專(zhuān)利名稱：：以肽為基礎(chǔ)的治療動(dòng)脈粥樣硬化的免疫療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及新肽，特別涉及用于對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)行免疫治療以及用于以肽為基礎(chǔ)的ELISA檢測(cè)中的肽，所述ELISA檢測(cè)用于確定針對(duì)氧化低密度脂蛋白的免疫反應(yīng)，以及診斷有無(wú)動(dòng)脈粥樣硬化的存在。特別地，本發(fā)明包括1)表1中所列的任一種肽在免疫療法或"抗動(dòng)脈粥樣硬化疫苗"中的應(yīng)用，所述肽以天然或經(jīng)MDA修飾的形式單獨(dú)或聯(lián)合使用，優(yōu)選與適當(dāng)?shù)妮d體和佐劑同時(shí)使用，用于預(yù)防和治療缺血性心血管疾病。2)上述肽在ELISA中的應(yīng)用，用于檢測(cè)與缺血性心血管疾病發(fā)生危險(xiǎn)性升高或降低有關(guān)的抗體。
背景技術(shù)：
：動(dòng)脈粥樣硬化是一種引起大、中動(dòng)脈的最內(nèi)層(內(nèi)膜)變厚的慢性疾病。該疾病使得血流速度減慢，可以導(dǎo)致由受影響的血管供血的器官發(fā)生缺血和組織損傷。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病發(fā)生的主要原因，包括心肌梗塞、中風(fēng)、外周動(dòng)脈疾病。該疾病是西方國(guó)家的主要死亡原因。預(yù)計(jì)在二十年內(nèi)，該疾病將成為全世界的首要死因。該疾病是由脂蛋白在血管的細(xì)胞間質(zhì)累積所引起的，主要是低密度脂蛋白(LDL)。這些LDL顆粒聚集在一起，并經(jīng)過(guò)氧化修飾。氧化后的LDL具有毒性，導(dǎo)致血管損傷。在許多方面，動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)為對(duì)所述損傷的一種反應(yīng)，包括炎癥和纖維化。1989年，Palinski及其同事發(fā)現(xiàn)人類(lèi)中存在著抗氧化LDL的循環(huán)自身抗體。該發(fā)現(xiàn)提示了動(dòng)脈粥樣硬化可能是一種由抗氧化脂蛋白的免疫反應(yīng)所引起的自身免疫性疾病。在此期間，有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始尋求抗氧化LDL的抗體滴度與心血管疾病之間的關(guān)系。然而，這些研究所提示的結(jié)果并不是很清楚。所存在的抗氧化LDL的大量不同抗原決定基的抗體，以及這些抗原決定基的結(jié)構(gòu)并不淸楚。因此，術(shù)語(yǔ)"氧化LDL抗體"是指尚不知曉的不同抗體的混合物，而不是某一個(gè)特定的抗體。T細(xì)胞非依賴性IgM抗體比T細(xì)胞依賴性IgM抗體更加多—些。心血管疾病的患者以及健康對(duì)照人群中均存在著抗氧化LDL的抗體。盡管之前有一些研究報(bào)道抗氧化LDL的抗體滴度和心血管疾病之間存在著聯(lián)系，但是其它研究并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這樣的關(guān)系。這些研究的一個(gè)重要缺陷在于，它們所采用的確定抗體滴度的ELISA方法中將氧化LDL顆粒作為配體。在不同的個(gè)體中，LDL的構(gòu)成不同，控制和評(píng)價(jià)氧化修飾的程度較為困難，也不能確定氧化LDL顆粒中針對(duì)不同抗原決定基的抗體水平。在一定程度上，由于技術(shù)問(wèn)題，使用現(xiàn)有技術(shù)評(píng)價(jià)抗氧化LDL的抗體的作用是非常困難的。然而，如果使用完整的氧化LDL顆粒，從而產(chǎn)生明確的并可以復(fù)制的疫苗組份也不是不可能的事情。研究針對(duì)血管壁上氧化LDL的自身免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化中所起的作用的另一種方法，是用自體氧化LDL免疫動(dòng)物。該方法所基于的思想是，通過(guò)采用經(jīng)典的免疫技術(shù)，如果抗氧化LDL的自身免疫反應(yīng)得到了增強(qiáng)，那么，其將導(dǎo)致血管炎癥加劇以及進(jìn)行性的動(dòng)脈粥樣硬化。為了驗(yàn)證該假設(shè)，用同源氧化LDL免疫兔子，然后給所述動(dòng)物喂食3個(gè)月的高膽固醇飲食從而誘導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化。然而，與原有假設(shè)相反的是，用氧化LDL進(jìn)行免疫具有保護(hù)性效應(yīng)，使動(dòng)脈粥樣硬化減少了50%左右。在隨后的實(shí)驗(yàn)中，我們給予動(dòng)物高膽固醇飲食以及血管氣球損傷從而導(dǎo)致更嚴(yán)重的斑塊形成，但是，我們觀察到了與上述類(lèi)似的結(jié)果。與我們的研究相一致的是，其它多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也報(bào)道了類(lèi)似的觀察結(jié)果。結(jié)合現(xiàn)有資料清楚地表明，存在有防止動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的免疫反應(yīng)，這些反應(yīng)中包括抗氧化LDL的自身免疫反應(yīng)。上述觀察結(jié)果同時(shí)還提示了在人類(lèi)中有可能研究出治療由動(dòng)脈粥樣硬化所引起的心血管疾病的免疫療法或"疫苗"。其中一種方法就是將個(gè)體自身的LDL先暴露于例如銅等物質(zhì)進(jìn)行氧化，然后用該氧化了的自身LDL免疫所述個(gè)體。然而，該方法還存在這樣一個(gè)問(wèn)題，那就是目前仍然不知道是何種氧化LDL結(jié)構(gòu)誘導(dǎo)了保護(hù)性的免疫反應(yīng)，以及氧化LDL是否也含有抗原決定基，從而會(huì)引起不良的免疫反應(yīng)。確定氧化LDL的抗原決定基是非常重要的，其原因如下首先，一個(gè)或多個(gè)上述抗原決定基可能是激活抗動(dòng)脈粥樣化免疫反應(yīng)的原因，在用氧化LDL免疫的動(dòng)物中觀察到了該免疫反應(yīng)。因此，含有這些抗原決定基的肽意味著在人類(lèi)中研究出免疫療法或"動(dòng)脈粥樣硬化疫苗"的可能性。進(jìn)一步地，這些肽可以用于治療人類(lèi)的動(dòng)脈粥樣硬化。其次，含有經(jīng)確定的抗原決定基的肽可以用于ELISA方法中，所述ELISA方法能夠檢測(cè)出抗氧化LDL的特定結(jié)構(gòu)的抗體。所述ELISA方法比現(xiàn)有的將氧化LDL顆粒作為抗原的ELISA方法更加準(zhǔn)確和可靠。同時(shí)，該方法還可以對(duì)抗氧化LDL的不同抗原決定基的免疫反應(yīng)進(jìn)行分析，其中所述免疫反應(yīng)與心血管疾病有關(guān)。美國(guó)專(zhuān)利US5972890涉及肽在診斷動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用。該美國(guó)專(zhuān)利所公開(kāi)的技術(shù)主要是一種放射物理診斷方法。對(duì)一肽序列進(jìn)行放射性標(biāo)記，然后將其注入血流中。如果該肽序列與載脂蛋白B的序列一致，則該肽序列將結(jié)合到具有載脂蛋白B受體的組織上。在血管中，該序列將位于所有動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的上面。然后通過(guò)例如Y照相機(jī)等方法確定血管壁的放射性濃度。因此，該技術(shù)是一種放射物理診斷方法，其基于的原理是，放射性標(biāo)記的肽序列結(jié)合于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中正常組織的受體上，然后通過(guò)外部放射性分析的方法進(jìn)行檢測(cè)。該方法是一種確定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的直接分析方法。在該方法中，病人需要注射放射性混合物。本發(fā)明的技術(shù)基于不同的原理和方法。與權(quán)利要求11相一致，本發(fā)明涉及用于免疫抗心血管疾病的載脂蛋白B的片段，以及一種診斷針對(duì)載脂蛋白B的肽序列的免疫反應(yīng)的方法。在具有嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化的個(gè)體中顯示，上述免疫反應(yīng)得到了增強(qiáng)。本發(fā)明基于將肽序列附著于聚合物小孔的底部。當(dāng)將血樣加入小孔中時(shí)，所述肽將與這些序列的特異性抗體相結(jié)合，從而可以通過(guò)一種免疫方法/技術(shù)確定所結(jié)合的抗體的量。與上述美國(guó)專(zhuān)利的技術(shù)相比，本發(fā)明的技術(shù)并不是一種直接確定和定位動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的方法，而是確定與動(dòng)脈粥樣硬化的程度和范圍具有高度協(xié)同變異的免疫反應(yīng)。因此，本發(fā)明的基本原理與上述專(zhuān)利申請(qǐng)完全不同，后者所依賴的基礎(chǔ)為肽序列與發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的組織中的正常脂蛋白受體相結(jié)合，而前者的基礎(chǔ)在于發(fā)現(xiàn)了存在有針對(duì)肽序列的免疫反應(yīng)，并確定抗這些肽序列的抗體。已經(jīng)公開(kāi)的研究(Palinski等，以及George等，1998)表明，抗氧化LDL的免疫反應(yīng)減少了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。其提示了，抗氧化LDL的免疫反應(yīng)總體上具有保護(hù)作用。然而令人驚奇的是，本文的研究結(jié)果表明，并不總是如上所述。例如，用肽#10，45，154，199，240的混合物進(jìn)行免疫會(huì)增加動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。用其他肽序列進(jìn)行免疫，例如肽序列#1，30—34，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生總體上沒(méi)有什么效應(yīng)。上述結(jié)果令人非常吃驚，因?yàn)槠錇橐韵率聦?shí)提供了依據(jù)，即根據(jù)所針對(duì)的氧化LDL的結(jié)構(gòu)，所述抗氧化LDL的免疫反應(yīng)可以防止、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、或者沒(méi)有任何效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)使研究出單獨(dú)激活保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫方法成為可能。進(jìn)一步地，這些發(fā)現(xiàn)表明，當(dāng)使用完整的氧化LDL進(jìn)行免疫時(shí)，如果所使用的顆粒含有大量的引起動(dòng)脈粥樣化免疫反應(yīng)的結(jié)構(gòu)時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生不良效果。WO9908109涉及一組單克隆鼠抗體的應(yīng)用，其中所述抗體結(jié)合氧化LDL顆粒，從而確定血清和血漿中是否存在氧化LDL。其與本發(fā)明中所公開(kāi)的確定抗氧化LDL抗體的方法完全不同。美國(guó)專(zhuān)利US4970144涉及一種通過(guò)肽序列進(jìn)行免疫從而制備抗體的方法，其中所述抗體可以通過(guò)ELISA方法確定載脂蛋白。因此，該申請(qǐng)也與本發(fā)明不同。美國(guó)專(zhuān)利US5861276中描述了一種針對(duì)正常狀態(tài)的載脂蛋白B的重組抗體。該抗體用于確定血清和血漿中是否存在正常的載脂蛋白B，并通過(guò)降低循環(huán)中正常LDL顆粒的量從而治療動(dòng)脈粥樣硬化。因此，本發(fā)明描述了抗體在治療動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用。然而，與美國(guó)專(zhuān)利US5861276相比，這些抗體針對(duì)的是氧化LDL顆粒的結(jié)構(gòu)，而不是正常LDL顆粒的結(jié)構(gòu)。其優(yōu)點(diǎn)是，氧化LDL被認(rèn)為可以導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。在上述美國(guó)申請(qǐng)中沒(méi)有描述抗氧化LDL特定結(jié)構(gòu)的抗體的應(yīng)用。本發(fā)明的簡(jiǎn)要概述目前認(rèn)為，動(dòng)脈血管壁上的載脂蛋白發(fā)生氧化，主要是LDL,是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的一個(gè)重要因素。LDL氧化過(guò)程中的產(chǎn)物對(duì)血管細(xì)胞具有毒性，導(dǎo)致炎癥以及斑塊的形成。免疫系統(tǒng)識(shí)別氧化LDL的抗原決定基，并產(chǎn)生抗體。