專利名稱：治療自身免疫病的方法
專利說(shuō)明治療自身免疫病的方法
背景技術(shù)：
自身免疫病是復(fù)雜的、互相聯(lián)系的生物學(xué)途徑的表現(xiàn)或結(jié)果。在正常的生理系統(tǒng)中，對(duì)于響應(yīng)創(chuàng)傷或損傷、啟動(dòng)創(chuàng)傷或損傷修復(fù)、及產(chǎn)生對(duì)抗外來(lái)生物體的先天性和獲得性防御，這些生物學(xué)途徑是關(guān)鍵性的。當(dāng)這些正常的生理學(xué)途徑與響應(yīng)強(qiáng)度有關(guān)、由于異常調(diào)節(jié)或過(guò)度刺激的結(jié)果、由于對(duì)自身的反應(yīng)、或這些的組合引起額外的創(chuàng)傷或損傷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)疾病或病理。
雖然這些疾病的成因常常涉及多步途徑，并且常常涉及多種不同的生物學(xué)系統(tǒng)/途徑，但是對(duì)在一個(gè)或多個(gè)這些途徑中的關(guān)鍵點(diǎn)的干預(yù)可具有改善或治療效果。可通過(guò)拮抗有害過(guò)程/途徑或刺激有益過(guò)程/途徑產(chǎn)生治療性干預(yù)。
哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)由許多共同作用以防御宿主免受細(xì)菌、病毒、毒素和其它非宿主物質(zhì)侵襲的獨(dú)特細(xì)胞組成。淋巴細(xì)胞(T和B細(xì)胞二者)主要負(fù)責(zé)免疫系統(tǒng)的特異性。T細(xì)胞因在胸腺中發(fā)育而得名，而B(niǎo)細(xì)胞則因在骨髓中發(fā)育而得名。
T淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞)是哺乳動(dòng)物免疫應(yīng)答的重要組分。T細(xì)胞識(shí)別與主要組織相容性復(fù)合體(MHC)內(nèi)基因編碼的自身分子結(jié)合的抗原。所述抗原可以與MHC分子一起展示在抗原呈遞細(xì)胞、病毒感染的細(xì)胞、癌細(xì)胞、移植物等的表面。T細(xì)胞系統(tǒng)消除這些對(duì)宿主哺乳動(dòng)物造成健康威脅的改變的細(xì)胞。T細(xì)胞包括輔助性T細(xì)胞(CD4+)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+)。輔助性T細(xì)胞(TH)在識(shí)別抗原呈遞細(xì)胞上的抗原-MHC復(fù)合物之后大量增殖。輔助性T細(xì)胞還分泌多種細(xì)胞因子，諸如淋巴因子，它們?cè)贐細(xì)胞、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞和多種參與免疫應(yīng)答的其它細(xì)胞的活化中起重要作用。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能夠引起其它細(xì)胞的破壞。
在體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答二者中的一個(gè)重要事件是輔助性T細(xì)胞的活化和克隆擴(kuò)增。輔助性T細(xì)胞的活化通過(guò)T細(xì)胞受體(TCR)-CD3復(fù)合物與抗原呈遞細(xì)胞表面上的抗原-MHC的相互作用啟動(dòng)。該相互作用介導(dǎo)誘導(dǎo)靜息(resting)輔助性T細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期(G0到G1轉(zhuǎn)變)的生化事件級(jí)聯(lián)，并導(dǎo)致IL-2高親和力受體的表達(dá)。活化的T細(xì)胞通過(guò)循環(huán)增殖和分化發(fā)展為記憶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞。
T輔助細(xì)胞子集(Th1和Th2)確定了2種免疫途徑細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和體液免疫。Th1和Th2亞型的細(xì)胞因子釋放譜影響效應(yīng)物機(jī)制和細(xì)胞毒性細(xì)胞的選擇(Mosmann等，1989，Adv.Immunol.，46111-147；Mosmann等，1996，Immunol.Today，17138-146)。Th1細(xì)胞(CD4+細(xì)胞的一個(gè)功能性子集)的特點(diǎn)在于它們推動(dòng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和產(chǎn)生細(xì)胞因子包括IL-2、干擾素-γ和淋巴毒素β的能力(Mosmann等，1989，1996，見(jiàn)上)。Th1細(xì)胞分泌的IL-2和干擾素-γ活化巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞。Th2細(xì)胞也是CD4+細(xì)胞，但與Th1細(xì)胞截然不同。Th2細(xì)胞的特點(diǎn)在于它們推動(dòng)體液免疫諸如抗體產(chǎn)生的能力。Th2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，包括IL-4、IL-5和IL-10(Mosmann等，1989，1996，見(jiàn)上)。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5和IL-10增加了嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的產(chǎn)生，也增強(qiáng)了包括IgE的抗體的產(chǎn)生，并且降低了細(xì)胞毒性細(xì)胞的功能(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。
Th1和Th2細(xì)胞因子釋放調(diào)節(jié)互相抑制的Th1和Th2應(yīng)答。例如，IL-4抑制Th1細(xì)胞表達(dá)干擾素-γ，而干擾素-γ則抑制Th2細(xì)胞表達(dá)IL-4(Mosmann等，1989，見(jiàn)上)。
四螺旋束細(xì)胞因子家族(Bazan，1990，PNAS，876934)的成員調(diào)節(jié)來(lái)自共同前體的T輔助細(xì)胞擴(kuò)增和終末分化成不同的Th1和Th2效應(yīng)細(xì)胞群(O′Garra，A.，1998，Immunity，8275-83)。例如，IL-4影響Th2細(xì)胞的發(fā)育，而IL-12則涉及Th1細(xì)胞的分化(Hsieh等，1993，Science，260547-9；Seder等，1993，PNAS，9010188-92)。
TCCR(T細(xì)胞細(xì)胞因子受體)是WS(G)XWS類的細(xì)胞因子受體，與IL-12β-2受體、G-CSFR和IL-6受體具有同源性。這些受體轉(zhuǎn)導(dǎo)能控制細(xì)胞尤其是涉及血細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的信號(hào)。已經(jīng)提出TCCR涉及T輔助細(xì)胞應(yīng)答。具體而言，已經(jīng)假定TCCR及其配體IL-27促進(jìn)Th1應(yīng)答(Chen等，2000，Nature，407916-920；Yoshida等，2001，Immunity，15569-578；Pflanz等，2002，Immunity，16779-790)。
Th1和Th2細(xì)胞任一或二者所產(chǎn)生的細(xì)胞因子的過(guò)表達(dá)給宿主造成醫(yī)學(xué)疾病。例如，Th1細(xì)胞因子的過(guò)表達(dá)促成多種自身免疫病諸如多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病。Th2細(xì)胞因子的過(guò)表達(dá)促成變應(yīng)性疾病的發(fā)病。
在有些自身免疫病中，CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)涉及組織的致病性破壞。例如，在自身免疫性I型糖尿病的病程中，CTL牽涉胰腺β細(xì)胞的破壞(Kagi等，1997，J.Exp.Med.，186989-997)。CTL還前述實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Huseby等，2001，J.Exp.Med.，194(5)669-676)。CTL介導(dǎo)與移植物抗宿主病(GVHD)有關(guān)的組織損傷(Graubert等，1997，J.Clin.Invest.，100904-911)。
多發(fā)性硬化(MS)是一種影響腦和脊髓的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。MS的常見(jiàn)體征和癥狀包括四肢的一肢或多肢中、軀干中、或臉的一側(cè)上感覺(jué)異常；腿或手無(wú)力或笨拙；或視覺(jué)障礙(例如部分失明和一只眼疼痛)、視覺(jué)模糊、或暗點(diǎn)。其它常見(jiàn)的早期癥狀為導(dǎo)致復(fù)視覺(jué)(復(fù)視)的眼原性麻痹、四肢的一肢或多肢短暫無(wú)力、四肢的輕微僵硬或罕見(jiàn)的易疲勞性、不嚴(yán)重的步態(tài)障礙、排尿控制困難、眩暈、和輕度情緒紊亂(Berkow等(編)，1999，Merck Manual ofDiagnosis and Therapy第17版)。目前用于MS的治療包括皮質(zhì)類固醇、β-干擾素(Betaferon，Avonex，Rebif)、醋酸格拉默(Copaxone)、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、克拉屈濱、巴氯芬、替扎尼定、阿米替林、卡馬西平(Berkow等(編)，1999，見(jiàn)上)。
類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性自身免疫病，特征在于通常影響小和大關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)滑膜炎，導(dǎo)致它們的進(jìn)行性破壞(Berkow等(編)，1999，見(jiàn)上)。RA的癥狀可包括僵硬、觸痛、滑膜增厚、屈曲攣縮、內(nèi)臟小結(jié)、引起腿潰瘍或多發(fā)性單神經(jīng)炎的血管炎、胸腔或心包積液、和發(fā)熱(Berkow等(編)，1999，見(jiàn)上)。
目前用于RA的治療包括非類固醇抗炎藥(包括水楊酸(鹽/酯))、金化合物、甲氨蝶呤、羥氯喹、柳氮磺吡啶、青霉胺、皮質(zhì)類固醇、和細(xì)胞毒性或免疫抑制性藥物(Berkow等(編)，1999，Merck Manual of Diagnosis and Therapy第17版)。
由于療效有限和/或毒性顯著，因此現(xiàn)有的用于自身免疫病的療法都不能令人滿意。因此，需要用于治療自身免疫病諸如MS和RA的新方法。
發(fā)明概述 幼稚的、未分化的T細(xì)胞(Th-0)應(yīng)答誘導(dǎo)Th-0細(xì)胞分化為成熟T輔助細(xì)胞的不同信號(hào)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受體TCCR的活化，例如通過(guò)施用TCCR激動(dòng)劑諸如IL-27，有效降低T淋巴細(xì)胞增殖。T淋巴細(xì)胞增殖的降低與IL-10和SOCS-3表達(dá)升高有關(guān)。業(yè)已發(fā)現(xiàn)表達(dá)TCCR的動(dòng)物對(duì)自身免疫病較不易感。
在EAE疾病模型中的進(jìn)一步研究指出IL-27受體(TCCR)缺陷型小鼠對(duì)自身免疫病高度敏感。對(duì)IL-27在Th細(xì)胞分化和免疫病中的作用的研究產(chǎn)生了驚人的發(fā)現(xiàn)，即IL-27是免疫抑制性的，在Th發(fā)育中的多個(gè)水平起作用。IL-27抑制Th-IL17細(xì)胞產(chǎn)生，抑制IL-6產(chǎn)生，以及抑制Th-IL17細(xì)胞因子包括IL-6的產(chǎn)生。IL-27誘導(dǎo)IL-10和IL-4(另一種Th-IL17細(xì)胞的抑制劑)產(chǎn)生，并刺激IL12受體產(chǎn)生和Th-1細(xì)胞分化。本文中披露的數(shù)據(jù)表明IL-27具有重要的免疫抑制功能，包括對(duì)Th-1、Th-2和Th-17細(xì)胞的重要抑制活性。
本發(fā)明提供了通過(guò)施用IL27R(TCCR)激動(dòng)劑諸如IL-27，治療自身免疫病包括多發(fā)性硬化(MS)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的方法。有用的TCCR激動(dòng)劑包括IL27R的變體和片段，IL27R配體諸如IL-27及其變體和片段，以及結(jié)合IL27R或IL27R配體并刺激、誘導(dǎo)或增強(qiáng)IL27介導(dǎo)的應(yīng)答的激動(dòng)性抗體。本發(fā)明還提供了抑制T淋巴細(xì)胞和/或細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞包括Th-IL17細(xì)胞增殖的方法，該方法包括施用刺激、誘導(dǎo)或增強(qiáng)IL27/IL27R應(yīng)答的激動(dòng)劑。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是TCCR/IL-27受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)的示意圖。
圖2是顯示表達(dá)人TCCR的Ba/F3細(xì)胞應(yīng)答單克隆抗體2685-IgG2a、2686-IgG1、2688-IgG1、對(duì)照同種型IgG2a和對(duì)照同種型IgG1的增殖的圖。
圖3是顯示表達(dá)人TCCR的Ba/F3細(xì)胞應(yīng)答鼠IL-3(陽(yáng)性對(duì)照)和抗體2686的增殖的圖。
圖4是顯示表達(dá)人TCCR、鼠TCCR的Ba/F3細(xì)胞和兩者都不表達(dá)的對(duì)照細(xì)胞應(yīng)答抗體2686的增殖的圖。
圖5是顯示與不表達(dá)TCCR的脾細(xì)胞的增殖相比，表達(dá)TCCR的脾細(xì)胞應(yīng)答抗CD3刺激的增殖的圖。
圖6是顯示與不表達(dá)TCCR的CD4+T細(xì)胞的增殖相比，表達(dá)TCCR的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答抗CD3刺激的增殖的圖。
圖7是顯示與不表達(dá)TCCR的CD8+T細(xì)胞的增殖相比，表達(dá)TCCR的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答抗CD3刺激的增殖的圖。
圖8是顯示在敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠中MOG誘導(dǎo)的EAE的臨床進(jìn)展的圖。
圖9是顯示在敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠中MBP誘導(dǎo)的EAE的臨床進(jìn)展的圖。
圖10是顯示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠腦和脊髓切片的平均組織學(xué)炎癥得分的圖。
圖11是顯示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠腦和脊髓切片的平均組織學(xué)脫髓鞘得分的圖。
圖12是顯示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠腦和脊髓切片的最大組織學(xué)炎癥得分的圖。
圖13是顯示在EAE模型中敲除型(TCCR-/-)和野生型(TCCR+/+)小鼠腦和脊髓切片的最大組織學(xué)脫髓鞘得分的圖。
圖14是顯示在CFSE標(biāo)記測(cè)定中，與不表達(dá)TCCR的CD4+T細(xì)胞的增殖相比，表達(dá)TCCR的CD4+T細(xì)胞應(yīng)答抗CD3刺激的增殖的圖。
圖15是顯示在CFSE標(biāo)記測(cè)定中，與不表達(dá)TCCR的CD8+T細(xì)胞的增殖相比，表達(dá)TCCR的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答抗CD3刺激的增殖的圖。
圖16A-C是顯示在中性(16A)、Th1偏愛(ài)(16B)和Th2偏愛(ài)(16C)條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)，IL-2應(yīng)答IL-27處理的誘導(dǎo)的圖。數(shù)據(jù)表示的是IL-27依賴性誘導(dǎo)的倍數(shù)。
圖17A-C是顯示在中性(17A)、Th1偏愛(ài)(17B)和Th2偏愛(ài)(17C)條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)，IL-10應(yīng)答IL-27處理的誘導(dǎo)的圖。數(shù)據(jù)表示的是IL-27依賴性誘導(dǎo)的倍數(shù)。
圖18A-C是顯示在中性(18A)、Th1偏愛(ài)(18B)和Th2偏愛(ài)(18C)條件下，在不同時(shí)間點(diǎn)，SOCS-3應(yīng)答IL-27處理的誘導(dǎo)的圖。數(shù)據(jù)表示的是IL-27依賴性誘導(dǎo)的倍數(shù)。
圖19是顯示在中性、Th1偏愛(ài)和Th2偏愛(ài)條件下，CD4+細(xì)胞應(yīng)答IL-27處理的增殖的圖。
圖20A-B是顯示抗IL-2抗體不存在(20A)或存在(20B)下，脾細(xì)胞應(yīng)答IL-27和/或IL-6處理的增殖的圖。
圖21是IL-27及其受體IL-27R(TCCR)的圖。
圖22是顯示在IL-12細(xì)胞因子組內(nèi)，IL-27與細(xì)胞因子IL-6簇的關(guān)系的圖。
圖23是顯示輔助性T細(xì)胞分化的圖。
圖24是顯示在IL-27R缺陷型小鼠中對(duì)EAE的高度敏感性的圖。
圖25顯示了在野生型和IL-27R敲除型小鼠中EAE表型的組織學(xué)分析。
圖26是測(cè)試T細(xì)胞中IL-27關(guān)系的方案的示意圖。
圖27顯示了IL-27對(duì)T細(xì)胞發(fā)育的影響的測(cè)試結(jié)果。對(duì)于以下細(xì)胞因子，將細(xì)胞因子應(yīng)答IL-27的降低與野生型對(duì)照進(jìn)行了比較IFN-γ、IL-2、TFN、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF和IL-17。
圖28圖示了IL-2和GM-CSF應(yīng)答IL-10、IL-27以及IL-10和IL-27的組合而產(chǎn)生的結(jié)果。
圖29圖示了IL-10應(yīng)答IL-27的強(qiáng)誘導(dǎo)，IL-10敲除型小鼠中EAE的嚴(yán)重程度。
圖30是描繪TH-17在EAE中的作用的圖。
圖31圖示了EAE疾病對(duì)IL-23和TH-IL-17細(xì)胞的要求。
圖32圖示了IL-27對(duì)TH-IL-17細(xì)胞因子的抑制。
圖33圖示了IL-27對(duì)IL-17的抑制。
圖34圖示了IL-27介導(dǎo)的IL-17抑制是不依賴IFN-γ的。
圖35圖示了IL-27對(duì)IL-17的抑制是通過(guò)STAT-1介導(dǎo)的。
圖36圖示了IL-17-R敲除型小鼠的再刺激的淋巴細(xì)胞的TH-IL-17細(xì)胞因子分泌。
圖37顯示了在IL-27-R缺陷型小鼠中，IL-17應(yīng)答誘導(dǎo)疾病的MOG或KLH的產(chǎn)生。
