專利名稱：淡色庫蚊細胞色素p450(cyp6f1)基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種來自于淡色庫蚊溴氰菊酯抗性的細胞色素P450(CYP6F1)基因。
背景技術(shù)：
及

發(fā)明內(nèi)容
細胞色素P450單加氧酶是昆蟲體內(nèi)參與各類殺蟲劑以及其它外援性和內(nèi)源性化合物化代謝的主要解毒酶系。細胞色素P450(簡稱CYP)是細胞色素P450單加氧酶系的末端氧化酶，起著與底物結(jié)合以及從NADPH傳遞電子到NADPH細胞色素P450還原酶的重要作用。細胞色素P450功能多樣，特別是能夠代謝目前廣泛使用的殺蟲劑如擬蟲菊酯類、氨基甲酸酯類等，其與昆蟲抗藥性形成機制的研究成為當前研究的熱點。近些年來，隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)的發(fā)展，克隆昆蟲P450基因、研究其系統(tǒng)進化以及與抗藥性的關(guān)系越來越引起重視。昆蟲細胞色素P450與諸多殺蟲劑，尤其目前廣泛使用的擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗性密切相關(guān)。目前，在眾多已知的昆蟲細胞色素P450家族中，被認為與菊酯類殺蟲劑抗性關(guān)系最為密切的主要為CYP6家族基因。
本發(fā)明所述的淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因是發(fā)明人在山東省寄生蟲病防治研究所醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)研究室應(yīng)用兼并引物，以淡色庫蚊溴氰聚酯抗性品系提取的RNA為模板，降落RT-PCR技術(shù)克隆擴增，并采用快速末端擴增法克隆獲得。序列經(jīng)拼接獲得淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因cDNA全長，為1639bp；其開放閱讀框為1527bp，編碼508個氨基酸。在NCBI網(wǎng)站上用BLAST完成序列同源性分析，表明其為新基因。經(jīng)半定量RT-PCR和實時定量PCR證實，該基因在淡色庫蚊溴氰聚酯抗性品系中高表達。因此，推測淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因可能與淡色庫紋溴氰聚酯抗性有關(guān)。
由于淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因在GenBank中為新基因，本發(fā)明人對該基因的結(jié)構(gòu)和功能研究成果均為開創(chuàng)性的。美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)已正式接收該基因為GenBank的新成員，接收號為AY662654。
淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因序列1639bp1 cttatgtttg cgtggataat ctgcgctgcg gcagcagttc cgctggtgta cttcctgatc61 gtgtaccagt tcagctactg gaaacgtcgt gggatcacac aactcactcc atcattccca121 tttggagatc ttggaccgtt ctttcggcaa cggtccagcc tcggagtggt ctacgccgat181 gtgtaccggc tgtgcaagcg cctacccttt gtggggatct acttttcctt gcggccaatg241 ctggtggtca acgaccccga gttgattaaa aatgtgcttg tgcgtgattt tgaccacttt301 cacgatcgtg gactgtacgt gaacgaggag aaggacccac tcagtgggca tttgtttgca361 ctcggtggcg aacagtggcg ccatcatcgg tccaagctaa cgccaacgtt cacctcggga421 aggttgaagg agatgttcac gaacttggtc caaattgggc gtgttctcca agatcacgtg481 gcgaaacgtg ctggggagga catcgaaatt cgggacgtga tggcgcggta cactaccgat541 atcattgcat cggttggatt cggaatcgaa aatgactcca tcaacgaaaa gggcaacatt601 ttcagggaaa tgggaacgaa ggtgttctct cctgatctta agacgatact tcgattgacg661 agcacatttt tcactccaaa gctgaacgca ctgtttggat tcaaatttat cgcacaggag721 attgaagact tcatcatgaa cgttgtacgt gaaaccctgg agtacagaga aagcaacaaa781 gtcgtccgga aggatatgat gcagctgctc atgcagctac gtaactccgg aacggtttcg841 atcgacgatc gatgggacat cgaagtgtca accaacaaga aaaagctgtc cctggaacaa901 gtcacagcac acgcgttcgt attcttcata gcagcatacg aaacatcatc gaccaccatt961 tcgttctgct tgttcgaact ggcacgcaat ccggagattc aaaagaaagt gcaacaagaa1021 attgaccaag ttctcgcaag ccacaacggc gaaatcacct