松弛了肺泡和/或小支氣管后發(fā)揮其作用。相似的，開啟血腦屏障的分子可以裝載在納米細胞的外側(cè)部分而中樞作用的刺激神經(jīng)的試劑可以裝載進入納米核心，導致CNS中活化劑的積累增加。納米細胞還可以用于遞送疫苗以產(chǎn)生較好的結(jié)果。例如，炎性劑例如佐劑可以被裝載進入納米細胞的外側(cè)部分，以及抗原裝載進入納米核心。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，納米細胞系統(tǒng)可用于治療多種疾病。
靶向劑納米細胞可以被修飾以包括靶向劑，因為通常合乎需要的是將藥物遞送裝置靶向到特定的細胞，收集細胞、組織或器官。將藥物組合物導向到特定的細胞的各種靶向劑是本領(lǐng)域公知的(參見，例如，Cotten等Methods Enzym.217618，1993；此處引作參考)。靶向劑可以包含在整個納米細胞中，只包含在內(nèi)部納米核心，只包含在外部脂質(zhì)或聚合物殼部分，或可以只包含在納米細胞的表面上。所述靶向劑可以是一種蛋白質(zhì)，肽，糖類，糖蛋白，脂質(zhì)，小分子，金屬等。所述靶向劑可用于靶向特定的細胞或組織或可用于促進對顆粒的胞吞或吞噬作用。靶向劑的例子包括但是不限于，抗體，抗體片段，低密度脂蛋白(LDLs)，輸鐵蛋白，asialycoproteins，人類免疫缺陷性病毒(HIV)的gp120包膜蛋白，糖類，受體配體，唾液酸等。如果靶向劑被包含在納米核心中，靶向劑可以包含在用于形成納米顆粒的混合物中。如果靶向劑只在納米細胞的表面上，靶向劑可以使用標準化學技術(shù)與形成的顆粒連接(即通過共價的、疏水的、氫鍵結(jié)合的、范德華或其他的相互作用)。
藥物組合物一旦本發(fā)明的顆粒已經(jīng)制備，它們可以與其它的藥物賦形劑組合以形成藥物組合物。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的，賦形劑的選擇可以基于如下所述的給藥途徑，被遞送的試劑，遞送試劑的時程等。
本發(fā)明的藥物組合物和其根據(jù)本發(fā)明的應用可以包括藥物可接受賦形劑或載體。此處使用的術(shù)語“藥物可接受的載體”表示無毒，惰性的固體、半固體或液體填充劑，稀釋劑，包囊材料，或任何類型的制劑助劑。可以作為藥物可接受的載體的材料的一些例子是糖例如乳糖，葡萄糖，和蔗糖；淀粉例如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物例如羧甲基纖維素鈉鹽，乙基纖維素，和醋酸纖維素；粉末黃芪膠；麥芽；明膠；滑石；賦形劑例如可可脂和栓劑蠟；油例如花生油，棉子油；紅花油；芝麻油；橄欖油；玉米油和豆油；二醇例如丙二醇；酯例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；瓊脂；去污劑例如吐溫80；緩沖劑例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原的水；等滲鹽水；Ringer氏溶液；乙醇；人工腦脊髓液(CSF)，和磷酸鹽緩沖液，以及其它無毒的相容性滑潤劑例如十二烷基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色劑，釋放劑，涂層劑，增甜劑，調(diào)味劑和香料，防腐劑和抗氧化劑也可以根據(jù)藥劑師的判斷而存在于所述組合物中。本發(fā)明的藥物組合物可以口服，直腸，胃腸外，腦池內(nèi)，陰道內(nèi)，鼻內(nèi)，腹腔內(nèi)，局部(通過粉末，乳膏，油膏，或滴劑)，透皮，皮下，含服，或作為口腔噴霧或鼻噴霧法而給藥到人和/或動物。
可注射的制劑，例如，無菌的可注射的含水或含油的懸浮液可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)使用合適的分散劑或潤濕劑和懸浮劑而配制。無菌的可注射制劑也可以是無毒的胃腸外的可接受稀釋劑或溶劑的無菌可注射溶液、懸浮液或乳液，例如，1，3-丁二醇的溶液。其中可以使用的可接受的載體和溶劑是水，Ringer氏溶液，U.S.P.和等滲氯化鈉溶液。此外，無菌的不揮發(fā)油常規(guī)用作溶劑或懸浮介質(zhì)。用于這個目的，任何無味的不揮發(fā)油可以使用，包括合成的單脂?；蚨８视椭?。此外，脂肪酸例如油酸用于制備可注射制劑。
可注射的制劑可以滅菌，例如，通過截留細菌的濾器過濾，或通過引入無菌固體組合物形式的殺菌劑，其可以在使用前溶解或分散在無菌水或其它無菌的可注射介質(zhì)中。
分析藥物組合物的方法干預實質(zhì)-間質(zhì)軸仍然是腫瘤治療有吸引力的目標。評價抗血管生成的標準方法已用于研究其對于內(nèi)皮細胞增殖，遷移，化學侵入或管生成(tubulogenesis)(這些是血管生成過程的主要步驟)的活性(Sengupta等，Circulation 107(23)2955-61，June 17，2003)。然而，這些分析受到被研究的活化的內(nèi)皮與腫瘤細胞分離這一事實的限制。這是關(guān)鍵的，因為腫瘤內(nèi)皮已經(jīng)證明顯示獨特的遺傳標志(StCroix等，Science289(5482)1197-1202，August 18，2000)。此外，標準組織培養(yǎng)技術(shù)通常不促進空間排列。實際上，在2-D系統(tǒng)生長的內(nèi)皮細胞不同于已經(jīng)發(fā)展到模擬細胞和細胞外環(huán)境之間天然相互作用的3-D模型系統(tǒng)。Shekhar等(Cancer Res.61(4)1320-26 February 15，2001)開發(fā)3-維的基于matrigeI的共培養(yǎng)模型，其中內(nèi)皮細胞與前-腫瘤乳腺上皮細胞混合以允許研究導管-胞狀物的形態(tài)發(fā)生，血管生成，以及發(fā)展為惡性的表型。Nehls和Drenclchahn(Histochem.Cell Biol.104(6)459-66，December 1995)使用基于微載體的血纖蛋白原凝膠包埋的共培養(yǎng)，而Dutt等(Tissue Eng.9(5)893-908，October 2003)使用NASA生物反應器開發(fā)3D共培養(yǎng)系統(tǒng)。Longo等(Blood 98(13)3717-26，December 15，2001)研究在3D膠原基質(zhì)上黑色素瘤細胞與單層內(nèi)皮細胞的相互作用。然而，在所有這些共培養(yǎng)試驗中，使用通常使用的抗體例如CD 31，CD 34，CD 105，vWF等，或結(jié)合到al-巖藻糖基部分的植物血凝素，并使用昂貴和耗時的標準的免疫組化方法來標記內(nèi)皮細胞。此外，對相互作用的細胞伴侶的同步可視化和分析使復雜性水平進一步增加。