圖38圖示了浸潤(rùn)C(jī)NS的CD4T細(xì)胞的IL-17表達(dá)。
圖39是顯示不同細(xì)胞因子與T輔助細(xì)胞分化的關(guān)系的圖。
圖40是顯示IL-6敲除型小鼠中EAE抗性的圖。
圖41圖示了IL-6對(duì)TH-IL-17細(xì)胞因子和應(yīng)答的誘導(dǎo)。
圖42是顯示IL-27對(duì)IL-6增殖效應(yīng)的拮抗作用的圖。
圖43是顯示IL-27和IL-6在TH-IL-17發(fā)育中的作用的圖。
圖44是顯示IL-27的多個(gè)作用水平的圖。
圖45圖解了IL-27在誘導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)變化中的作用。
序列簡(jiǎn)述 表24 發(fā)明詳述 T淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖或Th1或Th2細(xì)胞過(guò)度產(chǎn)生細(xì)胞因子引起宿主的醫(yī)學(xué)疾病。例如，與Th1應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞因子的過(guò)量產(chǎn)生或CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖可引起自身免疫病，包括同種異體移植物排斥、自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯氏(Graves)病和橋本氏(Hashimoto)甲狀腺炎)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、炎性腸病(包括克羅恩氏(Crohn)病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、肉芽腫性腸炎、遠(yuǎn)端回腸炎、節(jié)段性回腸炎和末端回腸炎)、胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化、惡性貧血、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病、和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
下文實(shí)施例中詳述的研究證明在應(yīng)答非特異性T細(xì)胞刺激中，缺少TCCR的T細(xì)胞比表達(dá)TCCR的T細(xì)胞增殖更多(見(jiàn)實(shí)施例1)。先前，有人提出TCCR及其配體IL-27促進(jìn)Th1應(yīng)答(Chen等，2000，Nature，407916-920；Yoshida等，2001，Immunity，15569-578；Pflanz等，2002，Immunity，16779-790)。但是，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與缺少TCCR的小鼠相比，表達(dá)TCCR的小鼠對(duì)特征部分為T(mén)h1應(yīng)答的自身免疫病較不易感，諸如實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，一種用于多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型(見(jiàn)實(shí)施例2)。
如下文實(shí)施例所示，通過(guò)給細(xì)胞施用TCCR激動(dòng)劑抑制了T淋巴細(xì)胞的增殖。同樣顯示的是，與TCCR-/-動(dòng)物相比，在表達(dá)TCCR的動(dòng)物(TCCR+/+)中存在自身免疫性炎性疾病臨床進(jìn)展減緩和癥狀較不嚴(yán)重。
這些資料說(shuō)明TCCR激動(dòng)劑可用于降低T細(xì)胞增殖。具體而言，這些資料說(shuō)明TCCR激動(dòng)劑可用于治療自身免疫介導(dǎo)的疾病，諸如多發(fā)性硬化(MS)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)。
定義 術(shù)語(yǔ)“自身免疫”指免疫系統(tǒng)組分諸如抗體或淋巴細(xì)胞攻擊或損害產(chǎn)生它們的生物體的分子、細(xì)胞或組織的過(guò)程。
術(shù)語(yǔ)“自身免疫病(autoimmune disorders)”指其中損傷諸如組織損傷或發(fā)病至少部分是自身免疫過(guò)程的結(jié)果的疾病。舉例來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“自身免疫病(autoimmune disease)”包括那些至少部分通過(guò)Th1應(yīng)答或CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。自身免疫病包括同種異體移植物排斥、自身免疫性甲狀腺病(諸如格雷夫斯氏病和橋本氏甲狀腺炎)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、炎性腸病(包括克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、肉芽腫性腸炎、遠(yuǎn)端回腸炎、節(jié)段性回腸炎和末端回腸炎)、胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化、惡性貧血、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
術(shù)語(yǔ)“Th1應(yīng)答”指T輔助細(xì)胞由前體分化為不同Th1效應(yīng)細(xì)胞群，包括由Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，諸如IFN-γ、IL-2和TNF-β。術(shù)語(yǔ)“Th1偏愛(ài)條件”指促成T輔助細(xì)胞由前體分化為不同Th1效應(yīng)細(xì)胞群的條件。
術(shù)語(yǔ)“Th1細(xì)胞因子”指那些在Th1應(yīng)答中表達(dá)的細(xì)胞因子，包括IFN-γ、IL-2和TNF-β(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。
術(shù)語(yǔ)“Th1介導(dǎo)的疾病”指主要或部分由Th1細(xì)胞因子過(guò)量產(chǎn)生介導(dǎo)的疾病。術(shù)語(yǔ)“Th1介導(dǎo)的疾病”包括那些可能由T細(xì)胞分化為T(mén)h1亞型中的過(guò)量產(chǎn)生或偏愛(ài)引起的疾病。這樣的疾病包括自身免疫病，例如RA和MS。
術(shù)語(yǔ)“Th2應(yīng)答”指T輔助細(xì)胞由前體分化為不同Th2效應(yīng)細(xì)胞群，包括由Th2細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，諸如IL-4、IL-5、IL-10和IL-13(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。術(shù)語(yǔ)“Th2偏愛(ài)條件”指促成T輔助細(xì)胞由前體分化為不同Th2效應(yīng)細(xì)胞群的條件。
在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“TCCR肽”、“TCCR蛋白”和“TCCR”涵蓋天然序列TCCR和TCCR肽變體。TCCR肽可分離自多種來(lái)源，諸如人組織或其它來(lái)源，或通過(guò)重組和/或合成方法制備?！疤烊恍蛄蠺CCR”是具有與衍生自自然界的TCCR肽相同的氨基酸序列的肽。這樣的天然序列TCCR可分離自自然界或可通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列TCCR”具體涵蓋TCCR的天然存在的截短和分泌形式(諸如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的截短形式(諸如可變剪接形式)和天然存在的等位變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，天然序列人TCCR是包含SEQ ID NO1的氨基酸1-636的成熟或全長(zhǎng)的天然序列TCCR。類似的，天然序列鼠TCCR是包含SEQ ID NO2的氨基酸1-623的成熟或全長(zhǎng)的天然序列TCCR。雖然SEQ ID NO1和SEQ ID NO2顯示為以本文中指定為氨基酸第1位的甲硫氨酸殘基起始，但是可以想到且有可能的是另一個(gè)位于SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的氨基酸第1位的上游或下游的甲硫氨酸殘基可作為T(mén)CCR肽的起始氨基酸殘基。
“TCCR肽胞外結(jié)構(gòu)域”或“TCCR ECD”指TCCR肽的一種形式，即基本上不含跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通常，TCCR肽ECD將包含少于約1％的所述跨膜結(jié)構(gòu)域和/或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，優(yōu)選將包含少于約0.5％的所述結(jié)構(gòu)域。應(yīng)當(dāng)理解，為本發(fā)明的TCCR肽鑒定的任何跨膜結(jié)構(gòu)域是依照常規(guī)用于鑒定那種類型的疏水結(jié)構(gòu)域的標(biāo)準(zhǔn)而鑒定的。跨膜結(jié)構(gòu)域的準(zhǔn)確邊界可有所變化，但最有可能不超過(guò)起初所鑒定的結(jié)構(gòu)域任一末端的約5個(gè)氨基酸。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，人TCCR肽的胞外結(jié)構(gòu)域包含氨基酸1或約33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的殘基512至殘基522的任意氨基酸殘基。類似的，鼠TCCR肽的胞外結(jié)構(gòu)域包含氨基酸1或約25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的殘基509至殘基519的任意氨基酸殘基。
術(shù)語(yǔ)“TCCR變體肽″意指具有TCCR肽的至少一種生物學(xué)活性以及與下列氨基酸序列具有至少約80％氨基酸序列同一性的肽 (a1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的殘基1或約33至636； (a2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的殘基1或約25至623； (b1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的X3至636，其中X3是SEQ ID NO1的氨基酸殘基27至37任一； (b2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的X4至623，其中X4是SEQ ID NO2的氨基酸殘基20至30任一； (c1)1或約33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的殘基512至殘基522的任意氨基酸殘基； (c2)1或約25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的殘基509至殘基519的任意氨基酸殘基； (d1)X5至636，其中X5是SEQ ID NO1的殘基533至543的任意氨基酸； (d2)X6至623，其中X6是SEQ ID NO2的殘基527至537的任意氨基酸；或 (e)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列的另外具體衍生的片段。
這樣的TCCR變體肽包括例如其中在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2序列的N-和/或C-末端以及在一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的TCCR肽。通常，TCCR變體肽將與下列氨基酸序列具有至少約80％的氨基酸序列同一性，可以是至少約81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列同一性 (a1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的殘基1或約33至636； (a2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的殘基1或約25至623； (b1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的X3至636，其中X3是SEQ ID NO1的氨基酸殘基27至37任一； (b2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的X4至623，其中X4是SEQ ID NO2的氨基酸殘基20至30任一； (c1)1或約33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的殘基512至殘基522的任意氨基酸殘基； (c2)1或約25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的殘基509至殘基519的任意氨基酸殘基； (d1)X5至636，其中X5是SEQ ID NO1的殘基533至543的任意氨基酸； (d2)X6至623，其中X6是SEQ ID NO2的殘基527至537的任意氨基酸；或 (e)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列的另外具體衍生的片段。
在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“IL-27”涵蓋天然序列IL-27異二聚體、天然序列IL-27組分EBI3和p28、IL-27異二聚體變體(在本文中有進(jìn)一步定義)、及EBI3和p28的變體。IL-27異二聚體及其組分可分離自多種來(lái)源，諸如人組織類型或其它來(lái)源，或可通過(guò)重組和/或合成方法制備?！疤烊恍蛄蠭L-27”包括具有與衍生自自然界的IL-27異二聚體相同的氨基酸序列的異二聚體。這樣的天然序列IL-27異二聚體可分離自自然界或可通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列IL-27”具體涵蓋IL-27異二聚體的天然存在的截短和分泌形式(諸如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的截短形式(諸如可變剪接形式)、及天然存在的等位變體。
術(shù)語(yǔ)“IL-27變體”指那些與能活化TCCR的天然序列IL-27包括天然序列IL-27組分EBI3和p28具有同源性的肽。IL-27變體可包括那些由EBI3變體和p28變體形成的變體。IL-27變體還可包括那些能招募(engage)TCCR和gp130二者的變體。IL-27變體可包括那些能形成TCCR同二聚體的變體。IL-27變體包括PEG化IL-27。
在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“p28”涵蓋天然序列p28和p28肽變體。p28可分離自多種來(lái)源，諸如人組織類型或其它來(lái)源，或可通過(guò)重組和/或合成方法制備?！疤烊恍蛄衟28”包括具有與衍生自自然界的p28肽相同的氨基酸序列的肽。這樣的天然序列p28可分離自自然界或可通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列p28”具體涵蓋p28的天然存在的截短或分泌形式(諸如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的截短形式(諸如可變剪接形式)及天然存在的等位變體。
術(shù)語(yǔ)“p28肽變體”涵蓋與天然序列人p28(SEQ ID NO3)或鼠p28(SEQID NO4)具有至少73％、75％、80％、90％、95％或99％序列同一性的肽。p28肽變體包括p28中能夠結(jié)合TCCR和gp130的部分。p28肽變體包括p28中能夠活化TCCR的部分。p28肽變體包括含有來(lái)自p28的第一和第三α螺旋的殘基及位于第一螺旋末端和第四螺旋起始的殘基的肽，認(rèn)為前者結(jié)合TCCR中在TCCR上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子受體同源結(jié)構(gòu)域的區(qū)，認(rèn)為后者結(jié)合gp130上發(fā)現(xiàn)的IG結(jié)構(gòu)域。
在本文中使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“EBI3”涵蓋天然序列EBI3和EBI3肽變體。EBI3肽可分離自多種來(lái)源，諸如人組織類型或其它來(lái)源，或可通過(guò)重組和/或合成方法制備?！疤烊恍蛄蠩BI3”包括具有與衍生自自然界的EBI3肽相同的氨基酸序列的肽。這樣的天然序列EBI3可分離自自然界或可通過(guò)重組和/或合成方法產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“天然序列EBI3”具體涵蓋EBI3的天然存在的截短和分泌形式(諸如胞外結(jié)構(gòu)域序列)、天然存在的截短形式(諸如可變剪接形式)及天然存在的等位變體。
舉例來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”指由編碼兩種不同蛋白質(zhì)的兩種基因融合所產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物。該術(shù)語(yǔ)還包括由編碼兩種不同蛋白質(zhì)的部分的兩種基因的部分融合所產(chǎn)生的表達(dá)產(chǎn)物。該術(shù)語(yǔ)包括那些由翻譯后發(fā)生的融合所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。如本文所使用的，該術(shù)語(yǔ)將包括融合有異源肽的IL-27、其組分(EBI3和p28)、或其部分。該術(shù)語(yǔ)還將包括融合有異源肽的TCCR或其部分。該術(shù)語(yǔ)還將包括與p28融合以形成功能性單鏈細(xì)胞因子的EBI3(Pflanz等，2002，Immunity，16779-790)。該術(shù)語(yǔ)包括偶聯(lián)有人Fc標(biāo)記的IL-27。
如本文所使用的，相對(duì)于給定肽的“異源肽”指具有不同序列的肽，與起源無(wú)關(guān)。例如，相對(duì)于天然序列TCCR，異源肽指具有不同于天然序列TCCR的序列的肽。相對(duì)于天然序列IL-27，異源肽指具有不同于天然序列IL-27的序列的肽。
術(shù)語(yǔ)“激動(dòng)劑”包括任何增強(qiáng)或刺激天然序列肽的生物學(xué)活性的分子。合適的激動(dòng)劑分子具體包括激動(dòng)劑肽、激動(dòng)劑抗體或抗體片段、本發(fā)明天然肽的片段或氨基酸序列變體、等等。鑒定TCCR激動(dòng)劑的方法包括例如使TCCR肽或表達(dá)TCCR肽的細(xì)胞與候選的激動(dòng)劑分子接觸，并測(cè)量一種或多種TCCR生物學(xué)活性的可檢測(cè)變化。
如本文所使用的，“TCCR生物學(xué)活性”指TCCR介導(dǎo)的應(yīng)答，諸如壓制或抑制T細(xì)胞增殖。TCCR生物學(xué)活性包括壓制或抑制Th1應(yīng)答或Th1介導(dǎo)的疾病。TCCR生物學(xué)活性包括提高IL-10和SOCS-3的表達(dá)。TCCR生物學(xué)活性還包括與TCCR活化有關(guān)的發(fā)信號(hào)，例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子諸如Stat1、Stat3、Stat4和Stat5的磷酸化(Lucas等，2003，PNAS，100(25)15047-52)。
