專利名稱：具有生理血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于體內(nèi)外肝細(xì)胞或肝細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞混合培養(yǎng)的具有肝臟生理 狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架及其制備方法，屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肝臟在人體中起到極為重要的作用，由于其功能的復(fù)雜及不可替代性，對(duì)于終末期肝 病而言，如何找到一種有著完整的肝功能的替代物一直是醫(yī)學(xué)界的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。目前，在 終末期肝病中比較肯定的方法是肝移植，但肝移植存在著供體緊張、手術(shù)難度大、受益人 群少、費(fèi)用高及排斥反應(yīng)等問題，從而限制了肝移植技術(shù)在臨床的應(yīng)用；而用的較多的人 工肝等方法也存在著不能完全替代失功的肝功能，且存在費(fèi)用過高，設(shè)備資源短缺以及可 能引起血液傳播性疾病等缺陷。因而，人造器官和組織再生研究的重要性和迫切性尤為重 要和突出。
組織工程化器官構(gòu)建的實(shí)質(zhì)是以細(xì)胞為中心的活體的組裝，構(gòu)筑基元為細(xì)胞、支架、 信號(hào)與活性物質(zhì)。肝組織器官工程是在體外利用生物相容性良好的可降解材料及支架結(jié)構(gòu) 與肝細(xì)胞及其他細(xì)胞復(fù)合，通過復(fù)雜制造工藝，構(gòu)建一個(gè)具有肝臟大部分或全部功能的器官, 而研究的終極目的是完成肝臟組織器官重建及損傷修復(fù)。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，必須在體外 的支架上培養(yǎng)能夠或大量表現(xiàn)正常肝功能的肝細(xì)胞聚集體、有血供和較長(zhǎng)時(shí)間存活并具有 部分生物學(xué)活性的肝臟組織，保證其在植入體內(nèi)的存活和增殖，但在其研究中至今尚有許 多難題需要解決，其中為加快血管的形成和細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氣體交換空隙，促進(jìn)和支持生 長(zhǎng)、聚集體的形成所需具有血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解的肝組織工程支架及制備方法，是 組織工程學(xué)中肝臟再生研究的課題之一。
通常用于肝組織工程研究的支架，其內(nèi)部結(jié)構(gòu)多為一種簡(jiǎn)單的多孔結(jié)構(gòu)。近年來，國(guó) 內(nèi)外研究者為制備含血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)支架的方法不斷被建立和開發(fā)，如微制造和三維打印技術(shù)、 激光快速成型和運(yùn)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行模擬造型等。Satoshi等利用影印石板技術(shù)，在硅和耐熱玻 璃制成的模板上，蝕刻形成具有各級(jí)分支的血管和毛細(xì)血管的完整血管網(wǎng)；Stephen等用 三維印刷技術(shù)制造出內(nèi)含網(wǎng)狀相連的管道化PLGA支架；Junji Fukuda等以微制造和微打 印技術(shù)將膠原/聚乙二醇復(fù)合物支架材料制成微圓柱狀槽形態(tài)的多孔支架，以及徐迎新教授 等人在用激光快速成型、計(jì)算機(jī)模擬造型等方法制備的肝組織工程支架上進(jìn)行肝組織工程 血管化的研究也表明管網(wǎng)結(jié)構(gòu)的支架利于肝組織的血管化。所以，在肝組織再生研究中， 支架內(nèi)具有血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的組織工程支架至關(guān)重要。但用上述方法進(jìn)行肝組織工程支架的 制備，除需要昂貴的微型加工設(shè)備、成型工藝復(fù)雜和加工成本高以外，在復(fù)雜的工藝成型 加工過程中易造成支架尺寸受到限制、脫模困難，還因制備條件要求限制了材料的種類， 如光固化工藝可以方便的控制管道或孔洞形態(tài)，但具備良好生物相容性和降解特性的光敏 樹脂材料的開發(fā)滯后,使成型的肝支架的特征誤差較大；熔融沉積法雖可直接成型生物可降解材料,但存在管道直徑較大,管道形態(tài)可控性較差等一系列問題，均無法達(dá)到完全復(fù)制肝 臟內(nèi)血管網(wǎng)的結(jié)構(gòu)。