專利名稱：黑乳海參多糖提取方法及其在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從黑乳海參中提取黑乳海參多糖的方法及其黑乳海參多糖在預(yù)防和治療腫瘤疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黑乳海參(Holothuria nobilis Jaeger)為棘皮動(dòng)物門(Echinodermata)海參科(Holothuriadae)生物。海參具有較高的食用和藥用價(jià)值。明代以后，海參收入本草，列為補(bǔ)益藥。資料記載，海參具有補(bǔ)腎益精、養(yǎng)血潤(rùn)燥的功用，主治精血虧損、虛弱勞怯、陽(yáng)痿、夢(mèng)遺、小便頻數(shù)、腸燥便艱等癥?，F(xiàn)代化學(xué)和藥理實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)海參體壁真皮結(jié)締組織、體腔、內(nèi)腺管及內(nèi)臟含有多種生物活性物質(zhì)，其主要有效成分為酸性粘多糖(SJAMP)，由氨基半乳糖、己糖醛酸、巖藻糖和硫酸基組成。是一種類肝素抗凝劑，具有抗凝血、抑制血小板聚集、防治急性放射性損傷作用，可明顯促進(jìn)造血功能的恢復(fù)和增強(qiáng)。SJAMP能抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗腫瘤轉(zhuǎn)移，是一種作用較強(qiáng)的免疫促進(jìn)劑。
國(guó)內(nèi)外關(guān)于黑乳海參的研究主要集中于其體內(nèi)皂苷類成分，對(duì)于黑乳海參多糖的提取方法則尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是運(yùn)用各種現(xiàn)代化學(xué)和藥理手段，從黑乳海參中提取具有治療腫瘤疾病的多糖類化合物。
黑乳海參多糖提取工藝流程是將黑乳海參粉碎后，與3～7％的氫氧化鉀溶液按質(zhì)量比1∶2～1∶6混合，并用打漿機(jī)打漿，在30～60℃的溫度下攪拌提取，提提取時(shí)間1～3小時(shí)，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解1～2小時(shí)，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶0.5～2.0。酶解液用3000轉(zhuǎn)/分鐘離心機(jī)離心后，收集全部濾液，在50～80℃濃縮8～12小時(shí)。將濃縮后的浸提液置于冷凍機(jī)中冷凍1～3小時(shí)，溫度為-1～10℃，然后減壓至20帕～200帕，干燥溫度為30～60℃，經(jīng)8～12小時(shí)，得到白色多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。本發(fā)明具有黑乳海參多糖損失少，工藝成本低，多糖得率高的特點(diǎn)。
實(shí)驗(yàn)研究證明，黑乳海參多糖對(duì)人體腫瘤細(xì)胞K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細(xì)胞株均有抑制作用；對(duì)S180荷瘤小鼠的腫瘤組織也有較強(qiáng)的抑制作用，是有效的治療腫瘤藥物。
本發(fā)明對(duì)黑乳海參多糖進(jìn)行了抗腫瘤的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。
(一)黑乳海參多糖對(duì)人體外腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)價(jià)黑乳海參多糖對(duì)K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細(xì)胞株生長(zhǎng)的影響。
2.實(shí)驗(yàn)方法細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)MTT法篩選。黑乳海參多糖的濃度為100μg/ml，10μg/ml，1.0μg/ml，0.1μg/ml，0.01μg/ml。
數(shù)據(jù)處理以抑制率(％)表示。計(jì)算公式如下抑制率＝[細(xì)胞死亡均數(shù)-(細(xì)胞存活數(shù)1+細(xì)胞存活數(shù)2)/2]/細(xì)胞死亡均數(shù)對(duì)照組指數(shù)×100％。
3.結(jié)果黑乳海參多糖在100μg/ml時(shí)，對(duì)K-562，SHG-44，HCT-8，PC-3M，A-549等細(xì)胞株生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用(結(jié)果見表1)。
表1.黑乳海參多糖對(duì)人體腫瘤細(xì)胞的抑制作用

4.結(jié)論黑乳海參多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
(二)黑乳海參多糖對(duì)S180荷瘤小鼠腫瘤的抑制作用1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑u(píng)價(jià)黑乳海參多糖對(duì)S180荷瘤小鼠肉瘤組織生長(zhǎng)的影響。
2.方法昆明種小鼠，體重20±5g，雌雄各半。隨機(jī)編成試驗(yàn)組、陰性對(duì)照組、內(nèi)環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組，每組10只。在無菌條件下，取生長(zhǎng)旺盛的瘤源，制備成1-2×107個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，分別接種于相應(yīng)宿主小鼠腋皮下，接種0.2ml/只，次日開始，按照如下實(shí)驗(yàn)方案給藥灌胃給藥100mg/kg、50mg/kg、25mg/kg，每天一次，連續(xù)給藥10d；陰性對(duì)照組給予與試驗(yàn)組等體積的生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組給予環(huán)磷酰胺30mg/kg，腹腔給藥，每天一次，連續(xù)7d。停藥后24h處死各組動(dòng)物，稱體重、瘤重，計(jì)算各組平均瘤重，按下列公式求出腫瘤抑制率并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