術(shù)語(yǔ)“抗體”和“免疫球蛋白”以最寬泛的含義使用，具體包括多克隆抗體、單克隆抗體(包括激動(dòng)劑和拮抗劑抗體)、多價(jià)抗體(諸如二價(jià)抗體)、多特異性抗體(諸如展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性的雙特異性抗體)、具有多表位特異性的抗體組合物、親和力成熟的抗體、人源化抗體、人抗體、嵌合抗體、以及展現(xiàn)出期望生物學(xué)活性的抗原結(jié)合片段(諸如Fab、F(ab′)2、scFv和Fv)。天然存在的抗體包含四條肽鏈，即通過(guò)二硫鍵互相連接的兩條相同的重(H)鏈和兩條相同的輕(L)鏈。每條重鏈包含一個(gè)重鏈可變區(qū)(VH)和一個(gè)重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，CH1、CH2和CH3。每條輕鏈包含一個(gè)輕鏈可變區(qū)(VL)和一個(gè)輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個(gè)結(jié)構(gòu)域，CL。VH和VL結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步細(xì)分成通過(guò)序列限定的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)(參見(jiàn)Kabat等，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md)或通過(guò)三維結(jié)構(gòu)限定的高變環(huán)(HVL)(Chothia等，1987，J.Mol.Biol.，196901-917)，之間散布著稱為構(gòu)架區(qū)(FR)的更保守的區(qū)。每個(gè)VH和VL通常由三個(gè)CDR(或HVL)和四個(gè)FR組成，從氨基末端至羧基末端以如下順序排列FR1，CDR1(HVL1)，F(xiàn)R2，CDR2(HVL2)，F(xiàn)R3，CDR3(HVL3)，F(xiàn)R4。
抗體(免疫球蛋白)根據(jù)其重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列分為不同的類。有五大類免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些進(jìn)一步分成亞類(同種型)，諸如IgG1、IgG2、IgA1、IgA2、等等。對(duì)應(yīng)于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，一般性描述于例如Abbas等，2000，Cellular and Mol.Immunology，第4版?？贵w可以是更大融合分子的一部分，所述融合分子通過(guò)抗體與一種或多種其它蛋白質(zhì)或肽共價(jià)或非共價(jià)結(jié)合而形成。
術(shù)語(yǔ)“全長(zhǎng)抗體”指以其基本上完整的形式存在的抗體，包含至少2條重鏈和2條輕鏈，并且不是下文所定義的抗體片段。該術(shù)語(yǔ)特別指重鏈包含F(xiàn)c區(qū)的抗體。全長(zhǎng)抗體可以是天然序列抗體或重組抗體。全長(zhǎng)抗體可以是人的、人源化的和/或親和力成熟的。
如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即除在產(chǎn)生抗體的過(guò)程中可能產(chǎn)生的變體外，構(gòu)成該群的單個(gè)抗體是基本上相同的。
在此描述的單克隆抗體明確包括“嵌合”抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而所述鏈的剩余部分則與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及這樣的嵌合抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國(guó)專利號(hào)4,816,567；Morrison等，1984，PNAS，816851-6855)。
非人(如鼠)抗體的“人源化”形式是包含衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈、或其片段(諸如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)。在大多數(shù)情況下，人源化抗體是如下的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來(lái)自受體的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或高變環(huán)(HVL)的殘基為具有期望的抗原特異性、親和力和能力、來(lái)自非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠或兔的一個(gè)或多個(gè)CDR或HVL的殘基所替換。在有些情況下，人免疫球蛋白的特定Fv構(gòu)架區(qū)(FR)殘基為相應(yīng)的非人殘基所替換。此外，人源化抗體可包含既不見(jiàn)于受體抗體，也不見(jiàn)于輸入CDR(或HVL)或框架序列的殘基。進(jìn)行這些修飾以進(jìn)一步改進(jìn)抗體性能并使之最大化。一般而言，人源化抗體將包含至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變區(qū)的基本上整個(gè)，其中整個(gè)或基本上整個(gè)CDR或HVL對(duì)應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，以及整個(gè)或基本上整個(gè)FR是人免疫球蛋白序列的那些。
所選擇的人可變區(qū)(輕鏈和重鏈二者)可用于生成人源化抗體。根據(jù)“最適(bestfit)”法，例如，用嚙齒類動(dòng)物抗體的可變區(qū)序列篩選已知人可變區(qū)序列的整個(gè)文庫(kù)。將與嚙齒類動(dòng)物最接近的人序列用作人源化抗體的人框架區(qū)(FR)(Sims等，1993，J.Immunol.，1512296)?；蛘?，受體框架區(qū)可衍生自人抗體輕鏈或重鏈特定亞群的共有序列。所述相同框架區(qū)可被使用或修飾，并可用于產(chǎn)生幾種不同的人源化抗體(Carter等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，894285；Presta等，1993，J.Immunol.，1512623)。人源化抗體任選包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的。欲知詳情，參見(jiàn)例如Jones等，1986，Nature，321522-525；Reichmann等，1988，Nature，332323-329；Presta，1992，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596。人源化抗體還可以是PRIMATIZED抗體，其中抗體的抗原結(jié)合區(qū)衍生自通過(guò)用目的抗原免疫獼猴所產(chǎn)生的抗體。
可生成能在免疫接種后在不產(chǎn)生內(nèi)源免疫球蛋白的情況下產(chǎn)生人抗體全集的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)。例如，嵌合和種系突變小鼠中抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合刪除導(dǎo)致內(nèi)源抗體生成的完全抑制。在這樣的種系突變小鼠中轉(zhuǎn)移大批(array)人種系免疫球蛋白基因?qū)е略诳乖艉螽a(chǎn)生人抗體。參見(jiàn)例如Jakobovits等，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902551；Jakobovits等，1993，Nature，362255-258；Bruggermann等，1993，Year in Immuno.，733。人抗體還可衍生自噬菌體展示文庫(kù)，例如如Hoogenboom等，1991，J.Mol.Biol.，227381；Marks等，1991，J.Mol.Biol.，222581-597中所述。
“人抗體”是具有對(duì)應(yīng)于人所產(chǎn)生的和/或使用任何在此披露的用于生成人抗體的技術(shù)所生成的抗體的氨基酸序列的抗體。
“親和力成熟的”抗體是在一個(gè)或多個(gè)高變區(qū)中具有一處或多處改變，導(dǎo)致抗體對(duì)抗原的親和力與不具有這些改變的親本抗體相比有所改善的抗體。優(yōu)選的親和力成熟的抗體將對(duì)靶抗原具有納摩爾或甚至皮摩爾的親和力。親和力成熟的抗體通過(guò)已知流程生成。參見(jiàn)例如Marks等，1992，Bio/Technology10779-783，描述了通過(guò)VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進(jìn)行的親和力成熟。CDR和/或框架殘基的隨機(jī)誘變描述于Barbas等，1994，Proc.Nat.Acad.Sci.USA913809-3813；Scier等，1995，Gene 169147-155；Yelton等，1995，J.Immunol.1551994-2004；Jackson等，1995，J.Immunol.154(7)3310-9；Hawkins等，1992，J.Mol.Biol.226889-896。
“抗體片段”僅包含完整抗體的一部分，通常包括完整抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)，因此保留結(jié)合抗原的能力。本發(fā)明定義所涵蓋的抗體片段的例子包括 (i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1結(jié)構(gòu)域，在重鏈和輕鏈之間有一個(gè)鏈間二硫鍵； (ii)Fab’片段，其是在CH1結(jié)構(gòu)域的C-末端具有一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基的Fab片段； (iii)Fd片段，具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域； (iv)Fd’片段，具有VH和CH1結(jié)構(gòu)域及在CH1結(jié)構(gòu)域C-末端的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸； (v)Fv片段，具有抗體單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域； (vi)dAb片段，由VH結(jié)構(gòu)域組成； (vii)無(wú)鉸鏈抗體，包括至少VL、VH、CL、CH1結(jié)構(gòu)域并缺少鉸鏈區(qū)； (viii)F(ab’)2片段，包括在鉸鏈區(qū)通過(guò)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab’片段的二價(jià)片段； (ix)單鏈抗體分子(如單鏈Fv；scFv)； (x)“雙抗體”，具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，包含在同一肽鏈中連接至輕鏈可變區(qū)(VL)的重鏈可變區(qū)(VH)； (xi)單臂抗原結(jié)合分子，包含輕鏈、重鏈和N-末端截短的重鏈恒定區(qū)，所述N-末端截短的重鏈恒定區(qū)足以形成能夠延長(zhǎng)單臂抗原結(jié)合域半衰期的Fc區(qū)； (xii)“線性抗體”，包含一對(duì)串聯(lián)的Fd片段(VH-CH1-VH-CH1)，其與互補(bǔ)的輕鏈肽一起形成一對(duì)抗原結(jié)合區(qū)。
如本文所使用的，“治療”或“處理”指試圖改變所治療個(gè)體或細(xì)胞的天然病程的嘗試中的臨床干預(yù)，可以為了預(yù)防或在臨床病理學(xué)的過(guò)程中執(zhí)行。期望的治療效果包括預(yù)防疫病的發(fā)生或復(fù)發(fā)、減輕癥狀、減少疾病的任何直接或間接病理結(jié)果、預(yù)防轉(zhuǎn)移、降低疾病進(jìn)展的速度、改善或減輕疾病狀況、及康復(fù)或預(yù)后改善。
TCCR TCCR(WSX-1)是WS(G)XWS類的細(xì)胞因子受體，與IL-12β-2受體、G-CSFR和IL-6受體具有同源性。與IL-12β-2受體同源性最高(26％同一性)。這些受體轉(zhuǎn)導(dǎo)控制細(xì)胞尤其是涉及血細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化的信號(hào)。下文實(shí)施例中所列數(shù)據(jù)說(shuō)明TCCR活化直接或間接誘導(dǎo)對(duì)自身免疫進(jìn)程的抑制，包括CD8+T淋巴細(xì)胞增殖或Th1應(yīng)答。
對(duì)自身免疫進(jìn)程的抑制可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞因子信號(hào)抑制物(SOCS)蛋白質(zhì)家族成員而發(fā)生(Alexander等，2004，Ann.Rev.Immunol.，22503)，其可使T細(xì)胞不響應(yīng)其它促有絲分裂刺激。具體而言，SOCS-3是結(jié)合Janus激酶活化環(huán)的蛋白質(zhì)，抑制激酶活性并由此抑制細(xì)胞因子發(fā)信號(hào)(Masuhara等，1997，Biochem.Biophys.Res.Commun.，239439-446)。已有報(bào)道，有些試劑諸如過(guò)氧化物酶體增殖物活化的受體(PPAR)-γ激動(dòng)劑(如羅西格列酮)的抗炎作用通過(guò)誘導(dǎo)SOCS1和SOCS3轉(zhuǎn)錄起作用(Park等，2003，J.Biol.Chem.，27814747-14752)。下文實(shí)施例中所列數(shù)據(jù)顯示TCCR活化直接或間接誘導(dǎo)SOCS3的表達(dá)。
對(duì)自身免疫進(jìn)程的抑制還通過(guò)誘導(dǎo)IL-10而發(fā)生。IL-10是由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。IL-10抑制多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括IL-2、IL-3、IFN-γ、GM-CSF和TNF。IL-10在限制和終止炎癥應(yīng)答中起主要作用(Moore等，2001，Ann.Rev.Immunol.，19683)。下文實(shí)施例中所列數(shù)據(jù)顯示TCCR活化直接或間接誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)。
人TCCR的氨基酸序列已經(jīng)公布(1996年5月23日提交的WO97/44455)，可以從GenBank憑入藏登記號(hào)4759327獲得。該序列還描述于Sprecher等，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.246(1)82-90。人TCCR(hTCCR)序列的長(zhǎng)度是636個(gè)氨基酸，示于下表1中(SEQ ID NO1)。已經(jīng)鑒定了位于SEQID NO1氨基酸殘基1-32的信號(hào)肽，和氨基酸殘基517-538的跨膜結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)鑒定了位于殘基51-54、76-79、302-305、311-314、374-377、382-385、467-470、563-566的N-糖基化位點(diǎn)及位于殘基107-112、240-245、244-249、281-286、292-297、373-378、400-405、459-464、470-475、531-536和533-538的N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)。原核膜脂蛋白脂質(zhì)附著位點(diǎn)位于殘基522-532，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體家族標(biāo)記1位于殘基41-54。殘基183-191處還有一個(gè)與人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)受體的第二亞基具有顯著同源性的區(qū)。TCCR在TCCR上的細(xì)胞因子受體同源域，即SEQ ID NO1的殘基41-230處與IL-27亞基p28結(jié)合。所述所有hTCCR殘基都依據(jù)SEQ ID NO1的序列編號(hào)。
在成人中，hTCCR在胸腺中最高度表達(dá)，但表達(dá)也見(jiàn)于外周血白細(xì)胞(PBL)、脾，以及在肺中弱表達(dá)。胎兒組織展現(xiàn)出肺和腎中的弱TCCR表達(dá)。
鼠TCCR(mTCCR)的氨基酸序列已經(jīng)公布(1996年5月23日提交的WO97/44455)，可以從GenBank憑入藏登記號(hào)7710109獲得。該序列還描述于Sprecher等，1998，Biochem.Biophys.Res.Commun.246(1)82-90。mTCCR序列的長(zhǎng)度是623個(gè)氨基酸，示于下表1中(SEQ ID NO2)。已經(jīng)鑒定了位于SEQ ID NO2的氨基酸殘基1-24的信號(hào)肽，和氨基酸殘基514-532的跨膜結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)鑒定了位于殘基46-49、296-299、305-308、360-361、368-371和461-464的N-糖基化位點(diǎn)。已經(jīng)鑒定了位于殘基10-13、93-96、130-133、172-175、184-187、235-238、271-274、272-275、323-326、606-609和615-618的酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)。已經(jīng)鑒定了位于殘基202-209附近的酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。已經(jīng)鑒定了位于殘基43-48、102-107、295-300、321-326、330-335、367-342、393-398、525-530和527-532附近的N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)及位于殘基240-243附近的酰胺化位點(diǎn)。原核膜脂蛋白脂質(zhì)附著位點(diǎn)位于殘基516-526附近，生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子受體家族標(biāo)記1位于殘基36-49附近。殘基14-51附近存在與人紅細(xì)胞生成素具有顯著同源性的區(qū)，殘基211-219處存在與鼠白介素-5受體具有顯著同源性的區(qū)。所述所有mTCCR殘基都依據(jù)SEQ ID NO2的序列編號(hào)。
