專利名稱：免疫原性制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，并且特別地涉及用于制備針對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)的 疫苗的免疫原性制劑。該制劑包含有在緩沖鹽水溶液中穩(wěn)定化的至少一種重組且減毒的活 分枝桿菌(Mycobacterium)菌株,優(yōu)選地卡介菌(Calmette_Gu6rin bacillus, BCG)菌株， 其關(guān)于一種或多種RSV免疫原性蛋白質(zhì)或片段而言是重組的。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明包括免疫原性制劑，其在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針對(duì)由呼吸道合胞病毒(RSV)引 起的感染的保護(hù)和/或減弱由該病毒引起的病理學(xué)狀態(tài)。本發(fā)明的免疫原性制劑可以用于 制備疫苗，并且包含一定的菌落形成單位(CFU)(例如，IX IO4-I X O9CFU/劑)的活的重組且 減毒的分枝桿菌菌株，優(yōu)選地卡介菌(BCG)菌株，所述菌株重組地或異源地表達(dá)一種或多 種RSV免疫原性蛋白質(zhì)或片段，并且在其使用前通過(guò)冷凍干燥(在4°C至25°C的溫度范圍 內(nèi))或者在穩(wěn)定化鹽水溶液中(在-80°C至4°C的溫度范圍內(nèi))進(jìn)行保存。例如，將免疫原 性制劑重懸浮在稀釋的Sauton SSI溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺， 12.5yg檸檬酸鐵銨，18.4mg 85%甘油，0. 5mg檸檬酸，Iml注射用水)中，并且保存于4°C; 給在 PBS(137mM NaCl, 2. 7mMKCl ；4. 3mM Na2HPO4 ； 1. 47mM KH2PO4, pH 7.4)中的免疫原性制 劑補(bǔ)充以0. 02% Tween 80和20%甘油，并且保存于_80°C ；或者將免疫原性制劑重懸浮在 25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT 0. 5g天冬酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og 葡萄糖/升蒸餾水)中，冷凍干燥，并且保存于4°C至25°C的溫度范圍下。本發(fā)明的免疫原性制劑的重組且減毒的分枝桿菌細(xì)菌包含一個(gè)或多個(gè)編碼來(lái)自 RSV亞型RSV A或RSV B或兩者的至少一種蛋白質(zhì)或免疫原性片段的基因。這些RSV蛋白 質(zhì)或免疫原性片段與來(lái)自RSV的蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、M2 (ORFl)、M2 (0RF2)、L、F或G 相對(duì)應(yīng)，并且以一個(gè)或多個(gè)拷貝插入到細(xì)菌基因組或染色體外質(zhì)粒中，并且它們的表達(dá)受 組成型或誘導(dǎo)型內(nèi)源或外源BCG啟動(dòng)子控制。這些RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段可以由BCG 或其他減毒的分枝桿菌菌株表達(dá)為胞質(zhì)可溶的、分泌至細(xì)胞外的或細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。本發(fā)明中公開(kāi)的免疫原性制劑可以連同包含其他減毒的分枝桿菌或BCG菌株的 免疫原性制劑一起進(jìn)行使用，所述其他減毒的分枝桿菌或BCG菌株在下列方面不同它們 表達(dá)不同的免疫原性RSV蛋白質(zhì)；和/或基因定位(插入到基因組中或者處于染色體外)； 和/或蛋白質(zhì)基因的拷貝數(shù)；和/或誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子；和/或RSV蛋白質(zhì)或免疫原 性片段的目的地(胞質(zhì)可溶的、分泌至細(xì)胞外的或膜結(jié)合的蛋白質(zhì))。前面所描述的免疫原性制劑的減毒的分枝桿菌細(xì)菌來(lái)自處于指數(shù)生長(zhǎng)期或穩(wěn)定 期(相應(yīng)于0.5至1.5的在600nm處的光密度)的分枝桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物，其在緩沖鹽水溶 液(PBS-0. 02% Tween 80 或稀釋的 Sauton SSI 溶液)中。前面所描述的免疫原性制劑可以與緩沖鹽水或生理溶液例如稀釋的Sauton SSI 溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺，12. 5 μ g檸檬酸鐵銨，18. 4mg 85%甘 油，0. 5mg檸檬酸，Iml注射用水)一起以皮下、經(jīng)皮或真皮下形式施用給個(gè)體。
前面所描述的免疫原性制劑可以用于對(duì)先前已與或未與呼吸道合胞病毒相接觸 的個(gè)體進(jìn)行疫苗接種，以便賦予針對(duì)RSV的免疫性。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒(RSV)是全世界幼兒中急性呼吸道感染的主要病原體。根據(jù)WHO， 這種病毒每年感染6千4百萬(wàn)人，其中160，000人死亡(www. who. int)。由這種病毒造成的 感染引起廣泛范圍的臨床癥狀，所述臨床癥狀可以輕至鼻炎或者嚴(yán)重得多例如肺炎或細(xì)支 氣管炎，其中在未斷奶的嬰兒、早產(chǎn)兒、具有先天性心臟病的兒童和免疫抑制的兒童中觀察 到最壞的情況(1-3)。由這種病毒引起的感染完全是頻繁和復(fù)發(fā)的，因?yàn)閷?shí)際上100%的小于3歲的兒 童已具有至少一次RSV感染發(fā)作(4)。因?yàn)檫@種感染不留下完整的免疫記憶(5)，所以再感 染是頻繁的，其中隨著患者年齡增加而嚴(yán)重性降低。由RSV感染引起的健康狀況對(duì)于受影響的國(guó)家產(chǎn)生了高的經(jīng)濟(jì)影響。在發(fā)達(dá)國(guó)家 中所進(jìn)行的研究估計(jì)，這種感染的花費(fèi)超過(guò)3，000歐元/患者(6)，其中最高限度達(dá)到高至 8，400 歐元(6)。RSV是具有脂質(zhì)外殼的負(fù)、不分節(jié)段、單鏈RNA病毒，其屬于副粘病毒科的肺病毒 屬(在(7)中進(jìn)行了綜述)。RSV具有約15kb的基因組，其編碼總共11種蛋白質(zhì)。這些蛋 白質(zhì)中的5種具有結(jié)構(gòu)功能，相應(yīng)于跨膜F、G和SH蛋白，核衣殼N蛋白，和基質(zhì)M蛋白。其 他4種蛋白質(zhì)，M2-1、M2-2、P和L，參與病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。其余的2種蛋白質(zhì)(稱為NSl 和NS2)是非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，并且它們看起來(lái)參與毒力(8)。感染人的RSV具有不同的毒株或亞群，其中亞群A和B是在群體中占優(yōu)勢(shì)的那些 (在(9)中進(jìn)行了綜述)。在亞群之間的主要抗原差異與蛋白G相關(guān)，其在不同亞群之間僅 保留40-44%的其氨基酸(9)。第一種針對(duì)RSV的疫苗在20世紀(jì)60年代進(jìn)行了測(cè)試，并且包含經(jīng)福爾馬林滅活 的完整病毒(RSV-FI)，其在明礬佐劑存在下經(jīng)肌內(nèi)進(jìn)行施用(10)。與預(yù)期的結(jié)果相反，在 經(jīng)疫苗接種的兒童中，在RSV感染后，這種免疫接種引起嚴(yán)重得多的呼吸病例，這導(dǎo)致其中 的80%住院和2例死亡(11)。由經(jīng)疫苗接種的兒童所呈現(xiàn)出的呼吸-肺臨床癥狀的特征 在于罕見(jiàn)的嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，連同高滴度的補(bǔ)體結(jié)合性抗體(11)。