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，上述免疫反應(yīng)中有一些是起保護(hù)作用的，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。抗體幾乎專(zhuān)門(mén)針對(duì)以肽為基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)。通過(guò)采用含有LDL中唯一存在的蛋白質(zhì)一載脂蛋白B的完整序列的多肽庫(kù)，確定了氧化LDL中導(dǎo)致人類(lèi)產(chǎn)生抗體的抗原決定基。這些肽一抗原決定基可以用于ELISA方法中，研究抗氧化LDL的免疫反應(yīng)與心血管疾病之間的關(guān)系，以及研究出預(yù)防和治療缺血性心血管疾病的免疫療法或抗動(dòng)脈粥樣硬化的"疫苗"。本發(fā)明的詳細(xì)描述對(duì)氧化LDL的抗原決定基的分子特征進(jìn)行了研究，所述抗原決定基在人類(lèi)中導(dǎo)致依賴抗體的免疫反應(yīng)。所使用的方法利用了這樣一個(gè)事實(shí)，也就是，免疫反應(yīng)幾乎總是專(zhuān)門(mén)針對(duì)具有5到6個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的肽序列。LDL只含有一個(gè)蛋白質(zhì)，即具有4563個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的載脂蛋白B。在氧化過(guò)程中，載脂蛋白B發(fā)生分裂，醛加合物連接至帶有正電荷的氨基酸上，特別是賴氨酸。這就意味著，免疫細(xì)胞能夠接近在正常情況下由于載脂蛋白的B三維結(jié)構(gòu)而不暴露于免疫系統(tǒng)的肽序列，和/或正常狀態(tài)下暴露的肽序列結(jié)合了醛使其半抗原化，從而具備了免疫原性。因此，下列肽，不論天然形式或?yàn)镸DA衍生物，應(yīng)具備足夠的量從而產(chǎn)生免疫反應(yīng)，這些肽是FLDTVYGNCSTHFTVKTRKGPQCSTHILQWLKRVHANPLLVISIP歸EARSEILAHWSKLVKEALKESQLP菌DFRKLKFVTQAEGAKQTEATMTFKDGSLRHKFLDSNIKFSHVEKKGTYGLSCQRDPNTGRLNGERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLTSTSDLQSGIIKNTASLKTASLKYENYELTLKSDTNGKDMTFSKQNALLRSEYQADYEMKVKIIRT扉QNSELQWPIALDDAKINFNEKLSQLQTYKTTKQSFDLSVKAQYKKNKHEEEMLENVSLVCPKDATRFKGSTS朋LVSRKSISAALE服IENIDFNKSGSSTASWIQNVIREVTQRLNGEIQALELPQKEVDVLTKYSQPEDSLIPFFEHTFLIYITELLKKLQSTTVMLLDIANYLMEQIQDDCTGDECTGDEDYTYKIKRVIGNMGQGNMGQTMEQLTPELKSSILKSSILKCVQSTKPSLMIQKAAIQKAAIQALRKMEPKDKDQERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLNSHGLELNADILGTDKINWIQNVDTKYQIRIQIQEKLQTYISDWWTLAAKNLTDFAEQEATLQRIYSLWEHSTKNHLQALLVPPETEEAKQVLFLDTVIEIGLEGKGFEPTLEALFGKSGASMKLTTNGRFREHNAKFNLIGDFEVAEKINAFRAKVHGHSVLTAKGMALFGEGKAEFFKSSVITLNTNAELFNQSDIFPDLGQEVALNANTKNQKIR,以及不產(chǎn)生抗體的肽ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS或上述一個(gè)或多個(gè)肽的一個(gè)活性位點(diǎn)。材料與方法為了確定由于LDL氧化而導(dǎo)致載脂蛋白B的哪一部分具備了免疫原性，我們制備了包含人類(lèi)載脂蛋白B的完整序列的多肽庫(kù)，每個(gè)肽具有20個(gè)氨基酸長(zhǎng)度。在斷裂點(diǎn)處，用一個(gè)具有5個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的重疊序列制備所述肽，從而覆蓋了所有序列。可以釆用天然形態(tài)的肽，或?qū)㈦慕Y(jié)合于磷酯脂質(zhì)體之后，或?qū)㈦脑诒┞队阢~進(jìn)行氧化之后，或用丙二醛(MDA)進(jìn)行修飾之后，使用所得到的肽。上述經(jīng)銅氧化或MDA修飾是模擬在LDL氧化過(guò)程中可能發(fā)生的不同形式的氨基酸修飾。肽相應(yīng)于人類(lèi)載脂蛋白B的全部氨基酸序列，合成了302個(gè)肽。(Euro-DiagnosticaAB,Malmo,瑞典，以及KjRossPetersenAS，Horsholm,丹麥)，并將它們用于ELISA檢測(cè)中。在37°C下，用0.5MMDA(Sigma-AldrichSwedenAB，斯德哥爾摩，瑞典)處理所述經(jīng)合成的肽3小時(shí)，從而對(duì)每個(gè)經(jīng)合成的肽的一部分進(jìn)行修飾，或在37。C下，用5uMCuCl2(Sigma)處理18小時(shí)。在4°C下，用含有l(wèi)mMEDTA的PBS溶液對(duì)經(jīng)MDA修飾的肽進(jìn)行透析18小時(shí)，中間更換PBS溶液數(shù)次。在適于分離肽的變性聚丙烯酰胺凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上檢測(cè)經(jīng)修飾的肽。在蛋白質(zhì)的N末端起對(duì)肽進(jìn)行編號(hào)，為1至302。在制備衍生物的過(guò)程中也可以使用其它的醛類(lèi)，例如，羥基壬烯醛及其它。脂質(zhì)體將摩爾比為9:l的卵磷脂(EPC)(Sigma)和磷脂酰絲氨酸(PS)(Sigma)的氯仿溶液，與濃度為3mM的磷酯(PL)溶液進(jìn)行混合，并在玻璃容器中用緩慢的氬氣流進(jìn)行吹干。然后，將容器放在真空狀態(tài)下3小時(shí)。取5ml含有0.lmM肽、經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的PH為7.4的10mMHEPES緩沖液、45mMNaCl、0.003%疊氮鈉的溶液加入EPC/PS干燥層中，并在50。C下孵化15分鐘。在室溫下，輕微振蕩所述混合物，然后將其放于冰水中，用振幅為7.5微米的微波進(jìn)行超聲降解3x3分鐘(Sonypr印150MSESanyo,Tamro-medlab，瑞典)，每次間隔1分鐘。將所述PL—肽混合物貯存于玻璃小瓶中，并位于氬氣下面，瓶的外周用鋁箔包裹，在4°C下貯存，并在1周內(nèi)使用。所述PL—肽混合物是天然形式，或是用0.5MMDA在37°C下進(jìn)行處理3小時(shí)，或是用5uMCuCl2在37°C下處理了18小時(shí)。在貯存前，所述經(jīng)MDA修飾的混合物需要在4°C下用含有l(wèi)mMEDTA的PBS溶液對(duì)其進(jìn)行透析18小時(shí)，中間需要更換PBS溶液數(shù)次。在適于分離肽的變性聚丙烯酰胺凝膠(Bio-RadLaboratoriesAB,Sundbyberg,瑞典)上檢測(cè)所述經(jīng)修飾的混合物。血漿樣品從10名心血管疾病(AHP)的患者中采集血漿樣品，并從正常血液供體(NHP)中收集50份血漿樣品，其中25名為男性，25名為女性。將收集到的兩種血漿樣品池進(jìn)行分裝，并在-80。C保存。ELISA不論有無(wú)脂質(zhì)體，用ra7.4(20ixg/ml)的PBS溶液稀釋天然或經(jīng)修飾的合成肽，然后加入微孔滴定板的小孔中(NuncMaxisorp，Nunc,Roskilde，丹麥)，在4'C下孵化過(guò)夜。作為參考，在每塊板上都加入其中一種肽(P6)。用含有0.05%Tween-20的PBS溶液清洗滴定板，然后在室溫下，用含有S叩erblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor，IL)封閉所述經(jīng)包被的板5分鐘，隨后孵化人類(lèi)血漿樣品，用含有0.05%Tween-20的TBS(TBS-T)以1:100的比例稀釋所收集到的人血漿樣品，AHP或NHP血漿，并將其加入反應(yīng)板中，在室溫下孵化2小時(shí)，然后在4。C下孵化過(guò)夜。洗板后，用生物素標(biāo)記的兔抗鼠Ig抗體(DakoA/S，Glostrup，丹麥)檢測(cè)沉積的抗所述肽的抗體，所述兔抗鼠抗體用TBS—T溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂專(zhuān)谑覝叵?，繼續(xù)孵化2小時(shí)；然后，洗板，用堿性磷酸酶結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗體，在室溫下孵化2小時(shí)。用磷酸酶底物試劑盒(Pierce)進(jìn)行顯色反應(yīng)，在室溫下孵化1小時(shí)后，在405nm處測(cè)量吸光度。將不同肽的吸光度值除以P6的吸光度值，進(jìn)行比較。由人類(lèi)血槳中的抗體所識(shí)別的脂蛋白B序列參見(jiàn)后面序列表中序列號(hào)1-37的序列。AHP和NHP中均含有針對(duì)大量不同肽的抗體。我們確定了抗天然形式和經(jīng)修飾的肽的抗體。總體來(lái)說(shuō)，抗MDA修飾的肽的抗體滴度高于或等于抗天然肽的抗體的滴度。比較天然肽，經(jīng)MDA修飾的肽、以及被銅氧化的肽，顯示它們之間具有高度的相關(guān)性，在經(jīng)MDA修飾的肽中檢測(cè)到了滴度最高的抗體。使用結(jié)合于脂質(zhì)體的肽并沒(méi)有導(dǎo)致抗體水平的升高。IgM亞型的抗體多于IgG亞型的抗體。針對(duì)所檢測(cè)到的具有最高抗體水平的肽可以分為六組，這六組之間具有共同的特征(表l)(A)高水平的抗經(jīng)MDA修飾的肽的IgG抗體(n=3);(B)高水平的IgM抗體，但是在天然和經(jīng)MDA修飾的肽之間沒(méi)有差異(n=9);(C)高水平的IgG抗體，但是在天然和經(jīng)MDA修飾的肽之間沒(méi)有差異(n=2);(D)高水平的抗經(jīng)MDA修飾的肽的IgG抗體，在NHP樣品池中的抗體水平至少是AHP樣品池中抗體的兩倍(n=5);(E)高水平的抗經(jīng)MDA修飾的肽的IgM抗體，在NHP樣品池中的抗體水平至少是AHP樣品池中抗體的兩倍(n=ll);(F)高水平的IgG抗體，但是在完整的和經(jīng)MDA修飾的肽之間沒(méi)有差異，在AHP樣品池中的抗體水平至少是NHP樣品池中抗體的兩倍(n=7);(G)沒(méi)有IgG或IgM抗體。表lA.高IgG，有MDA差異P11.FLDTVYGNCSTHFTVKTRKGP25.PQCSTHILQWLKRVHANPLLP74.VISIPRLQAEARSEILAHWSB.高IgM，沒(méi)有MDA差異P40.KLVKEALKESQLPTVMDFRKP68.LKFVTQAEGAKQTEATMTFKP94.DGSLRHKFLDSNIKFSHVEKP99.KGTYGLSCQRDPNTGRLNGEPI00.RLNGESNLRFNSSYLQGTNQP102.SLTSTSDLQSGIIKNTASLKP103.TASLKYENYELTLKSDTNGKPI05.DMTFSKQNALLRSEYQADYEP177.MKVKIIRTIDQMQNSELQWPC.高IgG，沒(méi)有MDA差異P143.IALDDAKINFNEKLSQLQTYP210.KTTKQSFDLSVKAQYKKNKHD.NHS/AHP,IgG-ak〉2，有MDA差異P1.EEEMLENVSLVCPKDATRFKP129.GSTSHHLVSRKSISAALEHKP148.IENIDFNKSGSSTASWIQNVPI62.IREVTQRLNGEIQALELPQKP252.E麗LTKYSQPEDSLIPFFEE.NHS/AHP，IgM-ak>2，有MDA差異P301.HTFLIYITELLKKLQSTTVMP30.LLDIANYLMEQIQDDCTGDEP31.CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQP32.GNMGQTMEQLTPELKSSILKP33.SSIL曙STKPSLMIQKAAP34.IQKAAIQALRKMEPKDK叫EP100.RLNGESNLRFNSSYLQGTNQP107.SLNSHGLELNADILGTDKINP149.WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQP169.TYISDWWTLAAKNLTDFAEQP236.EATLQRIYSLWEHSTKNHLQF.NHS/AHP，IgG-ak<0,5，沒(méi)有MDA差異P10.ALLVPPETEEAKQVLFLDTVP45.IEIGLEGKGFEPTLEALFGKPill.SGASMKLTTNGRFREHNAKFP154.NLIGDFEVAEKINAFRAKVHP199.GHSVLTAKG亂FGEGKAEFP222.FKSSVITLNTNAELFNQSDIP240.FPDLGQEVALNANTKNQKIRG.P2.ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS所有上述的38個(gè)肽序列均代表了免疫反應(yīng)的靶目標(biāo)，所述免疫反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化和缺血性心血管疾病的發(fā)生中可能起著重要的作用。