本發(fā)明克服了這些限制，因為其摻入穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化的腫瘤細胞(例如，黑色素瘤細胞)以表達熒光基因產(chǎn)物(例如，綠色熒光蛋白(GFP))，而不改變具有有限壽命的原代內(nèi)皮細胞。隨后區(qū)別一步標記內(nèi)皮和腫瘤組分，允許容易地目視觀察和分析，因為合并的圖像以不同于內(nèi)皮細胞的顏色來表示腫瘤細胞(例如，腫瘤細胞為綠色，而內(nèi)皮細胞呈紅色)。
實際上，從完全缺失綠色的黑色素瘤細胞可以顯見與阿霉素溫育產(chǎn)生化療作用。此外，捕獲具有更低背景的對比度強的圖象也促進用于定量的體視學分析，這是可以容易地通過計算實現(xiàn)自動化的步驟。
用于所述分析系統(tǒng)的細胞系是任何可以穩(wěn)定地表達熒光蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化的細胞或當使用合適的波長激發(fā)時已經(jīng)被修飾以發(fā)熒光的細胞。優(yōu)選所述細胞將來自間質(zhì)來源的腫瘤(肉瘤)，或來自上皮來源的腫瘤(癌)，或畸胎瘤。來自腦癌，肺癌，胃癌，結(jié)腸癌，乳癌，膀胱癌，前列腺癌，卵巢癌，子宮癌，睪丸癌，胰腺癌，白血病，淋巴腺癌，骨癌，肌肉癌，和皮膚癌的細胞可以用于本發(fā)明的分析。優(yōu)選所述細胞將吸附到細胞培養(yǎng)皿。內(nèi)皮細胞應該來自血管系統(tǒng)，例如，動脈，靜脈，或微血管系統(tǒng)例如毛細管。所述內(nèi)皮細胞可以源自于祖細胞或干細胞。在某些實施方案中，所述內(nèi)皮細胞源自于人臍帶。
在這個研究之前報道的所有共培養(yǎng)試驗中，相互作用的細胞組分接種在一起。然而，在病理生理學中，血管生成定義為來自現(xiàn)有的血管床的新血管結(jié)構(gòu)的萌發(fā)。為更精確模擬該病理生理，在接種腫瘤細胞前本發(fā)明允許發(fā)展形成內(nèi)皮細胞的原生網(wǎng)絡(luò)。在腫瘤細胞參與的情況下，在這個方法之后觀察到脈絡(luò)網(wǎng)絡(luò)的形成顯著增加。這種新的體外模型系統(tǒng)更精確模擬腫瘤血管生成，并允許同步檢測新分子的化療和抗血管生成活性。該分析系統(tǒng)將提供獨特的工具以仔細分析實質(zhì)-間質(zhì)軸的分子間相互作用，并促進化學治療和抗血管生成的戰(zhàn)略組合方案的開發(fā)。
本發(fā)明的這些和其它方面在考慮以下實施例后將得到更深的理解，這些實施例是用來說明本發(fā)明的某些特定的實施方案，而不打算限定本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍如權(quán)利要求書中所定義。
實施例實施例1納米細胞的合成和分析(A)阿霉素結(jié)合到PLGA(圖3)。從Alkermes(Wilmington，OH)獲得丙交酯/乙交酯摩爾比50/50的聚乳酸乙醇酸(PLGA)(Medisorb5050DL4A)。這種聚合物的平均分子量被報道是61kDa，其在末端具有游離羥基和羧基。從Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)獲得阿霉素鹽酸鹽，p-硝基苯基氯代甲酸酯，和三乙胺。簡單地說，1.5g PLGA 5050DL 4A被溶解在15ml二氯甲烷中，并通過添加14mg p-硝基苯基氯甲酸酯和9.4mg(～9.6μL)吡啶至溶液中，保持在0℃冰浴(PLGA∶p-硝基苯基氯甲酸酯∶吡啶的化學計量的摩爾比＝1∶2.8∶4.7)而活化。反應在室溫中氮氛下進行3小時。用二氯甲烷稀釋所得到的溶液并用0.1％HCl和鹽水溶液洗滌。分離有機相，對無水硫酸鎂干燥，過濾，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以得到活化的PLGA聚合物?；罨腜LGA(0.4g)被溶解在3mL二甲基甲酰胺(DMF)中，并與4mg阿霉素和2.7mg(～4μL)三乙胺在室溫氮氛下反應24小時(活化的PLGA∶阿霉素∶三乙胺的化學計量摩爾比＝1∶1∶4)。通過添加冷的醚而沉淀最終結(jié)合的產(chǎn)品，用醚洗滌，過濾，并在真空下干燥。
稱重已知量的結(jié)合物并溶解在二甲基亞砜(DMSO)中。通過測量溶液在480nm(測定阿霉素吸光度的波長)的吸光度而測定結(jié)合作用的程度。使用DMSO中的一系列阿霉素濃度的吸光度標準曲線來測定結(jié)合物中的阿霉素量。結(jié)合反應的產(chǎn)量是～90％。
(B)納米核心的合成和納米核心的掃描電子顯微術(shù)(圖3B)。使用乳劑-溶劑蒸發(fā)技術(shù)配制納米核心。簡單地說，在室溫下使50mgPLGA-DOX完全溶解在2.5mL丙酮中達1小時。這時，添加0.5mL甲醇，通過使用組織勻漿器持續(xù)勻漿緩慢注射繼之以超聲波作用(Misonix，F(xiàn)armingdale，NY)一分鐘而使整個溶液乳化成PVA的水溶液(0.5g/25mL)。乳劑被添加到稀釋的PVA水溶液(0.2g/100mL)，在室溫下迅速混合3小時以蒸發(fā)所有殘余的丙酮或甲醇。通過超離心法以8,000，15,000，20,000和22,000RPMs回收納米核心尺寸組分。來自最小尺寸組分的納米核心使用手持擠壓機(Avestin，Ottawa，ONT)擠壓通過100nm膜以獲得用于包囊在納米細胞內(nèi)的納米核心。通過動態(tài)光散射(Brookhaven Instruments Corp，Holtsville，NY)以及通過SEM(圖3B和3E)確定納米核心的大小。為準備SEM，將納米核心凍干72小時，隨后少量被撒在碳篩上并用金涂布。使用Philips EM以放大率65000X分析顆粒。在合成后2小時內(nèi)使用所有納米核心以使聚集減到最小。
為制備周圍的基質(zhì)/納米殼，從Avanti Polar Lipids(Birmingham，AL)獲得膽固醇(CHOL)，卵磷脂膽堿(PC)，和二硬脂酰磷脂酰膽堿-聚乙二醇(m.w.2000)(DSPE-PEG)。從Tocris Cookson(Ellisville，MO)獲得Combretastatin A4。所有其它的試劑和溶劑是分析等級的。
