專利名稱：：人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的新用途，具體涉及采用His-tag重組蛋白純化技術(shù)純化的人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥藥物中的應(yīng)用。二、
背景技術(shù)：
1985年，Coris首先提出全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemicinflammationresponsesyndrome,SIRS)是由不同疾病，包括微生物感染、創(chuàng)傷、燒傷等感染性疾病所引起的全身性的非特異性炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致機(jī)體對(duì)炎癥反應(yīng)的失控。根據(jù)臨床表現(xiàn)分為全身感染或膿毒癥、敗血癥綜合征、早期感染性休克、難治性感染性休克、多器官功能障礙綜合征以及死亡6期。最近的臨床資料表明，革蘭氏桿菌所致全身炎癥反應(yīng)綜合征的主要死亡原因是內(nèi)毒素的作用。SIRS是一動(dòng)態(tài)發(fā)展、連續(xù)的過(guò)程，治療得當(dāng)可使病情早期得到控制，避免其進(jìn)一步發(fā)展。目前臨床治療措施有1、抗介質(zhì)制劑治療。目前國(guó)外巳將包括單克隆腫瘤壞死因子(TNF-a)抗體、重組人類白介素-1受體拮抗劑、TNF受體、內(nèi)毒素單克隆抗體等抗炎介質(zhì)應(yīng)用于臨床。2、CRRT治療。通過(guò)體外循環(huán)清除血液中的代謝產(chǎn)物、內(nèi)源性抗體、異常血漿成分及蓄積體內(nèi)的藥物或毒物。3、核因子-kB(NF-kB)抑制劑治療。NF-KB抑制劑有糖皮質(zhì)激素、IL-10等，糖皮質(zhì)激素通過(guò)活化的糖皮質(zhì)激素受體與調(diào)節(jié)它們表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子結(jié)合而抑制炎癥基因的表達(dá)；而IL-10可抑制與輔助T淋巴細(xì)胞1(Thl)反應(yīng)相關(guān)的許多細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。4、基因治療。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)基因技術(shù)制成病毒疫苗傳遞某些必要的基因，可對(duì)抗過(guò)強(qiáng)的炎癥反應(yīng)，現(xiàn)己成功地給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物轉(zhuǎn)入抗炎因子基因IL-4、IL-IO，抗氧化劑和抗蛋白酶等基因調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，增強(qiáng)細(xì)胞的反應(yīng)性、耐受性。目前的抗炎藥物一定程度上都存在缺陷，很多藥物抗炎療效并不理想或不良反應(yīng)較大，在減輕組織炎癥損傷的同時(shí)亦削弱了機(jī)體免疫力，不利于炎癥的治療。提高抗炎藥物的療效和降低藥物對(duì)機(jī)體正常免疫力的影響是各國(guó)科學(xué)家一直不斷努力的研究目標(biāo)。1961年，Boouh首先發(fā)現(xiàn)了谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，該酶是由2個(gè)同源酶二聚體亞基組成的一個(gè)超基因家族，有a、ii、pi3種，在體內(nèi)主要催化外源性和內(nèi)源性親電子有毒物質(zhì)與谷胱苷肽結(jié)合，形成親水性強(qiáng)的物質(zhì)而起到解毒作用。目前研究最多的是pi亞型，已有研究表明谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi(GSTpi)與腫瘤的耐藥性/腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。目前尚未發(fā)現(xiàn)GSTpi在抗炎方面的應(yīng)用。另外，未見(jiàn)應(yīng)用重組蛋白純化技術(shù)表達(dá)、純化GSTpi的相關(guān)報(bào)道。三、
發(fā)明內(nèi)容1、發(fā)明目的本發(fā)明的目的是提供一種人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制藥中的新用途，即提供一種人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥反應(yīng)綜合癥以及由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。2、技術(shù)方案本發(fā)明為人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥反應(yīng)綜合征疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明為人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面將用重組蛋白純化技術(shù)得到人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi(GSTpi)的方法以及GSTpi的藥理藥效試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)說(shuō)明其在制藥領(lǐng)域中的新用途。(1)人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的表達(dá)純化方法方法一、第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coh'BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g,瓊脂15g,用去離子水定容至1升，37'C振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g,用去離子水定容至l升，37"C振搖培養(yǎng)16h，然后取lmL接種到100mLLB液體培養(yǎng)基，37t)振搖培養(yǎng)24h，006。。