專利名稱：犬腫瘤的治療方法及其應用的藥物制劑以及所使用的細胞的低溫保存方法
技術領域：
本發(fā)明涉及治療犬腫瘤的方法，使用犬淋巴細胞治療患有腫瘤的犬的藥物制劑，以及用于治療的細胞的培養(yǎng)和低溫保存方法。
背景技術：
J.H.Jardine等人報道可以使用人白介素2(human interleukin 2，hIL-2)擴增犬淋巴細胞(Veterinary Immunology，第21卷，1989，153-160)。此外，D.W.Mitchell等人報道使用植物凝血素(Phytohemaglutinin，PHA)和hIL-2可以使犬淋巴細胞增殖(American Journal of Veterinary Research，第52卷，1991，1132-1136)。
此外，H.Itoh等人報道使用固相抗-犬CD3抗體和hIL-2可以使犬淋巴細胞增殖(Journal of Veterinary Medical Science，第65卷，2003，329-333)。另外，Mizuno等人報道可以使用PHA和IL-2在38℃的溫度下培養(yǎng)犬淋巴細胞(Mizuno等，Experimental Animal，第45卷，1996，292)。
然而，J.H.Jardine等人和D.W.Mitchell等人的報道公開了可以單獨用hIL-2增殖犬淋巴細胞，以制備源自大顆粒淋巴細胞(large granularlymphocyte，LGL)的淋巴因子激活的殺傷細胞(lymphokine activated killercells，LAK)。D.W.Mitchell的報道公開了使用PHA和hIL-2培養(yǎng)犬外周淋巴細胞，以及所述PHA通過T-細胞表面上的CD2分子激活T-細胞，而抗-CD3抗體通過CD3激活T-細胞。因此，用這種方法培養(yǎng)的細胞有著不同的激活機理，因此顯現(xiàn)出不同的T-細胞群和功能。
此外，H.Itoh等人證實注入通過用固相抗-犬CD3抗體(anti-canine CD3antibodies)和hIL-2培養(yǎng)犬淋巴細胞而獲得的激活的淋巴細胞，沒有觀察到副作用，但是他們沒有證實有體內(nèi)抗-腫瘤活性。此外，Mizuno等人使用PHA和IL-2在38℃下增殖犬淋巴細胞，但是沒有證實任何體內(nèi)抗腫瘤作用。Mizuno和Itoh的激活淋巴細胞的方法與本發(fā)明描述的CD3激活方法的不同之處在于，這些方法未提供對于犬腫瘤的有效治療。
關于對患有腫瘤的犬施用的治療，截至目前還沒有開發(fā)出對犬的抗癌藥物。因此，對患有腫瘤的犬以根據(jù)體表面積計算的劑量給予對人開發(fā)的抗癌藥物。然而，還沒有充分證實治療的安全性及其抗腫瘤效果。此外，雖然很多臨床試驗已經(jīng)使用激活的淋巴細胞治療人癌癥，但是還沒有關于這些治療的安全性、患者生存質量改善的證實報道，也沒有激活的淋巴細胞對患有腫瘤的犬的抗腫瘤效果的證實報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過下列過程完成，該過程中發(fā)明人在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2(IL-2)的組合存在下，優(yōu)選用抗-犬CD3抗體和重組人白介素-2(hIL-2)的組合激活并增殖犬外周血淋巴細胞。將得到的淋巴細胞對患有腫瘤的犬給藥后，從生存質量指數(shù)和抗腫瘤效果提高方面觀察到有益的結果。
本發(fā)明權利要求1涉及一種治療犬腫瘤的方法，其中，使用固相抗-犬CD3抗體和白介素-2(IL-2)的組合增殖和激活犬外周血淋巴細胞，然后將得到的淋巴細胞給予患有腫瘤的犬。
此外，本發(fā)明權利要求2涉及一種根據(jù)權利要求1的治療犬腫瘤的方法，其中，所述白介素-2(IL-2)為人白介素-2(hIL-2)。
本發(fā)明權利要求3涉及一種根據(jù)權利要求1的治療犬腫瘤的方法，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在37℃至41℃的范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明權利要求4涉及一種根據(jù)權利要求1的治療犬腫瘤的方法，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在38℃至40℃的范圍內(nèi)。