通過在圓底燒瓶中將27.5mg脂質(zhì)溶解在2mL氯仿而制備PC∶CHOL∶DSPE-PEG(2∶1∶0.2摩爾)脂質(zhì)膜。12.5mg combretastatin A4以0.9∶1的藥物∶脂質(zhì)摩爾比共溶解在氯仿混合物中。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器蒸發(fā)氯仿以產(chǎn)生單層脂質(zhì)/藥物膜。在65℃振蕩一個小時后該膜重懸浮在1mL水中以使combretastatin A4優(yōu)先包囊在脂雙層中。所得到的懸浮液在65℃使用手持擠壓機(Avestin，Ottawa，ONT)被擠壓通過200nm膜以產(chǎn)生單層脂囊泡。通過動態(tài)光散射(Brookhaven Instruments Corp，Holtsville，NY)測定平均泡囊大小。通過使藥物/脂質(zhì)混合物通過含有Sephadex G-25(Pharmacia Biotech)的PD-10柱，以UV在290nm監(jiān)測combretastatin A4洗脫液而測定包囊效率。
如上所述制備PLGA-DOX納米核心，通過擠壓通過100nm膜，選擇～100nm的納米核心用于包囊在納米細胞中。在合成CHOL:PC:DSPE-PEG:Combretastatin納米細胞時，含有250μg阿霉素的納米核心被添加到含水脂質(zhì)重懸浮緩沖液中。使用TEM分析混合物以測定包囊效率。納米核心被凍干72小時，隨后少量被撒在碳篩上并用金涂布。使用Philips EM以放大率65000X分析納米核心(圖3B)。
(C)納米細胞的合成和透射電子顯微圖像(圖3C)。樣品被固定在具有5％蔗糖的2.5％戊二醛，3％多聚甲醛的0.1M二甲胂酸鈉緩沖液(pH7.4)中，包埋在低溫瓊脂糖內(nèi)，并在1％OsO4的佛羅拿-乙酸鹽緩沖液中進行后固定。以0.5％乙酸雙氧鈾的佛羅拿-乙酸鹽緩沖液(pH 6.0)將樣品整個兒染色過夜。然后脫水和包埋在epon-812樹脂中。在Leica超薄切割UCT以70nm厚度使用金剛石刀切割切片，用2.0％乙酸雙氧鈾繼之以0.1％檸檬酸鉛染色，使用Philips EM 410檢查。動態(tài)激光散射實驗也證實大小范圍在180-220nm之間(圖3D和3E)。
(D)物理化學釋放動力學研究。裝載濃縮藥物的納米細胞被懸浮在1ml PBS或缺氧細胞裂解物緩沖液中，并密封在透析袋內(nèi)(M.W.截留10,000，Spectrapor)。所述透析袋在37℃下以溫和振動溫育在20ml PBS緩沖液。以預定的時間間隔從溫育介質(zhì)中取200μl等份并冷凍存儲用于分析。釋放的藥物通過反相HPLC使用C18柱(4.5mm×150mm，Waters)以乙腈(A)和水(B)作為洗脫劑來定量。起始條件是80％A和20％B以A線性梯度15min至10％A和90％B，以線性梯度5min至0％A和100％B，以及線性梯度5min返回到起始條件，流速1ml/min。標準量的地塞米松被添加作為內(nèi)部對照用于combretastatain A4和阿霉素的絕對定量。通過在295nm監(jiān)測波長而檢測Combretastatin A4和地塞米松，并通過在480nm監(jiān)測波長而檢測阿霉素。大量combretastatin首先從納米細胞中釋放繼之以阿霉素從納米核心延長和緩釋地釋放。釋放的游離阿霉素的量比阿霉素-PLGA片段的量少，這證明是游離阿霉素和活性的阿霉素PLGA片段，而不是非阿霉素-PLGA寡聚物，起到細胞毒作用(圖3F)。
實施例2開發(fā)新的體外分析系統(tǒng)規(guī)程為安裝所述系統(tǒng)，從Cambrex購買收集自三個供體的人臍靜脈內(nèi)皮細胞，并且傳代3-6次。在補充有20％胎牛血清(FBS)和bulletkit-2(Sengupta等Cancer Res.63(23)8351-59，December 1，2003)的內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中生長細胞。對于腫瘤成分，我們使用B16/F10黑色素瘤細胞作為模式細胞系，其被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染以表達綠色熒光蛋白。表達增強的綠色熒光蛋白的質(zhì)粒(pEGFP-C2，Clontech)線性化后被脂感染(Lipofectamine 2000，Invitrogen)進入B16-F10細胞。通過800μg/mlG418選擇穩(wěn)定整合的B16-F10細胞克隆。通過流式細胞術(shù)和表熒光顯微鏡法進一步證實G418抗性克隆的綠色熒光。GFP-B16/F10細胞通常培養(yǎng)在補充有5％的DMEM中。無菌的玻璃蓋玻片(Corning)被涂有matrigel(從鼠Englebreth-Holms肉瘤提取的細胞外基質(zhì)，1∶3稀釋在磷酸鹽緩沖液鹽水中；Becton Dickinson)或膠原(來自大鼠尾部的I型膠原，BectonDickinson)。同步化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞被胰蛋白酶消化，并以2×104細胞每孔的密度鋪在蓋玻片上。細胞被允許在補充有20％胎牛血清的內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中粘附24小時。在這一時間點，用補充有1％血清的EBM置換培養(yǎng)基，表達綠色熒光蛋白的B16/F10細胞以×103細胞每孔的密度添加到系統(tǒng)中。共培養(yǎng)物允許溫育過夜，隨后對培養(yǎng)基進行不同的處理。在處理24小時后，細胞被固定在多聚甲醛(4％于冰上，20min)，用碘化丙錠染色。蓋玻片配以抗褪色(antifade)，用LSM510 Zeiss共聚焦顯微鏡分析。使用488nm和543nm激光線激發(fā)熒光染料，使用505/30nm和565/615帶通濾波器捕獲發(fā)射光。以512×512像素分辨率捕獲圖像。使用平面控制點計數(shù)法和224-交點直角網(wǎng)對被內(nèi)皮細胞或GFP-BL 6/F10細胞覆蓋的面積進行定量。數(shù)據(jù)表示為各組分與被細胞覆蓋的總面積的比例。
VEGF和HGF對體外腫瘤血管生成的影響(圖4)內(nèi)皮細胞在鋪在matrigel(1∶3稀釋)上24小時之內(nèi)形成有限數(shù)量的管狀網(wǎng)絡(luò)。然而，添加腫瘤細胞以建立共培養(yǎng)加速了血管生成過程。GFP+腫瘤細胞被可視化以濃縮成被血管網(wǎng)絡(luò)圍繞和整合的簇。同時添加VEGF和HGF/SF導致血管網(wǎng)絡(luò)的顯著增加。為證實系統(tǒng)的靈敏度以說明特定途徑的調(diào)節(jié)，我們使用VEGF受體拮抗體，PTK787。象期望的那樣，VEGF-誘導的血管生成被PTK787阻斷，PTK787的濃度對HGF/SF誘導的反應沒有影響(圖4)。