如從支架內(nèi)具有生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)角度考慮，并解決上述制 備管網(wǎng)支架中所存在的問題，制備出具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解的肝組織 工程支架，能夠促進(jìn)肝組織的血管化和利于肝組織的形成，是人們一直渴望解決的技術(shù)問 題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種具有生理血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架及其制 備方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工 程支架，由半乳糖基化殼聚糖、半乳糖基化或半乳糖修飾的可降解高分子材料制成。
所述的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架材料中半乳糖的取 代度為10%-30%。
本發(fā)明提供的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架為多孔海綿 體，支架內(nèi)具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)。支架外形根據(jù)血管鑄型模型的大小選擇的成
型模具。
本發(fā)明的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架的制備，采用鑄
型、滲流成型和冷凍干燥/瀝濾技術(shù)的結(jié)合方法制備，方法包括下列歩驟
(1) 以可降解型脂肪族聚酯類鑄型劑進(jìn)行肝臟血管鑄型鑄型方法有兩種， 一種是進(jìn)
行動(dòng)物活體肝臟血管鑄型，在鑄型劑固化后通過去除組織和清洗獲得肝臟血管樹模型；另 - 一種是在血管樹模具中，注入可降解型鑄型劑，待鑄型劑固化后取出血管樹模型；其血管 樹模具材料為石蠟、石膏、聚四氟乙烯或不銹鋼，所述的可降解型脂肪族聚酯類鑄型劑包 括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乙內(nèi)酯中任一種或兩種與有機(jī)溶劑為丙酮、乙酸乙酯、三氯 甲烷或1， 4一二氧六環(huán)組成的鑄型劑；
(2) 將血管樹模型放入與之相吻合的容器中，并根據(jù)肝組織工程支架海綿體所需孔徑 的大小加入致孔劑或不加致孔劑，所述致孔劑為脂肪族聚酯類聚乳酸、聚羥基乙酸或聚乙
內(nèi)酯的微粒，微粒大小為5(Vm 800^n;
(3) 在加入了致孔劑的容器中用滲流成型的方法加入半乳糖基化殼聚糖溶液或半乳糖 基化或修飾的可降解高分子材料溶液，在沒有加入致孔劑的容器中直接加入半乳糖基化殼 聚糖溶液或半乳糖基化或修飾的可降解高分子材料溶液，然后進(jìn)行低溫冷凍，冷凍溫度為 --10 -196°C，待溶液冷凍固定后再進(jìn)行冷凍干燥，即得肝組織工程支架的雛型；
(4) 將上述支架雛型浸入有機(jī)溶劑丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或1,4-二氧六環(huán)中， 待脂肪族聚酯的血管樹模型和致孔劑完全溶解并全部被瀝出后，經(jīng)蒸餾水或生理鹽水沖洗 后冷凍干燥，即得到具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的肝組織工程支架粗制品；
(5) 將上述粗制品支架放入抗凝血藥物肝素中浸泡，然后在丙酮濃度由高到低的溶液 中進(jìn)行縮聚，再進(jìn)行冷凍千燥，即得具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的肝組織工程支架產(chǎn)品。在所述的步驟3中，或者直接將抗凝血藥物肝素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)或血管內(nèi)皮細(xì)胞生 長(zhǎng)因子(VEGF)復(fù)合到半乳糖基化殼聚糖溶液或半乳糖基化或修飾的可降解高分子材料溶液 中。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
由于本發(fā)明使用的半乳糖基化殼聚糖、半乳糖基化或半乳糖修飾的可降解高分子生物 材料，材料中的半乳糖是肝細(xì)胞質(zhì)膜表面的去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)的特異性配體，所 以它可提高肝細(xì)胞在海綿體上的黏附，并且該支架所具有的肝臟內(nèi)生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)， 可為加快血管的形成和肝細(xì)胞的存活提供營(yíng)養(yǎng)和氣體交換空隙，促進(jìn)和支持生長(zhǎng)、聚集體 的形成以及植入體內(nèi)成為可能。該支架的制備方法簡(jiǎn)單、操作容易，無需復(fù)雜的成型設(shè)備 并且成本低廉。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1