由于 RSV感染而死亡的、用RSV-FI進(jìn)行疫苗接種的兒童的受侵襲肺組織的分析顯示出在支氣管 周圍區(qū)域中補(bǔ)體沉積、免疫復(fù)合物和嗜酸性粒細(xì)胞的存在(12)。連同這點(diǎn)，動(dòng)物研究證明， 用RSV-FI進(jìn)行的疫苗接種產(chǎn)生基于T CD4+淋巴細(xì)胞的Th2-型免疫應(yīng)答，其具有與已用蛋 白G進(jìn)行免疫接種(13)或者接受對(duì)于該蛋白質(zhì)特異的T CD4+淋巴細(xì)胞(在RSV感染前) 的動(dòng)物中所觀察到的那些相同的特征。因此之故，為了配制有效且安全的針對(duì)RSV的疫苗， 必須充分研究針對(duì)這種病毒的不同蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，以便鑒定能夠誘導(dǎo)基于干擾 素-Y (IFN- γ )產(chǎn)生性和細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞的Thl-型免疫應(yīng)答的那些。關(guān)于針對(duì)RSV的疫苗的當(dāng)前研究已集中于分析和開(kāi)發(fā)病毒亞單位，例如蛋白 F(14)、M2(15)以及某些保守的蛋白G區(qū)段(16)。另一方面，已研究了基于突變型RSV病 毒毒株的疫苗的產(chǎn)生，所述突變型RSV病毒毒株例如為對(duì)于溫度敏感的(17)、在某些基因 中具有缺失(18)或者關(guān)于細(xì)胞因子例如GM-CSF而言重組的(19)那些。這些疫苗中的一 些已在I和II期臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了測(cè)試，它們具有可變的結(jié)果(20-22)。其他推定的針對(duì)
4RSV的疫苗由基于蛋白F和G的疫苗的組代表，其用佐劑例如ISCOMs進(jìn)行施用。當(dāng)新的病 毒感染形成時(shí)，用這種類型的疫苗進(jìn)行的免疫接種產(chǎn)生增加的在肺組織中的嗜酸性粒細(xì)胞 浸潤(rùn)(23)，這增加了對(duì)肺組織的損害。幼兒的免疫系統(tǒng)的特征在于優(yōu)先發(fā)展出Th2_型免疫應(yīng)答，其可能由在生命的前6 個(gè)月期間免疫系統(tǒng)未成熟引起(24，25)。然而，如果經(jīng)適當(dāng)刺激，那么免疫系統(tǒng)可以呈現(xiàn)出 Thl-型應(yīng)答(26)。為了配制有效且安全的針對(duì)RSV的疫苗，必須充分研究針對(duì)這種病毒 的不同蛋白質(zhì)所產(chǎn)生的免疫應(yīng)答，以便鑒定能夠誘導(dǎo)基于細(xì)胞毒性T-淋巴細(xì)胞的Thl-型 免疫應(yīng)答的那些。使用細(xì)菌載體來(lái)異源表達(dá)病毒抗原具有下述優(yōu)點(diǎn)，即這些細(xì)菌載體可以 用作減毒的活載體，因?yàn)樗鼈兙哂型暾那秩肽芰Σ⑶夜J(rèn)為非病原性的。用于表達(dá)異 源抗原的某些細(xì)菌載體的另外優(yōu)點(diǎn)是其已知的誘導(dǎo)Thl-型免疫性的能力(27，28)，這對(duì) 于開(kāi)發(fā)針對(duì)RSV的疫苗的情況是非常有吸引力的(29)?？ń榫?BCG)是減毒的牛分枝桿 菌(Mycobacterium bovis)菌株，其用作針對(duì)新生兒中的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的疫苗。從BCG被批準(zhǔn)作為針對(duì)結(jié)核病的疫苗起，這已施用給全世界超過(guò) 3. 3萬(wàn)億人。通過(guò)這些細(xì)菌的許多有利特征(例如，其在冷凍干燥形式下的高熱穩(wěn)定性)而 促進(jìn)了它的大規(guī)模使用。此外，用這種細(xì)菌對(duì)新生兒進(jìn)行免疫接種是無(wú)風(fēng)險(xiǎn)的，并且僅產(chǎn)生 最低限度的副作用。BCG是高度免疫原性的，并且僅1劑就能夠產(chǎn)生長(zhǎng)期維持的免疫應(yīng)答。 重要的是，BCG在成人和兒童中誘導(dǎo)強(qiáng)有力的Thl-型免疫應(yīng)答(30)。在新生兒中通過(guò)針對(duì) 結(jié)核分枝桿菌的抗原(PPD)而產(chǎn)生的細(xì)胞類型免疫應(yīng)答(其能夠在延長(zhǎng)的時(shí)期期間存在) 而證明了這種現(xiàn)象(30)。迄今為止，幾種細(xì)菌、寄生蟲(chóng)和病毒抗原已在這種細(xì)菌系統(tǒng)中成功表達(dá)，當(dāng)在動(dòng)物 模型中進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，這被證實(shí)誘導(dǎo)了針對(duì)這些抗原的體液和細(xì)胞免疫(31，32)。此外，BCG 具有不被母乳中存在的抗體中和的特性，并因此它可以在未斷奶的嬰兒中用作免疫性誘導(dǎo) 物。本發(fā)明涉及免疫學(xué)制劑，其包含關(guān)于RSV蛋白質(zhì)而言重組的一種或多種減毒的分枝桿 菌細(xì)菌菌株，優(yōu)選地BCG菌株，并且可以用于制備針對(duì)這種病毒的疫苗。該制劑旨在避免或減弱由RSV感染引起的肺損害，這是由于產(chǎn)生了有利于去除病 毒的有效免疫應(yīng)答。因?yàn)闇p毒的分枝桿菌菌株例如BCG是強(qiáng)有力的Thl-型免疫應(yīng)答誘導(dǎo) 物，所以由關(guān)于RSV而言重組的BCG菌株所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答促成了針對(duì)由這種病毒引起的 感染的保護(hù)。附圖簡(jiǎn)述

圖1為用于評(píng)估在BCG菌株中來(lái)自RSV的蛋白N的表達(dá)的免疫印跡(Western 印跡)測(cè)定法。這種減毒的分枝桿菌菌株包含單個(gè)拷貝的來(lái)自RSV的蛋白N基因，其插 入到細(xì)菌基因組中從而處于組成型hsp60啟動(dòng)子的控制下，并且以組成型形式由所述細(xì) 菌表達(dá)。從總細(xì)菌提取物的可溶性級(jí)分中獲得所述蛋白質(zhì)。對(duì)于用質(zhì)粒PMV361-N轉(zhuǎn)化 的并且于 _80°C 保存在 PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)-0. 05% Tween 80-20%甘油溶液中的多個(gè)BCG克隆施行蛋白質(zhì)提取。使用針對(duì)來(lái)自 RSV的蛋白N而產(chǎn)生的兔多克隆抗體來(lái)檢測(cè)所述蛋白質(zhì)的存在；(+)是陽(yáng)性測(cè)定法對(duì)照，包 含0. 25 μ g的重組蛋白N ；(-)是陰性測(cè)定法對(duì)照，包含25 μ g的來(lái)自未用pMV361-N轉(zhuǎn)化的 BCG菌株的蛋白質(zhì)；泳道1-5是25 μ g的來(lái)自用pMV361-N轉(zhuǎn)化的BCG克隆的蛋白質(zhì)。可以 得出結(jié)論，當(dāng)將基因插入到細(xì)菌基因組中從而處于組成型啟動(dòng)子的控制下時(shí)，來(lái)自RSV的蛋白N在BCG中成功表達(dá)。圖 2 為用于評(píng)估在于 _80°C保存在 PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ； 1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)-0. 05% Tween 80-20%甘油溶液中的BCG菌株中來(lái)自RSV的蛋白 M2的表達(dá)的免疫印跡(Western印跡)測(cè)定法。這種減毒的分枝桿菌BCG菌株包含單個(gè)拷 貝的來(lái)自RSV的蛋白M2基因，其插入到細(xì)菌基因組中從而處于組成型hsp60啟動(dòng)子的控 制下，并且以組成型形式由所述細(xì)菌表達(dá)。從總細(xì)菌提取物的可溶性級(jí)分中獲得所述蛋白 質(zhì)。對(duì)于用質(zhì)粒PMV361-M2轉(zhuǎn)化的BCG克隆施行蛋白質(zhì)提取。使用針對(duì)來(lái)自RSV的蛋白 M2而產(chǎn)生的兔多克隆抗體來(lái)檢測(cè)所述蛋白質(zhì)的存在；(+)是陽(yáng)性測(cè)定法對(duì)照，包含0. 25 μ g 的被RSV感染的HEp-2細(xì)胞的總裂解物；㈠是陰性測(cè)定法對(duì)照，包含25 μ g的來(lái)自未用 PMV361-M2轉(zhuǎn)化的BCG菌株的蛋白質(zhì)；泳道1-3是25 μ g的來(lái)自用pMV361_M2轉(zhuǎn)化的BCG克 隆的蛋白質(zhì)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，當(dāng)將基因插入到細(xì)菌基因組中從而處于組成型啟動(dòng)子的控制 下時(shí)，來(lái)自RSV的蛋白M2在BCG中成功表達(dá)。圖 3 顯示了來(lái)自用在鹽水溶液(PBS :137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；