acgacaacat caacgaaatg1081 aaatacctcg aaaactgcat cgacgaaacg ctccgaaagt atccggcagt tccgttcctg1141 aaccgtgagt gttctaagga ttacaaaatc cccggaacag acaccaccat cgagaaagga1201 acatcgttag tcattccagt cctcggacta caccgcgatc ccgatcacta cccggaaccg1261 gacaggttca ttccggaacg gttcagcaac tttgaagata tttccaccaa accgtatctt1321 ccgtttgggg caggacctcg caactgtatt ggactgagat tgggcaagct gcaaacaaag1381 gcgggactgg tgatgatgct gtccaagttt aacgtgcggc ttgctgatga aacttacgcc1441 agcaaagagc tagcgctcga tgcgcgaagt gtggttctaa tgccggttgg aggtattaag1501 gtgtcgattt cggaacggag ggcttcgtaa tacaaattga agtgactcgt aatataatac1561 ttaaatatca caataaatga taccaaaata aactatttaa tgaacaaaaa aaaaaaaggt1621 ccggtacctc tagatcaga 1639
淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)氨基酸序列508aaMFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的全新基因，目前人類對于此基因的認識和了解僅限于本發(fā)明人所做的研究工作。由于該基因在淡色庫蚊溴氰聚酯抗性品系中高表達，因此該基因很可能與淡色庫蚊溴氰聚酯抗性發(fā)生密切有關(guān)，其表達量的上調(diào)可能引起抗藥性。該基因可用于1、通過制備該基因的融合蛋白，研究該基因與抗藥性的關(guān)系，為昆蟲抗藥性的治理提供新的思路。
2、制備特異性抗體，用于現(xiàn)場蚊蟲抗藥性的監(jiān)測。目前，現(xiàn)場蚊蟲抗藥性的監(jiān)測尚無行之有效的方法，可用該基因表達蛋白制備特異性抗體，然后制成檢測試劑盒，可大大簡化操作步驟，經(jīng)濟簡便、省時省力。
具體實施例方式淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因片斷的克隆淡色庫蚊敏感品系引自中國科學(xué)院上海昆蟲研究所，并在本室經(jīng)傳60余代；抗性品系由本室逐代用溴氰菊酯汰選而成，抗性系數(shù)617。蚊蟲飼養(yǎng)在28℃，相對濕度為70％-80％的室內(nèi)，14h光照時間，并用小白鼠飼喂產(chǎn)卵傳代。
根據(jù)GenBank登錄的昆蟲CYP6家族的已知基因序列，包括果蠅、岡比亞按蚊、埃及伊蚊、致倦庫蚊等CYP6基因，設(shè)計兼并引物。以淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系蚊蟲所提的總RNA為模板，用兩步法RT-PCR克隆擴增，第一鏈的合成后，用降落PCR克隆擴增基因序列。PCR結(jié)果經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，120V，30min后，用QIAquick Gel Extraction Kit割膠純化。純化產(chǎn)物加A尾，將之插入pGEM-T easy載體，進行藍白斑篩選，挑取培養(yǎng)板上的白斑，于含有抗生素Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，220rpm，37℃培養(yǎng)過夜。以菌液為模板，用通用引物及特異性引物PCR方法初步鑒定，陽性克隆提取質(zhì)粒進行測序。
1、RACE法獲得淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因根據(jù)測序獲得的基因序列，利用Primer premier軟件設(shè)計3’RACE和5’RACE引物用于擴增3’和5’端序列。
3’RACE引物5’-TGACCAAGTTCTCGCAAGCC-3’5’RACE引物5’-AGTATCCGGCAGTTCCGTTCC-3’以淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系蚊蟲所提的總RNA為模板，用兩步法RT-PCR克隆擴增，第一鏈的合成后，用降落PCR克隆擴增基因序列。PCR結(jié)果經(jīng)電泳鑒定、割膠純化后加A尾后，插入pGEM-T easy載體進行藍白斑篩選，陽性克隆提取質(zhì)粒進行測序。將3’RACE和5’RACE獲得的序列和RT-PCR獲得的序列進行拼接，得到基因全長cDNA序列。根據(jù)基因全長設(shè)計擴增基因全長引物，以總RNA為模板RT-PCR，擴增出1700bp的條帶，和預(yù)期的目的條帶(1639bp)大小相符，說明目的基因拼接正確。淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因全長序列(GenBank/NCBI AY662654)，總長度為1639bp；開放閱讀框為1527bp，推導(dǎo)的蛋白質(zhì)編碼508個氨基酸。
