專利名稱：抗人巨細胞病毒包膜糖蛋白b的人源化單鏈抗體的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程技術領域，具體涉及抗人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的人源化單鏈抗體。
背景技術：
人巨細胞病毒(HCMV，human cytomegalovirus)是皰疹病毒科β亞科中基因組最大的DNA病毒，所編碼的蛋白質超過227種，具有種屬特異性。在發(fā)達國家人群感染率為40％～60％，發(fā)展中國家感染率更高，我國成人感染率為70％～90％。HCMV感染可以侵襲多個器官，造成嚴重疾病。HCMV感染是最常見的宮內感染，是導致新生兒先天畸形、進行性耳聾和智力低下的首要原因。我國每年因HCMV感染造成的先天畸形患兒約4萬人。同時HCMV感染是目前導致骨髓和器官移植失敗的重要原因之一，接受器官移植的HCMV血清抗體陰性患者，HCMV感染率為53％～73％。因而抗HCMV感染的研究日益受到重視。目前在臨床上治療CMV的常用藥物，如ganciclovir等是核苷酸的衍生物或類似物，雖然能夠競爭抑制病毒利用宿主細胞的DNA復制和轉錄的相關酶類，對病毒的復制和增殖具有較好的阻止作用，但同時對宿主細胞本身所需要的DNA復制和轉錄過程也產生不可避免的干擾，對機體細胞的負作用也是顯而易見的。因此感染CMV的免疫低下病人、孕婦和新生兒的治療缺乏高效的特異性藥物。鑒于上述抗病毒藥物的缺陷，人們一直在尋求新的方法對HCMV感染進行防治。
HCMV通過吸附、侵入細胞、復制及釋放這一循環(huán)方式在人體內存活。病毒吸附到宿主細胞上是病毒感染的起點，阻斷病毒吸附毫無疑問是預防和治療病毒感染首選目標。gB蛋白在病毒吸附和侵入的過程中起重要作用。目前已經知道，HCMV gB為HCMV包膜中最豐富的糖蛋白，占包膜蛋白的50％以上，由開放閱讀框UL55基因編碼。gB是由跨膜亞基因gp55和表面亞基因gp116組成的I型膜糖蛋白。gB蛋白經轉錄翻譯后糖基化，形成150KD的gB前體，接著從內質網(wǎng)運輸進入高爾基體，在第460氨基酸位點分裂為以二硫鍵相連的gp55-gp116復合物，即gB。gp55位于羧基端，gp116位于氨基端，兩者均含抗原決定簇，復合物總長為906個氨基酸，gB被送至感染細胞的漿膜上并組成病毒體豐富的包膜成分。HCMVgB抗原性的研究已較為清楚，已發(fā)現(xiàn)的三個線性抗體結合位點中，其中兩個是病毒中和抗體的靶位。AD1是gB中首要的抗原決定簇，位于560-640氨基酸之間，人血清中gB特異性抗體反應中50％以上直接對AD1；gB的第二重要的抗原決定族為AD2，位于68-77氨基酸之間，人血清中30％含有與此表位反應的抗體。電鏡分析顯示，抗體中和的HCMV病毒體滯留在細胞表面，細胞內的病毒顆粒減少?？贵w能通過限制感染細胞病灶阻斷感染的擴散。這些結果表明gB的主要致病機制在于提高病毒體穿透，促進細胞間感染的擴散。表明gB蛋白在人巨細胞病毒吸附人體細胞的過程中具有至關重要的作用。
對于HCMVgB這樣的病毒包膜糖蛋白靶標，很自然會首先想到免疫方法進行針對性的治療。通常免疫治療可分為主動免疫治療和被動免疫治療。主動免疫治療通常采用疫苗激發(fā)機體特定抗原的免疫力。由于HCMV感染發(fā)病患者通常免疫水平低下，機體的免疫能力難以被充分激發(fā)，通過疫苗來防止HCMV感染或活化在時間和免疫的效果上不易得到良好的保證。被動免疫通過給予患者特定抗原的中和抗體能幫助患者立刻獲得針對特定抗原的免疫力，因為中和抗體能阻斷病毒與宿主細胞的結合；對于重新活化的病毒，也能夠阻止HCMV的進一步擴散。1998年，美國MedImmune公司的Cytogam通過FDA審批，這是目前唯一用于治療人巨細胞病毒感染的抗體類藥物，在骨髓移植和器官移植患者中有確切的療效。它是從人巨細胞病毒抗體高滴度的患者血液中提取純化的血液制品，來源極為有限，同時存在兩個主要的缺陷，一方面是因為來源于血漿，存在傳播血源性病毒感染的隱患；另一方面其抗體的序列結構尚不清楚，難以進一步擴大其來源。Cytogam的療效證明抗人巨細胞病毒人源化抗體的有效性，迫在眉睫的問題是設法找到序列明確的抗人巨細胞病毒抗體，為后續(xù)通過生物工程大量獲得抗人巨細胞病毒人源化抗體打下基礎。