具有大鼠肝臟血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架的制備，其制備歩驟為
1. 以丙酮為溶劑，配制0. 05g/ml和0. 1g/ml濃度的聚乳酸鑄型劑溶液，對(duì)大鼠進(jìn)行活 體肝臟血管鑄型，鑄型時(shí)鑄型劑濃度先低后高，并補(bǔ)注2次，然后切下肝臟放置室溫2天 后置于質(zhì)量濃度25%鹽酸溶液中腐蝕3天，用流水緩慢沖洗，除去細(xì)胞和結(jié)締組織，然后 用肥皂水浸泡1天，即可得到乳白色的大鼠肝臟血管樹模型；
2. 將血管樹模型放入與之相吻合的容器中，直接注入半乳糖基化殼聚糖溶液，并立即 置入-7(TC冷凍24h后，再進(jìn)行冷凍干燥而獲得支架雛形；
3. 將上述支架雛形浸泡于丙酮中，并輕輕攪拌加快血管樹模型的溶出，浸泡中更換浸 泡液1-2次直至支架海綿體中無乳白色聚乳酸，即得支架海綿體；
4. 將上述支架海綿體放入蒸餾水中輕輕沖洗后，經(jīng)低溫冷凍、冷凍干燥后獲得具有大 鼠肝臟血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架，支架海綿體中的孔隙直徑約為 50-200,。
實(shí)施例2
具有大鼠肝臟血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架的制備，其制備歩驟為
1. 以丙酮為溶劑，配制0. 05g/ml和0. lg/ml濃度的聚乳酸鑄型劑溶液，對(duì)大鼠進(jìn)行活 體肝臟血管鑄型，鑄型時(shí)鑄型劑濃度先低后高，并補(bǔ)注2次，然后切下肝臟放置室溫2天 后置于質(zhì)量濃度25%鹽酸溶液中腐蝕3天，用流水緩慢沖洗，除去細(xì)胞和結(jié)締組織，然后 用肥皂水浸泡1天，即可得到乳白色的大鼠肝臟血管樹模型；
2. 將血管樹模型放入與之相吻合的容器中，再加入適量的致孔劑，致孔劑為200-500)im 聚乳酸微粒，然后通過滲流緩慢注入半乳糖基化殼聚糖溶液，并立即置入-7CTC冷凍24h， 再進(jìn)行冷凍干燥而獲得支架雛形；
3. 將上述支架雛形浸泡于丙酮中，并輕輕攪拌加快血管樹模型和致孔劑的溶出。浸泡 中更換浸泡液1-2次直至支架海綿體中無乳白色聚乳酸，即得支架海綿體；沖洗后，經(jīng)低溫冷凍、冷凍干燥后獲得具有生 理血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架，支架海綿體中的孔隙直徑約為50-50(Vm。 實(shí)施例3
具有大鼠肝臟血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架的制備，其制備歩驟為
1. 以丙酮為溶劑，配制0. 05g/ml和0. lg/ml濃度的聚乳酸鑄型劑溶液，對(duì)大鼠進(jìn)行活 體肝臟血管鑄型，鑄型時(shí)鑄型劑濃度先低后高，并補(bǔ)注2次，然后切下肝臟放置室溫2天 后置于質(zhì)量濃度25%鹽酸溶液(或者10%氫氧化鈉)中腐蝕3天，用流水緩慢沖洗，除去細(xì) 胞和結(jié)締組織，然后用肥皂水浸泡l天，即可得到乳白色的大鼠肝臟血管樹模型；
2. 將血管樹模型放入與之相吻合的容器中；
3. 在半乳糖基化殼聚糖溶液中加入30%的致孔劑得到混合溶液，致孔劑為300-800(im 聚乳酸微粒；
4. 將上述的混合溶液倒入放有血管樹模型的容器中，并立即置入-7(TC冷凍24h，再進(jìn) 行冷凍干燥而獲得支架雛形；
5. 將上述支架雛形浸泡于丙酮中，并輕輕攪拌加快血管樹模型和致孔劑的溶出，浸泡 中更換浸泡液1-2次直至支架海綿體中無乳白色聚乳酸，即得支架海綿體。
6. 將上述支架海綿體放入蒸餾水中輕輕沖洗后，經(jīng)低溫冷凍、冷凍干燥后獲得具有生 理血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架，支架海綿體中的孔隙直徑權(quán)利要求
1. 一種具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架，其特征在于由半乳糖基化殼聚糖、半乳糖基化或半乳糖修飾的可降解高分子材料制成。
2. 按照權(quán)利要求1所述的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織 工程支架，其特征在于，其支架材料中半乳糖的取代度為10%-30%。