表1 人TCCR和鼠TCCR 102030 40 hTCCR MRGGRGGPFW LWPLPKLALL PLLWVLFQRT RPQGSAGPLQ mTCCR -----MNRLR VARLTPLELL LSLMSLLLGT RPHGSPGPLQ 50 60 70 80 hTCCR CYGVGPLGDL NCSWEPLGDL GAPSELHLQS QKYRSNKTQT mTCCR CYSVGPLGIL NCSWEPLGDL ETPPVLYHQS QKYHPNRVWE 90100110 120 hTCCR VAVAAGRSWV AIPREQLTMS DKLLVWGTKA GQPLWPPVFV mTCCR VKVPSKQSWV TIPREQFTMA DKLLIWGTQK GRPLWSSVSV130140150 160 hTCCR NLETQMKPNA PRLGPDVDFS EDDPLEATVH WAPPTWPSHK mTCCR NLETQMKPDT PQIFSQVDIS EEATLEATVQ WAPPVWPPQK170180190 200 hTCCR VLICQFHYRR CQEAAWTLLE PELKTIPLTP VEIQDLELAT mTCCR ALTCQFRYKE CQAEAWTRLE PQLKTDGLTP VEMQNLEPGT210220230 240 hTCCR GYKVYGRCRM EKEEDLWGEW SPILSFQTPP SAPKDVWVSG mTCCR CYQVSGRCQV ENGYP-WGEW SSPLSFQTPF LDPEDVWVSG250260270 280 hTCCR NLCGTPGGEE PLLLWKAPGP CVQVSYKVWF WVGGRELSPE mTCCR TVCETSGKRA ALLVWKDPRP CVQVTYTVWF GAGDITTTQE290300310320 hTCCR GITCCCSLIP SGAEWARVSA VNATSWEPLT NLSLVCLDSA mTCCR EVPCCKSPVP AWMEWAVVSP GNSTSWVPPT NLSLVCLAPE330340350360 hTCCR SAPRSVAVSS IAGSTELLVT WQPGPGEPLE HVVDWARDGD mTCCR SAPCDVGVSS ADGSPGIKVT WKQGTRKPLE YVVDWAQDGD370380390400 hTCCR PLEKLNWVRL PPGNLSALLP GNFTVGVPYR ITVTAVSASG mTCCR SLDKLNWTRL PPGNLSTLLP GEFKGGVPYR ITVTAVYSGG410420430440 hTCCR LASASSVWGF REELAPLVGP TLWRLQDAPP GTPAIAWGEV mTCCR LAAAPSVWGF REELVPLAGP AVWRLPDDPP GTPVVAWGEV450460470480 hTCCR PRHQLRGHLT HYTLCAQSGT SPSVCMNVSG NTQSVTLPDL mTCCR PRHQLRGQAT HYTFCIQSRG LSTVCRNVSS QTQTATLPNL 490500510520 hTCCR PWGPCELWVT ASTIAGQGPP GPILRLHLPD NTLRWKVLPG mTCCR HSGSFKLWVT VSTVAGQGPP GPDLSLHLPD NRIRWKALPW 530540 550 560 hTCCR ILFLWGLFLL GCGLSLATS----G RCYHLRHKVL PRWVWEKVPD mTCCR FLSLWGLLLM GCGLSLASTRCLQA RCLHWRHKLL PQWIWERVPD 570580590600 hTCCR PANSSSGQPH MEQVPEAQPL GDLPILEVEE MEPPPVMESS mTCCR PANSNSGQPY IKEVSLPQPP KDGPILEVEE VELQPVVES- 610620630636 hTCCR QPAQATAPLD SGYEKHFLPT PEELGLLGPP RPQVLA[SEQ ID NO1] mTCCR --PKASAPIY SGYEKHFLPT PEELGLLV(623)[SEQ ID NO2] IL-27 IL-27是TCCR的一種配體(Pflanz等，2002Immunity 16(6)779-790)。IL-27是由EBI3(EB病毒誘導(dǎo)的基因3)和p28蛋白亞基構(gòu)成的異二聚體細(xì)胞因子。p28是具有三個(gè)接觸面的四螺旋束細(xì)胞因子。第一接觸面結(jié)合EBI3，包含第二和第四α螺旋的殘基。第二接觸面結(jié)合TCCR中的細(xì)胞因子受體同源域，包含第一和第三α螺旋的殘基。第三接觸面結(jié)合IG結(jié)構(gòu)域，諸如在gp130發(fā)現(xiàn)的IG結(jié)構(gòu)域，包含第一螺旋末端和第四螺旋起始的殘基。
人p28的肽序列(SEQ ID NO3)的長(zhǎng)度是243個(gè)氨基酸，而鼠p28的肽序列(SEQ ID NO4)的長(zhǎng)度是234個(gè)氨基酸(Pflanz，NCBI登記號(hào)AAM34499)。如下表2所示，這些序列享有73％的序列同一性。
表2 人和鼠p28 10 20 30 40 hp28 MGQTAGDLGW RLSLLLLPLL LVQAGVWGFP RPPGRPQLSL mp28 MGQVTGDLGW RLSLLLLPLL LVQAGSWGFP TDP----LSL 50 60 70 80 hp28 QELRREFTVS LHLARKLLSE VRGQAHRFAE SHLPGVNLYL mp28 QELRREFTVS LYLARKLLSE VQGYVHSFAE SRLPGVNLDL 90100 110120 hp28 LPLGEQLPDV SLTFQAWRRL SDPERLCFIS TTLQPFHALL mp28 LPLGYHLPNV SLTFQAWHHL SDSERLCFLA TTLRPFPAML 130140150160 hp28 GGLGTQGRWT NMERMQLWAM RLDLRDLQRH LRFQVLAAGF mp28 GGLGTQGTWT SSEREQLWAM RLDLRDLHRH LRFQVLAAGF 170180 190 200 hp28 NLPEEEEEEE EEEEEERKGL -LP-GALGSALQ GPAQVSWPQL mp28 KCSKEEEDKE EEEEEEEEEK KLPLGALGGPNQ VSSQVSWPQL 210220230 243 hp28 LSTYRLLHSL ELVLSRAVRE LLLLSKAGHS VWPLGFPTLSPQP mp28 LYTYQLLHSL ELVLSRAVRD LLLLSLPRRP GSAWDS (234) hp28(SEQ ID NO3) mp28(SEQ ID NO4) EBI3具有可溶性細(xì)胞因子受體的結(jié)構(gòu)并結(jié)合p28上的特異性結(jié)合位點(diǎn)。人EBI3的長(zhǎng)度是229個(gè)氨基酸(Devergne等，1996，J.of Virology 70(2)1143-1153)并具有下表3所示的肽序列(SEQ ID NO5)。
表3 人EBI3 10 2030 40 MTPQLLLALV LWASCPPCSG RKGPPAALTL PRVQCRASRY 50 6070 80 PIAVDCSWTL PPAPNSTSPV SFIATYRLGM AARGHSWPCL 90 100110120 QQTPTSTSCT ITDVQLFSMA PYVLNVTAVH PWGSSSSFVP 130 140 150160 FITEHIIKPD PPEGVRLSPL AERQLQVQWE PPGSWPFPEI 170 180 190200 FSLKYWIRYK RQGAARFHRV GPIEATSFIL RAVRPRARYY 210 220229 VQVAAQDLTD YGELSDWSLP ATATMSLGK (SEQ ID NO5) TCCR/IL-27受體復(fù)合物 圖1顯示了TCCR/IL-27受體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。完整的IL-27受體包含gp130和TCCR亞基。細(xì)胞因子受體同源域位于gp130中，SEQ ID NO6的殘基126-323附近。gp130上存在的其它同源域包括位于SEQ ID NO6的殘基324-423、424-518和519-614附近的三個(gè)III型纖連蛋白結(jié)構(gòu)域，及位于殘基22-122附近的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。還知道gp130是IL-6、IL-11、CNTF、LIF、CT1和CLC的受體的組分(Hibi等，1990，Cell，63(6)1149-1157)。gp130的氨基酸序列(SEQ ID NO6)示于下表4中。
表4 gp130 10 20 30 40 MLTLQTWVVQ ALFIFLTTES TGELLDPCGY ISPESPVVQL 50 60 70 80 HSNFTAVCVL KEKCMDYFHV NANYIVWKTN HFTIPKEQYT 90 100110120 IINRTASSVT FTDIASLNIQ LTCNILTFGQ LEQNVYGITI 130140150160 ISGLPPEKPK NLSCIVNEGK KMRCEWDGGR ETHLETNFTL 170180190200 KSEWATHKFA DCKAKRDTPT SCTVDYSTVY FVNIEVWVEA 210220230240 ENALGKVTSD HINFDPVYKV KPNPPHNLSV INSEELSSIL 250260270280 KLTWTNPSIK SVIILKYNIQ YRTKDASTWS QIPPEDTAST 290300310320 RSSFTVQDLK PFTEYVFRIR CMKEDGKGYW SDWSEEASGI 330340350360 TYEDRPSKAP SFWYKIDPSH TQGYRTVQLV WKTLPPFFAN 370380390400 GKILDYEVTL TRWKSHLQNY TVNATKLTVN LTNDRYLATL 410420430440 TVRNLVGKSD AAVLTIPACD FQATHPVMDL KAFPKDNMLW 450460470480 VEWTTPRESV KKYILEWCVL SDKAPCITDW QQEDGTVHRT 490500510520 YLRGNLAESK CYLITVTPVY ADGPGSPESI KAYLKQAPPS 530540550560 KGPTVRTKKV GKNEAVLEWD QLPVDVQNGF IRNYTIFYRT 570580590600 IIGNETAVNV DSSHTEYTLS SLTSDTLYMV RMAAYTDEGG 610620630640 KDGPEFTFTT PKFAQGEIEA IVVPVCLAFL LTTLLGVLFC 650660670680 FNKRDLIKKH IWPNVPDPSK SHIAQWSPHT PPRHNFNSKD 690700710720 QMYSDGNFTD VSVVEIEAND KKPFPEDLKS LDLFKKEKIN 730740750760 TEGHSSGIGG SSCMSSSRPS ISSSDENESS QNTSSTVQYS 770780790800 TVVHSGYRHQ VPSVQVFSRS ESTQPLLDSE ERPEDLQLVD 810820830840 HVDGGDGILP RQQYFKQNCS QHESSPDISH FERSKQVSSV 850860870880 NEEDFVRLKQ QISDHISQSC GSGQMKMFQE VSAADAFGPG 890900910 918 TEGQVERFET VGMEAATDEG MPKSYLPQTV RQGGYMPQ (SEQ ID NO6) IL-27對(duì)TCCR的活化誘導(dǎo)主要Th1特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)(Lucas等，2003，PNAS，10015047-52)。TCCR活化的效應(yīng)是通過(guò)Stat(轉(zhuǎn)錄的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物和活化物)介導(dǎo)的。具體來(lái)說(shuō)，TCCR活化引起Stat1、Stat3、Stat4和Stat5磷酸化(Lucas等，2003，見(jiàn)上)。下文實(shí)施例中所列數(shù)據(jù)說(shuō)明TCCR活化直接或間接誘導(dǎo)對(duì)自身免疫進(jìn)程的抑制，包括CD8+T淋巴細(xì)胞增殖或Th1應(yīng)答。TCCR和T淋巴細(xì)胞亞型 如上所述，四螺旋束細(xì)胞因子家族(Bazan，J.F.，1990，Proc Natl Acad SciUSA，876934-8)的成員在T輔助細(xì)胞的增殖及由共同前體終末分化為不同Th1和Th2效應(yīng)細(xì)胞群中起作用(O′Garra，1998，Immunity，8275-83)。IL-4主要影響Th2細(xì)胞的發(fā)育，而IL-12則是Th1細(xì)胞分化中的主要因子(Hsieh等，1993，Science，260547-9；Seder等，1993，Proc Natl Acad Sci USA，9010188-92；Le Gros等，1990，J Exp Med，172921-9；Swain等，1991，Immunol Rev，123115-44)。因此，IL-4(Kuhn等，1991，Science，254707-10)、IL-4受體α鏈(Noben-Trauth等，1997，Proc Natl Acad Sci USA，9410838-43)或IL-4特異性轉(zhuǎn)錄因子STAT6(Shimoda等，1996，Nature，380630-3)缺陷型小鼠在Th2應(yīng)答方面是有缺陷的，而IL-12(Magram等，1996，Immunity，4471-81)、IL-12受體(IL-12R)β1鏈(Wu等，1997，J Immunol，1591658-65)或IL-12特異性轉(zhuǎn)錄因子STAT4(Kaplan等，1996，Nature，382174-7)缺陷型小鼠則具有受損的Th1應(yīng)答。
Th1和Th2細(xì)胞亞型衍生自共同的前體，TH-0細(xì)胞。Th1和Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放譜影響效應(yīng)物機(jī)制和細(xì)胞毒性細(xì)胞的選擇。Th1細(xì)胞分泌的IL-2和干擾素-γ活化巨噬細(xì)胞和細(xì)胞毒性細(xì)胞，而Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-5、IL-6和IL-10則傾向于提高嗜酸性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞的產(chǎn)生，以及增強(qiáng)抗體包括IgE的產(chǎn)生并降低細(xì)胞毒性細(xì)胞的功能(Powrie等，1993，Immunol.Today，14270)。一旦建立，Th1或Th2應(yīng)答模式通過(guò)產(chǎn)生通常抑制其它細(xì)胞子集產(chǎn)生細(xì)胞因子的細(xì)胞因子來(lái)保持。例如，IL-4抑制Th1克隆產(chǎn)生干擾素-γ，而干擾素-γ則抑制Th2克隆產(chǎn)生IL-4(Mosmann等，1989，Adv.Immunol.，46111-147；Mosmann等，1989，Annu.Rev.Immunol.，7145-173)。在許多免疫應(yīng)答過(guò)程中，該負(fù)反饋回路加強(qiáng)了極化細(xì)胞因子譜的產(chǎn)生。
細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CD8+)能夠快速破壞其它細(xì)胞。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞利用兩種主要的細(xì)胞溶解途徑穿孔蛋白依賴性胞吐途徑和Fas配體/Fas途徑。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞還是促炎細(xì)胞因子諸如干擾素-γ的產(chǎn)生者。
與Th1應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞因子的過(guò)量生成或CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖可引起自身免疫病，包括同種異體移植物排斥、自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯氏病和橋本氏甲狀腺炎)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、炎性腸病(包括克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、肉芽腫性腸炎、遠(yuǎn)端回腸炎、節(jié)段性回腸炎和末端回腸炎)、胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化、惡性貧血、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
下文實(shí)施例中詳述的研究證明在應(yīng)答非特異性T淋巴細(xì)胞刺激中，缺少TCCR的T淋巴細(xì)胞比表達(dá)TCCR的T淋巴細(xì)胞增殖更多(見(jiàn)實(shí)施例1)。此外，令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與缺少TCCR的小鼠相比，表達(dá)TCCR的小鼠對(duì)自身免疫病較不易感，諸如實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)，一種用于多發(fā)性硬化的動(dòng)物模型(見(jiàn)實(shí)施例2)。
這些資料說(shuō)明TCCR直接或間接介導(dǎo)對(duì)T淋巴細(xì)胞增殖的抑制和Th1介導(dǎo)的生物學(xué)活性。因此，TCCR的激動(dòng)劑可用于抑制T細(xì)胞增殖和/或治療自身免疫病，包括多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
自身免疫病 如上所討論的，T淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖或由Th1或Th2細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子的過(guò)度生成引起宿主的醫(yī)學(xué)疾病。例如，與Th1應(yīng)答有關(guān)的細(xì)胞因子的過(guò)量生成或CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的過(guò)度增殖可引起自身免疫病，包括同種異體移植物排斥、自身免疫性甲狀腺病(例如格雷夫斯氏病和橋本氏甲狀腺炎)、自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎、巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎、炎性腸病(包括克羅恩氏病、潰瘍性結(jié)腸炎、局限性回腸炎、肉芽腫性腸炎、遠(yuǎn)端回腸炎、節(jié)段性回腸炎和末端回腸炎)、胰島素依賴型糖尿病、多發(fā)性硬化、惡性貧血、銀屑病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、硬皮病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