1984年單克隆抗體OKT3開始應用于臨床，由于它是通過雜交瘤技術制備的鼠源性單克隆抗體，很快就發(fā)現(xiàn)存在由于免疫原性引起抗免疫球蛋白反應的問題。從此抗體預防和治療應用的核心問題就一直是如何才能降低抗體在體內應用時的免疫原性，也就是人源化問題。獲得能夠阻止HCMV粘附到宿主細胞的人源化抗體無疑具有良好的應用前景。那么，怎樣才能來獲得這樣的人源化抗體呢？目前兩種技術能夠有效地解決抗體的人源化問題，一種是噬菌體抗體庫技術，另一種是轉基因抗體技術。噬菌體抗體庫技術使得體外獲得抗體多樣性成為可能，轉基因抗體技術則能讓動物體內產生人源化的抗體。雖然轉基因抗體技術是目前獲得人源化抗體最理想的途徑，但是其技術難度大，對實驗室設備和經費的需求非常高。噬菌體抗體庫技術費用低廉得多，而且在普通實驗室即可完成，便于實施；噬菌體抗體庫技術另一個優(yōu)點在于因為沒有B細胞成熟過程中的選擇和淘汰，在體外獲得的多樣性可以遠遠大于體內B細胞產生抗體的多樣性，同時所獲得的序列均為人體來源，臨床應用不必再顧慮免疫原性問題。
發(fā)明的內容本發(fā)明的目的是提供一種能夠用于制備臨床上用于預防和治療人巨細胞病毒感染藥物的抗人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的人源化單鏈抗體。
為實現(xiàn)上述目的采用的技術方案是這樣的即選擇噬菌體抗體庫技術對人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的人源化單鏈抗體進行了研究。首先采集了臨床血液標本，通過ELISA檢測試劑盒鑒定出HCMVIgG陽性標本；然后提取陽性外周血標本中的淋巴細胞RNA，用RT-PCR共擴增獲取了抗體重鏈可變區(qū)基因編碼片斷、kappa鏈可變區(qū)編碼基因和lamda鏈可變區(qū)編碼基因；通過overlap-PCR技術，將重鏈和輕鏈裝配成ScFv片段；經電轉化后構建大庫容量噬菌體抗體庫；將抗體庫經過多次篩選后，隨后對陽性克隆進行了初步鑒定，獲得了具有良好的特異性的抗人巨細胞病毒增殖能力的人源化抗體。
所獲得的抗人巨細胞病毒人源化抗體的特征是1)、由蛋白質一級序列SEQ IDNO1表示，該序列表示如下Val Lys Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr1 5 10 15 20Ser Gly Met Cys Val Ser Trp Thr Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Ala21 25 30 35 40Arg Ile Asp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Ser Thr Ser Leu Lys Thr Arg Leu Thr Ile41 45 50 55 60Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Val Leu Thr Val Thr Asn Met Asp Pro Val Asp61 65 70 75 80Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile Arg Arg Asp Met Val Arg Gly Val Lys Tyr Tyr81 85 90 95 100
Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly101 105 110 115 120Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Glu Asn Asn121 125 130 135 140Tyr Val Tyr Trp Tyr Arg Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile His Thr Thr141 145 150 155 160Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ala Ser Ala161 165 170 175 180Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp181 185 190 195 200Asp Asp Ser Leu Ser Gly His Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser201 205 210 215 220Gly Ile Leu Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu221 225 2302)、具有識別人巨細胞病毒糖蛋白B的特征，并具有抗人巨細胞病毒感染的中和活性。