達(dá)到0.50.6時(shí)，加異丙基e-半乳糖苷至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL0.5MNaCl，20mMTris-HC1，5mM咪唑，PH7.9的結(jié)合緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4'C離心15min后取上清，上清與經(jīng)結(jié)合緩沖液預(yù)平衡過(guò)的IDA-N廣樹(shù)脂在4'C結(jié)合40min，用以上結(jié)合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5MNaCl，20mMTris-HC1,60mM咪唑，PH7.9的洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5MNaCl,20rnMTris-HCl，1M咪唑，PH7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；第三步合并3次洗脫液上清，用0.5MNaCl,20mMTris-HC1,PH7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mMEDTA，PH6.5透析液2透析測(cè)定酶活性。第四步用140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,1.8mM1(1^卩04的PBS緩沖液透析測(cè)定蛋白濃度，用凝血酶水解切割Hise標(biāo)簽。方法二、第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.coh'BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素IOOrag/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨IOg，酵母提取物5g,NaCl10g,瓊脂15g，用去離子水定容至1升，37'C振蕩培養(yǎng)12h，挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g，NaCl10g,用去離子水定容至1升，37'C振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100raLLB液體培養(yǎng)基，37'C振搖培養(yǎng)3h,OD咖達(dá)到0.50.6時(shí)，加異丙基e-半乳糖苷至終濃度為0.4mM,繼續(xù)振搖培養(yǎng)4h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL140mMNaCl，2.7mMKC1,10mMNa2HP04,1.8mMKH2P04的PBS緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4t)離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneS印harose4B36-38°C結(jié)合30min,PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50raMTris-HC1,pH8.0,10raM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次。第三步合并3次洗脫液上清，用PBS緩沖液透析。(2)人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在炎癥治療中的應(yīng)用①LPS是大腸桿菌內(nèi)毒素的主要成分，常作為致傷劑，用于誘導(dǎo)動(dòng)物全身炎癥反應(yīng)綜合征。當(dāng)空腹注射37.5mg/Kg的LPS時(shí)，小鼠死亡率達(dá)70%;而注射LPS后30分鐘再注射2mg/kg的GSTpi，小鼠死亡率降為30%。實(shí)驗(yàn)證明GSTpi非常顯著地對(duì)抗全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的致死作用，大大提高了動(dòng)物的存活率。②一氧化氮(N0)含量的增加是全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)的結(jié)果，NO在全身炎癥反應(yīng)中的作用是降低血壓、產(chǎn)生氧自由基如0N000N00是NO致細(xì)胞毒性的主要物質(zhì)，過(guò)量的氧化自由基導(dǎo)致細(xì)胞壞死、組織損傷和器官功能衰竭(鄒岡等.基礎(chǔ)神經(jīng)藥理學(xué)，第二版.科學(xué)出版社1999，5.)本實(shí)驗(yàn)測(cè)定LPS刺激后小鼠血清NO的水平。結(jié)果表明GSTpi通過(guò)抑制氧化自由基NO的增高來(lái)抵御全身反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)展。③髓過(guò)氧化物酶(MP0)是白細(xì)胞中的一種炎性標(biāo)志物，組織中MPO活性的增加反應(yīng)了白細(xì)胞的浸潤(rùn)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定LPS刺激后肺組織中MP0的活性。結(jié)果表明GSTpi抑制肺組織中MP0的活性，說(shuō)明其阻止全身反應(yīng)綜合征(SIRS)的發(fā)展。④誘生型一氧化氮合酶(iN0S)是SIRS中N0產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，巨噬細(xì)胞iN0S表達(dá)的增加是炎癥發(fā)展的標(biāo)志，本實(shí)驗(yàn)表明GSTpi能明顯抑制LPS所致巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞iNOS的表達(dá)，表明其阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)展。⑤環(huán)氧化酶-2(C0X—2)是體內(nèi)前列腺素合成的限速酶，與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)表明GSTpi能明顯抑制LPS所致巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞COX—2的表達(dá)，進(jìn)一步表明其阻止炎癥反應(yīng)的發(fā)展。