因此，這些肽可以用于ELISA檢測(cè)中，以確定抗體水平與發(fā)生心血管疾病的危險(xiǎn)之間的關(guān)系，其中所述抗體針對(duì)載脂蛋白B中經(jīng)MDA修飾的確定的氨基酸序列。同時(shí)，這些肽還代表了保護(hù)性免疫反應(yīng)中的可能介質(zhì)，所述保護(hù)性免疫反應(yīng)是在用氧化LDL對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行免疫時(shí)觀察到的。而且，在研巧抗動(dòng)脈粥樣硬化的免疫療法或"疫苗"的過(guò)程，這些肽可以進(jìn)一步用于檢測(cè)。因此，我們已經(jīng)證實(shí)了人類(lèi)載脂蛋白B的38個(gè)不同序列可以使人體產(chǎn)生顯著的免疫反應(yīng)。這些抗原決定基有可能代表了之前所描述的抗氧化LDL的抗體。由于大多數(shù)免疫反應(yīng)是針對(duì)肽序列的，載脂蛋白B為L(zhǎng)DL中唯一的蛋白質(zhì)，在該課題中所采用的方法應(yīng)該可以用于確定幾乎所有抗氧化LDL顆粒的抗體的特異性抗原決定基。我們已經(jīng)描述了包括抗心磷脂抗體在內(nèi)的、與氧化LDL反應(yīng)的磷脂特異性抗體家族，但是這些抗體的特征和作用仍然有待進(jìn)一步的研究禾d確認(rèn)c在很多情況下，經(jīng)MDA修飾的多肽的抗體滴度高于天然多肽序列的抗體滴度。如果檢測(cè)到抗經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體，則該抗體幾乎總是與天然序列的抗體同時(shí)存在。該現(xiàn)象的一種可能解釋是，機(jī)體對(duì)載脂蛋白B中經(jīng)MDA修飾的氨基酸序列的免疫反應(yīng)(由于LDL氧化而導(dǎo)致MDA修飾)導(dǎo)致機(jī)體終止了對(duì)天然序列的免疫耐受。對(duì)于其它序列，抗經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體與抗天然序列的抗體滴度之間沒(méi)有差異。其表明了，所述免疫反應(yīng)針對(duì)的是天然序列。機(jī)體對(duì)正常暴露于免疫系統(tǒng)的蛋白中的氨基酸序列應(yīng)該不產(chǎn)生免疫反應(yīng)。在天然LDL顆粒中，載脂蛋白B的大部分隱藏在LDL的脂質(zhì)層里面，因此，免疫系統(tǒng)不能接近該載脂蛋白。在LDL的氧化過(guò)程中，載脂蛋白B的氨基酸鏈斷裂導(dǎo)致其三維構(gòu)象發(fā)生改變。這就有可能導(dǎo)致其肽序列暴露于正常狀態(tài)下不接近該肽序列的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生了針對(duì)這些序列的抗體，從而可以解釋所觀察到的存在有抗天然載脂蛋白B序列的抗體。另外一種解釋?zhuān)庖叻磻?yīng)實(shí)際上是針對(duì)經(jīng)MDA修飾的序列，但是其與天然序列之間存在著顯著的交叉反應(yīng)，導(dǎo)致它們?cè)诮Y(jié)合率方面沒(méi)有差異。表2研究了78名受試者中不同肽的抗體與頸動(dòng)脈中動(dòng)脈粥樣硬化之間的關(guān)系，其中用血管內(nèi)膜/中膜的厚度評(píng)價(jià)頸動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化(78名受試者中，有26名受試者在此之后發(fā)生了心肌梗塞，26名受試者為健康對(duì)照，26名為無(wú)疾病的高危個(gè)體)。<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>+，r>0.2<0.3,p=<0.05;++'r>0.3<0,4，p=0.01;+++,r>0.4，p=〈0.001，灰色，發(fā)生心肌梗塞的受試組中肽抗體水平顯著升高。在一個(gè)預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們研究了將基于這些肽(天然的或經(jīng)MDA修飾的)的ELISA方法用于確定免疫反應(yīng)與患有心血管疾病和/或患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系的可能性，所述免疫反應(yīng)是針對(duì)氧化LDL中確定的抗原決定基。該實(shí)驗(yàn)在參與Malm6飲食癌癥研究的受試者中進(jìn)行的，所述飲食癌癥研究為一群體研究，在1989年至1993年，該研究共招募了30000多名受試者。其中26名受試者在隨后的隨訪調(diào)査期間發(fā)生了急性心肌梗塞，選取了26名在年齡、性別以及吸煙方面相匹配的健康個(gè)體作為對(duì)照，測(cè)定了上述受試者基線血漿樣品中的抗體值，這些抗體是表1所列38個(gè)肽中的24個(gè)肽的抗體。另外，還選擇了26名LDL膽固醇水平均高于5.0mmo1/1、在年齡、性別以及吸煙方面相匹配的受試者，這些受試者作為未患有心血管疾病的高危組，并對(duì)他們的抗體水平進(jìn)行研究。對(duì)于所分析的24個(gè)肽中的19個(gè)肽，經(jīng)MDA修飾的肽的IgM抗體水平與頸動(dòng)脈(內(nèi)膜/中膜厚度)中動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，也就是說(shuō)，抗體水平越高，動(dòng)脈粥樣硬化越嚴(yán)重。其中，通過(guò)對(duì)頸總動(dòng)脈進(jìn)行超聲檢査以評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度(表2)。同時(shí)，這些肽中有多個(gè)肽的抗天然肽抗體水平和頸動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜的厚度也具有顯著的相關(guān)性。只有4個(gè)肽顯示出其IgG抗體與頸動(dòng)脈內(nèi)膜/中膜的厚度之間存在顯著的相關(guān)性。這些觀察結(jié)果提示，用這些經(jīng)MDA修飾的肽(單獨(dú)使用或聯(lián)合使用)的ELISA方法可以用于確定具有嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化的受試者。在所檢測(cè)的肽中，有4個(gè)肽的抗體水平不僅與動(dòng)脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度有關(guān)，而且在以后發(fā)生心肌梗塞的受試組中其抗體水平也顯著升高(表2)。圖7中為其中一個(gè)肽(肽240)的資料。這些觀察結(jié)果同樣證明了基于肽的ELISA方法還可以用來(lái)識(shí)別發(fā)生心肌梗塞的危險(xiǎn)性較高的受試者。在之后發(fā)生心肌梗塞的受試者組中，天然肽103、162、199，以及經(jīng)修飾的肽102的IgG抗體水平顯著升高。但是，抗這些肽的IgG抗體與頸動(dòng)脈中的動(dòng)脈粥樣硬化之間并沒(méi)有顯著的相關(guān)。在抗經(jīng)MDA修飾的肽210的抗體方面，還觀察到了一個(gè)非常有趣的結(jié)果，其中在健康對(duì)照組和高危組aDL膽固醇高于5.0mmo1/1)中，其IgM抗體水平顯著高于以后發(fā)生心肌梗塞的受試者組的抗體水平。因此，抗經(jīng)MDA修飾的肽210的抗體可以作為一種標(biāo)志物，用于確認(rèn)那些發(fā)生心肌梗塞的危險(xiǎn)性較低的個(gè)體。目前已經(jīng)證實(shí)，在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中(NordinFredrikson,SSderberg等，Chyu等)，用天然的以及經(jīng)MDA修飾的apoB—100肽序列進(jìn)行免疫，抑制了動(dòng)脈粥樣硬化。但是，這些具有動(dòng)脈保護(hù)作用的免疫反應(yīng)的機(jī)制仍然有待進(jìn)一步的研究。然而，其中一種可能的解釋是所述動(dòng)脈保護(hù)的效應(yīng)是由針對(duì)這些肽序列的抗體介導(dǎo)的。例如，這些抗體可以通過(guò)巨噬細(xì)胞的Fc受體促進(jìn)對(duì)受到氧化受損的LDL顆粒的清除。巨噬細(xì)胞清除受體只識(shí)別受到廣泛氧化損傷的LDL(9)。最近的研究已經(jīng)確定了循環(huán)氧化LDL的存在(10，11)。這些顆粒只受到了極小的氧化損傷，因此不能被清除受體識(shí)別。抗體結(jié)合于這些循環(huán)氧化LDL顆粒上可以有助于在這些顆粒聚集到細(xì)胞組織之前。將這些顆粒從循環(huán)中清除出去(12)。已經(jīng)有幾個(gè)研究報(bào)道了抗體在抗動(dòng)脈粥樣硬化中的作用。在經(jīng)脾切除的apoE裸鼠中，B細(xì)胞重建抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。在RAG-1小鼠中，頸動(dòng)脈受損后，B細(xì)胞重建還抑制了動(dòng)脈內(nèi)膜的再生(我們實(shí)驗(yàn)室所觀察到的結(jié)果，但是仍未發(fā)表)。而且，實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)apoE裸鼠重復(fù)注射免疫球蛋白減少了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。如上所述，用合成的肽進(jìn)行主動(dòng)免疫，可以產(chǎn)生針對(duì)經(jīng)MDA修飾的apoB一100肽序列的抗體。該過(guò)程需要2-3周的時(shí)間才能達(dá)到產(chǎn)生抗體的最大效果。在某些情況下，可能需要更加快速的效果。其中一個(gè)例子就是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的情況，此時(shí)，氧化LDL有可能會(huì)導(dǎo)致炎癥、產(chǎn)生細(xì)胞毒性以及存在斑塊破裂的危險(xiǎn)。在這些情況下，通過(guò)注射純化的或重組生產(chǎn)的、針對(duì)天然以及經(jīng)MDA修飾的序列的抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫，可以達(dá)到較為快速的效果。通過(guò)注射純化的或重組生成的抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫從而起效用的另一種情況是老年人發(fā)生的冠心病。我們的研究表明，人的年齡越大，針對(duì)載脂蛋白B肽序列的抗體水平將減少，而且抗體水平的減少與血漿中氧化LDL水平的升高相關(guān)(NordinFredrikson,Hedblad等)。這就提示了，產(chǎn)生針對(duì)氧化LDL中抗原的抗體的免疫細(xì)胞的衰老使氧化受損的LDL顆粒沒(méi)有完全從循環(huán)中清除出去。因此，在這些受試者中，通過(guò)注入純化的或重組生成的抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫，比用載脂蛋白B—100肽序列進(jìn)行主動(dòng)免疫的效果要好。下列所使用的合成天然肽(Euro-DiagnosticaAB,Malmo，瑞典)為初次篩選出的多肽庫(kù)中的肽1，2,和301。我們發(fā)現(xiàn)，在肽1(氨基酸序列，EEEMLENVSLVCPKDATRFK，『10)和肽301(氨基酸序列，HTFLIYITELLKKLQSTTVM，n=10)中，它們各自的針對(duì)經(jīng)MDA修飾形式的IgG或IgM抗體反應(yīng)高于天然肽，而且在健康受試者中兩種抗體滴度均較高。選擇這些肽的原因基于這樣一個(gè)假設(shè)，即針對(duì)這些肽的抗體反應(yīng)可能會(huì)起到抗動(dòng)脈粥樣硬化的保護(hù)作用。在初次的抗體篩選中，肽2(氨基酸序列，ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS，n=10)并沒(méi)有引發(fā)抗體反應(yīng)，因此，將該肽選擇作為對(duì)照肽。接受明礬的小鼠作為對(duì)照組(11=9*)。在6至7周周齡時(shí)，對(duì)載脂蛋白5(-/-)小鼠進(jìn)行皮下注射從而進(jìn)行初次免疫，3周后，進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。從免疫一開(kāi)始，就持續(xù)給予小鼠高膽固醇飲食，直到25周被處死。在處死小鼠時(shí)，4組小鼠的各組之間在體重上沒(méi)有顯著區(qū)別。同時(shí)，用市售的試劑盒(Sigma)檢測(cè)4組小鼠血清中的膽固醇，各組之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異。各組平均血清膽固醇水平均高于715mg/dl。用油紅0染色后，測(cè)量前位標(biāo)本中降主動(dòng)脈中被動(dòng)脈粥樣硬化斑塊覆蓋的面積。與對(duì)照組相比，用肽2和肽301進(jìn)行免疫的小鼠，其動(dòng)脈粥樣硬化顯著減少(圖2)。與對(duì)照組相比，用肽l進(jìn)行免疫的小鼠，動(dòng)脈粥樣硬化并沒(méi)有顯著地減小。與降主動(dòng)脈相反，主動(dòng)脈根部和主動(dòng)脈弓部的動(dòng)脈粥樣硬化的范圍和程度在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間并沒(méi)有差別。