Combretastatin，反應停和阿霉素對VEGF-或HGF/SF誘導的反應的影響(圖5和6)如圖5所示，用阿霉素(10-50μM)溫育產(chǎn)生腫瘤細胞以濃度依賴的方式選擇性地切除。即使在使用的最高濃度(50mM)，也沒有對VEGF-誘導的內(nèi)皮網(wǎng)絡(luò)明顯的作用。比較起來，反應停和combretastatin產(chǎn)生VEGF-誘導的血管網(wǎng)絡(luò)的崩潰而不影響腫瘤細胞。
類似于VEGF誘導的共培養(yǎng)試驗，在有HGF/SF參與的情況下，阿霉素產(chǎn)生選擇性誘導腫瘤細胞死亡(圖6)。然而，與VEGF相反，在有反應?；騝ombretastatin參與的情況下，HGF/SF阻止內(nèi)皮細胞網(wǎng)絡(luò)的切除(圖6)。VEGF-誘導的血管生成的敏感性和HGF/SF針對這兩種間接的抗血管生成的保護作用表明在被兩種生長因子誘導的細胞內(nèi)信號水平的功能性差異。
膠原基質(zhì)對VEGF-或HGF-誘發(fā)腫瘤反應的影響(圖7-8)鋪在膠原基質(zhì)上的內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)平坦的“鵝卵石”形態(tài)，其不同于當鋪在matrigel上時形成的管狀網(wǎng)絡(luò)。此外，黑色素瘤細胞也呈現(xiàn)“散開的”形態(tài)，形成粘著斑，并且不形成在matrigel上顯見的細胞簇。用阿霉素溫育在VEGF-和HGF/SF-處理的共培養(yǎng)中誘發(fā)腫瘤細胞死亡(圖7，8)。如圖7所示，combretastatin和反應停抑制VEGF的血管生成作用。有趣的是，當細胞平鋪在matrigel上時觀察到HGF/SF的保護作用，但當細胞被被平鋪在膠原上時，該作用消失，反應停和combretastatin均誘發(fā)內(nèi)皮細胞死亡(圖8)。這些發(fā)現(xiàn)強調(diào)需要在篩選抗血管生成治療時摻入細胞外的組分。
實施例3裝載藥物的納米細胞的體外效力(圖9)無菌的玻璃蓋玻片(Corning)被涂有matrigel(從鼠Englebreth-Holms肉瘤提取的細胞外基質(zhì)，1∶3稀釋在磷酸鹽緩沖液鹽水中；Becton Dickinson)或膠原(來自大鼠尾部的I型膠原，BectonDickinson)。同步化的人臍靜脈內(nèi)皮細胞被胰蛋白酶消化，并以2×104細胞每孔的密度鋪在蓋玻片上。細胞被允許在補充有20％胎牛血清的內(nèi)皮細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基中粘附24小時。在這一時間點，用補充有1％血清的EBM置換培養(yǎng)基，表達綠色熒光蛋白的B16/F10細胞以×103細胞每孔的密度添加到系統(tǒng)中。允許共培養(yǎng)物溫育過夜，隨后對培養(yǎng)基進行不同的處理。在處理24小時后，細胞被固定在多聚甲醛(4％于冰上，20min)，用碘化丙錠染色。蓋玻片配以抗褪色，用LSM510 Zeiss共聚焦顯微鏡分析。使用488nm和543nm激光線激發(fā)熒光染料，使用505/30nm和565/615帶通濾波器捕獲發(fā)射光。以512×512像素分辨率捕獲圖像。使用平面控制點計數(shù)法和224-交點直角網(wǎng)對被內(nèi)皮細胞或GFP-BL6/F10細胞覆蓋的區(qū)域進行定量。數(shù)據(jù)表示為各組分與被細胞覆蓋的總面積的比例。
如統(tǒng)計圖表所示，用裝載阿霉素的納米核心溫育導致黃黑素瘤細胞選擇性丟失而不影響血管生成結(jié)果。比較起來，用捕獲在周圍脂類基質(zhì)中的combretastatin溫育導致血管網(wǎng)絡(luò)選擇性丟失，顯示其針對內(nèi)皮細胞的選擇性。當用combretastatin和裝載阿霉素的納米細胞培育共培養(yǎng)物，其首先導致內(nèi)皮細胞的迅速死亡，隨后整個共培養(yǎng)物完全丟失。這顯示在接近模擬病理生理的模仿中，周圍基質(zhì)中的活化劑(在該情況下是Combretastatin)在該活化劑連接到納米核心(對于該實施例為阿霉素)前被釋放，強調(diào)來自于使用納米細胞的空間-時間作用，和因為其導致完全切除腫瘤而產(chǎn)生較好的效力。
實施例4體內(nèi)腫瘤模型(圖10)雄性的C57/BL6小鼠(20g)被注射3×105YFP-BL6/F10細胞或2.5×105Lewis肺癌細胞至側(cè)腹。定期地監(jiān)測腫瘤的生長。當腫瘤體積達到50或150mm3時，小鼠被隨機分成不同的治療組。每隔一天通過尾部靜脈進行給藥，施用3-7次。每天測量腫瘤大小，根據(jù)以下公式計算出腫瘤體積體積＝3.14/6×長度×寬度2。
在特定時間點處死動物(參見圖10和12)，拍攝腫瘤的總體形態(tài)，并切除腫瘤用于組織病理學分析。同時，通過心臟穿刺抽取1ml血液，分析治療方案的毒性譜，因為白血細胞計數(shù)對化學治療的作用最敏感。
照片顯示與納米細胞治療組的比較，不同的藥物制劑和組合對小鼠黑色素瘤生長的影響。用阿霉素-納米核心和納米脂質(zhì)-捕獲的Combretastatin治療導致腫瘤增殖的減少，當彼此結(jié)合時具有疊加效應。然而，當以納米細胞制劑給藥時，結(jié)果顯著優(yōu)于任何對比組。這支持我們的假設(shè)納米細胞在破壞血管系統(tǒng)前遞送dox-納米核心至腫瘤。
該圖顯示不同治療對血球分類計數(shù)和氧血紅蛋白水平的影響。觀察到納米細胞治療組具有最小的毒性，盡管其是最有效的，該事實表明化療劑(阿霉素)被捕獲在腫瘤內(nèi)而更少量能夠滲漏進入體循環(huán)，因為血管在化療劑從納米核心釋放前已經(jīng)崩潰。
實施例5不同治療對腫瘤新生血管的影響(圖11)用納米核心-阿霉素(ND)治療對血管系統(tǒng)或血管密度沒有影響(見圖)，而納米脂質(zhì)-膠束Combretastatin(LC)降低血管密度以及使血管系統(tǒng)崩潰。盡管ND+LC是協(xié)同作用的，但在該組和使用納米細胞完成的組之間無顯著的差異。這是預期的，因為在兩個組中，LC被預期比ND更早起作用。
實施例6不同治療對腫瘤細胞凋亡的影響(圖12)經(jīng)歷凋亡的細胞被染為紅色，因為它們是TUNEL陽性的。盡管LC+ND和納米細胞治療組對腫瘤血管系統(tǒng)具有相同的影響，可以顯見后者在腫瘤中誘發(fā)更大的細胞凋亡。這解釋了在納米細胞治療組觀察到更好的治療結(jié)果，并且支持這樣的假設(shè)作為LC介導的腫瘤血管崩潰的結(jié)果，阿霉素從被捕獲在腫瘤內(nèi)部的納米核心釋放。比較起來，LC+ND治療的切片顯示較少的細胞凋亡，因為在大量ND進入腫瘤基質(zhì)前血管已經(jīng)崩潰。