1.47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80，pH 7. 4，在4°C下)中的表達(dá)蛋白N的BCG進(jìn)行免疫接種 的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞的⑶8+-⑶69+細(xì)胞百分比(A)和IFN-γ分泌(33)。將來(lái)自動(dòng)物 脾臟的5 X IO5個(gè)細(xì)胞用0. 5 μ M來(lái)自RSV的蛋白N刺激72小時(shí)，所述動(dòng)物未經(jīng)免疫接種， 或者用IXlO7PFU的RSV進(jìn)行免疫接種、用BCGdXlO8CFU/小鼠，在PBS中:137mM NaCl ；
2.7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80，pH 7. 4，4°C )進(jìn)行免疫接種、 或用關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白N而言重組的BCGdXlO8CFU/小鼠，在PBS中137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80,pH 7. 4，4°C )進(jìn)行免疫接種。隨后， 通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)來(lái)測(cè)定關(guān)于CD8和CD69標(biāo)志物而言陽(yáng)性的細(xì)胞的百分比(A)。對(duì)細(xì)胞上清 液實(shí)施ELISA，以檢測(cè)分泌出的IFN- γ的存在(33)。**，0. 002的ρ值，Student’ s t_檢 驗(yàn)?？梢缘贸鼋Y(jié)論，關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白N而言重組的BCG菌株在用這種免疫原性制劑進(jìn) 行免疫接種的小鼠中引起有利的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。作為對(duì)于用重組蛋白N進(jìn)行的攻擊的應(yīng) 答，這些T淋巴細(xì)胞被激活，在其表面上表達(dá)激活標(biāo)志物(⑶69+)，并且將IFN-γ分泌到細(xì) 胞外介質(zhì)中。圖4顯示了關(guān)于BALB/c小鼠的體重變化曲線，所述BALB/c小鼠用關(guān)于來(lái)自RSV 的蛋白 N 而言重組的 BCG 菌株(IX IO8CFU/小鼠，在 PBS 中:137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80,pH 7. 4，4°C )或者用關(guān)于來(lái)自 RSV 的蛋白 M2 而 言重組的 BCG 菌株(1 X IO8CFU/ 小鼠，在 PBS 中:137mM NaCl ；2. 7mMKCl ；4. 3mM Na2HPO4 ； 1. 47mM KH2PO4jO. 02% Tween 80，pH 7. 4,4°C )進(jìn)行免疫接種。用 1 X IO7PFU 的 RSV，毒株 13018-8，經(jīng)鼻內(nèi)感染BALB/c小鼠，所述BALB/c小鼠未經(jīng)疫苗接種(■)，或者用IXlO7噬 斑形成單位(PFU)的通過(guò)紫外線(UV燈，312nm, 8瓦特功率)20分鐘滅活的RSV (RSV-UV)進(jìn) 行免疫接種(▲)，或者用不表達(dá)RSV蛋白質(zhì)的野生型(WT)BCG菌株(IXlO8CFU/小鼠，在 PBS 中137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80，ρΗ7· 4， 4°C )進(jìn)行免疫接種(▼),或者用由pMV361-N轉(zhuǎn)化的BCG菌株(1 X IO8CFU/小鼠，在PBS 中137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80，pH 7. 4 A°C) 進(jìn)行免疫接種(□)，或者用由PMV 361-M2轉(zhuǎn)化的BCG菌株(1 X IO8CFU/小鼠，在PBS中 137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80,pH 7. 4，4°C )進(jìn)
6行免疫接種(Δ)。作為對(duì)照，包括了未經(jīng)疫苗接種且未感染的小鼠的組(·)。每天記錄 相對(duì)于第0天而言的體重的變化，持續(xù)4天。**，0.002的P值，Student’ S t_檢驗(yàn)。可以 得出結(jié)論，用關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白N或蛋白M2而言重組的BCG菌株進(jìn)行的小鼠免疫接種誘 導(dǎo)了有利的針對(duì)RSV感染的應(yīng)答，因?yàn)楫?dāng)與其中觀察到體重減少的未經(jīng)疫苗接種的小鼠的 體重相比較時(shí)，這些小鼠的體重卻沒(méi)有顯著地發(fā)生變化。圖5顯示了來(lái)自BALB/c小鼠的代表性的肺組織學(xué)切片，所述BALB/c小鼠經(jīng)免疫 接種并且用IXlO7PFU的RSV(毒株13018-8)經(jīng)鼻內(nèi)進(jìn)行感染。(A-B)，未感染的小鼠的 肺；(C-D)，用RSV感染的未經(jīng)免疫接種的小鼠的肺；(E-F)，針對(duì)RSV進(jìn)行免疫接種并且用 RSV感染的小鼠的肺；(G-H)，用關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白N而言重組的BCG (1 X IO8CFU/小鼠，在 PBS 中137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mMNa2HP04 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80，ρΗ 7. 4， 于4°C )進(jìn)行免疫接種的小鼠；和用關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白M2而言重組的BCG(1 X IO8CFU/小 鼠，在PBS 中137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4,0. 02% Tween 80,ρΗ 7. 4，于4°C)進(jìn)行免疫接種的小鼠。右邊的圖版相應(yīng)于放大40X的顯微照片，而左邊的圖 版相應(yīng)于放大100X的顯微照片，其中用顯示上皮肺細(xì)胞中病毒蛋白質(zhì)的存在的多克隆抗 RSV抗體-HRP(USBiologicaIs)進(jìn)行標(biāo)記。受感染的肺細(xì)胞更暗(由箭頭來(lái)指示)?？梢?