2、半定量PCR和實時定量PCR(Real time PCR)鑒定細胞色素P450(CYP6F1基因在溴氰菊酯抗性品系和敏感品系的表達差異(1)半定量PCR測定蚊抗性、敏感品系CYP6F1的表達分別取30mg淡色庫蚊對溴氰菊酯抗性、敏感品系蚊蟲蟲，提取總RNA。電泳鑒定、定量測定后，稀釋至相同濃度(0.5μg/μl)，RT-PCR預(yù)實驗確定PCR指數(shù)擴增的循環(huán)數(shù)為25個循環(huán)。各取5μl擴增PCR產(chǎn)物，以1％的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Gel-Pro Analyzer軟件定量分析，每次PCR反應(yīng)均以β-actin作為對照，通過目的基因和管家基因β-actin電泳條帶的光吸收灰度比值來衡量目的基因的表達強度。結(jié)果顯示，敏感品系的CYP6F1/β-actin灰度比值1.0；抗性品系的CYP6F1/β-actin灰度比值為1.6，提示抗性品系的CYP6F1基因的表達高于敏感品系。
(2)實時定量PCR測定蚊蟲抗性、敏感品系CYP6F1的表達根據(jù)擴增的基因全長設(shè)計實時定量PCR的引物
CYP6F1上游引物5’-GGCGAAATCACCTACGACAAC-3’下游引物5’-TCCGAGGACTGGAATGACTAAC-3’β-actin作為內(nèi)參照基因，引物如下β-actin上游引物5’-AGCGTGAACTGACGGCTCTTG-3’下游引物5’-ACTCGTCGTACTCCTGCTTGG-3’制備用于繪制標準曲線的梯度稀釋DNA模板針對需要測量的目的基因和管家基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應(yīng)。PCR產(chǎn)物2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。將PCR產(chǎn)物進行10倍梯度稀釋，設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1，分別稀釋為1×10-1，1×10-2，1×10-3，1×10-4，1×10-5，1×10-6梯度濃度的DNA，每一濃度取1μl作為模板進行熒光定量擴增。以模板拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，測得各自的Ct值為縱坐標作圖，即得標準曲線。
實時定量PCR反應(yīng)幾個梯度稀釋的DNA模板以及所有cDNA樣品分別配置實時定量PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)液置于實時定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件為50℃、2min，95℃、10min，然后再進行40個循環(huán)的95℃、15s，60℃、1min。
根據(jù)梯度稀釋DNA分別進行目的基因和管家基因定量PCR反應(yīng)，得出各自的Ct值，再以Ct值為縱坐標，拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，算得標準曲線為y＝-3.666x+6.216，R2＝0.99976，表明反應(yīng)體系狀態(tài)良好，具有可重復(fù)性。樣品目的基因和管家基因的濃度結(jié)果直接由機器生成。每個樣品的目的基因濃度除以其管家基因的濃度，即為此樣品此基因的校正后的相對含量。經(jīng)計算獲知抗性品系細胞色素P450(CYP6F1)表達是敏感品系的1.93倍，提示抗性品系的CYP6F1基因的表達高于敏感品系，即CYP6F1基因在溴氰菊酯抗性品系蚊蟲中表達增加。
盡管從原核生物到真核生物，全球科學(xué)家已就多種物種的細胞色素P450(CYP6F1)基因進行了研究，但這是首次獲得的在淡色庫蚊溴氰菊酯抗性品系高表達的細胞色素P450(CYP6F1)基因，這對進一步研究昆蟲抗藥性機制及其治理具有重要意義。
序列表淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因序列1639bp1 cttatgtttg cgtggataat ctgcgctgcg gcagcagttc cgctggtgta cttcctgatc61 gtgtaccagt tcagctactg gaaacgtcgt gggatcacac aactcactcc atcattccca121 tttggagatc ttggaccgtt ctttcggcaa cggtccagcc tcggagtggt ctacgccgat181 gtgtaccggc tgtgcaagcg cctacccttt gtggggatct acttttcctt gcggccaatg241 ctggtggtca acgaccccga gttgattaaa aatgtgcttg tgcgtgattt tgaccacttt301 cacgatcgtg gactgtacgt gaacgaggag aaggacccac tcagtgggca tttgtttgca361 ctcggtggcg aacagtggcg ccatcatcgg tccaagctaa cgccaacgtt cacctcggga421 aggttgaagg agatgttcac gaacttggtc caaattgggc gtgttctcca agatcacgtg481 gcgaaacgtg ctggggagga catcgaaatt cgggacgtga tggcgcggta cactaccgat541 atcattgcat cggttggatt cggaatcgaa aatgactcca tcaacgaaaa gggcaacatt601 ttcagggaaa tgggaacgaa ggtgttctct cctgatctta agacgatact tcgattgacg661 agcacatttt tcactccaaa gctgaacgca ctgtttggat tcaaatttat cgcacaggag721 attgaagact tcatcatgaa cgttgtacgt gaaaccctgg agtacagaga aagcaacaaa781 gtcgtccgga