實施例7不同治療對轉(zhuǎn)移的影響(圖13)黑色素瘤是一種攻擊性的腫瘤，其自發(fā)轉(zhuǎn)移到肝臟和肺，和其它器官。我們通過評價這些器官中轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)量而評價不同治療條件對轉(zhuǎn)移到肺(上部圖組)和肝臟(下部圖組)的影響。這通過計算綠色熒光陽性淋巴結(jié)的數(shù)量來完成，盡管在統(tǒng)計圖表中它們因為綠色熒光與從所有用標記核的染料標記的細胞發(fā)射的紅色融合而表現(xiàn)為黃色。如所示的那樣，用納米細胞治療阻止轉(zhuǎn)移到所述兩個器官。
實施例8組織分布研究納米細胞被合成為裝載有熒光素染色。將納米細胞通過SephadexG25柱而除去游離熒光素。熒光素-納米細胞被注射至荷腫瘤的小鼠。在給藥后5，10和24小時處死動物。在尸檢過程中收集血清，腫瘤，肝臟，肺和脾，從這些組織中用甲醇提取熒光素。使用熒光讀板機檢測各樣品中的熒光素的量，并對組織重量歸一化。納米細胞清楚地積累在腫瘤內(nèi)，而不積累在其它器官系統(tǒng)(圖10F)。
實施例9用于治療哮喘的納米細胞圖15顯示開發(fā)用于治療哮喘的納米細胞的結(jié)構(gòu)和釋放動力學譜。電子顯微照片顯示納米細胞的超顯微結(jié)構(gòu)，其中生物可降解-納米核心被涂布乳糖殼。皮質(zhì)類固醇(抗炎劑)被捕獲在納米核心內(nèi)，而支氣管擴張被誘捕在圍繞納米核心的乳糖基質(zhì)中。該圖顯示的事實是支氣管擴張劑(柳丁氨醇)在數(shù)分鐘內(nèi)被首先釋放，而皮質(zhì)類固醇(地塞米松)以緩慢延遲的方式釋放。這種時間釋放將首先使哮喘期間收縮的細支氣管擴張以允許納米核心滲透進入肺的深部。隨后的緩慢釋放將阻斷在急性哮喘事件之后的慢性炎癥。
其它的實施方案前文已經(jīng)描述了本發(fā)明的某些非限制性的優(yōu)選實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解對以上描述可以進行各種變化和修飾而不背離在權(quán)利要求中定義的本發(fā)明的精神或范圍。
權(quán)利要求
1.一種顆粒，包含位于脂囊泡內(nèi)的納米顆粒，其中納米顆粒包含第一試劑；以及脂囊泡包含第二試劑。
2.一種顆粒，包含包囊在基質(zhì)中的納米顆粒，其中納米顆粒包含第一試劑；以及基質(zhì)包含第二試劑。
3.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是多種試劑的組合。
4.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第二試劑是多種試劑的組合。
5.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中所述試劑是藥劑、診斷劑或預防劑。
6.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中所述試劑是藥劑。
7.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑和第二試劑的作用模式不同。
8.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑和第二試劑的藥物動力學不同。
9.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑和第二試劑的細胞靶不同。
10.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑和第二試劑的分子靶或細胞靶不同。
11.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一和第二藥劑各自獨立地是小分子，多核苷酸，反義試劑，RNAi，多糖，寡糖，糖類，脂質(zhì)，蛋白質(zhì)，肽，金屬，有機化合物，有機金屬化合物，或無機化合物。
12.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第二藥劑比第一藥劑更快起作用。
13.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一藥劑是抗腫瘤劑或細胞毒試劑，而第二藥劑是抗血管生成劑。
14.權(quán)利要求13所述的顆粒，其中抗腫瘤劑選自烷基化劑，抗代謝物，天然產(chǎn)物，抗生素，酶，類固醇，和有機金屬絡(luò)合物。
15.權(quán)利要求13所述的顆粒，其中抗腫瘤劑選自二氯甲二乙胺，環(huán)磷酰胺，異環(huán)磷酰胺，美法侖，瘤可寧，六甲密胺，硫替派，白血福恩，卡莫司汀，環(huán)己亞硝脲，賽氮芥，鏈脲霉素，甲氮咪胺，順鉑，卡鉑，米爾法蘭，二氯甲二乙胺，雙氯乙基亞硝基脲，氯乙基-環(huán)己基亞硝基脲，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶(5FU)，阿糖胞苷，6-巰基嘌呤，6-硫鳥嘌呤，F(xiàn)udR，噴司他丁，羥基脲，阿霉素，爭光霉素，絲裂霉素C，放線菌素，紫杉醇，epothilone，長春新堿，長春堿，依托泊甙，替尼泊甙，放線菌素D，柔紅霉素，阿霉素，普卡霉素，L-天冬酰胺酶，肝素酶，軟骨素酶，干擾素α，干擾素β，干擾素γ，腫瘤壞死因子，米托蒽醌，雙氯乙基亞硝基脲，4-二甲基-表鬼臼脂素亞乙基，強的松，二乙基己烯雌酚，甲羥基孕酮，他莫昔芬，普魯芐肼，氨基苯乙哌啶酮，孕激素，雄激素，抗雄激素，亮丙瑞林，蛋白酶體抑制劑，PS 341，HSP 90抑制劑，格爾德霉素，組蛋白脫乙?；敢种苿偷鞍准っ敢种苿?。
16.權(quán)利要求13所述的顆粒，其中抗血管生成劑直接作用于內(nèi)皮細胞以抑制血管生成。
17.權(quán)利要求13所述的顆粒，其中抗血管生成劑選自血管他丁，avastin，arrestin，canstatin，combretastatin，內(nèi)皮他丁，NM3，血小板反應蛋白，tumstatin，2-甲氧雌甾二醇，2-甲氧雌甾二醇衍生物，vitaxin，和其衍生物。
18.權(quán)利要求13所述的顆粒，其中抗血管生成劑分類為間接作用。
19.權(quán)利要求18所述的顆粒，其中間接作用的抗血管生成劑選自EGF受體酪氨酸激酶抑制劑，VEGF受體拮抗體，HER-2/neu受體酪氨酸激酶抑制劑，PDGF受體拮抗體，MAPK途徑抑制劑，和PI3K途徑抑制劑。
20.權(quán)利要求18所述的顆粒，其中間接作用的抗血管生成劑選自Iressa，ZD 6474，Tarceva，Erbitux，PTK 787，SU 6668，Herceptine，干擾素α，和SU 11248。