本發(fā)明權利要求5涉及一種用于治療犬腫瘤的藥物制劑，其中，該制劑通過在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2(IL-2)的組合存在下增殖和激活的犬外周血淋巴細胞而獲得。
此外，本發(fā)明權利要求6涉及一種根據(jù)權利要求5的用于治療犬腫瘤的藥物制劑，其中，所述白介素-2(IL-2)是人白介素-2(hIL-2)。
本發(fā)明權利要求7涉及一種根據(jù)權利要求5的用于治療犬腫瘤的藥物制劑，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在37℃至41℃的范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明權利要求8涉及一種根據(jù)權利要求5的用于治療犬腫瘤的藥物制劑，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在38℃至40℃的范圍內(nèi)。
本發(fā)明權利要求9涉及用于治療犬腫瘤的細胞的低溫保存方法，其中，在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2(IL-2)的組合存在下增殖和激活犬外周血淋巴細胞，然后將得到的淋巴細胞低溫保存用于接下來的解凍和藥物制劑的制備。
本發(fā)明權利要求10涉及根據(jù)權利要求9的用于治療犬腫瘤的細胞的低溫保存方法，其中，所述白介素-2(IL-2)是人白介素-2(hIL-2)。
本發(fā)明權利要求11涉及根據(jù)權利要求9的用于治療犬腫瘤的細胞的低溫保存方法，其中體外增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在37℃至41℃的范圍內(nèi)。
此外，本發(fā)明權利要求12涉及根據(jù)權利要求9的用于治療犬腫瘤的細胞的低溫保存方法，其中，體外增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在38℃至40℃的范圍內(nèi)。
如上所述，在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2(IL-2)的組合的存在下，優(yōu)選在抗-犬CD3抗體和人重組白介素-2(hIL-2)的組合的存在下，激活并增殖本發(fā)明具體描述的治療方法、藥物制劑和低溫保存方法中使用的犬腫瘤治療細胞。當以激活的淋巴細胞對患有腫瘤的犬給藥時，這些細胞提供了明顯可辨的腫瘤縮小效果。給予上述藥物制劑之后沒有觀察到嚴重的副作用，從受治療動物行走更長距離能力方面表明了生存質量改善顯著，并且從較健康的皮毛外觀方面表明了動物健康改善顯著。


圖1是比較不同培養(yǎng)溫度下細胞增殖水平的線條圖(line drawing)。
具體實施例方式
下面優(yōu)選實施方式提供對本發(fā)明的詳細描述。
實施例1根據(jù)下面步驟培養(yǎng)分別從兩只健康試驗犬收集的淋巴細胞，每只犬的細胞培養(yǎng)兩份。
步驟1細胞培養(yǎng)瓶的準備將用生理鹽水溶液(Hikari Pharmaceuticals，Ltd.)稀釋至5微克/毫升的5毫升(5ml)抗-犬CD3抗體(Serotec Ltd.，小鼠抗-犬CD3)溶液置于75平方厘米的培養(yǎng)瓶(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)中，達到覆蓋瓶底的水平。
將培養(yǎng)瓶保持在4℃(±2℃)下過夜，然后棄除培養(yǎng)瓶中的抗-犬CD3抗體溶液。將20毫升(20ml)生理鹽水溶液倒入培養(yǎng)瓶，然后用塞子密封并充分搖動(agitate)。然后移去塞子并棄除溶液。反復這項操作，然后移去培養(yǎng)瓶中保留的溶液和塞子，在下一步使用之前將培養(yǎng)瓶放在冰箱中。
步驟2血液的收集從體重2千克的健康受試犬1和體重22千克的健康受試犬2分別收集5毫升(5ml)外周血并肝素化。