3. 按照權(quán)利要求1所述的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織 工程支架，其特征在于，所述的支架為多孔海綿體，支架內(nèi)具有肝臟生理狀血管 網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。
4. 權(quán)利要求1所述的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程 支架的制備方法，其特征在于，采用鑄型、滲流成型和冷凍干燥/瀝濾技術(shù)的結(jié)合 方法，方法歩驟包括(1) 以可降解型脂肪族聚酯類鑄型劑進(jìn)行肝臟血管鑄型鑄型方法有兩種，一種是進(jìn)行動(dòng)物活體肝臟血管鑄型，在鑄型劑固化后通過去除組織和清洗獲得肝臟血管樹模型；另一種是在血管樹模具中，注入可降解型鑄型劑，待鑄型劑固化 后取出血管樹模型；其血管樹模具材料為石蠟、石膏、聚四氟乙烯或不銹鋼，所 述的可降解型脂肪族聚酯類鑄型劑包括聚乳酸、聚羥基乙酸、聚乙內(nèi)酯中任-一 種或兩種與有機(jī)溶劑為丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷或l， 4一二氧六環(huán)組成的鑄型 劑；(2) 將血管樹模型放入與之相吻合的容器中，并根據(jù)肝組織工程支架海綿體 所需孔徑的大小加入致孔劑或不加致孔劑，所述致孔劑為脂肪族聚酯類聚乳酸、 聚羥基乙酸或聚乙內(nèi)酯的微粒，微粒大小為50卩un 80(Vm;(3 )在加入了致孔劑的容器中用滲流成型的方法加入半乳糖基化殼聚糖溶液 或半乳糖基化或修飾的可降解高分子材料溶液，在沒有加入致孔劑的容器中直接 加入半乳糖基化殼聚糖溶液或半乳糖基化或修飾的可降解高分子材料溶液，然后 進(jìn)行低溫冷凍，冷凍溫度為-10 -196°C，待溶液冷凍固定后再進(jìn)行冷凍千燥，即 得肝組織工程支架的雛型；(4)將上述支架雛型浸入有機(jī)溶劑丙酮、乙酸乙酯、三氯甲垸或1,4-二氧 六環(huán)中，待脂肪族聚酯的血管樹模型和致孔劑完全溶解并全部被瀝出后，經(jīng)蒸餾 水或生理鹽水沖洗后冷凍干燥，即得到具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的肝組織工 程支架粗制品；(5 )將上述粗制品支架放入抗凝血藥物肝素中浸泡，然后在丙酮濃度由高到 低的溶液中進(jìn)行縮聚，再進(jìn)行冷凍干燥，即獲得具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的 肝組織工程支架產(chǎn)品。
5. 按照權(quán)利要求4所述的具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織 工程支架的制備方法，其特征在于，在所述的歩驟(3)中，或者直接將抗凝血藥 物肝素、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子復(fù)合到半乳糖基化殼聚糖溶液 或半乳糖基化或修飾的可降解高分子材料溶液中。
全文摘要
具有生理血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的體內(nèi)可降解肝組織工程支架及其制備方法。該支架材料為半乳糖基化殼聚糖、半乳糖基化或半乳糖修飾的可降解高分子材料。支架呈多孔海綿體，支架內(nèi)具有生理血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。其制備方法是選用可降解性脂肪族聚酯類材料通過血管鑄型獲得生理狀血管樹模型，然后采用滲流成型和冷凍干燥/瀝濾技術(shù)的結(jié)合方法，制備可降解具有肝臟生理狀血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的肝組織工程支架。本支架可使血管內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞在血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的管道和多孔海綿體中的孔隙中充分生長(zhǎng)，以利于新生血管的形成和支架植入體內(nèi)細(xì)胞數(shù)量的要求。本發(fā)明提供的肝組織工程支架生物相容性好、有一定的力學(xué)強(qiáng)度和韌性。制備工藝簡(jiǎn)單，操作容易。
文檔編號(hào)A61L27/00GK101530631SQ20091006168
公開日2009年9月16日 申請(qǐng)日期2009年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2009年4月21日
發(fā)明者濤 萬, 和 文, 斌 曹, 李世普, 飛 趙, 閆玉華 申請(qǐng)人:武漢理工大學(xué)