多發(fā)性硬化是認(rèn)為依賴T淋巴細(xì)胞的一種自身免疫性脫髓鞘疾病。MS通常展現(xiàn)出復(fù)發(fā)-緩和的病程或慢性進(jìn)行的病程。MS的病因未知，但是，病毒感染、遺傳傾向性、環(huán)境和自身免疫力都似乎能促成該病。MS患者的損傷包括主要由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的浸潤(rùn)和浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞。CD4+T淋巴細(xì)胞是出現(xiàn)在這些損傷中的主要細(xì)胞類型。MS損傷的特點(diǎn)是斑，即在MRI掃描中看到的與通常的白質(zhì)邊界清楚的脫髓鞘區(qū)。MS斑的組織學(xué)外觀隨不同的疾病階段而改變。在活動(dòng)性損傷中，血腦屏障受損，由此使得血清蛋白質(zhì)外滲進(jìn)入胞外間隙。在血管周圍套囊和整個(gè)白質(zhì)中可見(jiàn)炎癥細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞，尤其是Th1，積聚在斑邊緣的毛細(xì)血管后微靜脈周圍，還在白質(zhì)中分散。在活動(dòng)性損傷中，還觀察到黏附分子及淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞活化的標(biāo)記物諸如IL2-R和CD26的上調(diào)?；顒?dòng)性損傷中的脫髓鞘并不伴有少突膠質(zhì)細(xì)胞的破壞。相反，在疾病的慢性期，損傷的特征為喪失少突膠質(zhì)細(xì)胞，并因此在血液中出現(xiàn)髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)抗體。
自身免疫病存在多種公認(rèn)的動(dòng)物模型。舉例而言，EAE(實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎、)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫病，特征在于T細(xì)胞和單核細(xì)胞炎癥以及隨后中樞神經(jīng)系統(tǒng)中軸突的脫髓鞘。通常認(rèn)為EAE是與人中MS有關(guān)的動(dòng)物模型(參見(jiàn)例如Bolton，C.，1995，Multiple Sclerosis，143)?？梢詫?duì)諸如候選的TCCR激動(dòng)劑等試劑分析T細(xì)胞對(duì)免疫介導(dǎo)的脫髓鞘疾病的刺激或抑制活性，例如使用Current Protocols in Immunology，15.1和15.2單元；Coligan等編，National Institutes of Health，出版商John Wiley&Sons，Inc中描述的方案。也參見(jiàn)其中將少突膠質(zhì)細(xì)胞或許旺氏細(xì)胞移植到中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘疾病模型，例如如Duncan等，1997，Molec.Med.Today，554-561中所述。
關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型有膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。參見(jiàn)例如McIndoe等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，962210-2214。該模型具有人自身免疫性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的臨床、組織學(xué)和免疫學(xué)特性，并且是人自身免疫性關(guān)節(jié)炎的公認(rèn)模型。小鼠和大鼠模型的特征為滑膜炎、軟骨侵蝕和軟骨下骨。膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎具有人的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的許多特征，包括淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜肥大。參見(jiàn)例如McIndoe等，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，962210-2214?？衫眠@些模型的潛在的TCCR激動(dòng)劑分析對(duì)自身免疫性關(guān)節(jié)炎的活性，例如使用Current Protocols in Immunology，15.5單元；Coligan等編，National Institutes ofHealth，出版商John Wiley&Sons，Inc中描述的方案。也參見(jiàn)Issekutz，A.C.等，Immunology(1996)88569中描述的利用針對(duì)CD18和VLA-4整聯(lián)蛋白的單克隆抗體的模型。
皮膚同種異體移植物排斥的動(dòng)物模型是測(cè)試T細(xì)胞介導(dǎo)體內(nèi)組織破壞的能力的一種手段，即指示并測(cè)量它們?cè)诳共《竞湍[瘤免疫中的作用。最常見(jiàn)和公認(rèn)的模型利用鼠尾部皮膚移植物。重復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示皮膚同種異體移植物排斥是通過(guò)T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞和殺傷-效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的，而非抗體。參見(jiàn)例如Auchincloss和Sachs，1998，在Fundamental Immunology中，第2版，W.E.Paul編，Raven Press，NY，第889-992頁(yè)。一種合適的流程詳述于CurrentProtocols in Immunology，4.4單元；Coligan等編，1995，National Institutes ofHealth，出版商John Wiley&Sons，Inc。其它可用于篩選候選的TCCR激動(dòng)劑的移植排斥模型包括例如Tanabe等，1994，Transplantation，5823和Tinubu等，1994，J.Immunol.，4330-4338所描述的同種異基因心臟移植模型。
TCCR激動(dòng)劑 TCCR激動(dòng)劑是增強(qiáng)或刺激本文所披露的天然序列TCCR肽的生物學(xué)活性的分子。合適的激動(dòng)劑分子具體包括激動(dòng)劑抗體，包括人源化抗體或激動(dòng)劑抗體片段，包括Fab、Fab’、Fd、Fd’、Fv、dAb、無(wú)鉸鏈抗體、F(ab’)2片段、單鏈抗體分子、雙抗體、單臂抗原結(jié)合分子和線性抗體、天然多肽的氨基酸序列變體或片段、肽、小分子、等等。
合適的TCCR激動(dòng)劑還包括TCCR的肽片段、TCCR胞外結(jié)構(gòu)域和與下列氨基酸序列具有至少約80％氨基酸序列同一性的TCCR變體 (a1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的殘基1或約33至636； (a2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的殘基1或約25至623； (b1)SEQ ID NO1的人TCCR肽的X3至636，其中X3是SEQ ID NO1的氨基酸殘基27至37任一； (b2)SEQ ID NO2的鼠TCCR肽的X4至623，其中X4是SEQ ID NO2的氨基酸殘基20至30任一； (c1)1或約33至X1，其中X1是SEQ ID NO1的殘基512至殘基522的任意氨基酸殘基； (c2)1或約25至X2，其中X2是SEQ ID NO2的殘基509至殘基519的任意氨基酸殘基； (d1)X5至636，其中X5是SEQ ID NO1的殘基533至543的任意氨基酸； (d2)X6至623，其中X6是SEQ ID NO2的殘基527至537的任意氨基酸；或 (e)SEQ ID NO1和SEQ ID NO2的氨基酸序列的另外具體衍生的片段。
TCCR激動(dòng)劑包括例如其中在SEQ ID NO1和SEQ ID NO2序列的N-和/或C-末端或一個(gè)或多個(gè)內(nèi)部結(jié)構(gòu)域中添加或刪除一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的TCCR肽。
TCCR激動(dòng)劑包括天然序列IL-27、EBI3、p28、其具有與IL-27異二聚體通常有關(guān)的生物學(xué)活性的變體和片段。例如，TCCR激動(dòng)劑包括與IL-27的天然序列組分具有至少80％、90％、95％或99％序列同一性的IL-27變體。TCCR激動(dòng)劑還包括與天然序列人p28(SEQ ID NO3)或鼠p28(SEQ IDNO4)具有至少73％、75％、80％、90％、95％或99％序列同一性的p28變體。TCCR激動(dòng)劑包括p28中能夠結(jié)合TCCR和gp130的部分。舉例來(lái)說(shuō)，TCCR激動(dòng)劑包括與天然序列人p28(SEQ ID NO3)或鼠p28(SEQ ID NO4)具有至少73％、75％、80％、90％、95％或99％序列同一性且能夠結(jié)合TCCR和gp130的p28變體。TCCR激動(dòng)劑包括含有來(lái)自p28的第一和第三α螺旋的殘基及位于第一螺旋末端和第四螺旋起始的殘基的p28肽變體，認(rèn)為前者結(jié)合TCCR中在TCCR上發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子受體同源結(jié)構(gòu)域的區(qū)，認(rèn)為后者結(jié)合gp130上發(fā)現(xiàn)的IG結(jié)構(gòu)域。
TCCR激動(dòng)劑包括例如能夠結(jié)合并活化TCCR的分子。TCCR激動(dòng)劑還包括能夠使TCCR形成同二聚體的分子和/或那些能夠使TCCR和gp130形成異二聚體的分子。例如，針對(duì)TCCR的抗體可能能夠使TCCR形成同二聚體。作為進(jìn)一步的例子，對(duì)TCCR和gp130兩者特異的二價(jià)抗體可能能夠使TCCR和gp130形成異二聚體。
鑒定TCCR肽的激動(dòng)劑或拮抗劑的方法可包括使TCCR肽與候選的激動(dòng)劑或拮抗劑分子接觸，并測(cè)量與TCCR肽有關(guān)的一種或多種生物學(xué)活性的可檢測(cè)變化。例如，為了鑒定激動(dòng)劑，使表達(dá)TCCR肽的細(xì)胞與候選物接觸，然后利用蛋白質(zhì)印跡或其它合適的測(cè)定法，對(duì)發(fā)生接觸的細(xì)胞分析TCCR的生物學(xué)活性，諸如Stat1、Stat3、Stat4或Stat5的磷酸化。為了鑒定TCCR激動(dòng)劑，還可使經(jīng)過(guò)改造而表達(dá)TCCR肽的細(xì)胞諸如Ba/F3細(xì)胞與候選的激動(dòng)劑接觸，然后例如通過(guò)測(cè)量[3H]標(biāo)記的胸苷摻入或其它合適的測(cè)定法，對(duì)發(fā)生接觸的細(xì)胞分析增殖。
單克隆抗體 已知多種用于生產(chǎn)單克隆抗體的技術(shù)。在一種方法中，例如，用TCCR或其一部分作為免疫原，在完全弗氏佐劑中乳化，并以1-100微克的量皮下或腹膜內(nèi)注射，由此免疫小鼠諸如Balb/c?；蛘撸庖咴贛PL-TDM佐劑(Ribi Immunochemical Research，Hamilton，MT)中乳化，并注射到動(dòng)物的后爪墊中。然后在10-12天后用在選擇的佐劑中乳化的追加的免疫原加強(qiáng)經(jīng)過(guò)免疫的小鼠。此后，過(guò)幾周，再用追加的免疫接種注射加強(qiáng)小鼠。通過(guò)眼窩后采血，可周期性獲取小鼠的血清樣品，供ELISA測(cè)試之用，以檢測(cè)抗TCCR抗體。
在檢測(cè)到合適的抗體滴度后，可以給抗TCCR抗體“陽(yáng)性”的動(dòng)物注射最后一次免疫原靜脈內(nèi)注射。3-4天后，處死小鼠并采集脾細(xì)胞。然后將脾細(xì)胞與選擇的鼠骨髓瘤細(xì)胞系諸如可從ATCC，No.CRL 1597獲得的P3X63AgU.1融合(使用35％聚乙二醇)。接著可將融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞鋪在裝有HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培養(yǎng)基以抑制非融合細(xì)胞、骨髓瘤雜合體和脾細(xì)胞雜合體增殖的96孔組織培養(yǎng)板中。
可在ELISA或其它合適的測(cè)定法中對(duì)選擇的雜交瘤細(xì)胞篩選針對(duì)TCCR的反應(yīng)性?？蓪㈥?yáng)性雜交瘤細(xì)胞腹膜內(nèi)注射到例如同基因Balb/c小鼠中以產(chǎn)生含有抗TCCR單克隆抗體的腹水?；蛘撸稍诶缃M織培養(yǎng)瓶或滾瓶中培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞?？衫昧蛩徜@沉淀、接著通過(guò)凝膠排組層析或其它合適的方法進(jìn)行腹水中所產(chǎn)生的單克隆抗體的純化?；蛘?，可利用基于抗體與蛋白A或蛋白G結(jié)合的親和層析。
TCCR-/-小鼠 已經(jīng)構(gòu)建了不表達(dá)TCCR的“敲除型”小鼠(TCCR-/-)。這樣的小鼠可例如通過(guò)編碼TCCR的內(nèi)源基因和導(dǎo)入動(dòng)物胚細(xì)胞、編碼相同肽的改變的基因組DNA之間的同源重組來(lái)制備。
例如，依據(jù)已建立的技術(shù)，編碼特定肽的cDNA可用于克隆編碼該肽的基因組DNA。編碼特定肽的基因組DNA的一部分可刪除或用另一種基因替換，諸如編碼可用于監(jiān)測(cè)整合的選擇標(biāo)志的基因。典型的，載體中包含幾千堿基對(duì)的未改變的側(cè)翼DNA(5′和3′末端都有)(關(guān)于同源重組載體的描述參見(jiàn)Thomas等，1987，Cell，51503)。將該載體導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞系(諸如通過(guò)電穿孔)，并選擇其中導(dǎo)入的DNA與內(nèi)源DNA發(fā)生了同源重組的細(xì)胞。參見(jiàn)例如Li等，1992，Cell，69915。然后將選擇的細(xì)胞注射到動(dòng)物(諸如小鼠或大鼠)的胚泡中以形成聚集嵌合體，例如如Bradley等，1987，在Teratocarcinomasand Embryonic Stem CellsA Practical Approach中，E.J.Robertson編，IRL，Oxford，pp.113-152所述。接著可將嵌合胚植入合適的假孕雌性代孕動(dòng)物，并使胚胎足月生產(chǎn)以創(chuàng)建“敲除型”動(dòng)物。在其生殖細(xì)胞中具有同源重組DNA的后代可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定，并用于繁殖其中所有動(dòng)物細(xì)胞都含有同源重組DNA的動(dòng)物。
關(guān)于下文實(shí)施例中所使用的TCCR-/-小鼠的創(chuàng)建的描述見(jiàn)WO0129070(de Sauvage等)和Chen等，2000，Nature，407916，在此收入其內(nèi)容作為參考。
組合物和治療 可用于治療自身免疫病的TCCR激動(dòng)劑包括但不限于調(diào)控免疫功能例如T細(xì)胞增殖/活化、淋巴因子釋放或免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的蛋白質(zhì)、抗體、片段和變體、有機(jī)小分子、肽、磷酸肽、等等。具體而言，本文中所描述的TCCR激動(dòng)劑可用于抑制、減少或降低T淋巴細(xì)胞增殖、T淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子釋放和自身免疫病。
可通過(guò)上無(wú)討論的任一篩選測(cè)定法和/或任何其它已知篩選技術(shù)來(lái)鑒定TCCR激動(dòng)劑。
根據(jù)已知方法，可配制本發(fā)明的TCCR激動(dòng)劑以制備有用的組合物，由此TCCR激動(dòng)劑與可接受的載體結(jié)合。通過(guò)將具有期望純度的TCCR激動(dòng)劑與任選的可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合，以凍干劑型或水溶液的形式制備用于存儲(chǔ)的配制劑。參見(jiàn)例如RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第20版，Gennaro編(2000)?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對(duì)接受者是無(wú)毒的，包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個(gè)殘基)肽；蛋白質(zhì)，諸如血清請(qǐng)蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；和/或非離子型表面活性劑，諸如TWEEN、PLURONICS或PEG。
將要用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無(wú)菌的。這可在凍干和重建之前或之后容易的通過(guò)無(wú)菌濾膜過(guò)濾來(lái)實(shí)現(xiàn)。
在本文中，組合物通常置于具有無(wú)菌出入口的容器中，例如靜脈注射溶液袋或具有皮下注射針頭能刺穿的塞子的小瓶。
施用途徑與已知方法一致，諸如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、眼內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)或損傷內(nèi)途徑注射或輸注，局部施用，或通過(guò)持續(xù)釋放系統(tǒng)。施用途徑還可包括作為轉(zhuǎn)染合適載體諸如腺病毒載體的結(jié)果的體內(nèi)表達(dá)。
本發(fā)明藥物組合物的劑量和期望藥物濃度可隨預(yù)期的具體用途而變化。適宜施用劑量或途徑的確定完全在普通醫(yī)師的技術(shù)范圍內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了對(duì)確定用于人治療的有效劑量的可靠指導(dǎo)。有效劑量的物種間縮放可遵循Mordenti，J.和Chappell，W.，″The use of interspecies scaling in toxicokinetics″，在Toxicokinetics and New Drug Development中，Yacobi等編，Pergamon Press，New York 1989，pp.42-96所制定的原則進(jìn)行。
在采取體內(nèi)施用TCCR激動(dòng)劑時(shí)，根據(jù)施用途徑，正常的劑量可在每天約10ng/kg至100mg/kg哺乳動(dòng)物體重或更多之間變化，例如約1μg/kg/天至10mg/kg/天。文獻(xiàn)中提供了關(guān)于投遞的具體劑量和方法的指導(dǎo)；參見(jiàn)例如美國(guó)專利號(hào)4,657,760；5,206,344；或5,225,212?？梢灶A(yù)料，不同配制劑將對(duì)不同治療和不同疾病有效，而且旨在治療特定器官或組織的施用可能必需以不同于其它器官或組織的方式進(jìn)行投遞。
在具有適合于治療任何需要施用TCCR激動(dòng)劑的疾病或病癥的釋放特性的劑型中期望TCCR激動(dòng)劑持續(xù)釋放施用時(shí)，設(shè)想將TCCR激動(dòng)劑微囊化。用于持續(xù)釋放的重組蛋白的微囊化已經(jīng)成功的在人生長(zhǎng)激素(rhGH)，干擾素-α、-β、-γ，白介素-2和MN rgp120上實(shí)現(xiàn)。參見(jiàn)例如Johnson等，1996，Nat.Med.2795-799；Yasuda，1993，Biomed.Ther.，1221-1223；Hora等，1990，Bio/Technology，755-758；Cleland，1995，″Design and Production of SingleImmunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems″，在Vaccine DesignThe Subunit and Adjuvant Approach中，Powell和Newman編，Plenum PressNew York，第439-462頁(yè)；WO 97/03692，WO 96/40072，WO96/07399和美國(guó)專利號(hào)5,654,010。