在主動(dòng)脈竇處，斑塊的大小以及脂質(zhì)含量在4個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間并沒(méi)有差異(表A)。在主動(dòng)脈弓部，斑塊的平均尺寸在4組小鼠之間也沒(méi)有差異。然而，在經(jīng)油紅O染色的降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈中，對(duì)斑塊大小進(jìn)行前位評(píng)價(jià)，其結(jié)果表明，對(duì)照組和給予肽No.l的實(shí)驗(yàn)組具有相似數(shù)量的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊，而在給予肽No.2和肽No.9的實(shí)驗(yàn)組中，其主動(dòng)脈上的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊顯著減少(表A)。該觀察結(jié)果表明，用肽進(jìn)行免疫并不影響主動(dòng)脈竇或主動(dòng)脈弓部的斑塊大小，但是卻減少了降主動(dòng)脈處的斑塊，該結(jié)果非常有意思。同時(shí)，觀察結(jié)果還提示了用肽進(jìn)行免疫可以減少新斑塊的形成，但是不影響斑塊的進(jìn)展。我們還進(jìn)一步檢驗(yàn)了用肽進(jìn)行免疫是否可以調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的表型。對(duì)主動(dòng)脈竇處的斑塊的冷凍切片用單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞抗體(M0MA-2，Serotec)進(jìn)行免疫組化染色。與前位觀察的結(jié)果一致，肽No.2顯著減少了巨噬細(xì)胞進(jìn)入斑塊內(nèi)(圖1)。三色染色法顯示，給予肽No.2的實(shí)驗(yàn)組中，主動(dòng)脈竇的斑塊中平均膠原含量為40.0±7.7%;在給予明礬的對(duì)照組，肽No.l組，肽No.9組中的平均膠原含量分別為32.3±5.3%，35.6±8.5%，29.4±9.6%。我們檢測(cè)了每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中針對(duì)免疫肽的抗體反應(yīng)。在肽No.l組中，抗體滴度在免疫后增加了6.1±3.1倍，肽No.2組增加了2.4土1.0倍，肽No.9組增加了1.8±0.6倍；而明礬組的抗體滴度相對(duì)于肽No.1組增加了3.9±2.7倍，相對(duì)于肽2組增加了2.0±0.5倍，相對(duì)于肽9組增加了2.0±0.9倍。令人吃驚的是，在進(jìn)行免疫的實(shí)驗(yàn)組以及給予明礬的實(shí)驗(yàn)組中，抗免疫肽的抗體滴度平行升高。其意味著以下幾種可能性1)除了體液免疫反應(yīng)之外(例如細(xì)胞免疫反應(yīng))，動(dòng)脈粥樣硬化的調(diào)節(jié)還涉及到其它機(jī)制；或者2)抗體水平的升高是隨著時(shí)間的變化機(jī)體對(duì)高膽固醇血癥的一個(gè)副反應(yīng)。盡管目前對(duì)為何用肽進(jìn)行免疫可以減少動(dòng)脈粥樣硬化和/或調(diào)節(jié)斑塊的表型這個(gè)問(wèn)題仍然沒(méi)有一個(gè)清楚的理論機(jī)制，但是該發(fā)明的新穎性在于其將LDL肽作為免疫原的理念，以及其作為免疫調(diào)節(jié)策略的可行性。這種基于肽的免疫策略對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明，將同源性氧化LDL或天然LDL作為抗原進(jìn)行免疫減少了斑塊的大小卜3，但是，同源人LDL的可得性，生產(chǎn)，感染以及安全性使得該方法在臨床應(yīng)用中并不具備吸引力。盡管我們所得到的最終結(jié)果與最初的假設(shè)不一樣，本文中證實(shí)了基于肽的免疫療法是可行的。我們的最初假設(shè)是在正常的受試者中使用肽進(jìn)行免疫以產(chǎn)生較高的IgM或IgG抗體反應(yīng)，可以防止實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。在最初的人群篩選中，肽No.2并沒(méi)有引起任何的抗體反應(yīng)，然而，在研究中我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，用肽No.2進(jìn)行免疫可以防止動(dòng)物的降主動(dòng)脈發(fā)生新的動(dòng)脈粥樣硬化損傷，并減少了巨噬細(xì)胞的進(jìn)入，同時(shí)斑快中的膠原含量也較高。其可能的原因是，(a)肽No.2可能是人類(lèi)載脂蛋白B-100結(jié)構(gòu)的一部分，其并不暴露于免疫系統(tǒng)。因此沒(méi)有抗體產(chǎn)生，在健康人群的血清樣品中也檢測(cè)不到抗體；(b)肽No.2的氨基酸序列對(duì)于小鼠來(lái)說(shuō)是外來(lái)的，因此小鼠產(chǎn)生了抗這種肽的抗體，從而減少了新的動(dòng)脈粥樣化損傷的形成以及其表型。在評(píng)價(jià)主動(dòng)脈不同部位的斑塊大小時(shí)，用同源LDL進(jìn)行免疫的效果不一樣。例如，Ameli等人研究表明，在患有高膽固醇血癥的兔子中，用天然LDL進(jìn)行免疫導(dǎo)致主動(dòng)脈上斑塊形成減少、而Freigang等人研究表明，主動(dòng)脈竇上的斑塊變小，而不是位于主動(dòng)脈上的斑塊變小。結(jié)合他們的研究結(jié)果以及現(xiàn)有的研究結(jié)果，我們認(rèn)為用肽進(jìn)行免疫不僅調(diào)節(jié)斑塊的大小還調(diào)節(jié)斑塊的構(gòu)成。我們只在降主動(dòng)脈處觀察到了斑塊減少。眾所周知，在單個(gè)動(dòng)物的不同發(fā)育階段，載脂蛋白E(-/-)小鼠可以發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化損傷，特別是給予高膽固醇飲食。在年幼的動(dòng)物中，動(dòng)脈粥樣硬化損傷最初出現(xiàn)在主動(dòng)脈竇上6'7，在15周以后，高脂高膽固醇飲食可以導(dǎo)致主動(dòng)脈竇處的損傷發(fā)展成為晚期的斑塊；而此時(shí)在降主動(dòng)脈為動(dòng)脈粥樣硬化的早期6。由于斑塊成熟需要一定的時(shí)間過(guò)程，而且降主動(dòng)脈上的斑塊發(fā)展慢于主動(dòng)脈竇上的斑塊發(fā)展，免疫作用可以減小降主動(dòng)脈上的損傷大小而不降低主動(dòng)脈竇上的損傷，該發(fā)現(xiàn)提示免疫作用影響動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期階段。一種可能是，當(dāng)動(dòng)物逐漸衰老時(shí)，以及當(dāng)血清膽固醇的水平高于其生理狀態(tài)下的水平時(shí)，高膽固醇血癥的毒性作用超過(guò)了免疫作用的降低斑塊效應(yīng)。另外一種可能是，由于主動(dòng)脈竇斑塊成熟比較早，在25周處死動(dòng)物太晚了，從而不能檢測(cè)到斑塊大小的區(qū)別。盡管主動(dòng)脈竇處的損傷大小不能被減小，但是用肽進(jìn)行免疫確實(shí)可以調(diào)節(jié)斑塊的構(gòu)成。目前實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不能研究降主動(dòng)脈上的斑塊在形成的早期階段時(shí)，其斑塊的構(gòu)成。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果突出表明了，使用與LDL相關(guān)的載脂蛋白B-100的肽序列作為免疫原作為防止動(dòng)脈粥樣硬化的一種新方法的可行性，或者盡管具有嚴(yán)重的高脂血癥，其也可以有利地調(diào)節(jié)斑塊的表型。與將同源性氧化LDL或天然LDL作為抗原相比，該基于肽的免疫策略具有優(yōu)勢(shì)，這是因?yàn)樵摬呗圆恍枰蛛x和制備同源LDL，也沒(méi)有隨之而來(lái)的發(fā)生污染的危險(xiǎn)性。用肽No.2和No.301進(jìn)行免疫，只在降主動(dòng)脈處觀察到了減小斑塊的作用。這些研究結(jié)果與之前的有關(guān)報(bào)道是一致的，這些報(bào)道表明，其他治療干預(yù)措施在降主動(dòng)脈處的效果要好于主動(dòng)脈弓部的效果17，其可能是因?yàn)?，主?dòng)脈根部和弓部的損傷比降主動(dòng)脈處的損傷發(fā)展地快，從而在主動(dòng)脈根部和弓部進(jìn)行干預(yù)的機(jī)會(huì)要小14'15'16'18'19。由于斑塊成熟需要一定的時(shí)間過(guò)程，而且降主動(dòng)脈上的斑塊發(fā)展慢于主動(dòng)脈竇上的斑塊發(fā)展，免疫作用可以減小降主動(dòng)脈上的損傷大小而不降低主動(dòng)脈竇上的損傷，該發(fā)現(xiàn)提示免疫作用影響動(dòng)脈粥樣硬化形成的早期階段。一種可能是，當(dāng)動(dòng)物逐漸衰老時(shí)，以及當(dāng)血清膽固醇的水平高于其生理狀態(tài)下的水平時(shí)，高膽固醇血癥的毒性作用超過(guò)了免疫作用的降低斑塊效應(yīng)。盡管主動(dòng)脈竇或主動(dòng)脈弓部的損傷大小不能被減小，但是用肽No.2進(jìn)行免疫確實(shí)可以調(diào)節(jié)斑塊的構(gòu)成，使其向有利地方向發(fā)展，使斑塊表型更加穩(wěn)定，同時(shí)減少了巨噬細(xì)胞的進(jìn)入，并增加了膠原的含量?？傊?，在鼠動(dòng)物模型中證實(shí)了一種新的、以肽為基礎(chǔ)的抑制動(dòng)脈粥樣硬化的免疫介導(dǎo)方法。綜上所述，本發(fā)明顯示了一種新的、以肽為基礎(chǔ)的免疫介導(dǎo)方法，用于調(diào)節(jié)動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊。盡管在我們的模型中，動(dòng)脈粥樣硬化形成的改變是非常小的，但是這種以肽為基礎(chǔ)的免疫方法為研究、預(yù)防或治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了另外一種手段。方法肽的制備使用ImjectSuperCarrierEDC(Pierce,Rockford，IL)，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明并進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整，制備肽。將行有l(wèi)mg肽的500ul共軛緩沖液與含有2mg載體的200ul去離子水混合。然后，加入lmg共軛試劑(EDC，1一乙基一3—[3—二甲基氨丙基]碳二亞銨鹽酸)，在室溫下孵化2小時(shí)。然后，用PH7.2,含有0.083M磷酸鈉和0.9M氯化鈉的溶液進(jìn)行透析，在4°C下孵化過(guò)夜。透析后的共軛物用Imject干式混合純化緩沖液進(jìn)行稀釋使其終體積達(dá)到1.5毫升。將明礬作為免疫佐劑，并與肽共軛物以1:1的比例混合。每次進(jìn)行免疫注射的肽用量為33ug/100ul。動(dòng)物方案在6-7周周齡時(shí)，給予Jackson實(shí)驗(yàn)室(BarHarbor,Me)ApoE(_/-)小鼠皮下注射進(jìn)行初次免疫。3周后，進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。在進(jìn)行免疫的一開(kāi)始，就持續(xù)給予小鼠高膽固醇飲食，直至25周時(shí)處死小鼠。加強(qiáng)免疫后的2周，以及處死小鼠時(shí)采集小鼠的血樣。對(duì)照組小鼠給予明砜。實(shí)驗(yàn)方案得到了Cedars-Sinai醫(yī)學(xué)中心的社會(huì)機(jī)構(gòu)動(dòng)物監(jiān)護(hù)和使用委員會(huì)(theInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofCedars-SinaiMedicalCenter)的同意和批準(zhǔn)。所有的動(dòng)物都飼養(yǎng)在經(jīng)美國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)護(hù)鑒定協(xié)會(huì)(AmericanAssociationofAccreditationofLabloratoryAnimalCare)所鑒定的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，并以12小時(shí)白天/黑夜為周期進(jìn)行飼養(yǎng)。所有動(dòng)物都可以自由地飲水和飲食。在處死動(dòng)物時(shí)，給動(dòng)物吸入安氟醚進(jìn)行麻醉。在處死前，進(jìn)行眼眶后取血。采集組織并進(jìn)行切片為了評(píng)價(jià)用肽進(jìn)行免疫對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化形成的影響，對(duì)主動(dòng)脈賣(mài)、主動(dòng)脈弓部以及降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈處的斑塊大小進(jìn)行評(píng)價(jià)。用生理鹽水灌注心臟和主動(dòng)脈樹(shù)，切除心臟和近主動(dòng)脈，并包埋在OCT復(fù)合物中(Tissue-Tek)，然后進(jìn)行冷凍切片。