步驟3外周血單核細胞的分離將外周血在無菌條件下放在位于潔凈臺子(bench)(Showa Science Co.，Ltd；No.S-1100PRV)上的15毫升離心管(Greiner Bio-One Co.，Ltd；No.188271)中，并且在離心分離器(Kokusan Co.，Ltd.No.H-700FR)中以1800轉/分鐘在24℃下分離10分鐘。
該離心步驟使紅細胞、白細胞和淋巴細胞沉淀，與上清血漿分離。然后將血漿低溫保存并且存儲備用。為了從保留的血細胞層分離淋巴細胞，用大約為血細胞層兩倍體積的洗滌液[500毫升RPMI-1640培養(yǎng)基(Nikken BioMedical Laboratories Inc.)、3毫升的1N鹽酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.)和10毫升的1M的N-2-羥乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)溶液(Sigma-Aldrich Co.，No.H0887)]稀釋血細胞層，并且加入到50毫升離心管(Greiner Co.，Ltd.，No.227216)中。
接著使用5毫升移液管(Corning Japan K.K.，No.4487)將3毫升(3ml)Lymphosepar 1(Immuno-Biological Laboratories，Ltd.，No.23010)加到15毫升離心管中。然后小心地將10毫升(10ml)懸浮在洗滌液中的血細胞加到Lymphosepar 1上形成層，不擾動界面。然后在離心機中以1600轉/分鐘在24℃下將溶液分離30分鐘停止離心。
離心之后，從界面層取出淋巴細胞級分，并且用5毫升移液管移至50毫升離心管(Greiner Bio-one Co.，LtdNo.227216)中，加入洗滌液使體積達到20至30毫升，并且將所得溶液充分混合。取出10微升(10μl)所述溶液用于計數(shù)外周血淋巴細胞，并且在三個圓底試管(Beckton-Dickinson JapanCo.，Ltd.No.352008)的每一個中分別加入500微升所述溶液，用于分析細胞表面抗原。
步驟4計數(shù)收集的細胞將步驟3中為了計數(shù)外周血單核細胞數(shù)目而收集的10微升樣品與40微升Turks溶液(Muto Pure Chemicals Co.，Ltd.)混合，然后將10微升混合液放在改進的Neubeier血細胞計數(shù)器(Erma Inc.)中，在顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)目。對健康受試犬No.1計數(shù)的外周血單核細胞總計為2.1×107個和1.1×107個，對健康受試犬No.2計數(shù)為6.4×106個和6.9×106個。
步驟5細胞表面抗原分析在離心機中24℃下以1800轉/分鐘將步驟3中為細胞表面抗原分析而收集的樣品分離5分鐘后棄除上清液。向三個試管中分別加入(1)5微升對照γ1/γ1抗體(Becton，Dickinson and Company349526)，(2)5微升1∶1的異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)小鼠抗-犬CD3抗體(SerotecCo.，Ltd.；No.MCA1774F)和藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)小鼠抗-犬B細胞抗體(Serotec Co.，Ltd.No.MCA178PE)的混合物和(3)5微升FITC大鼠抗-犬CD4/PE大鼠抗-犬CD8抗體。然后這些溶液在4℃下反應至少10分鐘。
反應之后，向各試管中加入含有2％人白蛋白的2毫升IsoFlow鞘溶液(sheath solution)(Becton，Dickinson and Co.，No.C412006)，并且用渦流混合器(Scientific Industry Co.，No.4781487)混合試管中的內(nèi)含物。然后，在離心機中在24℃下以1800轉/分鐘將試管中內(nèi)含物分離5分鐘，然后盡可能多地棄除上清液。在當天向試管中加入500微升2％人白蛋白IsoFlow鞘溶液(sheath solution)后進行分析，在第二天向分析試管加500微升細胞固定液(Cell Fix)(Becton，Dickinson and CompanyNo.340181)。用流式細胞儀FACS Calibur 4A(Becton，Dickinson and Company)進行細胞表面抗原分析。結果見表1。