得出結(jié)論，用關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白N而言重組的BCG菌株進(jìn)行免疫接種的小鼠發(fā)展出有利 的針對(duì)RSV感染的T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。在RSV感染后，與未經(jīng)免疫接種的動(dòng)物相比較而言，在 來(lái)自經(jīng)疫苗接種的小鼠的肺中可以觀察到更少的細(xì)胞浸潤(rùn)。此外，與對(duì)照相比較而言，在用 關(guān)于來(lái)自RSV的蛋白N而言重組的BCG菌株進(jìn)行疫苗接種的小鼠中觀察到更少數(shù)目的被病 毒感染的肺細(xì)胞。發(fā)明詳述本發(fā)明包括可以用于制備疫苗的免疫原性制劑，所述疫苗在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)針 對(duì)由呼吸道合胞病毒(RSV)引起的感染的保護(hù)和/或減弱由該病毒引起的病理學(xué)狀態(tài)。 本發(fā)明的免疫原性制劑可以用于制備疫苗，并且包含一定的菌落形成單位(CFU)(例如， IX IO4-I X IO9CFU/劑)的活的重組且減毒的分枝桿菌菌株，優(yōu)選地卡介菌(BCG)菌株(例 如，Pasteur或Danish BCG菌株(34)，美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，www, atcc. on ，ATCC編號(hào) 分別為35734和35733)，所述菌株重組地或異源地表達(dá)一種或多種RSV免疫原性蛋白質(zhì)或 片段，并且在其使用前通過(guò)冷凍干燥或者在穩(wěn)定化鹽水中進(jìn)行保存。例如，將免疫原性制劑 在稀釋的 Sauton SSI 溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺，12. 5 μ g 檸檬 酸鐵銨，18. 4mg 85%甘油，0. 5mg檸檬酸，在Iml H2O中)中于4°C進(jìn)行保存；將免疫原性制 劑在補(bǔ)充有 0. 02% Tween 80 和 20%甘油的 PBS(137mM NaCl, 2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ； 1. 47mM KH2PO4, ρΗ 7. 4)中于_80°C進(jìn)行保存；或者將免疫原性制劑重懸浮在25體積％的 乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0. 5g天冬 酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1.5g檸檬酸鎂；0.5g硫酸鉀；0.5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/ 升蒸餾水)中，冷凍干燥，并且保存于4°C至25°C的溫度范圍下。本發(fā)明的免疫原性制劑的重組且減毒的分枝桿菌細(xì)菌包含編碼來(lái)自RSV亞型RSV A或RSV B或兩者的至少一種蛋白質(zhì)或免疫原性片段的基因。呼吸道合胞病毒的基因組先 前已在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了描述，具有登錄號(hào)gl_9629367和gl_9629198。這些來(lái)自 RSV的免疫原性蛋白質(zhì)或片段與來(lái)自RSV的蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(0RF1)、M2(0RF2)、
7L、F或G相對(duì)應(yīng)，并且包含在質(zhì)粒PMV361中(37)，所述質(zhì)粒pMV361根據(jù)先前所描述的技 術(shù)通過(guò)電轉(zhuǎn)化而摻入到細(xì)菌中(35)，并且通過(guò)分枝桿菌噬菌體整合酶的作用而隨之摻入到 細(xì)菌基因組中(36)。這些基因還可以存在于染色體外質(zhì)粒例如pMV261中(37)，所述質(zhì)粒 PMV261根據(jù)先前所描述的技術(shù)通過(guò)電轉(zhuǎn)化而摻入到分枝桿菌中(35)，并且以染色體外的 形式維持在細(xì)菌中(36)。這些基因可以以單個(gè)或多個(gè)拷貝存在，并且其表達(dá)受組成型或誘 導(dǎo)型(例如，分別為hsp60基因啟動(dòng)子和acr基因啟動(dòng)子)內(nèi)源BCG啟動(dòng)子(例如，來(lái)自 BCG的hsp60基因啟動(dòng)子)指揮。這些RSV免疫原性蛋白質(zhì)或片段可以由BCG或其他減毒 的分枝桿菌菌株表達(dá)為胞質(zhì)可溶的、分泌至細(xì)胞外的或膜結(jié)合的形式，這是由于將呼吸道 合胞病毒基因或其免疫原性片段與編碼充當(dāng)朝向不同細(xì)菌區(qū)室的蛋白質(zhì)目的地信號(hào)的肽 (例如，α “抗原基因的N-末端序列，其用于細(xì)胞外分泌；和19-kDa蛋白基因的N-末端序 列，其用于膜結(jié)合蛋白質(zhì))的DNA序列相融合。本發(fā)明中公開(kāi)的免疫原性制劑可以連同包含一種或多種在下列方面不同的減毒 的分枝桿菌或BCG菌株的免疫原性制劑一起進(jìn)行使用它們表達(dá)不同的免疫原性RSV蛋白 質(zhì)；和/或基因定位(插入到基因組中或者處于染色體外)；和/或蛋白質(zhì)基因的拷貝數(shù)； 和/或誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)的啟動(dòng)子；和/或RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段的目的地(胞質(zhì)可溶 的、分泌至細(xì)胞外的或膜結(jié)合的蛋白質(zhì))。前面所描述的免疫原性制劑的減毒的分枝桿菌細(xì)菌來(lái)自處于指數(shù)生長(zhǎng)期或 穩(wěn)定期(具有0.5至1.5的在600nm處的光密度)的分枝桿菌細(xì)菌培養(yǎng)物(例如， 在37°C下，在培養(yǎng)基中，其補(bǔ)充有4. 9g/L的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基，Difco，目錄號(hào) 0713-01-7, IX 富集 OADCBeckton Dickinson 介質(zhì)，目錄號(hào) 212351，http://www.bd. com/ ds/productCenter/212351. asp ；5 % 甘油和 0. 05 % Tween 80)，其在緩沖鹽水溶液 (PBS-0. 02% Tween 80，或稀釋的 Sauton SSI 溶液)中。前面所描述的免疫原性制劑可以與緩沖鹽水或生理溶液例如稀釋的Sauton SSI 溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺，12. 5 μ g檸檬酸鐵銨，18. 4mg 85%甘 油，0. 5mg檸檬酸，Iml注射用水)一起以皮下、經(jīng)皮或真皮下形式施用給個(gè)體。前面所描述的免疫原性制劑可以用于對(duì)先前已與或未與呼吸道合胞病毒相接觸 的個(gè)體進(jìn)行疫苗接種，以便賦予針對(duì)這種病毒的免疫性或減弱由其引起的病理學(xué)狀態(tài)。
實(shí)施例下述涉及關(guān)于來(lái)自呼吸道合胞病毒(RSV)的蛋白質(zhì)而言重組的BCG菌株的產(chǎn)生和 使用的實(shí)施例僅是舉例說(shuō)明性的，并不意欲限制本發(fā)明的產(chǎn)生或申請(qǐng)范圍。盡管在下列描 述中使用特定的術(shù)語(yǔ)，但它們的使用僅是描述性的而不是限制性的。實(shí)施例I 免疫原性制劑，其包含IO8個(gè)關(guān)于來(lái)自RSV亞型A的N基因而言重組的 BCG Danish菌株的細(xì)菌。將該基因插入到細(xì)菌基因組中從而處于來(lái)自BCG的內(nèi)源組成型 hsp60啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，并且以胞質(zhì)方式表達(dá)出蛋白質(zhì)。所述免疫原性制劑可以于-80°C 包含在稀釋的 Sauton SSI 溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺，12. 5 μ g 檸檬酸鐵銨，18.4mg 85%甘油，0.5mg檸檬酸，Iml H2O)中。所述制劑還可以以IO8個(gè)細(xì)菌 /100 μ 1的終濃度包含在補(bǔ)充有20%甘油和0. 02% Tween 80的PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mMNa2HP04 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)溶液中，并且保存于_80°C。類似地，可以將所述