21.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是抗炎劑，而第二試劑是抗血管生成劑。
22.權(quán)利要求21所述的顆粒，其中抗炎劑選自非類固醇抗炎藥物，類固醇，脂加氧酶抑制劑，和肥大細胞穩(wěn)定劑。
23.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是抗炎劑，而第二試劑是支氣管擴張劑。
24.權(quán)利要求23所述的顆粒，其中抗炎劑選自非類固醇抗炎藥物，類固醇，脂加氧酶抑制劑，和肥大細胞穩(wěn)定劑。
25.權(quán)利要求23所述的顆粒，其中支氣管擴張劑是β-腎上腺素受體激動劑。
26.權(quán)利要求23所述的顆粒，其中第一試劑是皮質(zhì)類固醇，而第二試劑是β-腎上腺素受體激動劑。
27.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是緩解病情抗風濕藥物(DMARD)，而第二試劑是抗血管生成劑。
28.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是生長因子，而第二試劑是另一種不同的生長因子，以及其中生長因子的空間/時間釋放導致信號途徑的協(xié)同調(diào)節(jié)。
29.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑抑制信號途徑，而第二試劑影響不同的途徑或相同途徑中不同的信號。
30.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是神經(jīng)刺激劑，而第二試劑是離液劑。
31.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑是神經(jīng)刺激劑，而第二試劑使血腦屏障更有滲透性。
32.權(quán)利要求30所述的顆粒，其中第二試劑使血腦屏障對第一試劑更容易滲透。
33.權(quán)利要求2所述的顆粒，其中基質(zhì)包含多糖，糖類，蛋白質(zhì)，聚合物，糖蛋白，糖脂，或其衍生物或組合。
34.權(quán)利要求33所述的顆粒，其中糖類選自乳糖，葡萄糖胺聚糖，蔗糖，麥芽糖，半乳糖，葡萄糖，鼠李糖，唾液酸，淀粉，纖維素，及其衍生物和組合。
35.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆粒最大維度的大小范圍從5-10,000nm。
36.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆粒最大維度的大小范圍從10-800nm。
37.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆粒最大維度的大小范圍從10-500nm。
38.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆粒最大維度的大小范圍從50-250nm。
39.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆粒是納米線，量子點，或納米管。
40.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆?；旧鲜枪腆w而不是脂質(zhì)體。
41.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中顆粒最大維度的大小范圍從10nm到500,000nm。
42.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中顆粒最大維度的大小范圍從50nm到100μm。
43.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中顆粒最大維度的大小范圍從500nm到50μm。
44.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中顆粒最大維度的大小范圍從20nm到1000nm。
45.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中顆粒最大維度的大小范圍從50nm到1000nm。
46.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中顆粒最大維度的大小范圍從50nm到500nm。
47.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中納米顆粒包含聚合物。
48.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是生物相容性的。
49.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是生物可降解的。
50.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是天然聚合物。
51.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是合成聚合物。
52.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物選自聚酯，聚酰胺，聚碳酸酯，聚氨基甲酸酯，聚脲，聚醚，聚硫醚，和聚胺。
53.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是共聚物。
54.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物從選自以下的單體合成D，L-丙交酯，D-丙交酯，L-丙交酯，D，L-乳酸，D-乳酸，L-乳酸，乙交酯，乙醇酸，ε-己內(nèi)酯，ε-羥基己酸，γ-丁內(nèi)酯，γ-羥基丁酸，δ-戊內(nèi)酯，δ-羥基戊酸，羥丁酸和蘋果酸。
55.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是聚乙二醇。
56.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物選自聚(磷酸酯)，聚(亞磷酸酯)，聚(膦酸酯)，用聚(羧酸)改性的聚(磷酸酯)，聚(苯基新羧酸亞磷酸酯)，環(huán)狀環(huán)亞烷基磷酸酯，環(huán)狀亞芳基磷酸酯，聚羥基氯丙基磷酸-磷酸酯，二次膦酸酯，聚(苯基膦酸酯)，聚(三苯二甲酸膦酸酯)(poly(terphthalate phosphanates))，聚(胺基羧酸)，磷酸的直鏈飽和聚酯，聚酯膦酸酯，具有含磷部分的聚亞芳基酯，或聚(磷酸酯-氨基甲酸乙酯)，聚(磷酸酯)，聚(亞磷酸酯)，和聚(膦酸酯)。