表1培養(yǎng)之前細胞表面抗原分析

步驟6外周血單核細胞的培養(yǎng)取樣之后，在離心機中24℃下以1600轉/分鐘將剩余的外周血單核細胞分離10分鐘，然后通過傾析棄除上清液，并且用渦旋混合器將細胞沉積物分散。將細胞懸浮在20毫升培養(yǎng)基[400毫升的RPMI-1640+7s；(Nikken BioMedical Laboratory Inc.)、4.5毫升35000國際單位/毫升(IU/mL)的重組白介素-2(rIL-2)(ProleukinChiron Corp.)、45毫升胎牛血清(Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS)(JRH Biosciences，Inc.)]中，并且轉移到根據(jù)所述步驟1制備的培養(yǎng)瓶中。然后將培養(yǎng)瓶放在大的空氣夾套的CO2培養(yǎng)箱中，在37℃(±0.2℃)溫度下，在CO2濃度是5％(±0.2％)，并且濕度95％(±5％)的環(huán)境下孵育。
步驟7增殖和擴大細胞培養(yǎng)在顯微鏡下觀察根據(jù)步驟6培養(yǎng)的細胞，在開始培養(yǎng)之后3-7天加入10-30毫升相同的培養(yǎng)基。加入培養(yǎng)基直到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基的體積達到50毫升，然后繼續(xù)培養(yǎng)。開始培養(yǎng)之后4-8天將細胞和培養(yǎng)基一起轉移至新的培養(yǎng)瓶。加入50毫升(50ml)新鮮培養(yǎng)基，然后得以繼續(xù)培養(yǎng)。開始培養(yǎng)后6-10天，加入含有175國際單位/毫升hIL-2和10％FBS的150毫升培養(yǎng)基，并且可以繼續(xù)培養(yǎng)8-16天。
步驟8自體血清的滅活在57℃水浴中將步驟3中收集的血清熱滅活50分鐘，然后在4℃下保存。
步驟9驗證細胞特性的試驗為了證實細胞的特性，在8-16天培養(yǎng)期后最終用于給藥而制備細胞之前的當天進行內(nèi)毒素試驗、無菌試驗和細胞表面抗原分析。為了檢驗，使用帶有38毫米18-號針頭的5毫升注射器(Terumo Corporation)收集大約3毫升培養(yǎng)液作為試驗樣品。對于內(nèi)毒素試驗，將1毫升樣品加到5毫升圓底試管(Becton，Dickinson and Company，No.352054)中并且給試管蓋上蓋子。在巧克力瓊脂板(Nikken Bio Medical Laboratory Inc.)上鋪上500微升(500μl)樣品進行無菌試驗。在三個5毫升圓底試管的每一個中加入500微升(500μl)樣品用于細胞表面抗原分析。
步驟10內(nèi)毒素試驗在24℃下以1800轉/分鐘將在步驟9中收集的試驗樣品離心5分鐘。試驗之前，將80微升純水和20微升培養(yǎng)的上清液混合到在5毫升圓底試管中制備的主試劑溶液(Toxi Color LS-50S set，Seikagaku Corporation，No.020130)中，然后在37℃水浴中將所述溶液孵育35分鐘。同時，100微升純水和內(nèi)毒素標準液(CSE-L set，Seikagaku Corp.，No.020055)，分別與主試劑溶液混合并分別用作空白對照物和陽性對照物，且與樣品一起在水浴中孵育。
加入400微升0.8摩爾/升乙酸溶液終止反應，然后將380微升得到的溶液轉移到96-孔微量滴定板中。使用微量滴定板讀數(shù)器在405納米和655納米測定吸光度參考波長。作為將標準溶液制成大約0.1內(nèi)毒素單位/毫升(EU/ml)的結果，試驗樣品測定值的五倍都在標準結果之內(nèi)，這樣測得試驗樣品符合標準。測得所有結果都符合這個標準。
步驟11無菌試驗將步驟9中制備的樣品接種到巧克力瓊脂板上并且在37℃培養(yǎng)箱中保存。第二天也就是在用于治療的最終細胞制劑的制備之前，進行無菌測定。因為板上沒有微生物菌落，進行陰性測定，這樣使得所有結果都是陰性。