8菌株重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g天冬酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中，然后冷凍干燥并保存于25°C。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV361質(zhì)粒的pMV361/N質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn)化BCG Danish菌 株(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，www. atcc. org, ATCC編號(hào)35733),所述pMV361/N質(zhì)粒插入 到細(xì)菌基因組中一次。該質(zhì)粒包含編碼來(lái)自RSV亞型A的蛋白N的基因，其在來(lái)自BCG的 hsp60基因的內(nèi)源組成型啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行表達(dá)。使所得到的重組體菌落進(jìn)行生長(zhǎng)(于 37°C在經(jīng)補(bǔ)充的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基中)直至OD600nm = 1，在4，OOOrpm下離心20分 鐘(Eppendorf 5702/R A-4-38型轉(zhuǎn)子)，并且以IO8個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度重懸浮在補(bǔ) 充有 20%甘油和 0. 02% Tween 80 的 PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7.4)溶液中，并保存于-80°C。類似地，將所述菌株重懸浮在25體積％的乳糖 溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0. 5g天冬酰胺； 5.(^磷酸二氫鉀；1.58檸檬酸鎂；0.58硫酸鉀；0.51111 Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸 餾水)中，然后冷凍干燥并保存于25°C。通過(guò)使用針對(duì)來(lái)自RSV的蛋白N而產(chǎn)生的抗體的 Western印跡測(cè)定法，可以觀察到，這種BCG菌株在細(xì)胞質(zhì)中重組地表達(dá)來(lái)自RSV亞型A的 蛋白N(圖1)。使用用作疫苗的所描述的制劑對(duì)BALB/c小鼠所進(jìn)行的免疫接種賦予這些動(dòng) 物以針對(duì)下述感染的保護(hù)用IO7噬斑形成單位的RSV亞型A的鼻內(nèi)感染(圖4和5)。該 免疫原性制劑能夠賦予針對(duì)來(lái)自RSV亞型A和B的蛋白N的免疫性。實(shí)施例II 免疫原性制劑，其包含5X IO7個(gè)關(guān)于來(lái)自RSV亞型A的N基因而言重 組的BCG Danish菌株的細(xì)菌和5X IO7個(gè)關(guān)于來(lái)自RSV亞型A的M2基因而言重組的BCG Danish菌株的細(xì)菌。在所述免疫原性制劑所包含的細(xì)菌的每一種中，RSV基因以單個(gè)拷貝 插入到細(xì)菌基因組中從而處于來(lái)自BCG的內(nèi)源組成型hsp60啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，并且以胞質(zhì) 方式表達(dá)出蛋白質(zhì)。所述免疫原性制劑可以以IO8個(gè)細(xì)菌/100μ 1的終濃度保存在補(bǔ)充有 20%甘油和0. 02% Tween 80 的PBS(137mMNaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, PH 7.4)中，并且保存于-20°C。類似地，可以將所述菌株重懸浮在25體積％的乳糖溶液以 及補(bǔ)充有葡萄糖和 Tween 80 的 Proskauer and Beck Medium (PBGT 0. 5g 天冬酰胺；5. Og 磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水) 中，然后冷凍干燥并保存于4°C。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV361質(zhì)粒的pMV361/N或pMV361/M2質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn) 化BCG Danish菌株(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，www, atcc. org, ATCC編號(hào)35733)，所述 PMV361/N或pMV361/M2質(zhì)粒插入到細(xì)菌基因組中一次。這些質(zhì)粒分別包含來(lái)自RSV亞型 A的蛋白N和M2基因，所述基因處于來(lái)自BCG的組成型hsp60基因啟動(dòng)子的控制下。使所 得到的重組體菌落進(jìn)行生長(zhǎng)(于37°C在經(jīng)補(bǔ)充的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基中)直至OD6tltlnm =1，在4，OOOrpm下離心20分鐘(Eppendorf 5702/R A-4-38型轉(zhuǎn)子)，并且以IO7個(gè)細(xì)菌 /100 μ 1的終濃度重懸浮在補(bǔ)充有20%甘油和0. 02% Tween 80的PBS (137mMNaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ； 1. 47mM KH2PO4,pH 7.4)溶液中，并保存于_20°C。類似地，可以將所述 菌株重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g天冬酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80;和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中，然后冷凍干燥并保存于4°C。通過(guò)使用針對(duì)來(lái)自RSV