從至少出現(xiàn)兩個(gè)主動(dòng)脈瓣的地方直至主動(dòng)脈瓣葉片消失的地方進(jìn)行一系列的切片，切片厚度為6um,以評(píng)價(jià)主動(dòng)脈竇處的斑塊。通常，一個(gè)載玻片上有3個(gè)連續(xù)切片，一只小鼠共采集25-30張載玻片，每50張載玻片為一組進(jìn)行染色。同時(shí)也對(duì)升主動(dòng)脈，朝向左鎖骨下動(dòng)脈的主動(dòng)脈弓部進(jìn)行切片，并進(jìn)行相似的處理。單獨(dú)對(duì)降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈進(jìn)行處理，油紅0染色后對(duì)斑塊的構(gòu)成進(jìn)行前位評(píng)價(jià)。制備前位的降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈的t示本。將濃度為0.8g/ml的雞蛋白蛋白(Sigma)水溶液與甘油以1:1的比例相混合。然后，加入疊氮鈉，使疊氮鈉的最終濃度達(dá)到0.2%。將降主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈周?chē)慕M織和脂肪清除干凈后，將左鎖骨下動(dòng)脈至腎主動(dòng)脈的動(dòng)脈部分小心地切除下來(lái)，然后在Hisochoice(Amresco)中進(jìn)行固定，過(guò)夜。然后，小心地縱向打開(kāi)動(dòng)脈，將有空腔的一面放在用雞蛋白蛋白溶液進(jìn)行新鮮涂覆的載玻片上。當(dāng)白蛋白溶液變干后，用油紅0對(duì)動(dòng)脈進(jìn)行染色，然后用計(jì)算機(jī)輔助的組織形態(tài)測(cè)定技術(shù)評(píng)價(jià)動(dòng)脈粥樣硬化的程度。免疫組織化學(xué)和組織形態(tài)學(xué)主動(dòng)脈竇的切片用M0MA-2抗體(Serotec)按照標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用三色染色法評(píng)價(jià)膠原含量，用油紅0染色評(píng)價(jià)斑塊的大小，用標(biāo)準(zhǔn)的染色程序評(píng)價(jià)脂質(zhì)含量。進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助的形態(tài)測(cè)定分析從而進(jìn)行如前所述的組織形態(tài)學(xué)測(cè)定8?？贵w滴度的測(cè)量為了測(cè)定用肽進(jìn)行免疫后的抗體反應(yīng)，進(jìn)行了ELISA檢測(cè)。對(duì)加強(qiáng)免疫后兩周的血樣以及處死時(shí)血樣進(jìn)行了檢測(cè)，測(cè)定了其中的抗免疫肽的抗體滴度。同時(shí)，對(duì)給予明礬的對(duì)照組也測(cè)定了相同時(shí)間點(diǎn)的抗3個(gè)肽的抗體反應(yīng)。簡(jiǎn)而言之，用PH7.4的PBS(20ug/ml)稀釋合成的天然肽，然后將其加入微孔滴定板的小孔中(Nunc,MaxiSorp,Nunc,Roskilde，丹麥)進(jìn)行包被，在4°C下孵化過(guò)夜。用含有0.05。/^Tween-20的PBS(PBS-T)洗板，然后在室溫下，用含有Superblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封閉所述經(jīng)包被的板5分鐘，隨后加入用含有0.05%Tween-20的TBS(TBS-T)以1:100的比例稀釋所收集到的人血漿池，并加入反應(yīng)板中，在室溫下孵化2小時(shí)，然后在4。C下孵化過(guò)夜。洗板后，用生物素標(biāo)記的兔抗鼠Ig抗體(DakoA/S,Glostrup，丹麥)檢測(cè)沉積的針對(duì)所述肽的抗體，所述兔抗鼠抗體用TBS—T進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂專(zhuān)谑覝叵?，繼續(xù)孵化2小時(shí)；然后，洗板，用堿性磷酸酶結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗體，在室溫下孵化2小時(shí)。用磷酸酶底物試劑盒(Pierce)進(jìn)行顯色反應(yīng)，在室溫下孵化1小時(shí)后，在405nm處測(cè)量吸光度。減去背景值，然后計(jì)算出平均值。當(dāng)然也可以采用其它的檢測(cè)方法，包括檢測(cè)抗體的免疫檢測(cè)方法，例如，放射免疫檢測(cè)法，Western雜交，Southern雜交，以及檢測(cè)結(jié)合于肽的抗體，酶電極和其它分析方法。統(tǒng)計(jì)所有的結(jié)果以平均值土std的形式表示。所使用的統(tǒng)計(jì)方法見(jiàn)正文，表或。p<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。表A主動(dòng)脈竇處的斑塊大小和脂質(zhì)含量，主動(dòng)脈弓部的斑塊大小，降主動(dòng)脈處斑塊的百分?jǐn)?shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>*顯著區(qū)別于給予明礬的對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)方法采用了Tukey—Kramer檢驗(yàn)方法，并采用了ANOVA分析。用載脂蛋白B—100的肽序列對(duì)剔除載脂蛋白E的小鼠進(jìn)行免疫后，其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響的資料見(jiàn)表B表B用載脂蛋白B—IOO的肽序列對(duì)剔除載脂蛋白E的小鼠進(jìn)行免疫后，其對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的影響的資料見(jiàn)表B用JI'種M:序列的源,合物講行免疫對(duì)主動(dòng)脈的動(dòng)脈粥樣硬化的影響1.肽序列143和210-64.6%2.肽序列l(wèi)l，25和74-59.6%3.肽序列129,148和167-56.8%4.肽序列99，100，102，103和105-40.1%5.肽序列30，31,32，33和34+6.6%6.肽序列10，45，154，199和240+17.8%用單個(gè)肽序列講行免疫1.肽序列2-67.7%2.肽序列210-57.9。％3.肽序列301-55.3%4.肽序列45-47.4%5.肽序列74-31.0%6.肽序列1-15.4%7.肽序列2400%通常，通過(guò)注射的方法給予肽，例如皮下注射，靜脈內(nèi)注射，肌肉注射或腹膜內(nèi)注射。根據(jù)每個(gè)病人的體重，年齡以及其它物理和醫(yī)療條件確定第一次免疫用的劑量，其劑量為1-100mg。在特殊情況下，也可以通過(guò)導(dǎo)管向冠狀血管中局部給予含有一種或多種肽的溶液。也可以口服含有所述肽的制劑，但是，必須考慮到一些特殊情況以使口服制劑能夠吸收進(jìn)入血流。一次注射用劑量可以含有重量百分比為0.5%—99.5%的本發(fā)明中所述的一種或多種片段或肽。通常，將所述肽連接于陽(yáng)離子牛血清白蛋白上，并同時(shí)給予，將白蛋白氫氧化物作為佐劑。也可以使用本領(lǐng)域所公知的其它佐劑。用于給予所述肽的溶液不能含有任何的EDTA或抗氧化劑。對(duì)于已經(jīng)患有動(dòng)脈粥樣硬化的病人，所述肽也可以作為治療劑。因此，可以采用任何一種適當(dāng)?shù)慕o藥途徑添加本發(fā)明的一種或多種片段或肽。最初一些研究的重點(diǎn)是確定肽的何種氧化修飾可以導(dǎo)致其被人類(lèi)血漿中的抗體識(shí)別。在這些研究中使用了肽No.1—5以及No.297-302。在LDL氧化的過(guò)程中，磷酯中的多不飽和脂肪酸以及膽固醇酯經(jīng)歷了預(yù)氧化，從而形成了具有高反應(yīng)性的斷裂產(chǎn)物，例如丙二醛(MDA)。MDA可以與apoB-100中的賴氨酸和組氨酸殘基形成共價(jià)加合物，從而使它們具有高度的免疫原性。LDL氧化還導(dǎo)致apoB-100分裂，從而使正常狀態(tài)下不能被免疫系統(tǒng)接近的肽序列暴露于免疫系統(tǒng)中。在這些實(shí)驗(yàn)中，采用了肽的天然形態(tài)，或經(jīng)過(guò)MDA修飾，或者在用銅氧化或MDA修飾后結(jié)合于磷酯脂質(zhì)體上。在上述研究中，檢測(cè)了針對(duì)天然肽、經(jīng)MDA修飾的肽以及結(jié)合于脂質(zhì)體上的氧化肽的IgM抗體，它們的抗體滴度分別為經(jīng)MDA修飾的肽〉經(jīng)MDA修飾的脂質(zhì)體肽〉結(jié)合于脂質(zhì)體的氧化肽〉天然肽。特異性試驗(yàn)表明MDA—LDL以及經(jīng)銅氧化的LDL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于針對(duì)經(jīng)MDA修飾的肽的抗體。然后，我們將天然形態(tài)的和經(jīng)MDA修飾的肽作為抗原，用從健康對(duì)照受試者中收集來(lái)的血漿樣品，對(duì)完整的肽庫(kù)進(jìn)行篩選。確定了針對(duì)apoB-100上多個(gè)位點(diǎn)的抗體。將對(duì)照的背景吸光度的兩倍作為陽(yáng)性滴度的判定值，檢測(cè)了構(gòu)成完整apo-100肽序列庫(kù)的302個(gè)肽中的102個(gè)肽的抗體。IgM的結(jié)合率明顯高于IgG的結(jié)合率?？傮w上來(lái)說(shuō)，抗體與經(jīng)MDA修飾的肽的結(jié)合率高于與相應(yīng)的天然肽序列的結(jié)合率，但是兩者之間有著顯著的相關(guān)性。經(jīng)MDA修飾的LDL和經(jīng)銅氧化的LDL與天然形式的肽序列和經(jīng)MDA修飾的肽序列競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于抗體，但是，天然LDL并不參與所述的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。這些觀察結(jié)果表明，針對(duì)apoB-100中經(jīng)MDA修飾的肽序列的免疫反應(yīng)與天然序列之間存在著交叉反應(yīng)性。天然LDL不競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合于結(jié)合天然鄰oB-100肽序列的抗體的現(xiàn)象是非常有趣的，但是，其可能提示了，只有經(jīng)過(guò)LDL氧化，導(dǎo)致apoB-100發(fā)生了蛋白分解，此時(shí)這些肽序列才暴露出來(lái)。所述肽分子的親水和厭水部分被抗體識(shí)別。用從具有冠心病臨床癥狀[CHD，急性心肌梗塞(AMI)、不穩(wěn)定心絞痛；n-10]的受試者中所收集的血漿樣品，對(duì)apoB-100肽庫(kù)進(jìn)行第二次篩選。所收集的CHD血漿中的抗體與健康對(duì)照受試者血漿中的抗體結(jié)合于同樣的肽序列，而且其分布也與健康對(duì)照受試者血漿中的抗體分布一致。然而，在CHD受試者的血漿中，針對(duì)幾種肽(編號(hào)為l，30-34，100，107,148，149，162，236，252以及301)的抗體滴度至少是健康對(duì)照受試者血漿中抗體滴度的兩倍，此外，CHD患者血漿中還有幾種肽(編號(hào)為10,45，111,154,199,222以及240)的抗體滴度高于對(duì)照組。然后，我們進(jìn)行了一項(xiàng)前瞻性臨床研究，以調(diào)査針對(duì)apoB-100中經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體水平能否用于預(yù)測(cè)發(fā)生CHD的危險(xiǎn)。采用嵌套式病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，我們從Malmo飲食癌癥研究項(xiàng)目中選擇了78名冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)重大病變的受試者(AMI或死于CHD)，以及149名對(duì)照人群。病例組和對(duì)照組中的受試者之前均沒(méi)有發(fā)生MI或中風(fēng)的病史。在病例組中，從采集血樣到發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈疾病的中位數(shù)時(shí)間為2.8年(范圍為0.1-5.9年)。測(cè)定加入抗氧化劑的基線血漿樣品中的抗體水平。采用超聲波檢査法評(píng)價(jià)了頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜的基線厚度(IMT),我們同時(shí)還分析了抗體濃度和所存在的血管疾病的嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。我們研究了8個(gè)在初次篩選研究中與血漿中高抗體水平相關(guān)(編號(hào)為74，102以及210)，和/或?qū)φ战M血漿池與CHD血漿池之間存在明顯差異(編號(hào)為32，45，129，162以及240)的經(jīng)MDA修飾的肽序列。