3、有益效果本發(fā)明的有益效果是提供了用重組蛋白純化技術(shù)得到的人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的新用途，為炎癥的治療特別是全身性炎癥反應(yīng)綜合癥找到了一種新型有效藥物。人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在炎癥治療中的應(yīng)用，不僅能有效控制炎癥，避免其進(jìn)一步發(fā)展；而且對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響較小；作為一種內(nèi)源性蛋白，給藥后不會(huì)引起免疫反應(yīng)，副作用極小。四圖l、His-tag重組蛋白純化技術(shù)純化人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi圖2、GSTpi對(duì)LPS所致小鼠死亡率的影響圖3、GSTpi對(duì)LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響圖4、GSTpi對(duì)LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響圖5、WesternBlotting檢測(cè)GSTpi、Y7F對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS合成的抑制作用圖6、WesternBlotting檢測(cè)GSTpi對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞COX-2合成的抑制作用五具體實(shí)施方式實(shí)施例1、帶組氨酸標(biāo)簽的人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(Hise-hGSTpi)重組蛋白的純化方法1)實(shí)驗(yàn)儀器及材料菌株E.coh'DH5a和E.co7iBL21(DE3)，質(zhì)粒pET-28a、HisBind蛋白純化試劑盒購(gòu)自Novagen公司，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，超聲破碎儀，4'C層析柜。2)實(shí)驗(yàn)步驟方法一第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.co力'BL21/DE3菌株接種于含卡那霉素100mg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，瓊脂15g，用去離子水定容至1升，36-38'C振蕩培養(yǎng)12h,挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g,NaCl10g,用去離子水定容至l升，36-38'C振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100mLLB液體培養(yǎng)基，37。C振搖培養(yǎng)2~4h，ODMO達(dá)到0.50.6時(shí),加異丙基e-半乳糖苷至終濃度為0.4mM，繼續(xù)振搖培養(yǎng)4-5h，12,500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL0.5MNaCl，20mMTris-HC1，5mM咪唑，PH7.9的結(jié)合緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g，4。C離心15min后取上清，上清與經(jīng)結(jié)合緩沖液預(yù)平衡過(guò)的IDA-N;T樹(shù)脂在4°C結(jié)合40min，用以上結(jié)合緩沖液洗滌柱3次，再用0.5MNaCl，20mMTris-HCl，60mM咪唑，PH7.9洗滌緩沖液洗滌2次，用0.5MNaCl，20mMTris-HC1，1M咪唑，PH7.9的洗脫緩沖液洗脫3次；第三步合并3次洗脫液上清，用0.5MNaCl，20mMTris-HC1，ffl7.9的透析液1透析去咪唑，再用0.1M磷酸鉀，1mMEDTA，PH6.5透析液2透析測(cè)定酶活性。第四步用140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04,1.8mM10^04的PBS緩沖液透析測(cè)定蛋白濃度，用凝血酶水解切割Hise標(biāo)簽，獲得純化的人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶hGSTpi。方法二第一步將含表達(dá)載體pET-28a/hGSTpi的E.co7iBL21/DE3菌株接種于含卡那霉素IOOmg/L的LB固體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨IOg,酵母提取物5g，NaCl10g,瓊脂15g，用去離子水定容至1升，36-38""C振蕩培養(yǎng)12h,挑單菌落接種于含卡那霉素100mg/LLB液體培養(yǎng)基，每升培養(yǎng)基含胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，用去離子水定容至l升，36-38'C振搖培養(yǎng)16h，然后取1mL接種到100raLLB液體培養(yǎng)基，37。C振搖培養(yǎng)24h，OD朋。達(dá)到0.50.6時(shí)，加異丙基P-半乳糖苷至終濃度為0.4mM,繼續(xù)振搖培養(yǎng)4-5h,12，500g離心10min收集菌體；第二步按每g菌體沉淀加5mL140mMNaCl，2.7mMKC1，10mMNa2HP04，1.8mMKH2P04的PBS緩沖液重懸誘導(dǎo)表達(dá)后收集的菌體沉淀，經(jīng)超聲破碎后，12,500g,4'C離心15min后取上清，將上清與谷胱甘肽親和層析柱GlutathioneS印harose4B36-38°C結(jié)合30min，PBS緩沖液洗滌柱3次，用含50mMTris-HC1:pH8.0，10raM谷胱甘肽的洗脫液洗脫2次。第三步合并3次洗脫液上清，用PBS緩沖液透析。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖l可以看出，釆用以上方法純化得到的人谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(hGSTpi)重組蛋白純度高、產(chǎn)量高，且空氣氧化形成的無(wú)活性二聚體少。