可利用聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)，一種展示出強(qiáng)生物相容性水平和廣泛的生物可降解特性的聚合物，來(lái)開(kāi)發(fā)TCCR激動(dòng)劑的持續(xù)釋放劑型。PLGA的降解產(chǎn)物，乳酸和乙醇酸，可從人體中快速清除。此外，根據(jù)其分子量和組成，該聚合物的可降解性能可在幾個(gè)月到幾年的范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。詳情參見(jiàn)Lewis，″Controlled Release of Bioactive Agents from Lactide/Glycolidepolymer″，在Biogradable Polymers as Drug Delivery Systems中，M.Chasin和R.Langeer編，Marcel DekkerNew York，1990，第1-41頁(yè)。
實(shí)施例 參照下文實(shí)施例可以更好的理解本發(fā)明。這些實(shí)施例旨在代表本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而非意在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1TCCR介導(dǎo)的對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的抑制 通過(guò)分析野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)脾細(xì)胞的誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，測(cè)試TCCR活性對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的效應(yīng)。T細(xì)胞受體與CD3結(jié)合，形成T細(xì)胞受體復(fù)合物。足夠劑量的抗CD3抗體非特異性刺激T細(xì)胞的增殖，所述T細(xì)胞通常與T細(xì)胞受體復(fù)合物和抗原呈遞細(xì)胞(APC)的II類MHC分子(CD4)的相互作用有關(guān)。
野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)混合淋巴細(xì)胞、分離的CD4+T細(xì)胞、及分離的CD8+T細(xì)胞的增殖受抗CD3抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA，克隆145-2c11)所刺激。將細(xì)胞在增濕的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，并通過(guò)在該測(cè)定的最后8-16小時(shí)期間測(cè)量的[3H]-胸苷摻入測(cè)定增殖。令人驚奇的是，如表5和圖5所示，在亞最大(submaximal)的抗CD3劑量下，抗CD3抗體誘導(dǎo)的獲自敲除型小鼠(TCCR-/-)的混合淋巴細(xì)胞的增殖顯著高于獲自野生型小鼠(TCCR+/+、)的淋巴細(xì)胞的增殖。該數(shù)據(jù)說(shuō)明TCCR活性的保護(hù)效應(yīng)，例如，抑制受到刺激的T細(xì)胞增殖，以及用激動(dòng)劑刺激TCCR可能可用于直接或間接抑制T細(xì)胞應(yīng)答，諸如T細(xì)胞增殖。
表5 但是，分別如圖6(表6)和圖7(表7)所示，在野生型和敲除型細(xì)胞之間，抗CD3抗體誘導(dǎo)的分離的CD4+T細(xì)胞和分離的CD8+T細(xì)胞的增殖沒(méi)有顯著差異。該數(shù)據(jù)說(shuō)明IL-27，TCCR的一種配體，是由CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞以外的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的。
表6 表7 接著，在CFSE(二醋酸羧基熒光素，琥珀酰亞胺酯)標(biāo)記測(cè)定中測(cè)量CD4+和CD8+細(xì)胞應(yīng)答抗CD3抗體刺激的增殖。因?yàn)樵诿看渭?xì)胞分裂后標(biāo)記細(xì)胞失去它們熒光強(qiáng)度的50％，故CFSE標(biāo)記使得細(xì)胞分裂數(shù)得以監(jiān)測(cè)。用CFSE標(biāo)記野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)混合淋巴細(xì)胞懸浮液以在細(xì)胞懸浮液中形成0.5μM CFSE(Sigma，St.Louis，MO)的濃度。然后將細(xì)胞懸浮液在37℃溫育10分鐘。標(biāo)記后，F(xiàn)CS添加到5％終濃度，細(xì)胞立刻離心并用冰冷的PBS洗滌。用2.5μg/ml濃度的抗CD3抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA，克隆145-2c11)刺激野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)混合淋巴細(xì)胞的增殖。
接著將細(xì)胞在37℃溫育2天。此刻用CD4+和CD8+的標(biāo)志物(CD4-Cychrome或CD8-Cychrome)標(biāo)記細(xì)胞并通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析。
下文所示數(shù)據(jù)顯示了在TCCR敲除型細(xì)胞中CD4+和CD8+兩種陽(yáng)性T細(xì)胞都是過(guò)度增殖的(見(jiàn)表8)。圖10和11描繪了在溫育期經(jīng)歷了0、1、2、3、4或5次細(xì)胞分裂的細(xì)胞數(shù)。對(duì)于CD4+和CD8+兩種T細(xì)胞，與野生型相比，在敲除型中有更多的細(xì)胞經(jīng)歷了3、4和5次分裂(即在CD4+細(xì)胞(圖14)和CD8+細(xì)胞(圖15)中敲除型細(xì)胞的線右移)。
表8 實(shí)施例2表達(dá)TCCR的小鼠對(duì)EAE較不易感 實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是一種用作多發(fā)性硬化(MS)動(dòng)物模型的CNS自身免疫病。與MS類似，EAE是一種脫髓鞘疾病，其中免疫介導(dǎo)的對(duì)髓鞘的損害產(chǎn)生可觀察到的癥狀。認(rèn)為EAE是通過(guò)CD4+Th1細(xì)胞(Fife等，2001，J.of Immun.，1667617-7624)和CD8+細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)(Huseby等，2001，J.EXp.Med.，194(5)669-676)介導(dǎo)的。為了檢驗(yàn)TCCR對(duì)EAE的作用，在表達(dá)TCCR的野生型小鼠(TCCR+/+)和缺少TCCR的敲除型小鼠(TCCR-/-)中檢查EAE的臨床進(jìn)展。如下所示，與缺少TCCR的小鼠相比，表達(dá)TCCR的小鼠對(duì)CD4+Th1和CD8+介導(dǎo)的疾病EAE較不易感。
敲除型TCCR-/-小鼠如WO0129070(de Sauvage等)中所述產(chǎn)生，回交到C57BL/6背景上，并從N12建立者(founders)繁殖。野生型TCCR+/+對(duì)照是購(gòu)自Jackson Laboratory(Bar Harbor，ME)的C57BL/6小鼠。
MOG誘導(dǎo)的EAE MOG 35-55肽具有氨基酸序列MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK(SEQID NO7)，在Rainin Quartet自動(dòng)化肽合成儀(Rainin，Oakland，CA)上使用9-芴基甲氧羰基化學(xué)法合成。將該肽從樹(shù)脂上切下并使用制備性反相HPLC純化，流動(dòng)相中具有水/乙腈/0.1％TFA梯度。通過(guò)電噴射質(zhì)譜法確認(rèn)肽的身份(identity)。
給野生型TCCR+/+和敲除型TCCR-/-小鼠皮內(nèi)免疫200μl含有溶于100μl PBS和100μl CFA(完全弗氏佐劑)中的200μg MOG 35-55肽的乳狀液，以在第0天誘導(dǎo)EAE。通過(guò)將IFA(不完全弗氏佐劑)(Difco-BD DiagnosticSystems，Sparks，MD)與死亡且干燥的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)H37A(Difco-BD Diagnostic Systems，Sparks，MD)混合至8mg/ml結(jié)核分枝桿菌的濃度來(lái)制備CFA(每只小鼠接種800μg死亡的結(jié)核分枝桿菌作為CFA的組分)。在第0天及再次在第2天，給每只小鼠腹膜內(nèi)注射溶于100μl PBS中的200ng百日咳毒素(List Biological Laboratories，Campbell，CA)以幫助穿透血腦屏障。各成分的劑量概述于下表9中。
表9 MBP誘導(dǎo)的EAE Ac 1-11肽具有氨基酸序列ASQKRPSQRHG(SEQ ID NO8)，在RaininQuartet自動(dòng)化肽合成儀(Rainin，Oakland，CA)上使用9-芴基甲氧羰基化學(xué)法合成。將該肽從樹(shù)脂上切下并使用制備性反相HPLC純化，流動(dòng)相中具有水/乙腈/0.1％TFA梯度。通過(guò)電噴射質(zhì)譜法確認(rèn)肽的身份(identity)。
給野生型TCCR+/+和敲除型TCCR-/-小鼠皮內(nèi)免疫溶于100μl CFA(完全弗氏佐劑)中的10μg Ac 1-11肽(ASQKRPSQRHG)，髓鞘堿性蛋白的一種組分，以在第0天誘導(dǎo)EAE。如上關(guān)于MOG誘導(dǎo)的EAE所討論的，通過(guò)將IFA(不完全弗氏佐劑)與結(jié)核分枝桿菌H37A(死亡且干燥的)混合至8mg/ml結(jié)核分枝桿菌的濃度來(lái)制備CFA(每只小鼠接種800μg死亡的結(jié)核分枝桿菌作為CFA的組分)。在第2天及再次在第3天，給每只小鼠腹膜內(nèi)注射溶于100μl PBS中的200ng百日咳毒素以幫助穿透血腦屏障。各成分的劑量概述于下表10中。
表10 對(duì)所有小鼠評(píng)估臨床疾病，每周3次，在第1天開(kāi)始。達(dá)到疾病4級(jí)的小鼠每日評(píng)估。對(duì)任何達(dá)到5級(jí)的動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。對(duì)那些在5天內(nèi)未能改善為3級(jí)或更低的動(dòng)物實(shí)施安樂(lè)死。所使用的臨床分級(jí)系統(tǒng)如下表11所示 表11 在第40天，處死所有剩余動(dòng)物并剝離腦和脊髓用于組織學(xué)分析。將腦切片，對(duì)于每個(gè)腦，四個(gè)水平中的每一水平切一片切片，并用H&E(蘇木精曙紅染料，Sigma，St.Louis，MO)染色以評(píng)估炎癥。將脊髓切片，對(duì)于每個(gè)脊髓，三個(gè)不同水平中的每一水平切四片切片，并用H&E染色以評(píng)估炎癥，以及用勒克司堅(jiān)牢藍(lán)(Luxol Fast Blue)(VWR Scientific，St.Paul，MN)染色以評(píng)估脫髓鞘。對(duì)于每個(gè)載玻片，報(bào)告炎癥和脫髓鞘的最高得分和平均得分(每個(gè)載玻片上所有切片的平均得分)。所使用的炎癥分級(jí)系統(tǒng)如下表12所示 表12 所使用的脫髓鞘分級(jí)系統(tǒng)如下表13所示 表13 與在敲除型(TCCR-/-)小鼠中誘導(dǎo)的EAE相比，在野生型(TCCR+/+)中MOG(髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白)誘導(dǎo)的EAE(實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎)的臨床進(jìn)展較不嚴(yán)重(見(jiàn)圖8)。類似的，與在敲除型(TCCR-/-)小鼠中誘導(dǎo)的EAE相比，在野生型(TCCR+/+)中MBP(髓鞘堿性蛋白)誘導(dǎo)的EAE的臨床進(jìn)展較不嚴(yán)重(見(jiàn)圖9)。
如圖8和9所示，缺少TCCR的動(dòng)物(TCCR-/-)顯示更嚴(yán)重的EAE臨床癥狀，而表達(dá)的TCCR的小鼠(野生型)則顯示出較不嚴(yán)重的癥狀和進(jìn)展，說(shuō)明TCCR活性對(duì)自身免疫病諸如EAE的保護(hù)效應(yīng)。
圖10-13中所示的組織學(xué)分析進(jìn)一步支持了臨床數(shù)據(jù)。與野生型小鼠相比，TCCR-/-小鼠具有更高的炎癥和更高的脫髓鞘得分，表明與缺少TCCR的小鼠(TCCR-/-)相比，表達(dá)TCCR的小鼠(野生型)對(duì)CD4+Th1和CD8+介導(dǎo)的疾病EAE較不易感。
總之，數(shù)據(jù)說(shuō)明TCCR活性對(duì)自身免疫病諸如EAE的保護(hù)、壓制或抑制效應(yīng)。
實(shí)施例3用TCCR激動(dòng)劑治療自身免疫病 如實(shí)施例2所述，實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)是用作多發(fā)性硬化(MS)動(dòng)物模型的CD4+Th1或CD8+介導(dǎo)的CNS自身免疫病。為了檢驗(yàn)所施用的TCCR激動(dòng)劑對(duì)自身免疫病的進(jìn)展和病程的效應(yīng)，在MS的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ拖到y(tǒng)諸如誘導(dǎo)的EAE中施用TCCR激動(dòng)劑諸如IL-27。如例如上文實(shí)施例2所述，在小鼠中發(fā)起EAE。在表達(dá)TCCR(TCCR+/+)并接受TCCR激動(dòng)劑諸如IL-27的小鼠中評(píng)估EAE的臨床進(jìn)展。與未治療的TCCR+/+對(duì)照相比，用TCCR激動(dòng)劑諸如IL-27治療的小鼠預(yù)期顯示出減輕的疾病臨床癥狀或進(jìn)展和/或?qū)ψ陨砻庖卟≥^不易感。
實(shí)施例4用TCCR激動(dòng)劑治療動(dòng)物模型中的關(guān)節(jié)炎 可在幾種可利用的動(dòng)物模型系統(tǒng)之一中測(cè)試TCCR激動(dòng)劑對(duì)自身免疫病的抑制和/或保護(hù)效應(yīng)。小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎是自身免疫病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的模型。該模型描述于例如McIndoe等，1999，PNAS USA 962210-2214中。小鼠中膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎與人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎具有許多共同特征，包括淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜肥大。
在小鼠例如C57BL/6小鼠或其它合適的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中檢驗(yàn)?zāi)z原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎的臨床進(jìn)展。例如通過(guò)McIndoe等，見(jiàn)上中所描述的方法或其它已知方法，在測(cè)試動(dòng)物中誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎。一般而言，通過(guò)將衍生自不同動(dòng)物物種的II型膠原注射到測(cè)試動(dòng)物中來(lái)產(chǎn)生模型動(dòng)物，例如將牛II型膠原注射到小鼠中。膠原可以與佐劑諸如完全弗氏佐劑聯(lián)合使用。
例如，在施用誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的試劑之前、期間和/或之后，或者在關(guān)節(jié)炎癥狀發(fā)作之前、期間和/或之后，將TCCR激動(dòng)劑諸如TCCR配體IL-27施用于測(cè)試動(dòng)物。施用方法和劑量可以變化，包括例如施用載體中的肽配體諸如IL-27，例如以每天一劑在前(pre)和/或在后(post)劑量，以多劑量，在兩劑或多劑在前和/或在后劑量的一段時(shí)期內(nèi)每天一次，或?qū)τ趯㈦脑噭┦┯糜诒磉_(dá)TCCR受體的細(xì)胞已知的其它合適劑量?；蛘甙ㄍㄟ^(guò)自重組腺病毒表達(dá)肽來(lái)投遞肽配體諸如IL-27，例如表達(dá)IL-27的兩種亞基或連接的IL-27細(xì)胞因子。
例如如McIndoe等，見(jiàn)上中所述，監(jiān)測(cè)測(cè)試和對(duì)照動(dòng)物中臨床疾病的進(jìn)展。例如，在一段時(shí)期內(nèi)監(jiān)測(cè)疾病的物理和化學(xué)特征并對(duì)其打分?？蓪?duì)動(dòng)物分析主要關(guān)節(jié)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜肥大、滑液中細(xì)胞因子含量、等等。在測(cè)試動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物之間比較這些參數(shù)。與實(shí)施例1和2中所證明的TCCR的保護(hù)/抑制效應(yīng)一致，用TCCR激動(dòng)劑治療動(dòng)物中誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎預(yù)期提供抑制和/或保護(hù)效應(yīng)，與未治療的對(duì)照動(dòng)物相比，展示出不及其嚴(yán)重的臨床癥狀、結(jié)果和/或物理或化學(xué)特征。
實(shí)施例5針對(duì)TCCR的單克隆抗體的制備 使用hTCCR的胞外結(jié)構(gòu)域制備針對(duì)hTCCR的單克隆抗體。免疫原是缺少跨膜部分(SEQ ID NO1的殘基517-538)的hTCCR(SEQ ID NO1)，在羧基末端添加有8個(gè)組氨酸殘基標(biāo)記供純化目的。通過(guò)鎳NTA親和層析純化hTCCR(ECD)-(His)8肽。
將hTCCR(ECD)-(His)8肽(1-2微克)與25微升MPL-TDM佐劑(RibiImmunochemical Research，Hamilton，MT)混合，并注射到野生型balb/c小鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)的足墊中，每周兩次，總共注射12次。
在第42天，處死小鼠并采集脾細(xì)胞。將脾細(xì)胞與鼠骨髓瘤細(xì)胞(P3X63AgU.1，可從ATCC，No.CRL 1597獲得)融合(使用35％聚乙二醇)。然后將融合產(chǎn)生的雜交瘤細(xì)胞鋪在裝有HAT(次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷)培養(yǎng)基以抑制非融合細(xì)胞、骨髓瘤雜合體和脾細(xì)胞雜合體增殖的96孔組織培養(yǎng)板中。