57.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中聚合物是PLGA。
58.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑在整個納米顆粒中發(fā)現(xiàn)。
59.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中第一試劑只在納米顆粒內(nèi)部發(fā)現(xiàn)，而不在納米顆粒的表面上發(fā)現(xiàn)。
60.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中第一試劑共價連接到聚合物。
61.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中所述試劑與聚乙二醇結(jié)合。
62.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中第一試劑電共價連接到聚合物。
63.權(quán)利要求47所述的顆粒，其中第一試劑通過接頭偶聯(lián)到聚合物。
64.權(quán)利要求63所述的顆粒，其中接頭對酶的切割敏感。
65.權(quán)利要求64所述的顆粒，其中在第一試劑作用位點，接頭對酶切割敏感。
66.權(quán)利要求1所述的顆粒，其中脂囊泡還包含選自以下的脂類磷酸甘油脂；磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)；二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)；二油酰氧基丙基三乙基銨(DOTMA)；二油酰磷脂酰膽堿；膽固醇；膽固醇酯；二酰甘油；二?；视顽晁狨ィ浑p磷脂酰甘油(DPPG)；己烷癸醇；己烷癸醇，1，2-二?；?sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)]，其中所述?；嵌王＃仓?，二棕櫚酰，或二肉豆蔻酰，和其中所述聚乙二醇范圍從350到5000g/mol；聯(lián)乙炔磷脂；脂肪醇；聚乙二醇(PEG)；聚氧乙烯-9-月桂基醚；表面活性的脂肪酸；棕櫚酸；油酸；脂肪酸；脂肪酸酰胺；去水山梨糖醇三油酸酯(Span 85)甘氨膽酸；表面活性素；poloxomer；去水山梨糖醇脂肪酸酯；去水山梨糖醇三油酸酯；卵磷脂；溶血卵磷脂；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰肌醇；鞘磷脂；磷酯酰乙醇胺(腦磷酯)；心脂；磷脂酸；腦糖苷；二十六烷基磷酸酯；二棕櫚酰磷脂酰甘油；十八胺；十二烷胺；十六烷基胺；乙酰棕櫚酸酯；甘油基蓖麻醇酸酯；十六烷基硬脂酸酯；異丙基豆蔻酸酯；泰洛沙泊；聚(乙二醇)5000-磷酯酰乙醇胺；磷脂；官能化磷脂；1，2-二油酰-sn-甘油基-3-琥珀酸酯；磷脂酰肌醇；磷脂酰絲氨酸；磷脂酰甘油；磷脂酸；雙磷脂酰甘油；聚(乙二醇)-磷脂酰乙醇胺；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油；二油酰磷脂酰甘油；二月桂酰磷脂酰甘油；二棕櫚酰磷脂酰甘油；二硬脂酰磷脂酰甘油；二肉豆蔻酰磷脂酸；二棕櫚酰磷脂酸；二肉豆蔻酰磷脂酰絲氨酸；二棕櫚酰磷脂酰絲氨酸；磷脂酰絲氨酸；兩性離子的磷脂；磷脂酰膽堿；磷脂酰乙醇胺；鞘磷脂；卵磷脂；溶血卵磷脂；溶血磷脂酰乙醇胺；腦糖苷；二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿；二棕櫚酰磷脂酰膽堿；二硬脂酰磷脂酰膽堿；二反油酰磷脂酰膽堿；二油酰磷脂酰膽堿；二月桂酰磷脂酰膽堿；1-肉豆寇酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿；1-棕櫚酰-2-肉豆寇酰磷脂酰膽堿；1-棕櫚酰-磷脂酰膽堿；1-硬脂酰-2-棕櫚酰磷脂酰膽堿；二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺；二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺；腦鞘磷脂；二棕櫚酰鞘磷脂；二硬脂酰鞘磷脂)；陽離子脂類；甾醇；膽固醇；膽固醇衍生物；膽固醇酯；維生素D；植物固醇；類固醇激素；膽固醇-磷酸膽堿，膽固醇聚乙二醇；膽固醇-SO4；植物固醇；谷固醇；camposterol；豆固醇；和其混合物。
67.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中一個納米顆粒被包含在顆粒中。
68.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中超過一個納米顆粒被包含在顆粒中。
69.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中所述顆粒被涂布。
70.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中所述顆粒被涂布有聚乙二醇。
71.權(quán)利要求1或2所述的顆粒，其中所述顆粒還包含靶向劑。
72.權(quán)利要求71所述的顆粒，其中靶向劑選自抗體，抗體片段，受體，糖蛋白，和多糖。
73.一種藥物組合物，包含治療有效量的權(quán)利要求1或2所述的顆粒。
74.權(quán)利要求73所述的藥物組合物，還包含藥物可接受的賦形劑。
75.一種制備顆粒的方法，所述顆粒包含位于脂囊泡內(nèi)納米顆粒，所述方法包括以下步驟提供包含第一試劑的納米顆粒；提供脂類；提供第二試劑；和在含有第二試劑的脂囊泡內(nèi)包囊納米顆粒。
76.權(quán)利要求75所述的方法，其中所述提供納米顆粒的步驟包括以下步驟提供聚合物；提供第一藥劑；和通過噴霧干燥，雙乳劑技術(shù)，相轉(zhuǎn)化技術(shù)制備納米顆粒。
77.一種給藥顆粒的方法，所述顆粒包含位于脂囊泡內(nèi)的納米顆粒，所述方法包括以下步驟提供顆粒，其中所述顆粒包含納米顆粒，所述納米顆粒具有包囊在脂囊泡內(nèi)的第一試劑，該脂囊泡裝載有第二試劑；和給藥治療有效量的顆粒到需要的受試者。
78.權(quán)利要求77所述的方法，由此兩種試劑被同時給藥但是獲得順序的時間或空間效應。
79.權(quán)利要求77所述的方法，由此試劑被同時給藥但是獲得順序的時間或空間效應，且至少一種試劑的毒性被降低。
80.權(quán)利要求77所述的方法，由此試劑被同時給藥但是獲得順序的時間或空間效應，且至少一種試劑的效力被提高。