實(shí)施例2、GSTpi對(duì)LPS所致小鼠死亡率的影響1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料LPS(Sigma)使用時(shí)用IXPBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用IXPBS配制；無(wú)菌注射器；雄性清潔級(jí)ICR小鼠購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)。2)實(shí)驗(yàn)步驟取雄性20土2gICR小鼠腹腔注射LPS(37.5mg/kg)后30min，分別腹腔給藥GSTpi(2mg/kg)，觀察并記錄LPS組和LPS+GSTpi組小鼠的存活率。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖1可以看出GSTpi可以提高LPS引起小鼠炎癥后的存活率。LPS刺激40小時(shí)后，LPS組小鼠存活率僅有30X而腹腔給予GSTpi后，小鼠存活率提高到了60%(LPS+GSTpi組)。表l.QSTpi別t"LPS引起炎近巨后<、鼠存活^^的影響(％)0510152025303540455055606570LPS100100100958080707070707070707070LPS+GSTpi100100100957545353030303030303030動(dòng)物數(shù)每組20只。實(shí)施例3、GSTpi對(duì)LPS所致炎癥小鼠血清中NO含量的影響1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料LPS(Sigma)使用時(shí)用1XPBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用1XPBS配制；無(wú)菌注射器；雄性清潔級(jí)ICR小鼠購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)；NO試劑盒(硝酸還原酶法)，購(gòu)于南京建成生物。2)實(shí)驗(yàn)步驟取雄性20士2gICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立內(nèi)毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi組腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M組腹腔注射GSTpi的4M變體，分別在4、8和12小時(shí)眼眶取血采集小鼠血液樣本，1000rpm/min離心取血清，參照NO試劑盒方法，檢測(cè)血清中NO含量。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖2可以看出，LPS引起動(dòng)物炎癥反應(yīng)后，血清中NO含量顯著升高且隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，NO含量持續(xù)升高。GSTpi可以抑制NO的分泌，在12小時(shí)顯示了顯著的抑制效果；相反，GSTpi的4M變體則不具有這種抑制作用，該組動(dòng)物血清中NO含量與LPS組無(wú)顯著差異。^\-__^間(h)4812LPS112.42±86.181061.11±33.921884.7±40.87LPS+GSTpi265.62±46.551123.40±64.931327.45±131.77*LPS+GSTpi4Mmutant229.80±14.461052.81±106.901688.37±100.39結(jié)果由均值土標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P<0.05，與LPS組比較，n=5。實(shí)施例4、GSTpi對(duì)LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料LPS(Sigma)使用時(shí)用IXPBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用IXPBS配制；3%戊巴比妥鈉；無(wú)菌注射器；雄性清潔級(jí)ICR小鼠購(gòu)于南京醫(yī)科大學(xué)；'MPO試劑盒，購(gòu)于南京建成生物。2)實(shí)驗(yàn)步驟選取雄性20g左右ICR小鼠，腹腔注射LPS(37.5mg/kg)建立內(nèi)毒素休克模型，30min后，LPS+GSTpi組腹腔注射GSTpi(2mg/kg)而LPS+4M組腹腔注射GSTpi的4M變體，分別在4、8、12和16小時(shí)麻醉動(dòng)物打開(kāi)胸腔，剪開(kāi)左心房后經(jīng)右心室注入100ml生理鹽水沖洗肺部，待沖洗干凈后摘取肺。玻璃勻漿器研磨后用超聲破碎儀破碎細(xì)胞，參照MPO試劑盒檢方法，測(cè)肺組織勻漿中MPO活性。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3可以看出，LPS引起動(dòng)物炎癥反應(yīng)后，肺部MPO活性顯著升髙且隨著LPS刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，MPO活性持續(xù)升髙。GSTpi可以抑制MP0活性，LPS刺激動(dòng)物后30min腹腔注射GSTpi后動(dòng)物肺部MPO活性被抑制，在4、8、12和16小時(shí)均有顯著抑制效果。相反，GSTpi的4M變體的這種抑制作用要小的多，在LPS的刺激下，該組動(dòng)物肺部MPO活性仍然趨于升高。表3.GSTpi對(duì)LPS所致炎癥小鼠肺部MPO活性的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果由均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示，**P<0.01，與LPS組比較，n=5。