步驟12在配制用于給藥的細胞之前的細胞表面抗原分析利用步驟5中描述的相同的方法進行細胞表面抗原分析。結果見表2。
表2培養(yǎng)之后的細胞表面抗原分析

步驟13制備細胞制劑在開始培養(yǎng)的第8-12天時間之內(nèi)測得細胞符合內(nèi)毒素、無菌和細胞表面抗原分析標準之后的當天制備用于給藥的制劑。如下進行制備。培養(yǎng)期間，將培養(yǎng)瓶中全部250毫升培養(yǎng)肉湯(incubation broth)轉移到離心管，并且在24℃下以1000轉/分鐘離心8分鐘。傾析棄除得到的上清液并且使用渦旋混合器分散細胞。然后向溶液中加入50毫升(50ml)含有0.5％自體血清(步驟8中制備的)的生理鹽水并混合。
在24℃下以1700轉/分鐘將得到的溶液再次分離8分鐘，棄除上清液，使用渦旋混合器分散細胞。為了確保細胞充分懸浮，向細胞分散溶液加入含有2％自體血清的10毫升生理鹽水，用于治療體重小于10千克的犬；加入30毫升含有2％自體血清的生理鹽水，用于治療體重大于10千克的犬。通過細胞過濾器(cell strainer)(Beckton，Dickinson & Co.，No.352360)將細胞懸液過濾，然后將10微升所得細胞懸浮在1毫升生理鹽水中用于測量細胞數(shù)目，制劑中含有2％白蛋白。
步驟14配制之后計數(shù)細胞數(shù)目取步驟13中制備的最終制劑樣品10微升(10μl)，利用步驟4中描述的相同方法測定細胞數(shù)。將10微升樣品與20微升臺盼藍染色液(Sigma Corp.，No.T8154)混合，將10微升得到的溶液置于改進的Neubeier血細胞計數(shù)器中，然后在顯微鏡下計數(shù)染色細胞，測定成活率。對于健康受試犬1測得的細胞量是3.3×109個和2.2×109個，對于健康受試犬2測得細胞量是4.1×109個和3.0×109個。所有細胞成活率大于95％，因此認為是安全的。
步驟15給予激活的淋巴細胞對健康受試犬1和健康受試犬2給予步驟13中制備的自體細胞懸液。除了體溫稍有升高之外沒有發(fā)現(xiàn)副作用。
實施例2對九只患有腫瘤的犬給予由與實施例1中描述的相同的方法配制的激活的淋巴細胞，治療1-12次。在食欲提高，皮毛外觀改善，動物行走距離是治療前行走距離大約兩倍遠的能力方面表明生存質量顯著改善。給藥結果見表3。
表3用37℃下培養(yǎng)的淋巴細胞治療患有腫瘤的犬的結果

實施例3通過實施例1中描述的方法分離從健康受試犬3和健康受試犬4獲取的外周血淋巴細胞。通過與實施例1所述基本相似的方法培養(yǎng)犬淋巴細胞，不同的是培養(yǎng)溫度為37℃(±0.2℃)，38℃(±0.2℃)和39℃(±0.2℃)。在表4(對于健康受試犬3)、表5(對于健康受試犬4)、表6和圖1中給出了生長15至20倍的淋巴細胞量的結果，圖1比較了不同培養(yǎng)溫度下細胞生長。在37℃、38℃和39℃三個培養(yǎng)溫度中，39℃下培養(yǎng)的細胞實現(xiàn)最佳細胞生長。
表4不同培養(yǎng)溫度下的細胞量和表面抗原(健康受試犬3)

表5不同培養(yǎng)溫度下的細胞量和表面抗原(健康受試犬4)

表6細胞量提高10倍需要的天數(shù)

如表6所示，細胞數(shù)量增長10倍需要的培養(yǎng)期平均來說，在37℃下需要7.3天，38℃下需要6.2天，39℃下需要5.3天。確定培養(yǎng)所需要的時間可以縮短幾天。
實施例4在實施例4中，在與實施例1所述的相同條件下進行培養(yǎng)，不同的是，溫度升高至38℃和39℃之間，大空氣夾套型CO2培養(yǎng)箱環(huán)境中CO2濃度是5.0(±0.2％)并且濕度是95.0％(±5.0％)。對五只患有腫瘤的犬給予一次和兩次所獲得的激活淋巴細胞。在食欲提高，皮毛質量改善，動物行走距離是治療之前大約兩倍遠的能力方面觀察到生存質量得以改善。結果見表7。
表7對患有腫瘤的犬施用38℃下培養(yǎng)的淋巴細胞獲得的結果

給予激活淋巴細胞六次之后，表3和表7中的第5號患有腫瘤的犬死亡，該犬死亡與其腫瘤生理狀況無關。另一方面，尸體解剖證實不能手術去除的腫瘤消失了。