aggatatgat gcagctgctc atgcagctac gtaactccgg aacggtttcg841 atcgacgatc gatgggacat cgaagtgtca accaacaaga aaaagctgtc cctggaacaa901 gtcacagcac acgcgttcgt attcttcata gcagcatacg aaacatcatc gaccaccatt961 tcgttctgct tgttcgaact ggcacgcaat ccggagattc aaaagaaagt gcaacaagaa1021 attgaccaag ttctcgcaag ccacaacggc gaaatcacct acgacaacat caacgaaatg1081 aaatacctcg aaaactgcat cgacgaaacg ctccgaaagt atccggcagt tccgttcctg1141 aaccgtgagt gttctaagga ttacaaaatc cccggaacag acaccaccat cgagaaagga1201 acatcgttag tcattccagt cctcggacta caccgcgatc ccgatcacta cccggaaccg1261 gacaggttca ttccggaacg gttcagcaac tttgaagata tttccaccaa accgtatctt1321 ccgtttgggg caggacctcg caactgtatt ggactgagat tgggcaagct gcaaacaaag1381 gcgggactgg tgatgatgct gtccaagttt aacgtgcggc ttgctgatga aacttacgcc1441 agcaaagagc tagcgctcga tgcgcgaagt gtggttctaa tgccggttgg aggtattaag1501 gtgtcgattt cggaacggag ggcttcgtaa tacaaattga agtgactcgt aatataatac1561 ttaaatatca caataaatga taccaaaata aactatttaa tgaacaaaaa aaaaaaaggt1621 ccggtacctc tagatcaga 1639
淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)氨基酸序列508aaMFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS。
權(quán)利要求
1.一種淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因，其特征是淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因，氨基酸序列為MFAWIICAAAAVPLVYFLIVYQFSYWKRRGITQLTPSFPFGDLGPFFRQRSSLGVVYADVYRLCKRLPFVGIYFSLRPMLVVNDPELIKNVLVRDFDHFHDRGLYVNEEKDPLSGHLFALGGEQWRHHRSKLTPTFTSGRLKEMFTNLVQIGRVLQDHVAKRAGEDIEIRDVMARYTTDIIASVGFGIENDSINEKGNIFREMGTKVFSPDLKTILRLTSTFFTPKLNALFGFKFIAQEIEDFIMNVVRETLEYRESNKVVRKDMMQLLMQLRNSGTVSIDDRWDIEVSTNKKKLSLEQVTAHAFVFFIAAYETSSTTISFCLFELARNPEIQKKVQQEIDQVLASHNGEITYDNINEMKYLENCIDETLRKYPAVPFLNRECSKDYKIPGTDTTIEKGTSLVIPVLGLHRDPDHYPEPDRFIPERFSNFEDISTKPYLPFGAGPRNCIGLRLGKLQTKAGLVMMLSKFNVRLADETYASKELALDARSVVLMPVGGIKVSISERRAS
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因，其特征是應(yīng)用兼并引物，以淡色庫蚊溴氰聚酯抗性品系蚊蟲提取的RNA為模板，降落RT-PCR技術(shù)克隆擴增，并采用快速末端擴增法克隆獲得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因制備的融合蛋白，其特征是融合蛋白可用作制備治理昆蟲抗藥性的有關(guān)藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因制備的特異性抗體，其特征是可用該抗體制成試劑盒，用于現(xiàn)場蚊蟲抗藥性的監(jiān)測和蚊蟲抗藥性機理的研究。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，所述淡色庫蚊細胞色素P450(CYP6F1)基因(Culex pipiens pallens CYP6F1)，基因全長為1639bp，其開放閱讀框為1527bp，編碼508個氨基酸。該基因在GenBank中的編號為AY662654。本發(fā)明以淡色庫蚊溴氰聚酯抗性品系蚊蟲提取的RNA為模板，應(yīng)用降落RT－PCR技術(shù)克隆擴增，并采用快速末端擴增法(rapid amplification cDNA ends，RACE)克隆獲得。利用該基因制備融合蛋白及特異性抗體，用于制備與抗藥性治理有關(guān)的藥物及試劑盒。
文檔編號A61K38/17GK101078014SQ20071001418
公開日2007年11月28日 申請日期2007年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月14日
發(fā)明者公茂慶, 鄧緒禮, 閆歌, 劉波, 寇景軒, 王懷位, 程鵬, 朱昌亮 申請人:山東省寄生蟲病防治研究所