實(shí)施例5:WesternBlotting檢測(cè)GSTpi、Y7F對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞iNOS合成的抑制作用1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料電泳儀BioRad;LPS(Sigma)使用時(shí)用IXPBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用IXPBS配制，GSTpiY7F變體(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用IXPBS配制；培養(yǎng)液DMEM(GIBCO);血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7細(xì)胞系購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所。2)實(shí)驗(yàn)步驟將RAW264.7細(xì)胞以105個(gè)/孔的密度接種于24孔板。細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%(:02條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80%時(shí)，加入終濃度為100ng/ml的LPS,30分鐘后，加入終濃度分別為5ug/ml的GSTpi或Y7F,以未經(jīng)處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后棄上清，冷PBS洗兩遍，冰上裂解細(xì)胞30min，裂解液4°C15000Xg15min取上清。WesternBlotting檢測(cè)iNOS蛋白量。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4可以看出未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞無(wú)iNOS表達(dá)，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞iNOS表達(dá)量明顯增高，而加入GSTpi后可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)，且表現(xiàn)為劑量依賴性；但是GSTpi變體Y7F由于7位的酪氨酸突變?yōu)楸奖彼幔ッ富?，不能抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的合成。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GSTpi抑制NO合成的機(jī)制是通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的iNOS的表達(dá)且其抑制作用依賴本身酶活。實(shí)施例6:WesternBlotting檢測(cè)GSTpi對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞COX-2合成的抑制作用1)實(shí)驗(yàn)儀器與材料電泳儀BioRad;LPS(Sigma)使用時(shí)用IXPBS配制，GSTpi(本實(shí)驗(yàn)室純化)使用時(shí)用IXPBS配制，培養(yǎng)液DMEM(GIBCO)，血清杭州四季青胎牛血清；RAW264.7細(xì)胞系，購(gòu)于中科院上海細(xì)胞所2)實(shí)驗(yàn)步驟將RAW264.7細(xì)胞以105個(gè)/孔的密度接種于24孔板。細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM中，37°C、5%(]02條件下培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70-80%時(shí)，加入終濃度為100ng/ml的LPS，分別于1、2、4、6、8、IO小時(shí)后，加入終濃度為5yg/ml的GSTpi，以未經(jīng)處理的細(xì)胞為陰性對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)后棄上清，冷PBS洗兩遍，冰上裂解細(xì)胞30min，裂解液4°C15000Xg15min取上清。WesternBlotting檢測(cè)COX-2蛋白量。3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖5可以看出未經(jīng)LPS處理的細(xì)胞無(wú)COX-2表達(dá)，經(jīng)LPS處理后，細(xì)胞COX-2表達(dá)量明顯增高，而加入GSTpi后可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的COX-2的表達(dá)。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明GSTpi可通過(guò)抑制COX-2表達(dá)來(lái)抑制前列腺素的分泌，從而抑制炎癥反應(yīng)及組織損傷。權(quán)利要求1、人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥反應(yīng)綜合癥疾病藥物中的應(yīng)用。2、人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi的新用途，具體涉及采用His-tag重組蛋白純化技術(shù)純化的人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療全身炎癥反應(yīng)綜合癥疾病以及由革蘭氏桿菌引起炎癥性疾病藥物中的應(yīng)用。6xHis-tag標(biāo)簽分子量小，不會(huì)影響被修飾蛋白質(zhì)的生理pH值，在大部分情況下不會(huì)改變被修飾蛋白質(zhì)的免疫原性，結(jié)構(gòu)和功能，也不會(huì)干擾蛋白的分泌；人谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶pi在制備治療炎癥藥物中的應(yīng)用，不僅能有效控制炎癥，避免其進(jìn)一步發(fā)展，而且對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的影響較小，作為一種內(nèi)源性蛋白，給藥后不會(huì)引起免疫反應(yīng)，副作用極小。文檔編號(hào)A61K38/45GK101239184SQ20071030623公開(kāi)日2008年8月13日申請(qǐng)日期2006年7月19日優(yōu)先權(quán)日2006年7月19日發(fā)明者泓張,殷志敏,沈佳胤,宇王,蘭羅申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)