9的蛋白N和M2而產(chǎn)生的抗體的Western印跡測(cè)定法，可以觀察到，這些BCG Danish菌株重 組地表達(dá)來(lái)自RSV亞型A的蛋白N和M2 (圖1和2)。該免疫原性制劑能夠賦予同時(shí)的針對(duì) 來(lái)自RSV亞型A和B的蛋白N和M2的免疫性。實(shí)施例III 免疫原性制劑，其包含IO6個(gè)關(guān)于來(lái)自RSV亞型B的蛋白F的區(qū)段而 言重組的BCG Pasteur菌株的細(xì)菌。該基因以多個(gè)拷貝(2_4個(gè)拷貝/細(xì)菌)以染色體外形 式存在于細(xì)菌中，并且編碼來(lái)自RSV亞型B的蛋白F的片段(從氨基酸5至氨基酸200的 區(qū)段)。該基因的表達(dá)處于編碼來(lái)自BCG的α-抗原蛋白(85kDa)的基因的內(nèi)源組成型啟 動(dòng)子的控制下。此外，由該基因所編碼的蛋白質(zhì)在其N-末端處具有信號(hào)肽HMKKRGLTVAVAGA AILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGTTASPGG,該信號(hào)肽屬于BCG的19kDa蛋白并且誘導(dǎo)其表達(dá) 在細(xì)菌膜處。所述免疫原性制劑在補(bǔ)充有0.02% Tween 80和20%甘油的PBS (137mMNaCl ； 2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)中于 _80°C進(jìn)行保存。類似地，可以將 所述菌株重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g天冬酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中，然后冷凍干燥并保存于4°C。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自PMV261質(zhì)粒的pMV261/F5_2(1(1質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn)化BCG Pasteur菌株(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，www, atcc. org, ATCC編號(hào)35734),所述pMV261/ F5_■質(zhì)粒以多個(gè)拷貝以染色體外形式位于細(xì)菌內(nèi)。該質(zhì)粒編碼在其N-末端處與來(lái)自BCG 的19kDa蛋白的下述信號(hào)肽相融合的來(lái)自RSV亞型B的F基因的片段(從氨基酸5至氨 基酸 200 的區(qū)段)HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGTTASPGG,該信號(hào)肽 誘導(dǎo)所述19kDa蛋白表達(dá)在細(xì)菌膜處。該基因的表達(dá)處于編碼來(lái)自BCG的抗原蛋 白(85kDa)的基因的內(nèi)源組成型啟動(dòng)子的控制下。使所得到的重組體菌落于37°C在經(jīng) 補(bǔ)充的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)直至OD6tltlnm = 1，在4，OOOrpm下離心20分鐘 (Eppendorf 5702/R A-4-38型轉(zhuǎn)子)，并且以IO6個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度重懸浮在補(bǔ)充 有 0.02% Tween 80 和 20 % 甘油的 PBS (137mM NaCl ； 2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ； 1. 47mM KH2PO4,pH 7.4)中。類似地，可以將所述菌株重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡 萄糖和 Tween 80 的 Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g 天冬酰胺；5. Og 磷酸二氫鉀； 1.5g檸檬酸鎂；0.5g硫酸鉀；0.5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中，然后以各 包含IO6個(gè)細(xì)菌的等分試樣進(jìn)行冷凍干燥并保存于4°C。該免疫原性制劑能夠賦予針對(duì)來(lái) 自RSV亞型A和B的蛋白F的免疫性。實(shí)施例IV:免疫原性制劑，其包含IO5個(gè)同時(shí)對(duì)于來(lái)自RSV亞型A的N和M2基因 而言重組的BCG Danish菌株的細(xì)菌。將N基因插入到細(xì)菌基因組中從而處于來(lái)自BCG的 內(nèi)源組成型hsp60啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下，并且以胞質(zhì)方式表達(dá)出蛋白質(zhì)。M2基因以多個(gè)拷貝 (2-4個(gè)拷貝/細(xì)菌)以染色體外形式存在于細(xì)菌中，并且處于編碼來(lái)自BCG的α-抗原蛋 白(85kDa)的基因的內(nèi)源組成型啟動(dòng)子的控制下。由M2基因所編碼的蛋白質(zhì)在其N-末端 處具有來(lái)自 BCG 的 19kDa 蛋白的信號(hào)肽HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGSGETTTTAAGT TASPGG，該信號(hào)肽誘導(dǎo)所述19kDa蛋白表達(dá)在細(xì)菌膜上。將所述免疫原性制劑保存于4°C， 由重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g天冬酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)的細(xì)菌進(jìn)行冷凍干燥，冷凍干燥并保存于4V。類似地，可以將所述菌株以IO5個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度保存在補(bǔ)充有0. 02% Tween 80和20%甘 油的 PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mMNa2HP04 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)溶液中。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV 361質(zhì)粒的pMV361/N質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn)化BCG Danish 菌株(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,www, atcc. org,ATCC編號(hào)35733) Jif^pMV 361/N質(zhì)粒插 入到細(xì)菌基因組中一次。該質(zhì)粒包含編碼來(lái)自RSV亞型A的蛋白N的基因，其在來(lái)自BCG的 hsp60基因的內(nèi)源組成型啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行表達(dá)。在評(píng)估出所得到的BCG菌株關(guān)于來(lái)自 RSV的蛋白N而言是重組的之后，通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV206質(zhì)粒的pMV206/M2質(zhì)粒 (37)轉(zhuǎn)化所述BCG菌株，所述pMV206/M2質(zhì)粒以多個(gè)拷貝以染色體外形式位于細(xì)菌內(nèi)。由 M2基因所編碼的蛋白質(zhì)在其N-末端處具有信號(hào)肽HMKKRGLTVAVAGAAILVAGLSGCSSNKSTTGS GETTTTAAGTTASPGG，該信號(hào)肽屬于BCG的19kDa蛋白并且誘導(dǎo)其表達(dá)在細(xì)菌膜處。使所得 到的重組體菌落于37°C在經(jīng)補(bǔ)充的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)直至OD6tltlnm = 1， 在4，OOOrpm下離心20分鐘(Eppendorf 5702/R A-4-38型轉(zhuǎn)子)，并且以IO5個(gè)細(xì)菌/Iml 的終濃度重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡萄糖和Tween 80的Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g天冬酰胺；5. Og磷酸二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中。最后，對(duì)具有IO5個(gè)細(xì)菌的l_ml等分試樣進(jìn) 行冷凍干燥，并且保存于4°C。