然后在ELISA中對(duì)雜交瘤細(xì)胞篩選結(jié)合TCCR的抗體。鑒定出具有對(duì)TCCR的反應(yīng)性的雜交瘤培養(yǎng)物包括培養(yǎng)物2685、2686和2688。雜交瘤培養(yǎng)物2686(抗體2686)于2004年12月15日保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，Va)，入藏登記號(hào)ATCC PTA-6447。
實(shí)施例6單克隆Ab 2686活化人TCCR 使用表達(dá)重組TCCR的Ba/F3細(xì)胞分析抗TCCR抗體活化TCCR的能力。Ba/F3細(xì)胞是一種鼠IL-3依賴性細(xì)胞系?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量表達(dá)TCCR的Ba/F3細(xì)胞應(yīng)答候選激動(dòng)劑的增殖來(lái)評(píng)估候選的TCCR激動(dòng)劑。由于多核苷酸的合成增加，因此細(xì)胞增殖導(dǎo)致[3H]-胸苷摻入增加。例如通過(guò)測(cè)量[3H]-胸苷攝取來(lái)監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖。如下所示，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)TCCR的Ba/F3細(xì)胞增殖，單克隆抗體AB 2686展現(xiàn)出TCCR激動(dòng)劑活性。
Ba/F3細(xì)胞(Palacios等，1985，Cell，41727-734)是一種鼠造血因子依賴性細(xì)胞系，其生長(zhǎng)和生存都需要IL-3。Ba/F3細(xì)胞在補(bǔ)充有10％胎牛血清(GIBCO，Carlsbad，CA)和100pg/mL小鼠IL-3(R&D Systems，Minneapolis，MN)的RPMI-1640培養(yǎng)基(GIBCO，Carlsbad，CA)中培養(yǎng)。
通過(guò)電穿孔將帶有新霉素抗性基因并包含編碼人或鼠TCCR的多核苷酸序列的pMSCV載體(Clontech，Palo Alto，CA)轉(zhuǎn)染到Ba/F3細(xì)胞中。用1mg/ml G418(Clontech，Palo Alto，CA)處理穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染子以選擇已經(jīng)轉(zhuǎn)染了含有新霉素抗性基因的載體的穩(wěn)定真核細(xì)胞系。然后用藻紅蛋白標(biāo)記的識(shí)別TCCR的單克隆抗體處理細(xì)胞。通過(guò)FACS選擇標(biāo)記的表達(dá)TCCR的克隆。
用補(bǔ)充有10％胎牛血清但未補(bǔ)充IL-3的RPMI-1640培養(yǎng)基洗滌表達(dá)TCCR的細(xì)胞。然后將細(xì)胞以5×103個(gè)細(xì)胞/孔鋪在100μl補(bǔ)充有10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，一式兩份。以下表14所示的4∶1連續(xù)稀釋的濃度添加純化的重組鼠IL-3(陽(yáng)性對(duì)照)或純化的抗TCCR(人)單克隆抗體 2685-IgG2a、2686-IgG1、2688-IgG1、對(duì)照同種型IgG2a(BD Pharmingen，SanDiego，CA)或?qū)φ胀N型IgG1(BD Pharmingen，San Diego，CA)。
表14 在48小時(shí)后，將1μCi[3H]-胸苷(Amersham-Pharmacia，Piscataway，NJ)添加到每個(gè)孔中。在又6小時(shí)后，在β-計(jì)數(shù)器(Packard Topcount，PerkinElmerLife and Analytical Sciences，Boston，MA)中測(cè)量摻入細(xì)胞中的[3H]-胸苷。
結(jié)果示于圖2-4。表達(dá)人TCCR的Ba/F3細(xì)胞應(yīng)答單克隆抗體2685-IgG2a、2686-IgG1、2688-IgG1和對(duì)照同種型IgG2a和同種型IgG1的增殖示于圖2。與任何其它所測(cè)試的抗體相比，抗體2686誘導(dǎo)的[3H]-胸苷摻入顯著更多，證明抗體2686是Ba/F3細(xì)胞中表達(dá)的人TCCR的有效激動(dòng)劑。
表達(dá)人TCCR的Ba/F3細(xì)胞應(yīng)答鼠IL-3(陽(yáng)性對(duì)照)或抗體2686的增殖示于圖3。如所示，雖然不如陽(yáng)性對(duì)照IL-3，抗體2686在表達(dá)人TCCR的Ba/F3細(xì)胞中有效產(chǎn)生TCCR應(yīng)答。
如圖4所示，與表達(dá)鼠TCCR的Ba/F3細(xì)胞相比，表達(dá)人TCCR的Ba/F3細(xì)胞應(yīng)答抗體2686處理?yè)饺肓孙@著更大量的[3H]-胸苷。該數(shù)據(jù)證實(shí)了抗體2686是人TCCR的特異性激動(dòng)劑，并顯示與鼠TCCR沒(méi)有交叉反應(yīng)性。
這些研究證明TCCR激動(dòng)劑，諸如所證明的激動(dòng)劑抗體，能結(jié)合并刺激TCCR受體以誘導(dǎo)TCCR介導(dǎo)的生物學(xué)活性，在這里指Ba/F3細(xì)胞的增殖。因此，該數(shù)據(jù)說(shuō)明TCCR激動(dòng)劑可用于在體內(nèi)直接或間接誘導(dǎo)TCCR介導(dǎo)的活性。
實(shí)施例7其它TCCR激動(dòng)劑的鑒定 為鑒定和驗(yàn)證具有TCCR激動(dòng)活性的試劑，對(duì)推定的TCCR激動(dòng)劑包括IL-27的片段和TCCR的變體分析與TCCR受體的結(jié)合?？稍隗w外或體內(nèi)分析TCCR結(jié)合。例如，將潛在的激動(dòng)劑施用于表達(dá)TCCR的細(xì)胞，諸如經(jīng)過(guò)改造而表達(dá)重組TCCR的COS細(xì)胞或Ba/F3細(xì)胞，如上文實(shí)施例3所述，并測(cè)量對(duì)潛在激動(dòng)劑的細(xì)胞應(yīng)答。
還可通過(guò)將潛在的肽激動(dòng)劑表達(dá)為融合蛋白來(lái)分析受體結(jié)合，例如含有人IgG Fc結(jié)構(gòu)域的免疫黏附素。為了檢測(cè)受體-配體結(jié)合，可例如使免疫黏附素與表達(dá)TCCR的細(xì)胞相互作用。利用識(shí)別Fc融合結(jié)構(gòu)域的熒光試劑，可在顯微鏡下觀察到結(jié)合的免疫黏附素?？赏ㄟ^(guò)分析熒光或通過(guò)其它已知方法對(duì)結(jié)合定量。
可通過(guò)分析候選激動(dòng)劑刺激TCCR介導(dǎo)的活性諸如IL-10或SOCS-3的表達(dá)的能力來(lái)篩選TCCR激動(dòng)劑。例如，可使表達(dá)TCCR的T淋巴細(xì)胞與候選的激動(dòng)劑接觸?？衫缤ㄟ^(guò)ELISA、定量PCR等方法來(lái)測(cè)量IL-10和/或SOCS-3的表達(dá)。IL-10和/或SOCS-3表達(dá)相對(duì)于對(duì)照例如基礎(chǔ)IL-10和/或SOCS-3水平的升高與TCCR刺激有關(guān)，表明是有用的TCCR激動(dòng)劑。
實(shí)施例8IL-27介導(dǎo)的細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子的誘導(dǎo)和抑制 在中性、Th1或Th2誘導(dǎo)條件下，在野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)CD4+細(xì)胞中檢驗(yàn)IL-27對(duì)細(xì)胞因子誘導(dǎo)的效應(yīng)。在中性、Th1或Th2誘導(dǎo)條件下，在野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)CD4+細(xì)胞中檢驗(yàn)IL-27對(duì)細(xì)胞恢復(fù)(recall)增殖的效應(yīng)。
在第0天，將野生型CD4+或TCCR敲除型CD4+細(xì)胞以2×105細(xì)胞/孔鋪在事先已經(jīng)用激動(dòng)性抗CD3單克隆抗體(145-2C11，BD Pharmingen，SanDiego，CA，5ug/ml，在PBS中，過(guò)夜)包被的24孔板中。然后在中性、Th1偏愛(ài)或Th2偏愛(ài)條件下，誘導(dǎo)各個(gè)孔中的增殖。中性條件通過(guò)添加IL-2(R&D Systems，Minneapolis，MN)、抗IL-12抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)、抗IFN-γ抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)、抗IL-4抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)和CD-28(BD Pharmingen，San Diego，CA)創(chuàng)建。Th1偏愛(ài)條件通過(guò)添加IL-2、IL-12(R&D Systems，Minneapolis，MN)、抗IL-4抗體和CD-28創(chuàng)建。Th2偏愛(ài)條件通過(guò)添加IL-2、IL-4(R&D Systems，Minneapolis，MN)、抗IL-12抗體、抗IFN-γ抗體和CD28創(chuàng)建。對(duì)這些各個(gè)孔的處理如下表15所示。
表15 在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。在24小時(shí)、48小時(shí)和/或72小時(shí)時(shí)采集上清液樣品。對(duì)上清液樣品進(jìn)行ELISA，使用了針對(duì)TNF-α、IL-5、IL-2、IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-4、GM-CSF的探針(試劑盒購(gòu)自BD Pharmingen，San Diego，CA)。下文表16以IL-27依賴性誘導(dǎo)的倍數(shù)顯示了ELISA數(shù)據(jù)。圖16A-C顯示了在中性(16A)、Th1偏愛(ài)(16B)和Th2偏愛(ài)條件(16C)下IL-2的IL-27依賴性誘導(dǎo)。圖17A-C顯示了在中性(17A)、Th1偏愛(ài)(17B)和Th2偏愛(ài)條件(17C)下IL-10的IL-27依賴性誘導(dǎo)。
數(shù)據(jù)顯示TNF-α、IFN-γ和IL-4應(yīng)答IL-27得到誘導(dǎo)。數(shù)據(jù)還顯示IL-2、IL-6和GM-CSF應(yīng)答IL-27得到抑制。數(shù)據(jù)顯示在中性、Th1偏愛(ài)和Th2偏愛(ài)條件下IL-27誘導(dǎo)了IL-10。如上所述，IL-10在限制和終止炎癥應(yīng)答中起主要作用。由于IL-27誘導(dǎo)IL-10，數(shù)據(jù)說(shuō)明IL-27能用于治療免疫介導(dǎo)的疾病。
表16 IL-27誘導(dǎo)的細(xì)胞因子 *數(shù)據(jù)顯示為IL-27的誘導(dǎo)倍數(shù) 從在24小時(shí)、48小時(shí)和/或72小時(shí)時(shí)采集的細(xì)胞樣品中提取RNA，然后如下表17所示，用對(duì)SOCS-1、SOCS-3、PIAS-1和PIAS-3特異的探針進(jìn)行定量PCR(TAQMAN)。
表17 下表18以IL-27依賴性誘導(dǎo)的倍數(shù)顯示了定量PCR數(shù)據(jù)。圖18A-C顯示了在中性(18A)、Th1偏愛(ài)(18B)和Th2偏愛(ài)條件(18C)下，SOCS-3的IL-27依賴性誘導(dǎo)。
數(shù)據(jù)顯示在中性、Th1偏愛(ài)和Th2偏愛(ài)條件下，IL-27誘導(dǎo)了SOCS-3。如上所述，已知SOCS-3抑制細(xì)胞因子發(fā)信號(hào)，并且已報(bào)道了其是某些試劑抗炎效應(yīng)的介導(dǎo)物。由于IL-27誘導(dǎo)SOCS-3，數(shù)據(jù)說(shuō)明IL-27能用于治療免疫介導(dǎo)的疾病。
表18 在中性條件下處理的上述細(xì)胞在72小時(shí)時(shí)采集樣品并提取RNA。然后利用GENECHIP(Affymetrix，Santa Clara，CA)對(duì)RNA分析誘導(dǎo)的表達(dá)。下表19以相對(duì)于未處理對(duì)照的誘導(dǎo)(抑制)倍數(shù)顯示了所選擇基因的GENECHIP數(shù)據(jù)。
在此，數(shù)據(jù)再次顯示在中性條件下IL-27誘導(dǎo)IL-10。如上所述，IL-10在限制和終止炎癥應(yīng)答中起主要作用。由于IL-27誘導(dǎo)IL-10，數(shù)據(jù)說(shuō)明IL-27能用于治療免疫介導(dǎo)的疾病。
表19 在第3天，在存在IL-2和存在或缺乏IL-27時(shí)擴(kuò)增細(xì)胞。具體而言，從24孔板中取出含有那些先前暴露于IL-27的細(xì)胞的1ml培養(yǎng)基，然后與含有2×10-4mg/ml IL-27和1×10-5mg/ml IL-2的3ml培養(yǎng)基一起置于6孔板中。取出含有那些先前未暴露于IL-27的細(xì)胞的1ml培養(yǎng)基，然后與含有1×10-5mg/ml IL-2的3ml培養(yǎng)基一起置于6孔板中。
在第5天，將含有2×10-4mg/ml IL-27和1×10-5mg/ml IL-2濃度的4ml培養(yǎng)基(IMDM(Invitrogen，Carlsbad，CA)w/10％HyClone血清)添加到那些含有先前暴露于IL-27的細(xì)胞的孔中。將含有1×10-5mg/ml IL-2濃度的4ml培養(yǎng)基添加到那些含有先前未暴露于IL-27的細(xì)胞的孔中。
在第6天，將細(xì)胞離心，然后將沉淀物重懸于培養(yǎng)基(如上相同的培養(yǎng)基)并計(jì)數(shù)。不同孔的細(xì)胞計(jì)數(shù)示于下表20中，并反映于圖19中。
數(shù)據(jù)顯示在Th1或Th2偏愛(ài)條件下添加IL-27降低CD4+細(xì)胞的增殖，說(shuō)明IL-27可用于治療特征為CD4+細(xì)胞增殖的疾病，包括自身免疫病諸如多發(fā)性硬化和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
表20 實(shí)施例9IL-27抑制IL-6誘導(dǎo)的增殖 在存在和缺乏抗IL-2抗體(BD Pharmingen，San Diego，CA)時(shí)，檢驗(yàn)IL-27對(duì)IL-6誘導(dǎo)的野生型(TCCR+/+)和敲除型(TCCR-/-)CD4+細(xì)胞增殖的效應(yīng)。
將來(lái)自野生型小鼠的混合脾細(xì)胞(4×105)置于96孔板的孔中。將來(lái)自敲除型小鼠的混合脾細(xì)胞(4×105)置于板上的不同孔中。所有孔都用100μl溶于PBS中的2ug/ml抗CD3包被過(guò)夜。依照下表21中所示的實(shí)驗(yàn)組處理孔。
表21 在37℃培養(yǎng)細(xì)胞。48小時(shí)后，添加[3H]-胸苷，又過(guò)一夜，通過(guò)[3H]-胸苷摻入來(lái)測(cè)量增殖。每組的平均CPM示于下表22中。沒(méi)有IL-2中和的增殖示于圖20A中。有IL-2中和的增殖示于圖20B中。
表22 數(shù)據(jù)顯示不管是否存在抗IL-2抗體，IL-27都抑制抗CD3抗體刺激的及IL-6增強(qiáng)的增殖。當(dāng)不存在抗IL-2抗體時(shí)，IL-27抑制抗CD3抗體刺激的增殖。抗IL-2抗體降低抗CD3抗體刺激的增殖。但是，添加IL-27部分減輕該效應(yīng)。
實(shí)施例10IL-27受體(TCCR)缺陷型小鼠是EAE高度敏感的 IL-27是一種由活化的抗原呈遞細(xì)胞(APC)產(chǎn)生的配體。IL-27通過(guò)由特異性亞基IL-27和gp130(許多其它受體包括IL-6R所共有的)組成的異二聚體受體發(fā)信號(hào)。如本文中所討論的，IL-27通過(guò)多種STAT和Jak-1活化信號(hào)，但主要的信號(hào)事件似乎是STAT-1的活化。通過(guò)STAT-1的活化和TH-1特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的下游誘導(dǎo)，促進(jìn)了IL-12RB2鏈和IFN-γ的表達(dá)。IL-27配體和受體圖示于圖21。
IL-27是IL-12家族的成員，屬于細(xì)胞因子IL-6簇。見(jiàn)圖22。IL-27的兩種組分，EBI3和p28，與IL-12亞基享有密切的同源性。IL-27受體(IL-27R)，也稱為T(mén)CCR，的兩個(gè)亞基在多種白細(xì)胞上協(xié)調(diào)表達(dá)。最高的表達(dá)似乎在T細(xì)胞和NK細(xì)胞上。
幼稚的、未分化的T細(xì)胞(Th-0)應(yīng)答誘導(dǎo)幼稚Th-0細(xì)胞分化為成熟T輔助細(xì)胞的不同信號(hào)。一般而言，已知兩種類型的T輔助細(xì)胞，Th-1和Th-2細(xì)胞。如圖23所示，IL-4對(duì)Th-0細(xì)胞的刺激引起Th-2細(xì)胞發(fā)育，產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。Th-2細(xì)胞和細(xì)胞因子產(chǎn)物影響體液免疫和抗蠕蟲(chóng)應(yīng)答。IL-27和/或IFN-γ對(duì)Th-0細(xì)胞的刺激誘導(dǎo)T細(xì)胞中IL-12應(yīng)答性的狀態(tài)，使得它們?cè)贗L-12控制下能分化為成熟的TH-1細(xì)胞，并產(chǎn)生IFN-γ、IL-2和淋巴毒素(LT)。Th-1細(xì)胞及其細(xì)胞因子產(chǎn)物與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫和巨噬細(xì)胞活化有關(guān)。
為使我們進(jìn)一步理解IL-27在Th-0細(xì)胞分化為T(mén)h-1和Th-2輔助細(xì)胞中的作用，如上文實(shí)施例所述產(chǎn)生IL-27R缺陷型小鼠(TCCR敲除型)。利用實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦炎(EAE)，一種多發(fā)性硬化的小鼠模型，檢驗(yàn)IL-27在自身免疫病過(guò)程中的潛在作用。由于僅轉(zhuǎn)移來(lái)自具有EAE的小鼠的CD4+T細(xì)胞能在首次用于實(shí)驗(yàn)的(naive)受體小鼠中引起EAE，因此EAE是T細(xì)胞介導(dǎo)的。
為誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性EAE，用在完全弗氏佐劑中的髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白(MOG)35-55肽免疫小鼠。用MOG免疫野生型(WT)和IL-27受體(TCCR)敲除型小鼠，并如上文實(shí)施例所述檢查EAE的證據(jù)。在治療后過(guò)25天評(píng)估臨床EAE得分。
圖24所示數(shù)據(jù)證明不是所假定的由于除去IL-27刺激所引起的EAE疾病減輕，IL-27R缺陷型小鼠中EAE加重了。小鼠似乎是EAE高度敏感的且發(fā)展成嚴(yán)重的EAE疾病。取自表現(xiàn)出EAE表型的受體缺陷型小鼠的脊髓組織的組織學(xué)分析示于圖25，證實(shí)了具有EAE的IL-27受體敲除型小鼠中炎癥和脫髓鞘增強(qiáng)。
進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，用多種病原體刺激IL-27受體缺陷型小鼠，以及誘導(dǎo)的哮喘和肝炎模型，導(dǎo)致Th-1和Th-2介導(dǎo)的應(yīng)答都加重。這些數(shù)據(jù)表明IL-27具有重要的免疫抑制功能。