根據(jù)本發(fā)明上述抗人巨細胞病毒人源化抗體蛋白，通過現(xiàn)有生物工程技術，就能夠找到與之對應的核苷酸編碼序列，所述序列能在原核細胞、真核細胞以及任何重組病毒表達系統(tǒng)中表達。
為此，本發(fā)明的保護還涉及與抗人巨細胞病毒人源化抗體所對應的核苷酸編碼序列。
本發(fā)明的優(yōu)點在于所涉及的抗人巨細胞病毒人源化單鏈抗體，對人體沒有物種差異，不會導致免疫損傷；而且特異性好，具有良好的結合能力，可以為將來臨床抗病毒預防和治療提供可行的特異性抗體類藥物。


附圖1為臨床患者外周血淋巴細胞RNA電泳圖；附圖2為抗體重鏈編碼區(qū)RT-PCR結果。在400bp處出現(xiàn)明顯亮帶，與預計的擴增片段大小相符；附圖3為抗體kappa鏈編碼區(qū)RT-PCR結果。在350bp左右出現(xiàn)明顯亮帶，與預計的擴增片段大小相符；附圖4為抗體lamda鏈編碼區(qū)RT-PCR結果。在350bp左右出現(xiàn)明顯亮帶，與預計的擴增片段大小相符；附圖5為重鏈輕鏈裝配結果；附圖6為噬菌體單鏈抗體庫單個克降篩選結果；附圖7為人源化單鏈抗體HCMV-scfv-1的中和試驗結果。
具體實施例方式
以下通過實例對本發(fā)明作詳細說明實例1、臨床患者外周血淋巴細胞分離和RNA提取取15ml離心管；每管加淋巴細胞分離液8ml。將每個標本的4ml血液輕輕疊加在分離液上；3000rpm離心20分鐘；輕輕吸取分層界面的淋巴細胞層，3000RPM離心20分鐘；輕輕吸去上清，加入0.5ml Tripure混勻，提取RNA。RNA提取結果見圖1實例2、人源化單鏈抗體基因片段的擴增將實例1中提取收集樣本的RNA，通過逆轉錄-多聚酶鏈式反應(RT-PCR)擴增出抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的基因編碼片段，并將重鏈和輕鏈可變區(qū)通過overlap-PCR裝配在一起。其中，逆轉錄反應條件30℃10min；42℃60min；99℃5min；4℃5min。PCR條件94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，循環(huán)35次；72℃10min；4℃10min。overlap-PCR條件94℃5min；94℃30sec，56℃30sec，72℃2min，循環(huán)25次；72℃10min；4℃10min。所得的結果如圖2-圖5所示。
實例3、抗體庫的構建將回收純化的overlap-PCR產物用和載體質粒pComb3X分別用SfiI酶切，將酶切后的單鏈抗體片段和載體回收純化后，用DNA連接酶連接，室溫孵育4小時至過夜。將連接樣品和相應數(shù)量電轉杯冰浴10min。同時取電感受態(tài)細菌，冰上溶解。將連接后的樣品與感受態(tài)細菌混合，加入電轉杯。冰浴1分鐘，電轉儀設定為25μF，2.5kV，200Ω，持續(xù)時間約4-5毫秒。分次用1、2、2mlSOC培養(yǎng)基立即沖洗電轉杯，在50ml試管中混合洗液，37度250rpm振蕩1小時。加入10ml預熱的SB培養(yǎng)基，3ul100mg/ml羧芐(如果用XL1-blue，同時加入30ul5mg/ml四環(huán)素。計算轉化滴度時，取2ul培養(yǎng)液稀釋到200ulSB培養(yǎng)基中，，分別取100和10ul在LB羧芐平板上推板。37度過夜?？傓D化數(shù)等于菌落克隆數(shù)X培養(yǎng)液體積/推板液體積)。250rpm振蕩15ml培養(yǎng)液，37度1小時。再加入4.5ul100mg/ml羧芐，再振蕩培養(yǎng)1小時。加入2mlVCSM13輔助噬菌體(1012-1013pfu/ml)，加入183ml37度預熱的SB培養(yǎng)基，92.5ul100mg/ml羧芐，(如果用XL1-blue，同時加入370ul5mg/ml四環(huán)素)。300rpm振蕩培養(yǎng)液，37度1.5-2小時。加入280ul50mg/ml卡那霉素，300rpm振蕩培養(yǎng)液，37度過夜。構建噬菌體抗體庫容量約為6.5*108。