我們發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組中針對(duì)經(jīng)MM修飾的肽74的IgM抗體水平較高(對(duì)照組0.258，吸光度范圍為0-1.123;病例組0.178,吸光度范圍為0-0.732,p<0.05),而對(duì)于其它的肽，病例組和對(duì)照組之間的抗體水平?jīng)]有差異。我們觀察到了，在病例組中，IMT和針對(duì)經(jīng)MDA修飾的肽No.102，129以及162的IgM抗體之間存在著相關(guān)性(r分別為0.233，0,232，0.234，p〈0.05)'在對(duì)照組中，IMT與針對(duì)經(jīng)MDA修飾的肽45的IgM抗體之間也存在著相關(guān)性(r=0.18，p〈0.05)。針對(duì)經(jīng)MDA修飾的肽129的抗體以及總膽固醇和LDL膽固醇之間存在著微弱的相關(guān)性(r分別等于O.19，0.19，p〈0.0D，其它肽的抗體水平與總的血漿膽固醇，LDL膽固醇，HDL膽固醇或血漿甘油三酯之間沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)性。針對(duì)不同肽的抗體水平之間存在著顯著的協(xié)相關(guān)(r值范圍0.6-0.9)。其中只有一個(gè)例外，那就是經(jīng)MDA修飾的肽74的抗體與其它肽的抗體之間存在著微弱的相關(guān)性或不具有相關(guān)性。在病例組中，除了經(jīng)MDA修飾的肽74，所有肽序列的抗體與年齡存在著負(fù)相關(guān)(r值范圍0.38-0.58，p〈0.01'0.001)，但是在對(duì)照組中不存在這種負(fù)相關(guān)。相反的是，血漿中氧化LDL的水平隨著年齡的增長(zhǎng)而升高。而且，這種相關(guān)性在病例組中比對(duì)照組中更加顯著。為了研究針對(duì)經(jīng)MDA修飾的肽序列的免疫反應(yīng)與心血管疾病之間的關(guān)系在不同的年齡組中是否不同，我們對(duì)病例組和對(duì)照組進(jìn)行了年齡分組分析，分為年齡中位數(shù)(61歲)以下和以上兩組。在年齡較小的組中，與對(duì)照組相比，病例組中肽32和45的抗體水平較高，肽74的抗體水平較低，但是在高年齡組中沒(méi)有觀察到差異。在年齡較小的組中，除了肽74，所有經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體均與IMT具有顯著的相關(guān)性，而在高年齡組中不存在上述情況。(表)這些研究確定了apoB-100中存在的多個(gè)被人類(lèi)抗體所識(shí)別的經(jīng)MDA修飾的肽序列。由于LDL氧化所導(dǎo)致的印oB-100的MDA修飾表明這些抗體屬于上文所描述的抗氧化LDL的自身抗體家族。該結(jié)論同樣得到了以下觀察結(jié)果的支持，即結(jié)合于經(jīng)MDA修飾的apoB-100肽的抗體也被氧化LDL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。與Horkko等人所確定的氧化磷脂一起，這些經(jīng)MDA修飾的肽序列有可能構(gòu)成了氧化LDL的絕大部分具有抗原性的結(jié)構(gòu)。與氧化LDL的抗磷脂抗體類(lèi)似，經(jīng)MDA修飾的apoB-100序列的抗體類(lèi)型為IgM型。這就提示了，后者抗體也可能屬于T15自然產(chǎn)生的抗體家族。T15抗體在抗細(xì)菌感染的T細(xì)胞非依賴性免疫反應(yīng)中起著重要的作用，同樣在清除凋落細(xì)胞中也起著非常重要的作用。但是，我們?nèi)孕枰M(jìn)一步確定本文所描述的經(jīng)MDA修飾的肽的抗體是否也具有類(lèi)似功能。此外，我們還檢測(cè)了多個(gè)天然apoB-100序列的抗體。然而，天然肽的抗體和經(jīng)MDA修飾的肽的抗體之間所存在的顯著共變性提示了，這些抗體同樣也是在針對(duì)LDL氧化的免疫反應(yīng)中形成的。此外還存在這樣的可能，那就是經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體與相應(yīng)的天然肽序列之間存在著交叉反應(yīng)性。如果抗天然apoB-100序列的抗體同樣結(jié)合于天然LDL顆粒，這就有可能對(duì)LDL的代謝產(chǎn)生重大影響。然而，發(fā)現(xiàn)表明天然LDL并不競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合于抗天然apoB-100序列的抗體，而且抗天然apoB-100序列的抗體與LDL膽固醇水平之間缺乏相關(guān)性，從而否定了上述現(xiàn)象的存在。在病例組中，經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體水平隨著年齡的增長(zhǎng)而進(jìn)行性地下降，但是在對(duì)照組中不存在這種現(xiàn)象。在年齡較小的組中(62歲以下)，除了經(jīng)MDA修飾的肽74，經(jīng)MDA修飾的肽的IgM抗體與頸動(dòng)脈IMT之間存在著顯著的相關(guān)性，但是在年齡較大的組中不存在這種相關(guān)性。這些發(fā)現(xiàn)表明，在50歲到70歲之間，免疫系統(tǒng)和動(dòng)脈粥樣硬化血管壁之間的相互作用發(fā)生了顯著的變化。其中一種可能性是，在較年輕的個(gè)體中，動(dòng)脈粥樣硬化疾病的過(guò)程處于一個(gè)較為活躍的階段，其中免疫細(xì)胞顯著地參與該過(guò)程。另一種可能性是，在年老的個(gè)體中，經(jīng)MDA修飾的肽序列的抗體水平下降反映了參與動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的免疫細(xì)胞也衰老了。有人認(rèn)為，免疫衰老所引起的免疫細(xì)胞功能損傷導(dǎo)致了老年人感染和癌癥的易感性升高。有趣的是，抗氧化劑可以抑制免疫衰老，其提示了免疫衰老過(guò)程中涉及了氧化因素。尤其是，與氧化LDL的抗原決定基之間具有相互作用的免疫細(xì)胞有可能暴露于氧化因素中。由于在年幼的時(shí)候，氧化LDL就已經(jīng)存在于動(dòng)脈中，因此，免疫反應(yīng)一直被持續(xù)激發(fā)了數(shù)十年，從而進(jìn)一步加劇了免疫衰老的發(fā)生。我們發(fā)現(xiàn)，針對(duì)apoB-100中兩個(gè)位點(diǎn)的抗體可以用于預(yù)測(cè)年齡在62歲以下的受試者中發(fā)生心肌梗塞和冠狀動(dòng)脈死亡的危險(xiǎn)性。針對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)的抗體之間具有高度的共變性，其提示了，這些抗體是針對(duì)同一潛在的病理過(guò)程的反應(yīng)所產(chǎn)生的。從采集血樣至發(fā)生重大冠狀動(dòng)脈病變的中位i時(shí)間僅僅為2.8年的事實(shí)表明，這些特別受關(guān)注的抗體可以作為CHD危險(xiǎn)升高的標(biāo)記物。經(jīng)MDA修飾的apoB肽序列的抗體水平與其它的CHD危險(xiǎn)因素之間沒(méi)有表現(xiàn)出相關(guān)性，例如高脂血癥、高血壓、糖尿病，其表明這些抗體是獨(dú)立的患有CHD危險(xiǎn)的標(biāo)記物。在本研究中，CHD病例并不是具有極高危險(xiǎn)性的個(gè)體，他們只代表了普通的CHD患者。結(jié)果表明，經(jīng)MDA修飾的apoB肽序列的IgM抗體可以預(yù)測(cè)個(gè)體在短期內(nèi)發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈病變的危險(xiǎn)，通過(guò)對(duì)目前所確定的危險(xiǎn)因素進(jìn)行篩選并沒(méi)有確定所述個(gè)體為高危人群，這就提示了，經(jīng)MM修飾的apoB-100肽序列的IgM抗體可以成為確定那些需要進(jìn)行積極預(yù)防治療的個(gè)體的一種重要的手段。然而，在完全確定針對(duì)經(jīng)MDA修飾的apoB-100肽序列的抗體的臨床值之前，需要更多的、更大規(guī)模的、進(jìn)行多因素分析的前瞻性研究。本發(fā)明中的臨床研究的另一個(gè)不足是，我們僅僅分析了針對(duì)apoB-100中一小部分抗原位點(diǎn)的抗體，可能針對(duì)其它位點(diǎn)的抗體滴度可以更好地作為發(fā)生心血管疾病危險(xiǎn)的標(biāo)記物。在年齡60歲以下的受試者中，針對(duì)apoB-100中大量經(jīng)MDA修飾的位點(diǎn)的抗體與所存在的血管疾病的范圍和程度之間具有相關(guān)型，所述血管疾病的范圍和程度是通過(guò)頸動(dòng)脈IMT進(jìn)行評(píng)價(jià)的。IgM抗體與頸動(dòng)脈IMT的關(guān)系比IgG抗體更加密切。盡管將頸動(dòng)脈IMT用于評(píng)價(jià)總體動(dòng)脈粥樣硬化的程度具有明顯的局限性，但是這些研究結(jié)果仍然提示了，測(cè)定針對(duì)apoB-100中經(jīng)MDA修飾的肽序列的IgM抗體可以作為評(píng)價(jià)所存在的動(dòng)脈粥樣硬化嚴(yán)重程度的一種方法。這些觀察結(jié)果與在此之前的其它幾個(gè)研究一致，這些研究報(bào)道了冠狀動(dòng)脈疾病、頸動(dòng)脈疾病以及抗氧化LDL的IgM抗體之間的關(guān)聯(lián)?？闺?4的抗體在很多方面不同于其它apoB-100肽的抗體。在對(duì)照組中抗肽74的抗體高于病例組，隨著年齡的增長(zhǎng)這些抗體并不減少，這些抗體與頸動(dòng)脈疾病的程度之間沒(méi)有聯(lián)系。因此，抗該肽序列的抗體可以作為具有動(dòng)脈保護(hù)效應(yīng)的免疫反應(yīng)的候選物質(zhì)。一種非常重要的問(wèn)題是為何存在這樣的聯(lián)系。這些聯(lián)系清楚地表明，針對(duì)經(jīng)MDA修飾的apoB-100位點(diǎn)的免疫反應(yīng)在一定程度上參與了動(dòng)脈粥樣硬化疾病的病程。由于高抗體水平與較為嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化，以及發(fā)生急性冠狀動(dòng)脈疾病的高危險(xiǎn)性有關(guān)，一個(gè)顯而易見(jiàn)的可能性就是，這些免疫反應(yīng)促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣化。有研究表明，針對(duì)例如HSP65等熱休克蛋白的免疫反應(yīng)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣化，這些研究支持了上述觀點(diǎn)。然而，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究表明，用氧化LDL進(jìn)行疫具有保護(hù)動(dòng)脈的作用。對(duì)切除脾的apoE裸鼠進(jìn)行B細(xì)胞重建導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化降低。對(duì)apoE裸鼠進(jìn)行反復(fù)注射免疫球蛋白也觀察到了動(dòng)脈粥樣硬化的減少。本發(fā)明中的觀察結(jié)果并不足以反駁針對(duì)氧化LDL的免疫反應(yīng)所具有的動(dòng)脈保護(hù)作用。這些免疫反應(yīng)是由促進(jìn)動(dòng)脈粥樣化的過(guò)程所激發(fā)的，例如，LDL氧化。因此，這些免疫反應(yīng)同樣有可能與上述疾病的嚴(yán)重程度之間具有一定的比例關(guān)系，可以作為疾病嚴(yán)重程度和發(fā)生CHD危險(xiǎn)的標(biāo)記物，但是其并不促使疾病向前發(fā)展。在兩篇論文中所報(bào)道的研究結(jié)果表明，用apoB-100肽序列免疫apoE裸鼠抑制了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展，其提示了有可能就是如上所述的情況。實(shí)際上，本研究最重要的結(jié)果可能是確定了可以作為抗動(dòng)脈粥樣硬化疫苗組成部分的結(jié)構(gòu)。研究結(jié)果表明，隨著年齡的增長(zhǎng)，apoB-100中經(jīng)MDA修飾肽序列的抗體而水平減少，同時(shí)還伴有血漿中氧化LDL水平的升高，其提示了，增加循環(huán)中極少量氧化LDL的清除率可能是這些抗體具有防止動(dòng)脈粥樣硬化的一個(gè)機(jī)制。方法研究人群本研究的受試者出生于1926-1946年間，為Malmo"飲食和癌癥(MDC)"研究隊(duì)列中的受試者。在1991年11月至1994年2月期間，我們從參與MDC研究的受試值中隨機(jī)選取了50%的受試則，參與頸動(dòng)脈疾病的流行病學(xué)研究。在進(jìn)行健康檢查之后，確定了有關(guān)發(fā)病率和致死率等方面的信息，以及傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素的定義，并對(duì)確定的方法和定義進(jìn)行了報(bào)道。確定了有85例急性冠狀動(dòng)脈性心臟疾病，也就是，致死性或非致死性的心肌梗塞(MI)或由冠心病(CHD)所導(dǎo)致的死亡。具有心肌梗塞或中風(fēng)(n=6)病史的參與者為不合格者，不能參加本研究。對(duì)于每個(gè)病例，選取兩個(gè)在年齡、性別，吸煙習(xí)慣、有無(wú)高血壓、參與篩選檢査的月份、隨訪的時(shí)間等方面相匹配的對(duì)照者，所述對(duì)照者沒(méi)有心肌梗塞或中風(fēng)的病史。