實施例5在實施例5中，在與實施例3所述那些基本上相同的條件下培養(yǎng)淋巴細胞，溫度升至38℃和39℃之間，在大空氣夾套型CO2培養(yǎng)箱中，其中環(huán)境CO2濃度為5％(±0.2％)，濕度為95％(±5.0％)。然后將一部分細胞低溫保存，解凍，孵育，然后給予受試者。在開始培養(yǎng)之前應用與步驟1-6所述那些基本上相似的方法。
步驟16一部分細胞的低溫保存在激活和增殖細胞的培養(yǎng)期之后3-5天，向相同的培養(yǎng)瓶加入10-30毫升培養(yǎng)基，直到培養(yǎng)瓶中的體積達到50毫升。然后在開始培養(yǎng)之后4-7天間計數(shù)細胞數(shù)目。當細胞數(shù)目超過1.0×106個/毫升時將細胞低溫保存。
細胞仍處于培養(yǎng)狀態(tài)下，每個50毫升試管中轉移30至50毫升培養(yǎng)液，然后在24℃下以1200轉/分鐘分離5分鐘。傾析去除它們的上清液，然后向每個試管加入1.8毫升細胞低溫保存培養(yǎng)基(BambankerTM，Lymphotec Inc.)，然后用渦流混合器充分混合。向每個2毫升冷凍管(Corning Incorporated，No.430289)加入1.8毫升(1.8ml)細胞懸液，將所述冷凍管放在Bicell裝置(Nihon Freezer Co.，Ltd.生產(chǎn)的低溫保存容器)中，并且儲存在-85℃溫度的深冷冰箱(deep freezer)(Sanyo Electric Co.，Ltd.No.MDF-192)中。一天之后，將它們移到用于保存生物試驗樣品的液氮罐(My Sciences Co.，Ltd.)中。
步驟17解凍和培養(yǎng)低溫保存細胞如下將步驟16中制備的低溫保存細胞解凍并培養(yǎng)。從液氮罐中取出冷凍管并且在加熱器(heating block)(Taitec Co.，Ltd.，Dryothermic UnitNo.DTU-28)中解凍4分鐘。使用巴斯德氏吸管將全部內(nèi)含物置于10毫升洗滌液中，然后在24℃下以1200轉/分鐘將得到的細胞懸液分離3分鐘。
棄除上清液之后，將分散的細胞沉積物懸浮于15至20毫升培養(yǎng)基(400毫升RPMI1640+7S、4.5毫升35000IU/ml人rIL-2和45毫升FBS)中，然后轉移到50毫升試管中，從中取10微升樣品至臺盼藍染色液中用于細胞計數(shù)。向沒有處理的24-孔板(Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.，No.MS-80240)中的每一個孔加入1-2毫升(1-2ml)剩余的細胞懸液，然后在37℃(±0.5℃)、5％(±0.2％)CO2和95％(±5.0％)濕度環(huán)境下的大夾套型CO2培養(yǎng)箱中開始孵育。
激活和增殖之后1-3天用顯微鏡檢查在少于20毫升培養(yǎng)基中開始培養(yǎng)的細胞，然后向每孔加入1-2毫升培養(yǎng)基。將細胞計數(shù)溶液和臺盼藍染色液充分混合，然后在改進的Neubeier血細胞計數(shù)器中加入10微升溶液，顯微鏡下測定其中沒有染色的活細胞和染色的死亡細胞的數(shù)目。
步驟18激活低溫保存細胞用顯微鏡觀察根據(jù)步驟17所述方法培養(yǎng)的細胞。在細胞激活和增殖的孵育期之后2-4天，使用移液管將20至30毫升仍在培養(yǎng)狀態(tài)的細胞溶液從孔中轉移至根據(jù)步驟1所述相同方法制備的培養(yǎng)瓶中，然后加入20至30毫升培養(yǎng)基(400毫升RPMI1640+7S、4.5毫升35000IU/毫升人rIL-2和45毫升FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)。
步驟19低溫保存細胞的增殖和擴增培養(yǎng)通過顯微鏡觀察步驟18中培養(yǎng)的細胞。在細胞被激活并增殖的培養(yǎng)期之后2-4天，通過輕敲培養(yǎng)瓶取下培養(yǎng)瓶中與瓶底粘附的細胞。然后將所有的細胞轉移到225平方厘米培養(yǎng)瓶(Corning Costar CompanyNo.3000)中，加入另外的50毫升培養(yǎng)基(400毫升的RPMI1640+7S、4.5毫升的35000IU/毫升人rIL-2和45毫升的FBS)，得以繼續(xù)培養(yǎng)。