實例4、抗體庫篩選用2ug/100ul的抗原包被96孔板，每孔100ul。用膠膜封好后，4℃過夜。排干包被液，用150ul 3％BSA封阻液，用膠膜封好后，37℃孵育1hours。拍干包被液，加50ul準備好的抗體庫/孔，用膠膜封好后，37℃孵育2hours。同時取12ml試管加入2ml SB培養(yǎng)基，2ul XL1-Blue，37℃培養(yǎng)1.5-2.5hours，振蕩速度250rpm，到菌液OD600nm接近1時取出。拍干噬菌體液，加150ul 0.5％TBS溶解，快速上下沖洗5次，靜置5分種后，排干液體，重復洗滌5次。拍干最終洗脫液后，每孔加入50ul新鮮配制的胰蛋白酶，封口孵育37℃0.5hours，猛烈沖洗10次，將洗脫液轉入準備好的2mlEcoli中，室溫孵育15min。加入37℃預熱的6ml SB培養(yǎng)基，1.6ul100mg/ml羧芐，12ul5mg/ml四環(huán)素，將培養(yǎng)液移到50ml離心管中，37℃培養(yǎng)1hours，振蕩速度250rpm。加入2.4ul100mg/ml羧芐，37℃培養(yǎng)1.5-2.5hours，振蕩速度250rpm。加入1mlVCSM13(1012-1013)到8ml培養(yǎng)液中，移入500ml搖瓶，加入91ml37℃預熱SB，46ul100mg/ml羧芐。37℃培養(yǎng)1.5-2.5hours，振蕩速度300rpm。加入140ul50mg/ml卡那霉素，37℃培養(yǎng)過夜，振蕩速度300rpm。4℃，3000g離心15min，取上清收獲噬菌體，將上清加入一個干凈的500ml離心瓶，加入4gPEG8000，3gNaCl，37℃培養(yǎng)5min，振蕩速度300rpm，溶解固體。冰浴保存30min。4℃，15000g離心15min，沉淀PEG，棄上清，倒置用吸水紙吸干管壁上的液體。用2ml1％BSA輕柔懸浮噬菌體沉淀，4℃15000g離心5min。將上清用0.2um濾膜過濾，進入新一輪篩選。隨著篩選輪數(shù)的增加，逐步提高篩選嚴謹度。將1-5輪篩選后的噬菌體抗體庫液做ELISA，分析陽性抗體的富集程度。挑選單個克隆的噬菌體抗體作ELISA實驗，結果如圖6所示。將陽性克隆送公司測序并分析抗體序列。
實例5、單鏈抗體中和試驗為了避免傳統(tǒng)的噬斑減少試驗不易于定量和標準化的缺點，我們以空白噬菌體為對照，用噬菌體抗體和病毒共同孵育后24小時內感染細胞內病毒糖蛋白B含量的變化來觀察單鏈抗體抗體的抑制效果。從圖7中的變化趨勢可以看出本發(fā)明單鏈抗體的抑制效果良好，與對照組相比人巨細胞病毒包膜糖蛋白B表達量下降了36％。
權利要求
1.一種抗人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的人源化單鏈抗體，其特征在于1)、由蛋白質一級序列SEQ ID NO1表示；2)、具有識別人巨細胞病毒糖蛋白B的特征，并具有抗人巨細胞病毒感染的中和活性。
2 與權利1所列出的單鏈抗體序所對應的核苷酸編碼序列，所述序列能在原核細胞、真核細胞以及任何重組病毒表達系統(tǒng)中表達。
3.權利1所述人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的人源化單鏈抗體在制備臨床上用于預防和治療人巨細胞病毒感染藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種抗人巨細胞病毒包膜糖蛋白B的人源化單鏈抗體，其特征是1)由蛋白質一級序列SEQ ID NO1表示；2)具有識別人巨細胞病毒糖蛋白B的特征，并具有抗人巨細胞病毒感染的中和活性。本發(fā)明還保護與所述人源化單鏈抗體序列所對應的核苷酸編碼序列。本發(fā)明的優(yōu)點在于所涉及的抗人巨細胞病毒人源化單鏈抗體，對人體沒有物種差異，不會導致免疫損傷；而且特異性好，具有良好的結合能力，可以為將來臨床抗病毒預防和治療提供可行的特異性抗體類藥物。
文檔編號A61P3/00GK101054415SQ200710078440
公開日2007年10月17日 申請日期2007年4月28日 優(yōu)先權日2007年4月28日
發(fā)明者顧長國, 李磊, 王正國, 劉琛 申請人:中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學野戰(zhàn)外科研究所