由于后勤方面的原因(血樣量不夠，不足以對(duì)肽進(jìn)行測(cè)定)，有7名病例只有一個(gè)對(duì)照者，有l(wèi)名病例沒(méi)有對(duì)照者。分析時(shí)，剔除了該名病例。因此，本研究人群包括227名受試者，其中有78名病例，149名對(duì)照，在進(jìn)入研究時(shí)，他們的基線年齡在49-67歲之間(年齡中位數(shù)為61歲)。實(shí)驗(yàn)室分析采集過(guò)夜禁食后的血樣，檢測(cè)血清中總膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇、LDL膽固醇和全血血糖的濃度。根據(jù)Friedwald公式計(jì)算LDL膽固醇濃度，其單位是mmo1/1。用ELISA方法(Mercordia)檢測(cè)氧化LDL。B型超聲血管檢測(cè)用具有兆赫茲傳感器的Acuson128計(jì)算機(jī)斷層系統(tǒng)(CT)(Acuson,MountainView,加利福尼亞)對(duì)右頸動(dòng)脈的頸動(dòng)脈斑塊進(jìn)行評(píng)價(jià)，如上文所述。用ELISA方法檢測(cè)apoB-100肽序列合成302個(gè)對(duì)應(yīng)于人類(lèi)載脂蛋白B完整氨基酸序列的肽(Euro-DiagnosticaAB,瑞典，以及KJRosePetersenAS,Horsholm,丹麥)，并將它們用于ELISA分析中。在37。C下，用0.5MMDA(Sigma-AldrichSwedenAB，斯德哥爾摩，瑞典)處理所述合成肽3小時(shí)，對(duì)每個(gè)經(jīng)合成的肽的一部分進(jìn)行修飾，或在脂質(zhì)體存在的情況下，用0.5MMDA在37。C下處理3小時(shí)，或在37。C下，用5mMCuCl2(Sigma)處理18小時(shí)。然后在4°C下，用含有ImMEDTA的PBS溶液對(duì)所述經(jīng)MDA修飾的肽進(jìn)行透析18小時(shí)，中間更換PBS溶液數(shù)次。在適于分離肽的變性聚丙烯酰胺凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上檢測(cè)經(jīng)修飾的肽。將摩爾比為9:1的卵磷脂(EPC)(Sigma)和磷脂酰絲氨酸(PS)(Sigma)的氯仿溶液，與濃度為3mM的磷酯(PL)溶液進(jìn)行混合，然后，在玻璃容器中用緩慢的氬氣流進(jìn)行吹干。然后，將容器放在真空狀態(tài)下3小時(shí)。取5ml含有0.lmM肽、經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾的PH為7.4的10mMHEPES緩沖液、45mMNaCl、0.003^疊氮鈉的溶液加入EPC/PS干燥層，并在50°C下孵化15分鐘。在室溫下，輕微振蕩所述混合物，然后將其放于冰水中，用振幅為7.5微米的微波進(jìn)行超聲降解3x3分鐘(Sonypr印150MSESanyo,Tamro-medlab，瑞典)，每次間隔1分鐘。將所述PL—肽混合物貯存于玻璃小瓶中，并位于氬氣下面，瓶的外周用鋁箔包裹，在4。C下貯存，并在l周內(nèi)使用。所述PL—肽混合物為天然形態(tài)，或是用0.5MMDA在37°C下進(jìn)行處理3小時(shí)，或是用5mMCuCl2在37°C下處理18小時(shí)。在貯存前，所述經(jīng)MDA修飾的混合物需要在4°C下用含有ImMEDTA的PBS對(duì)其進(jìn)行透析18小時(shí)，中間更換PBS溶液數(shù)次。在適于分離肽的變性聚丙烯酰胺凝膠(Bio-RadLaboratoriesAB,Sundbyberg,瑞典)上檢測(cè)所述經(jīng)修飾的混合物。不論有無(wú)脂質(zhì)體，用PH為7.4的PBS(20leg/ml)溶液稀釋天然或經(jīng)修飾的合成肽，并用其包被微孔滴定板的小孔(NuncMaxiSorp,Nunc,Roskide，丹麥)，在4。C下孵化過(guò)夜。作為對(duì)照，在每塊板上都加入其中的一個(gè)肽(P6)。用含有0.05%Tween-20的PBS(PBS-T)溶液洗板，然后在室溫下，用含有Superblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封閉所述經(jīng)包被的板5分鐘，用含有0.05%Tween-20的TBS(TBS-T)溶液以100:1的比例稀釋所收集到的人血漿樣品，并將稀釋后的血樣加入反應(yīng)板中，在室溫下孵化2小時(shí)，然后在4。C下孵化過(guò)夜。洗板后，用生物素標(biāo)記的兔抗鼠Ig抗體(DakoA/S，Glostrup，丹麥)檢測(cè)沉積的針對(duì)所述肽的抗體，所述兔抗鼠抗體用TBS—T溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)叵♂專(zhuān)谑覝叵?，繼續(xù)孵化2小時(shí)；然后，洗板，用堿性磷酸酶結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素(Sigma)檢測(cè)結(jié)合的生物素標(biāo)記的抗體，在室溫下孵化2小時(shí)。用磷酸酶底物試劑盒(Pierce)進(jìn)行顯色反應(yīng)，在室溫下孵化1小時(shí)后，在405nm處測(cè)量吸光度。將每個(gè)肽的吸光度值除以P6的吸光度值，進(jìn)行比較。統(tǒng)計(jì)用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得結(jié)果以中位數(shù)和范圍表示，適當(dāng)?shù)臅r(shí)候用比例表示。用框圖或散點(diǎn)圖解釋病例組和對(duì)照組中年齡和所選擇的肽之間的關(guān)系。此外，分別在對(duì)照組和病例組中，用相應(yīng)的圖形解釋基線年齡在中位數(shù)(61歲)之下和之上的亞組之間年齡和所選擇的肽之間的關(guān)系，并單獨(dú)地用相應(yīng)圖形解釋病例組和對(duì)照組中年齡在中位數(shù)以下時(shí)年齡和所選擇的肽之間的關(guān)系。單獨(dú)計(jì)算病例組和對(duì)照組中所選擇的肽和血脂水平，以及頸總動(dòng)脈IMT之間的、經(jīng)年齡和性別調(diào)整后的偏相關(guān)系數(shù)。同時(shí)，對(duì)病例組和對(duì)照組中年齡在中位數(shù)(61歲)之下和之上的亞組，計(jì)算頸總動(dòng)脈IMT和所選擇的肽之間的經(jīng)年齡和性別調(diào)整后的偏相關(guān)系數(shù)。對(duì)符合正態(tài)分布的連續(xù)變量，用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用卡方(x2)檢驗(yàn)比較病例組和對(duì)照組之間的比例。用非參數(shù)檢驗(yàn)的方法(Mann-Whitney)評(píng)價(jià)病例組和對(duì)照組之間不符合正態(tài)分布的連續(xù)變量之間的差異。所有的P值都是雙向的。表患有心肌梗塞的病例組以及相應(yīng)的在年齡、性別、吸煙、.高血壓方面相匹配的對(duì)照組在年齡較小組(49-61歲)和年齡較大組(62-67歲)中基線MDA-肽和頸動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度之間經(jīng)年齡和性別調(diào)整后的偏相關(guān)系數(shù)肽病例組加對(duì)照組年齡在49-61歲，n=116IgMMDA32廳45MDA74MDA102MDA129MDA162MDA210MDA2400.0.0.0.0.0.0.0.235t366$178255$330$2451254284$[gG0.119病例組加對(duì)照組年齡在62-67歲，n=lll-0.101-0.0300.063-0.039-0.0090.0010.0130.006—0.059MDA215P<0.05;$/x0.01參考文獻(xiàn)1.AmellSetal.EffectofimmunizationwithhomologousLDLandoxidizedLDLonearlyatherosclerosisinhypercholesterolemicrabbits.2.FreigangS，HorkkoS,MillerE，WitztumJ丄&PalinskiW.ImmunizationofLDLreceptor-deficientmicewithhomologousmalondialdehyde-modifiedandnativeLDLreducesprogressionofatheroscelrosisbymechanismsotherthaninductionofhightitiersofantibodiestooxidativeneoepitopes.3.GeorgeJetal.Hyperimraunizationofapo-E-deficientmicewithhomologousmalondialdehydelow-densitylipoproteinsuppressesearlyantherogenesis.Atherosclerosis138,147-152(1998)4.AlvingC.R.etal.Immunizationwithcholesterol-richliposomesinducesanticholesterolantibodiesandreduceshypercholestgeroleraiaandplaqueformation.J.Lab.Clin.Med.127,40-49(1996).5.HouX，CaligiuriG,HamstenA，LefvertA.K&HanssonG.K.LDLimmunizationinducesT—cell-dependentantibodyformationandprotectionagainstatherosclerosis.ArteriosclerThrombVaseBiol.21,108-144(2001)6.NakashimaY，PlumpA.S.,RainesE.W.，BreslowRossR.Apo-E-deficientmicedeveloplesionsofallphasesofatherosclerosisthroughoutthearterialtree，ArteriosclerThromb14,133-140(1994)7.ReddickR.L.，ZhangS.H,&MaedaN.AtherosclerosisinmicelackingapoE.Evaluationoflesionaldevelopmentandprogression.ArteriosclerThromb14，141-147(1994)8.ShahP.K.etal.EffectsofrecombinantapolipoproteinA-I(Milano)onaorticatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmice.Circulation97，780-785(1998)9.Glass,C.K.&Witztum，J"丄Atherosclerosis.Theroadahead.Cell104,503-16(2001)10.Holvoet，P.，Vanhaecke，J.,J"anssens，S.，VandeWerf,F.&Collen,D.OxidizedIJDLandmalondialdehyde-modifiedU)Linpatientswithacutecoronarysyndromesandstablecoronaryarterydisease.Circulation98，1487-94(1998)11.Ehara，S.etal.Elevatedlevelsofoxidizedlowdensitylipoproteinshowapositiverelationshipwiththeseverityofacutecoronarysyndromes.Circulation103，1955-60(2001)12.Krych-Goldberg，M.&Atkinson,J.P.Structure-functionrelationshipofcomplementreceptortypel,ImmunolRev180，112-22(2001)13.Nicoletti，A.，Caligiuri,G.，Paulsson，G.&Hansson，G.K.Functionalityofspecificimmunityinatherosclerosis.AmHeartJ138，5438-43(1999)16.Chobanian，A.V.Haudenschild，C.C.，Nickerson,C.&Drago，R.AntiatherogeniceffectofcaptoprilintheWatanabeHeritablehyperlipidemicrabbit.Hypertension15,327-32(1990)17-Inoue,I.etal.MacrophagecolonystimulatingfactorpreventstheprogressionofatherosclerosisintheWatanabeHeritablehyperlipidemicrabbit.Atherosclerosis93，245-54(1992)18.Bourassa，P.A.，Milos，P.M.,Gaynor,B.j.，Breslow,J丄&Aiello,R.J.EstrogenreducesatheroscleroticlesiondevelopmentinapolipoproteinE-deficientmice.ProcNatlAcadSciUSA93,10022-7(1996)19.Sparrow,C.P.etal.Simvastatinhasanti-inflammatoryandantiatheroscleroticactivitiesindependentofplasmacholesterollowering.ArteriosclerThrombVaseBiol21，115-21(2001)20Nakashima，Y.