類似地，可以將所述菌株以IO5個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度保 存在補(bǔ)充有 0. 02% Tween 80 和 20%甘油的 PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mMNa2HP04 ； 1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)溶液中。該免疫原性制劑能夠賦予針對(duì)來(lái)自RSV亞型A和B的蛋 白N和M2的免疫性。實(shí)施例V 免疫原性制劑，其包含IO4個(gè)關(guān)于來(lái)自RSV亞型A的N基因而言重組的 BCG Danish菌株的細(xì)菌。該基因以單個(gè)拷貝插入到細(xì)菌基因組中從而處于來(lái)自BCG的誘導(dǎo) 型內(nèi)源啟動(dòng)子acr的調(diào)節(jié)下，所述啟動(dòng)子響應(yīng)于一氧化氮、低氧濃度和穩(wěn)定生長(zhǎng)期而變得 具有活性。該蛋白質(zhì)表達(dá)是細(xì)胞質(zhì)的。所述免疫原性制劑在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ) 充有葡萄糖和 Tween 80 的 Proskauer and Beck Medium (PBGT 0. 5g 天冬酰胺；5. Og 磷酸 二氫鉀；1. 5g檸檬酸鎂；0. 5g硫酸鉀；0. 5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中進(jìn) 行冷凍干燥，在稀釋的Sauton SSI溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺， 12. 5 μ g檸檬酸鐵銨，18. 4mg 85%甘油，0. 5mg檸檬酸，在Iml H2O中)中于25°C進(jìn)行保存。 類似地，可以將所述菌株以IO4個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度保存在補(bǔ)充有0. 02% Tween 80和 20%甘油的 PBS(137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)溶液中。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV 361質(zhì)粒的pMV361Pa /N質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn)化BCG Danish 菌株(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，www, atcc. orR, ATCC編號(hào)35733)，所述pMV361P_/N質(zhì) 粒插入到細(xì)菌基因組中一次。該質(zhì)粒包含編碼來(lái)自RSV亞型A的蛋白N的基因，其在來(lái)自 BCG的內(nèi)源誘導(dǎo)型acr啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行表達(dá)。使所得到的重組體菌落進(jìn)行生長(zhǎng)(于 37°C在經(jīng)補(bǔ)充的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基中)直至OD600nm = 1，在4，OOOrpm下離心20分 鐘(Eppendorf 5702/R A-4-38型轉(zhuǎn)子)，并且重懸浮在25體積％的乳糖溶液以及補(bǔ)充有葡 萄糖和 Tween 80 的 Proskauer and Beck Medium (PBGT :0· 5g 天冬酰胺；5. Og 磷酸二氫鉀； 1.5g檸檬酸鎂；0.5g硫酸鉀；0.5ml Tween 80 ；和10. Og葡萄糖/升蒸餾水)中。最后，對(duì) 具有IO4個(gè)細(xì)菌的1-ml等分試樣進(jìn)行冷凍干燥，并且保存于25°C。類似地，可以將所述菌株 以IO8個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度保存在補(bǔ)充有0.02% Tween 80和20%甘油的PBS (137mMNaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)溶液中。該免疫原性制劑能夠賦 予針對(duì)來(lái)自RSV亞型A和B的蛋白N的免疫性。實(shí)施例VI 免疫原性制劑，其包含IO9個(gè)關(guān)于來(lái)自RSV亞型A的N基因而言重組的 BCG Danish菌株的細(xì)菌。將該基因插入到細(xì)菌基因組中從而處于外源T7-噬菌體啟動(dòng)子 的調(diào)節(jié)下，以用于在共表達(dá)T7-噬菌體聚合酶的BCG菌株中進(jìn)行組成型表達(dá)。該蛋白質(zhì)表 達(dá)是細(xì)胞質(zhì)的。所述免疫原性制劑包含在稀釋的Sauton SSI溶液(125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺，12. 5 μ g檸檬酸鐵銨，18. 4mg 85%甘油，0. 5mg檸檬酸，在Iml H2O 中)中并且保存于-20°C，或者可以進(jìn)行冷凍干燥并且保存于4°C。類似地，可以將所述菌株 以IO9個(gè)細(xì)菌/100 μ 1的終濃度保存在補(bǔ)充有0.02% Tween 80和20%甘油的PBS (137mM NaCl ；2. 7mM KCl ；4. 3mM Na2HPO4 ；1. 47mM KH2PO4, pH 7. 4)溶液中。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV361質(zhì)粒的pMV361PT7/N質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn)化BCG Danish 菌株(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,www, atcc. org,ATCC編號(hào)35733),所沭pMV361m/N質(zhì)粒插 入到細(xì)菌基因組中一次。該質(zhì)粒包含編碼來(lái)自RSV亞型A的蛋白N的基因，其在通過(guò)T7-噬 菌體聚合酶的表達(dá)而被激活的T7啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下進(jìn)行表達(dá)(39)。通過(guò)電轉(zhuǎn)化(35)用衍生自pMV261質(zhì)粒的PMV261Amp/PolT7質(zhì)粒(37)轉(zhuǎn)化所得到 的BCG菌株，所述PMV261-/P01T7質(zhì)粒以多個(gè)拷貝以染色體外形式位于細(xì)菌內(nèi)。在該質(zhì)粒 中，針對(duì)抗生素卡那霉素的抗性(40)已被針對(duì)潮霉素(Hygr)的抗性替代。來(lái)自T7噬菌 體的T7聚合酶處于來(lái)自BCG的hsp60的組成型啟動(dòng)子的控制下。使所得到的重組體菌落 于37°C在經(jīng)補(bǔ)充的Middlebrock 7H9培養(yǎng)基中進(jìn)行生長(zhǎng)直至OD6tltlnm = 1，在4，OOOrpm下 離心20分鐘(Eppendorf 5702/R A-4-38型轉(zhuǎn)子)，并且重懸浮在稀釋的Sauton SSI溶液 (125 μ g MgSO4,125 μ g K2HPO4, Img L-天冬酰胺，12. 5 μ g 檸檬酸鐵銨，18. 4mg 85%甘油， 0.5mg檸檬酸，在Iml H2O中)中，并保存于_80°C。該免疫原性制劑能夠賦予針對(duì)來(lái)自RSV 亞型A和B的蛋白N的免疫性。前述的實(shí)施例對(duì)于包含重組且減毒的分枝桿菌菌株的免疫原性制劑來(lái)說(shuō)是廣泛 而全面的，所述分枝桿菌菌株表達(dá)來(lái)自RSV的蛋白NS2、N、P、M、SH、M2 (ORFl)、M2 (0RF2)、 L、F或G，以及其所有組合。