81.權(quán)利要求77所述的方法，由此至少一種試劑在作用位置的效力被提高，和至少一種試劑的全身性毒性被降低。
82.權(quán)利要求80所述的方法，其中效力的增加是由于試劑生物利用度的增加。
83.權(quán)利要求77所述的方法，其中兩種試劑的作用是協(xié)同的。
84.權(quán)利要求77所述的方法，由此至少一種試劑活性的增強是由于試劑靶向造成病理體況的不同步驟或事件。
85.權(quán)利要求77所述的方法，由此至少一種試劑活性的增強是由于試劑在作用位置的局部生物利用度增加，其中局部生物利用度增加是由于另一種試劑的活性。
86.權(quán)利要求77所述的方法，由此至少一種試劑毒性的降低是由于作用位置的局部生物利用度增加，而局部生物利用度的增加是由于另一種試劑的活性引起的。
87.權(quán)利要求77所述的方法，由此至少一種試劑毒性的降低是由于全身性生物利用度的降低，其中所述降低是由于另一種試劑的活性。
88.權(quán)利要求77所述的方法，其中給藥步驟包括以口服，胃腸外，靜脈內(nèi)，吸入，肌內(nèi)，皮下，直腸，鞘內(nèi)，鼻，陰道，皮內(nèi)，粘膜，或透皮的方式給藥所述顆粒。
89.權(quán)利要求77所述的方法，其中給藥步驟包括使用霧化器，轉(zhuǎn)動推進器或盤式推進器給藥所述顆粒。
90.一種治療癌癥的方法，所述方法包括以下步驟提供權(quán)利要求1，2，13，14，15，16，17，18，19或20的顆粒；和給藥治療有效量的顆粒到患有癌癥的受試者。
91.一種治療關(guān)節(jié)炎或強直性脊柱炎的方法，所述方法包含以下步驟提供權(quán)利要求1，2，21，22，或27的顆粒；和給藥治療有效量的顆粒到患有關(guān)節(jié)炎或強直性脊柱炎的受試者。
92.一種治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)紊亂的方法，所述方法包括以下步驟提供權(quán)利要求1，2，30，31或32的顆粒；和給藥治療有效量的顆粒到患有CNS紊亂的受試者。
93.權(quán)利要求92所述的方法，其中CNS紊亂是癲癇；而第一治療劑是抗癲癇發(fā)作試劑。
94.一種治療哮喘或慢性阻塞性肺病(COPD)的方法，所述方法包含以下步驟提供權(quán)利要求1，2，23，24，25，或26的顆粒；和給藥治療有效量的顆粒到患有哮喘的受試者。
95.一種治療銀屑癬的方法，所述方法包括以下步驟提供權(quán)利要求1，2，21或22的顆粒，其中第一試劑是抗銀屑癬試劑；和第二試劑是抗血管生成劑；和給藥治療有效量的顆粒到患有銀屑癬的受試者。
96.一種治療視網(wǎng)膜病變的方法，所述方法包括以下步驟提供權(quán)利要求1或2的顆粒，其中第一試劑是抗血管生成劑，而第二試劑是吸收促進劑；和給藥治療有效量的顆粒到患有視網(wǎng)膜病變的受試者。
97.一種分析藥劑的方法，所述方法以下步驟提供至少一種穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染以表達熒光蛋白質(zhì)的腫瘤細胞；提供至少一種原代內(nèi)皮細胞；提供細胞外基質(zhì)，腫瘤和內(nèi)皮細胞在其上生長；提供測試化合物；將測試化合物與在基質(zhì)上生長的細胞接觸；和檢測熒光蛋白質(zhì)表達的改變。
98.權(quán)利要求97所述的方法，其中在腫瘤細胞被接種在基質(zhì)上之前，內(nèi)皮細胞被接種在細胞外基質(zhì)上。
99.權(quán)利要求97所述的方法，其中檢測的步驟包括用活體染料使細胞染色。
100.權(quán)利要求97所述的方法，其中檢測的步驟包括用熒光染料使細胞染色，其中染料的發(fā)射與熒光蛋白質(zhì)的不同。
101.權(quán)利要求99所述的方法，其中染料是碘化丙錠。
102.權(quán)利要求97所述的方法，其中檢測的步驟包括使用落謝熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡方法，體視學或微量培養(yǎng)板讀板機分析和定量不同顏色細胞的數(shù)量。
103.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)包括膠原。
104.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)是matrigel。
105.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)包含纖維連接蛋白。
106.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)包含層粘連蛋白。
107.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)包含玻連蛋白。
108.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)是合成的基質(zhì)。
109.權(quán)利要求97所述的方法，其中細胞外基質(zhì)包含聚賴氨酸。
110.一種試劑盒，包括穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染有熒光蛋白的腫瘤細胞，內(nèi)皮細胞，涂有細胞外基質(zhì)的細胞培養(yǎng)板，和標記染料。
全文摘要
納米細胞允許順序遞送兩種具有不同作用模式或不同藥物動力學的不同治療劑。納米細胞通過將具有第一試劑的納米核心包囊在含有第二試劑的脂囊泡內(nèi)而形成。首先釋放外部脂質(zhì)隔室內(nèi)的試劑，并可以在納米核心中的試劑被釋放以前發(fā)揮其作用。納米細胞遞送系統(tǒng)可以被配制成藥物組合物以遞送到患有例如癌癥，炎性疾病例如哮喘，自身免疫病例如類風濕性關(guān)節(jié)炎，傳染病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如癲癇疾病的患者。在治療癌癥時，常規(guī)的抗腫瘤劑被包含在納米細胞的外部脂囊泡內(nèi)，抗血管生成劑被裝載進入納米核心。這種布置允許抗腫瘤劑在腫瘤的血液供給被抗血管生成劑切斷以前首先被釋放和遞送到腫瘤。
文檔編號A61K9/127GK101031287SQ200580013065
公開日2007年9月5日 申請日期2005年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月2日
發(fā)明者希拉迪蒂亞·森古普塔, 趙甘霖, 伊尚·卡皮拉, 大衛(wèi)·亞沃羅內(nèi), 拉姆·薩西采哈倫 申請人:麻省理工學院