，Plump,A.S.，Raines,E.,Breslow,丄L&Ross，R.ApoE-deficientmicedeveloplesionsofallphasesofatherosclerosisthroughoutthearterialtree.ArteriosclerThromb14，133-40(1994)21Palinski，W.etal，ApoE-deficientmiceareamodeloflipoproteinoxidationinatherogenesis.Demonstrationofoxidation-specificepitopesinlesions肌dhightitersofautoantibodiestomalondialdehyde-lysineinserum.ArteriosclerThromb14，605-16(1994)附圖1-6表示針對(duì)本發(fā)明中所制備的不同肽的抗體反應(yīng)。圖1:經(jīng)MDA修飾的肽I一IOO的IgG抗體。圖2:經(jīng)MDA修飾的肽101_200的IgG抗體。圖3:經(jīng)MDA修飾的肽201—302的IgG抗體。圖4:經(jīng)MDA修飾的肽l一100的IgM抗體。圖5:經(jīng)MDA修飾的肽101—200的IgM抗體。圖6:經(jīng)MDA修飾的肽201_302的IgM抗體。序列表Seq.IDNO1來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG序列表Seq.IDNO2來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性PQCSTHILQWLKRVHANPLL序列表Seq.IDNO3來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性VISIPRLQAEARSEILAHWS序列表Seq.IDNO4來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性KLVKEALKESQLPTVMDFRK序列表Seq.IDNO5來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性LKFVTQAEGAKQTEATMTFK序列表Seq.IDNO6來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK序列表Seq.IDNO7來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE序列表Seq.IDNO8來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ序列表Seq.IDNO9來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性SLTSTSDLQSGII麗ASLK序列表Seq.IDNO10來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性TASLKYENYELTLKSDTNGK序列表Seq.IDNO11來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性匿FSKQ亂LRSEYQADYE序列表Seq.IDNO12來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性MKVKIIRTIDQMQNSELQWP序列表Seq.IDNO13來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性IALDDAKINFNEKLSQLQTY序列表Seq.IDNO14來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH序列表Seq.IDNO15來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性EEEMLENVSLVCPKDATRFK序列表Seq.IDNO16來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性GSTSHHLVSRKSISAALE服序列表Seq.IDNO17來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性IENIDFNKSGSSTASWIQNV序列表Seq.IDNO18來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性IREVTQRLNGEIQALELPQK序列表Seq.IDNO19來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性E麗LTKYSQPEDSLIPFFE序列表Seq.IDNO20來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性HTFLIYITELLKKLQSTTVM序列表Seq.IDNO21來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性LLDIANYLMEQIQDDCTGDE序列表Seq.IDNO22來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ序列表Seq.IDNO23來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性GNMGQTMEQLTPELKSSILK序列表Seq.IDNO24來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性SSILKCVQSTKPSLMIQKM序列表Seq.IDNO25來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性IQKAAIQALRKMEPKDKDQE序列表Seq.IDNO26來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ序列表Seq.IDNO27來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性SLNSHGLELNADILGTDKIN序列表Seq.IDNO28來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性W蒙DTKYQIRIQIQEKLQ序列表Seq.IDNO29來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ序列表Seq.IDNO30來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ序列表Seq.IDNO31來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性ALLVPPETEEAKQVLFLDTV序列表Seq.IDNO32來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性IEIGLEGKGFEPTLEALFGK序列表Seq.IDNO33來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性SGASMKLTTNGRFREH腿F序列表Seq.IDNO34來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性NLIGDFEVAEKINAFRAKVH序列表Seq.IDNO35來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性GHSVLTAKGMALFGEGKAEF序列表Seq.IDNO36來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性FKSSVITLNTNAELFNQSDI序列表Seq.IDNO37來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性FPDLGQEVALNANTKNQKIR序列表Seq.IDNO38來(lái)源載脂蛋白B的片段長(zhǎng)度20類(lèi)型氨基酸肽鏈單鏈拓?fù)渚€性權(quán)利要求1.一種經(jīng)純化或重組產(chǎn)生的抗體，所述抗體為用于預(yù)防或治療包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物中缺血性心血管疾病的載脂蛋白B的一個(gè)或多個(gè)片段的抗體。2.如權(quán)利要求l所述的抗體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)片段選自IEIGLEGKGFEPTLEALFGKFLDTVYGNCSTHFTVKTRKGPQCSTHILQWLKRVHANPLLVISIPRLQAEARSEILAHWSKLVKEALKESQLPTVMDFRKLKFVTQAEGAKQTEATMTFKDGSLRHKFLDSNIKFSHVEKKGTYGLSCQRDPNTGRLNGERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLTSTSDLQSGIIKNTASLKTASLKYENYELTLKSDTNGKDMTFSKQNALLRSEYQADYEMKVKIIRTIDQMQNSELQWPIALDDAKINFNEKLSQLQTYKTTKQSFDLSVKAQYKKNKHEEEMLENVSLVCPKDATRFKGSTSHHLVSRKSISAALEHKIENIDFNKSGSSTASWIQNVIREVTQRLNGEIQALELPQKEVDVLTKYSQPEDSLIPFFEHTFLIYITELLKKLQSTTVMLLDIANYLMEQIQDDCTGDECTGDEDYTYKIKRVIGNMGQGNMGQTMEQLTPELKSSILKSSIL,STKPS國(guó)KAAIQKAAIQALRKMEPKDKDQERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLNSHGLELNADILGTDKINWIQNVDTKYQIRIQIQEKLQTYIS酬TLAA亂TDFAEQEATLQRIYSLWEHSTKNHLQALLVPPETEEAKQVLFLDTVSGASMKLTTNGRFREHNAKFNLIGDFEVAEKINAFRAKVHGHSVLTAKGMALFGEGKAEFFKSSVITLNTNAELFNQSDIFPDLGQEVALNANTKNQKIR，以及ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS或者上述肽的一個(gè)活性位點(diǎn)。3.如權(quán)利要求1-2中任一所述的抗體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)片段為天然形式或氧化形式。4.如權(quán)利要求3所述的抗體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)片段為醛衍生物。5.如權(quán)利要求4所述的抗體，其中，用丙二醛或羥基壬烯醛修飾所述的一個(gè)或多個(gè)片段。6.如權(quán)利要求4-5中任一所述的抗體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)片段為醛半抗原。7.如權(quán)利要求3所述的抗體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)片段是經(jīng)銅進(jìn)行氧化過(guò)的。8.如上述權(quán)利要求中任一所述的抗體，其中所述的一個(gè)或多個(gè)片段結(jié)合于磷脂脂質(zhì)體。9.用于預(yù)防或治療包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物中缺血性心血管疾病的藥物制劑，所述藥物制劑含有治療有效劑量的如權(quán)利要求1-8所述的一種或多種經(jīng)純化或重組產(chǎn)生的抗體。10.如權(quán)利要求1-8中任一所述的抗體在制備用于預(yù)防或治療包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物中缺血性心血管疾病的藥物組合物中的應(yīng)用。11.用于預(yù)防或治療包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物患有動(dòng)脈粥樣硬化或面臨發(fā)生缺血性心血管疾病危險(xiǎn)的方法，其中，給藥一治療有效劑量的如權(quán)利要求1-8中任一所述的一種或多種經(jīng)純化或重組產(chǎn)生的抗體。全文摘要本發(fā)明涉及以肽為基礎(chǔ)的治療動(dòng)脈粥樣硬化的免疫療法，和以肽為基礎(chǔ)的用于確定針對(duì)氧化低密度脂蛋白的免疫反應(yīng)的檢測(cè)方法。本發(fā)明尤其涉及用于預(yù)防或治療包括人類(lèi)在內(nèi)的哺乳動(dòng)物中缺血性心血管疾病的載脂蛋白B的一個(gè)或多個(gè)片段的經(jīng)純化或重組產(chǎn)生的抗體，以及含有這些抗體的藥物制劑。文檔編號(hào)A61KGK101284874SQ200710195398公開(kāi)日2008年10月15日申請(qǐng)日期2002年4月5日優(yōu)先權(quán)日2001年4月5日發(fā)明者揚(yáng)·尼爾森,普里迪曼·K·沙赫申請(qǐng)人:南方佛斯卡專(zhuān)利公司;賽達(dá)斯西奈醫(yī)療中心