類似地，這些實(shí)施例對(duì)于包含一種或幾種重組且減毒的分枝桿 菌菌株的免疫原性制劑來(lái)說(shuō)是廣泛而全面的；其中所述重組細(xì)菌包含來(lái)自RSV的蛋白質(zhì)或 免疫原性片段基因，所述基因以一個(gè)或多個(gè)拷貝插入到細(xì)菌基因組或染色體外質(zhì)粒中，并 且它們的表達(dá)處于內(nèi)源或外源的組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下，從而被表達(dá)為胞質(zhì)可溶 的、分泌至細(xì)胞外的或膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。本文所提及的所有出版物(包括在“參考文獻(xiàn)”部分中所列出的所有出版物)通 過(guò)提及而合并入本文。當(dāng)引用參考文獻(xiàn)以提供關(guān)于本文所描述的方法或材料的信息時(shí)，涉 及那種方法或材料的該參考文獻(xiàn)的那部分特別地合并入本文。參考文獻(xiàn)1. 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1權(quán)利要求
賦予針對(duì)由呼吸道合胞病毒引起的感染或病理學(xué)狀態(tài)的保護(hù)的免疫原性制劑，其中該制劑在藥學(xué)上可接受的緩沖鹽水溶液中以104至109個(gè)細(xì)菌的濃度包含重組且減毒的分枝桿菌菌株，優(yōu)選地卡介菌(BCG)菌株，該重組菌株表達(dá)來(lái)自呼吸道合胞病毒(RSV)的至少一種蛋白質(zhì)或免疫原性片段。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑，其中至少一種RSV蛋白質(zhì)與RSV亞型A或RSV亞 型B或這兩種亞型相對(duì)應(yīng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的免疫原性制劑，其中至少一種RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段選自來(lái) 自 RSV 的蛋白賂2、1 、]\1、3!1、]\12(01^1)、]\12(01^2)、1^、？或6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3的免疫原性制劑，其中編碼RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段的基因 以一個(gè)或多個(gè)拷貝插入到分枝桿菌優(yōu)選BCG的基因組中或者包含在染色體外質(zhì)粒中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4的免疫原性制劑，其中蛋白質(zhì)基因的表達(dá)處于組成型或誘導(dǎo)型 內(nèi)源或外源分枝桿菌BCG啟動(dòng)子的控制之下。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5的免疫原性制劑，其中所述RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段可以由 BCG表達(dá)為胞質(zhì)可溶的、分泌至細(xì)胞外的或細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6的免疫原性制劑，其中所述制劑可以進(jìn)一步連同其他免疫 原性制劑一起進(jìn)行使用，所述其他免疫原性制劑表達(dá)與來(lái)自RSV的蛋白NS2、N、P、M、SH、 M2 (ORFl)、M2 (0RF2)、L、F或G不同的蛋白質(zhì)或免疫原性片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至6的免疫原性制劑，其中所述制劑可以進(jìn)一步連同其他免疫原 性制劑一起進(jìn)行使用，所述其他免疫原性制劑在它們將蛋白質(zhì)或免疫原性片段表達(dá)為可溶 的、胞質(zhì)可溶的、分泌至細(xì)胞外的或膜結(jié)合的蛋白質(zhì)的形式方面不同。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6的免疫原性制劑，其中所述制劑可以進(jìn)一步連同其他免疫原性 制劑一起進(jìn)行使用，所述其他免疫原性制劑在RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段基因的拷貝數(shù)方 面，以及在組成型或誘導(dǎo)型的RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段表達(dá)的控制方面不同，并且可以 進(jìn)一步在RSV蛋白質(zhì)或免疫原性片段的目的地方面不同。
10.根據(jù)權(quán)利要求1、7、8或9的免疫原性制劑，其中它通過(guò)冷凍、冷凍干燥或者使用緩 沖鹽水溶液來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定化以便在其使用前進(jìn)行保存。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10的免疫原性制劑，其中它通過(guò)冷凍、冷凍干燥或者使用緩沖鹽 水溶液來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定化以便在其使用前進(jìn)行保存。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性制劑的用途，其中它用于制備疫苗以預(yù)防、 治療或減弱RSV感染，其中該制劑包含有在鹽水溶液中穩(wěn)定化的IX IO4-I X IO9菌落形成單 位的前述權(quán)利要求的重組且減毒的分枝桿菌菌株。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的免疫原性制劑的用途，其中它用于制備疫苗以預(yù)防、 治療或減弱RSV感染，其中該制劑可以以在生理學(xué)上可接受的鹽水溶液中的皮下、經(jīng)皮或 真皮下形式進(jìn)行施用。
全文摘要
本發(fā)明描述了待在哺乳動(dòng)物中針對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)而使用的免疫原性制劑，其包含卡介菌(Calmette-Guérin bacillus，BCG)菌株或其他減毒的分枝桿菌(Mycobacterium)菌株，所述菌株異源表達(dá)RSV亞型A或RSV亞型B毒株的至少一種蛋白質(zhì)或免疫原性片段，所述至少一種蛋白質(zhì)或免疫原性片段源自蛋白NS1、NS2、N、P、M、SH、M2(ORF1)、M2(ORF2)、L、F或G。編碼這些蛋白質(zhì)或免疫原性片段的遺傳材料以一個(gè)或幾個(gè)拷貝插入到BCG基因組中或者處于染色體外，其表達(dá)由組成型或誘導(dǎo)型內(nèi)源或外源BCG啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)。所述病毒蛋白質(zhì)或免疫原性片段可以由BCG表達(dá)為胞質(zhì)可溶的、分泌至細(xì)胞外的或細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。所述制劑可以進(jìn)一步包含先前所描述制劑的組合。所述制劑可以通過(guò)冷凍干燥(4℃至25℃的保存范圍)或者在緩沖鹽水溶液中通過(guò)低溫(-80℃)來(lái)進(jìn)行穩(wěn)定化以便在其使用前進(jìn)行保存。
文檔編號(hào)A61K39/155GK101918029SQ200880114324
公開(kāi)日2010年12月15日 申請(qǐng)日期2008年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月20日
發(fā)明者A·M·卡勒吉斯帕拉, P·A·岡扎雷茲姆諾茲, S·M·布諾拉米瑞茲 申請(qǐng)人:智利天主教教皇大學(xué)