為了制備用于對受試犬給藥的制劑，在細胞被激活并增殖的培養(yǎng)期開始6-8天通過顯微鏡觀察細胞，然后加入150毫升培養(yǎng)基(400毫升的RPMI1640+7S、2.25毫升的35000IU/ml人rIL-2和45毫升的FBS)。
步驟20檢測低溫保存細胞用與步驟9至12相似的方法檢測培養(yǎng)并低溫保存的細胞。
步驟21用于治療給藥的低溫保存細胞的制備和計數(shù)計數(shù)并制備根據(jù)步驟13和步驟14所述培養(yǎng)的低溫保存細胞，用于最終給藥。
步驟22低溫保存細胞給藥當對患病犬只給予一次步驟13中制備的自體細胞懸液時，在食欲提高、皮毛外觀改善、動物行走距離是治療之前大約兩倍遠的能力方面表明生存質量得以明顯改善。結果見表8。
表8將低溫冷凍的淋巴細胞解凍，再激活，并且施于患病犬的治療結果

權利要求
1.一種治療患有腫瘤的犬的方法，其中，在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2的組合存在下增殖和激活犬外周血淋巴細胞，然后將該淋巴細胞給予患有腫瘤的犬。
2.根據(jù)權利要求1所述的治療患有腫瘤的犬的方法，其中，所述白介素-2是人白介素-2。
3.根據(jù)權利要求1所述的治療患有腫瘤的犬的方法，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在37℃至41℃的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權利要求1所述的治療患有腫瘤的犬的方法，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在38℃至40℃的范圍內(nèi)。
5.一種用于治療患有腫瘤的犬的藥物制劑，其中，所述制劑含有在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2的組合存在下增殖和激活的犬外周血淋巴細胞。
6.根據(jù)權利要求5所述的用于治療患有腫瘤的犬的藥物制劑，其中，所述白介素-2是人白介素-2。
7.根據(jù)權利要求5所述的用于治療患有腫瘤的犬的藥物制劑，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在37℃至41℃的范圍內(nèi)。
8.根據(jù)權利要求5所述的用于治療患有腫瘤的犬的藥物制劑，其中，增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在38℃至40℃的范圍內(nèi)。
9.用于治療患有腫瘤的犬的細胞的低溫保存方法，其中，在固相抗-犬CD3抗體和白介素-2的組合存在下體外增殖和激活犬外周血淋巴細胞，然后將該淋巴細胞低溫保存、解凍并恢復備用，以及再激活用于制備藥物制劑。
10.根據(jù)權利要求9所述的用于治療患有腫瘤的犬的細胞的低溫保存方法，其中，所述白介素-2是人白介素-2。
11.根據(jù)權利要求9所述的用于治療患有腫瘤的犬的細胞的低溫保存方法，其中，體外增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在37℃至41℃的范圍內(nèi)。
12.根據(jù)權利要求9所述的用于治療患有腫瘤的犬的細胞的低溫保存方法，其中，體外增殖和激活犬外周血淋巴細胞所處的溫度在38℃至40℃的范圍內(nèi)。
全文摘要
患有腫瘤的犬的治療，以及在治療中使用的藥物制劑的制備、培養(yǎng)和低溫保存的方法。在抗－犬CD3抗體和白介素－2(IL－2)(優(yōu)選抗－犬CD3抗體和人白介素－2(人IL－2))的組合存在下，激活并擴增犬淋巴細胞，并且對患有腫瘤的犬給藥。治療之后，發(fā)現(xiàn)犬腫瘤消退，并且沒有嚴重的副作用。在動物行走距離延長的能力和改善皮毛外觀方面觀察到生存質量改善。
文檔編號A61K38/20GK1919342SQ20061011150
公開日2007年2月28日 申請日期2006年8月21日 優(yōu)先權日2005年8月22日
發(fā)明者石井宏志, 飯沼明子, 大隅一興, 馬場憲三, 黑巖保幸, 關根暉彬 申請人:株式會社淋巴技術