3.結(jié)果黑乳海參多糖(100mg/kg)具有明顯抑制S180荷瘤小鼠肉瘤組織的生長(zhǎng)形成。

注與陰性對(duì)照組比較*P＜0.014.結(jié)論黑乳海參多糖具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一取新鮮黑乳海參10公斤，洗凈，切碎，加入3～7％的氫氧化鉀溶液30公斤，打漿機(jī)打漿，在45℃攪拌提取2小時(shí)，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解1小時(shí)，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶1。酶解液用3000轉(zhuǎn)/分鐘離心機(jī)離心后，收集全部濾液，在50℃濃縮12小時(shí)。將濃縮后的浸提液置于冷凍機(jī)中冷凍2小時(shí)，溫度為-1℃，然后減壓，使干燥壓降至100帕，干燥溫度為55℃，經(jīng)10小時(shí)，得到白色多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。
實(shí)施例二取自然干燥的黑乳海參2公斤，粉碎，加入加入3～7％的氫氧化鉀溶液12公斤，浸泡，打漿機(jī)打漿，60℃攪拌提取3小時(shí)，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解2小時(shí)，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶0.9。酶解液用3000轉(zhuǎn)/分鐘離心機(jī)離心后，收集全部濾液，在60℃濃縮12小時(shí)。將濃縮后的浸提液置于冷凍機(jī)中冷凍2小時(shí)，溫度為5℃，然后減壓，使干燥壓降至100帕，干燥溫度為55℃，經(jīng)10小時(shí)，得到白色多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。
實(shí)施例三取新鮮黑乳海參5公斤，洗凈，切碎，加入3～7％的氫氧化鉀溶液30公斤，打漿機(jī)打漿，60℃攪拌提取2小時(shí)，收集提取液。在提取液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解2小時(shí)，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶1。酶解液用3000轉(zhuǎn)/分鐘離心機(jī)離心后，收集全部濾液，在80℃濃縮10小時(shí)。將濃縮后的浸提液置于冷凍機(jī)中冷凍2小時(shí)，溫度為2℃，然后減壓，使干燥壓降至40帕，干燥溫度為40℃，經(jīng)12小時(shí)，得到白色多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。
實(shí)施例四取黑乳海參多糖100mg，用適量注射用水溶解，加甘露醇200mg，按照常規(guī)凍干工藝凍干，即得注射用凍干粉。用于治療腫瘤。
實(shí)施例五將黑乳海參多糖用適量注射用水分散，噴霧干燥或真空干燥，得黑乳海參多糖干粉。取聚乙二醇400，加入黑乳海參干粉，邊加邊攪拌至勻，采用壓制法，制成軟膠囊。用于治療腫瘤。
實(shí)施例六取黑乳海參多糖100g，用適量注射用水分散，加入輔料適量，混勻，制粒，干燥，壓成1000片，包衣，即得黑乳海參多糖片。用于治療腫瘤。
權(quán)利要求
1.一種從海洋動(dòng)物黑乳海參中提取黑乳海參多糖的方法，其特征在于將黑乳海參與溶劑按比例混合，并用打漿機(jī)打漿，在一定的溫度下進(jìn)行攪拌提取，提取液用雙酶水解，離心，收集并濃縮濾液。將濃縮液冷凍干燥，得到白色的多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。
2.按權(quán)利要求1所述的黑乳海參，其特征在于，可以是新鮮采集的黑乳海參，也可以是經(jīng)過干燥后的黑乳海參。
3.按權(quán)利要求1所述的黑乳海參與溶劑按比例混合，在一定的溫度下攪拌提取，其特征在于，打漿的溶劑為3～7％的氫氧化鉀溶液，溶劑與黑乳海參混合的質(zhì)量比為2∶1～6∶1。攪拌提取溫度為30～60℃，時(shí)間為1～3小時(shí)。
4.按權(quán)利要求1所述的雙酶水解，其特征在于在浸提液中加入總重量1％的纖維素酶和果膠酶，酶解1～2小時(shí)，纖維素酶和果膠酶的比例為1∶0.5～2.0。
5.按權(quán)利要求1所述的離心和濃縮，其特征在于用3000轉(zhuǎn)/分鐘離心機(jī)離心后，收集全部濾液，在50～80℃濃縮8～12小時(shí)。
6.按權(quán)利要求1所述的冷凍干燥，其特征在于將濃縮后的浸提液置于冷凍機(jī)中冷凍1～3小時(shí)，溫度為-1～10℃，然后減壓至20帕～200帕，干燥溫度為30～60℃，經(jīng)8～12小時(shí)，得到白色多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。
7.一種按權(quán)利要求1所述的黑乳海參多糖在制備治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從海洋動(dòng)物黑乳海參中提取純化多糖的工藝。其工藝流程是將黑乳海參粉碎后，與溶劑按比例混合，并用打漿機(jī)打漿，在一定的溫度下進(jìn)行攪拌提取，提取液用雙酶水解，離心，收集并濃縮濾液。將濃縮液冷凍干燥，得到白色的多糖干性物質(zhì)，即為黑乳海參多糖。實(shí)驗(yàn)研究證明，黑乳海參多糖對(duì)人體腫瘤細(xì)胞K－562，SHG－44，HCT－8，PC－3M，A－549等細(xì)胞株的生長(zhǎng)均有抑制作用；對(duì)S180荷瘤小鼠的腫瘤組織的生長(zhǎng)也有較強(qiáng)的抑制作用。本發(fā)明中的黑乳海參多糖是一種作用較強(qiáng)的免疫促進(jìn)劑，可制備成新的抗腫瘤藥物。
文檔編號(hào)A61K31/715GK1986826SQ20061015546
公開日2007年6月27日 申請(qǐng)日期2006年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月26日
發(fā)明者巫軍 申請(qǐng)人:巫軍