為進(jìn)一步研究IL-27及其在T細(xì)胞分化中可能的作用，根據(jù)圖27圖示的流程，通過(guò)MACS純化幼稚CD4+細(xì)胞并用抗CD3+抗體處理，添加或不添加IL-27。在促進(jìn)T細(xì)胞極化為T(mén)h-0、Th-1或Th-2的條件下，用IL-27刺激T細(xì)胞。
簡(jiǎn)而言之，用5μg/ml抗CD3(BD Pharmingen)包被24孔平皿過(guò)夜。在存在IL-2(10ng/ml)和抗CD28(1μg/ml)時(shí)，在每個(gè)孔中接種1.8×106CD4+T細(xì)胞。為了分化，添加以下細(xì)胞因子和抗體TH-0(抗IL-12、抗IFN-γ、抗IL-4，每種為5μg/ml)，TH-1(IL-12為3.5ng/ml，抗IL-4為5μg/ml)，TH-2(IL-4為3.5ng/ml，抗IFNγ和抗IL-12為5μg/ml)。將IL-27以200ng/ml的濃度添加到有些培養(yǎng)物中。72小時(shí)后，分離上清液以及RNA，并通過(guò)芯片、RT-PCT和/或ELISA分析法分析特定細(xì)胞因子的產(chǎn)生。所得數(shù)據(jù)示于圖28，證明IL-27對(duì)T細(xì)胞發(fā)育具有深刻作用。
IL-27對(duì)大多數(shù)所檢驗(yàn)的細(xì)胞因子具有深刻作用，該作用通常不依賴細(xì)胞分化的條件。在誘導(dǎo)Th-2的條件下，IL-27誘導(dǎo)TNFα和IL-10以及IL-4。同時(shí)，IL-27深深抑制IL-2、IL-5、IL-6、GM-CSF和IL-17的產(chǎn)生。
為確定任何這些作用是否是眾所周知且有力的免疫抑制細(xì)胞因子IL-10的誘導(dǎo)所繼發(fā)的(secondary)，還在IL-10缺陷型T細(xì)胞中檢驗(yàn)IL-27的作用。如圖29所示，IL-27誘導(dǎo)的對(duì)細(xì)胞因子產(chǎn)生的調(diào)控不依賴IL-10，因?yàn)楸容^野生型和IL-10缺陷型T細(xì)胞，在IL-2或GM-CSF的產(chǎn)生中看到的差異很小。
盡管在體外看到IL-27對(duì)免疫抑制性IL-10的強(qiáng)誘導(dǎo)(圖28)，在來(lái)自具有EAE的IL-27R-/-小鼠的T細(xì)胞中只看到較小的IL-10降低(圖30)。但是，該人為的體外觀察結(jié)果決不能排除如下解釋，即IL-27介導(dǎo)的IL-10誘導(dǎo)是EAE過(guò)程中的重要生物學(xué)過(guò)程。相反，它最有可能反映了我們用于研究IL-27誘導(dǎo)的IL-10體內(nèi)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)的限制。
實(shí)施例11EAE是TH-17依賴性的 最近的證據(jù)表明新的輔助性T細(xì)胞亞型，即所謂的TH-17細(xì)胞，是許多促炎過(guò)程包括EAE的關(guān)鍵介導(dǎo)物。報(bào)道了這些Th-17產(chǎn)生IL-17A、IL-17F、IL-6、TNF和GM-CSF。見(jiàn)圖31提供的圖解。對(duì)TH-17細(xì)胞的發(fā)育了解很少，但認(rèn)為依賴IL-23，另一種類似于IL-12的異二聚體細(xì)胞因子。IL-23缺陷型動(dòng)物無(wú)法有效發(fā)育該T細(xì)胞表型，并且對(duì)EAE和CIA有抗性。但是，盡管IL-23似乎是必需的，它還不足以使TH-17細(xì)胞在體外分化。
如上為所討論的，與野生型同窩幼仔相比，IL-27R缺陷型小鼠發(fā)展出更嚴(yán)重的EAE疾病。分析IL-27信號(hào)的下游事件以確定對(duì)EAE嚴(yán)重程度的此限制效應(yīng)中的重要因素。在活化過(guò)程中檢驗(yàn)多種細(xì)胞因子應(yīng)答IL-27的表達(dá)。
IL-27促進(jìn)IFN-γ產(chǎn)生，已知IFN-γ抑制IL-17。數(shù)據(jù)表明IL-27比IFN-γ更有效的抑制IL-17和其它Th-17細(xì)胞因子IL-6和GM-CSF的產(chǎn)生(見(jiàn)圖33和34)。此外，來(lái)自具有EAE的TCCR-/-小鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞在體外在再刺激時(shí)分泌比野生型更多的Th-17細(xì)胞因子(圖37)。
IL-27介導(dǎo)的對(duì)IL-17產(chǎn)生的抑制不依賴IFN-γ，因?yàn)橹率蛊洳豁憫?yīng)IFN-γ的T細(xì)胞在用IL-27刺激時(shí)仍然抑制IL-17產(chǎn)生(圖35)。在缺乏IFN-γ信號(hào)時(shí)，基礎(chǔ)IL-17產(chǎn)生更高。原因尚不清楚，因?yàn)榧词乖谝吧团囵B(yǎng)物中，通過(guò)添加IFN-γ中和性抗體仍阻斷IFN-γ信號(hào)。因此，在IFN-γR缺陷型小鼠中的IL-17高表達(dá)可能反映發(fā)育改變(即IFNγR缺陷型T細(xì)胞與野生型細(xì)胞的不同不只限于IFNγR表達(dá))，或者可能反映胞內(nèi)IFNγ回路。在共表達(dá)配體和受體的細(xì)胞中，在晚期分泌途徑中能產(chǎn)生信號(hào)，這樣的信號(hào)將是胞內(nèi)的且不為中和性抗體所阻斷。
為確定Th-17細(xì)胞在IL-27R缺陷型小鼠中是否調(diào)節(jié)異常，用CFA中的MOG免疫IL-27R缺陷型小鼠。在第14天取出引流淋巴結(jié)，并用MOG離體再刺激。含有IL-27R缺陷型T細(xì)胞的淋巴結(jié)上清液表達(dá)顯著升高水平的IL-17(圖37和38)。
此外，對(duì)腦和脊髓(EAE中炎癥的實(shí)際部位)的免疫浸潤(rùn)物的分析揭示IL-27R缺陷型小鼠中浸潤(rùn)了更多細(xì)胞。此外，在通過(guò)胞內(nèi)染色分析時(shí)，更高百分?jǐn)?shù)的這些細(xì)胞是IL-17陽(yáng)性的?？傊?，這兩項(xiàng)觀察結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榧顾柚蠭L-17的表達(dá)是粗略兩倍(見(jiàn)圖39)。
IFN-γ和IL-27都活化STAT-1，STAT-1敲除導(dǎo)致IL-17升高。因此，IL-27可通過(guò)活化STAT-1而抑制IL-17。該關(guān)系通過(guò)在獲自STAT-1敲除型模型的細(xì)胞中分析IL-27介導(dǎo)的IL-17抑制來(lái)研究。在缺乏STAT-1時(shí)，IL-27不抑制IL-17，表明該抑制是由STAT-1介導(dǎo)的。在缺乏STAT-1時(shí)，IL-27成為IL-17的誘導(dǎo)物。這種顛倒的機(jī)制基礎(chǔ)是未知的，但有可能推測(cè)IL-27對(duì)STAT-3的活化在該效應(yīng)中起作用，因?yàn)槠渌T導(dǎo)IL-17的細(xì)胞因子(特別是IL-23)通過(guò)STAT-3發(fā)信號(hào)而不活化STAT-1(見(jiàn)圖36)。
總之，IL-27受體(TCCR)缺陷型小鼠是EAE高度敏感的。IL-27在體外有效抑制Th-17細(xì)胞因子IL-17、IL-6和GM-CSF。此外，具有EAE的L-27受體缺陷型小鼠比野生型產(chǎn)生更多的Th-17細(xì)胞因子。IL-27可通過(guò)使免疫應(yīng)答偏離Th-17來(lái)抑制EAE。
實(shí)施例12IL-6誘導(dǎo)Th-17細(xì)胞 如圖41所圖示的，IL-23是Th-0細(xì)胞分化為產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-17、IL-6、GM-CSF和TNF的Th-17細(xì)胞所必需的，但非充分的。IL-23不是充分的一個(gè)可能原因是Th-0細(xì)胞不表達(dá)IL-23受體，因此不響應(yīng)IL-23。因此，能夠在Th-0細(xì)胞中誘導(dǎo)IL-23R的因素是TH-17分化途徑的強(qiáng)制性組分。
由于TH-1(IFN-γ)和TH-2(IL-4)細(xì)胞的效應(yīng)細(xì)胞因子也參與這些細(xì)胞的發(fā)育，因此提供了穩(wěn)定化反饋回路，照此類推，我們推論出TH-17效應(yīng)細(xì)胞因子之一必然參與TH-17發(fā)育。在TH-17效應(yīng)細(xì)胞因子中，IL-6看上去最有希望，因?yàn)槠涫荏w在幼稚T細(xì)胞上表達(dá)，并且因?yàn)榇嬖诮K末分化T細(xì)胞以外的其它IL-6來(lái)源(最值得注意的是抗原呈遞細(xì)胞)。此外，IL-6敲除型小鼠對(duì)EAE有抗性(見(jiàn)圖42)。
對(duì)野生型和IL-27受體敲除型小鼠檢驗(yàn)對(duì)單獨(dú)的IL-6或與IL-27和IL-23組合的應(yīng)答。如圖43所示，IL-6誘導(dǎo)Th-17軸(axis)。IL-6的單獨(dú)處理刺激IL-23受體，還刺激IL-17A和IL-17F產(chǎn)生。有趣的是，IL-27的共施用降低或消除IL-6刺激的IL-23受體和IL-17產(chǎn)生的升高(見(jiàn)圖43)。IL-23對(duì)IL-23受體和IL-17產(chǎn)生的刺激有輕微影響，似乎能與IL-6單獨(dú)展示的大刺激疊加。在此組合中添加IL-27也降低或消除應(yīng)答。取自再刺激的淋巴結(jié)細(xì)胞的mRNA顯示出IL-23受體敲除型中與野生型對(duì)照相比IL-23受體的誘導(dǎo)(見(jiàn)圖43)。
在增殖測(cè)定法中進(jìn)一步比較IL-6的效應(yīng)，在野生型和TCCR敲除型小鼠中IL-6刺激大大增強(qiáng)純化的T細(xì)胞的增殖。在野生型細(xì)胞中，添加IL-27完全中和IL-6誘導(dǎo)的增殖。但是，在TCCR敲除型小鼠中沒(méi)有看到該降低，證明IL-27拮抗IL-6的有力增殖效應(yīng)。見(jiàn)圖44。因此，IL-27似乎在幾個(gè)水平上是IL-6拮抗劑，包括IL-6驅(qū)動(dòng)的TH-17分化。
實(shí)施例13IL-27的作用 如圖46所示，IL-27影響T細(xì)胞分化，特別是在多個(gè)水平影響Th-17細(xì)胞的發(fā)育。雖然IL-27刺激IL-10、IL-4的產(chǎn)生及Th-1細(xì)胞的發(fā)育，它也抑制Th-17細(xì)胞的產(chǎn)生、Th-17細(xì)胞細(xì)胞因子IL-17和GM-CSF的產(chǎn)生。
此說(shuō)明書(shū)中的所有出版物和專利申請(qǐng)表明了本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)水平。所有出版物和專利申請(qǐng)?jiān)诖耸杖胱鳛閰⒖?，其程度如同明確且單獨(dú)指示每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)作為參考。
本發(fā)明已根據(jù)多個(gè)具體和優(yōu)選的實(shí)施方案和技術(shù)得以描述。但是，應(yīng)當(dāng)理解可以進(jìn)行許多變異和修改而仍然在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.治療自身免疫病的方法，包括施用TCCR激動(dòng)劑。
2.TCCR激動(dòng)劑在制造治療自身免疫病的藥物中的用途。
3.增加淋巴細(xì)胞中IL-10表達(dá)的方法，包括給淋巴細(xì)胞施用TCCR激動(dòng)劑。
4.增加淋巴細(xì)胞中SOCS3表達(dá)的方法，包括給淋巴細(xì)胞施用TCCR激動(dòng)劑。
5.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述TCCR激動(dòng)劑是抗體。
6.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述TCCR激動(dòng)劑是單克隆抗體。
7.權(quán)利要求6的方法或用途，其中所述單克隆抗體是以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心入藏登記號(hào)ATCC PTA-6447保藏的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述TCCR激動(dòng)劑是人源化抗體。
9.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述TCCR激動(dòng)劑是能減弱或抑制Th1應(yīng)答的TCCR變體。
10.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述TCCR激動(dòng)劑是抗體片段或單鏈抗體。
11.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述激動(dòng)劑是TCCR胞外結(jié)構(gòu)域。
12.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述激動(dòng)劑包括IL-27或其部分。
13.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述激動(dòng)劑包括IL-27變體。
14.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述激動(dòng)劑包括包含p28能夠結(jié)合TCCR和gp130的那部分的IL-27變體。
15.依照權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述激動(dòng)劑是包含IL-27能減弱或抑制Th1應(yīng)答的那部分和異源肽的融合蛋白。
16.依照要求15的方法或用途，其中所述異源肽包括抗體的Fc部分。
17.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是同種異體移植物排斥。
18.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是自身免疫性甲狀腺病。
19.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎。
20.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是巨細(xì)胞性動(dòng)脈炎。
21.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是炎性腸病。
22.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是胰島素依賴型糖尿病。
23.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是多發(fā)性硬化。
24.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是惡性貧血。
25.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是銀屑病。
26.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
27.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是結(jié)節(jié)病。
28.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是硬皮病。
29.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
30.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是至少部分通過(guò)Th1應(yīng)答介導(dǎo)的。
31.依照權(quán)利要求1-2任一項(xiàng)的方法或用途，其中所述自身免疫病是至少部分通過(guò)CD8+T細(xì)胞增殖介導(dǎo)的。
32.篩選TCCR激動(dòng)劑的方法，包括
(1)使表達(dá)TCCR的細(xì)胞與候選的TCCR激動(dòng)劑接觸；
(2)分析應(yīng)答候選的TCCR激動(dòng)劑的TCCR活化的基因的表達(dá)；并
(3)建立TCCR活化的基因的表達(dá)的增加與候選的TCCR激動(dòng)劑的活性的聯(lián)系。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述TCCR活化的基因包括IL-10、SOCS-3或兩者。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述TCCR活化的基因包括SOCS-3。
35.權(quán)利要求32的方法，其中所述細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞。
36.權(quán)利要求32的方法，其中所述分析包括定量PCR分析。
37.權(quán)利要求32的方法，其中所述分析包括免疫測(cè)定分析。
38.以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心入藏登記號(hào)ATCC PTA-6447保藏的雜交瘤細(xì)胞系所產(chǎn)生的單克隆抗體。
39.以美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心入藏登記號(hào)ATCC PTA-6447保藏的雜交瘤細(xì)胞系。
40.治療或抑制免疫應(yīng)答的方法，包括施用IL-27或其激動(dòng)劑。
41.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫應(yīng)答是通過(guò)Th-17細(xì)胞介導(dǎo)的。
42.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫應(yīng)答是Th-1或Th-2介導(dǎo)的應(yīng)答。
43.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫應(yīng)答是超炎癥應(yīng)答。
44.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫應(yīng)答是自身免疫應(yīng)答。
45.權(quán)利要求1的方法，其中IL-27抑制IL-17產(chǎn)生。
46.抑制IL-17、IL-6或GM-CSF產(chǎn)生的方法，包括施用IL-27或其激動(dòng)劑。
47.治療或抑制免疫應(yīng)答的方法，包括施用IL-6的拮抗劑或其受體。
48.權(quán)利要求47的方法，其中所述拮抗劑是阻斷IL-6與其受體活化的抗體、適體或小分子拮抗劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療自身免疫病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括施用TCCR激動(dòng)劑的治療自身免疫病的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫病是至少部分通過(guò)Th1應(yīng)答介導(dǎo)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫病是至少部分通過(guò)CD8+T細(xì)胞增殖介導(dǎo)的。
文檔編號(hào)A61K38/20GK101120022SQ200580048153
公開(kāi)日2008年2月6日 申請(qǐng)日期2005年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月16日
發(fā)明者尼科·吉拉迪, 弗雷德里克·德索瓦格 申請(qǐng)人:健泰科生物技術(shù)公司