專利名稱：一種微生物的分子標(biāo)記及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種微生物的分子標(biāo)記及其構(gòu)建和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
CpG-DNA是含有未甲基化CpG的DNA序列，能夠刺激脊椎動物的免疫系統(tǒng)。這種 序列通常可以用人工合成方法獲得，稱為CpG寡核苷酸(CpG 0DN)，也可以構(gòu)建于質(zhì)粒DNA 中。由于CpG-DNA廣泛存在于細(xì)菌DNA中，但很少存在于脊椎動物DNA中，因而CpG-DNA是 一種細(xì)菌等微生物的分子標(biāo)記，可以被脊椎動物免疫系統(tǒng)識別。識別CpG-DNA的免疫分子 是Toll樣受體家族成員TLR9 ；TLR9與CpG-DNA作用誘發(fā)多種免疫反應(yīng)，包括促使淋巴細(xì)胞 增值，激活自然殺傷細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫因子等?；谄涿庖叽龠M(jìn)活性，CpG-DNA被認(rèn)為是 一種具有良好應(yīng)用前景的免疫佐劑和抑菌因子。由于CpG-DNA具有種屬特異性，因而不同 物種的有效CpG-DNA序列不同。目前魚類CpG-DNA的研究大多針對虹鱒、大西洋鮭魚等，針 對牙鲆的CpG-DNA研究很少。由于牙鲆是我國重要的海水養(yǎng)殖魚類，具有廣闊的市場和很 高的經(jīng)濟(jì)價值，因而開展牙鲆特異性CpG-DNA研究對我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有切實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種微生物的分子標(biāo)記及其構(gòu)建和應(yīng)用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種微生物的分子標(biāo)記微生物的分子標(biāo)記為牙鲆特異性CpG-DNA序列，為序列 表SEQ ID中的堿基序列所示。構(gòu)建1)將質(zhì)粒pCN3用BamHI酶切后與寡聚核苷酸CPG43用T4DNA連接酶于室溫連 接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24-30小時，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，待用；所述CPG43為5，-GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCG TTGGTTGTCGTTTTGGTG-3，；2)將上述所得質(zhì)粒用BamHI酶切后與寡聚核苷酸CPG40用T4DNA連接酶于室溫 連接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24-30小時，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒；所述CPG40 為 5，-GATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，。應(yīng)用所述序列表SEQ ID中的堿基序列能顯著抑制致病性細(xì)菌的侵染。所序列表 SEQ ID中的堿基序列能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水氣單胞菌侵染。所述具有序列表 SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒的PBS溶液至濃度為20ug/ml，具有序列表SEQID中的堿基序 列的質(zhì)粒的PBS溶液以100-120ul的劑量腹腔注射牙鲆能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水 氣單胞菌侵染。本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.能夠非特異性抑制病原侵染。本發(fā)明的微生物的分子標(biāo)記CpG-DNA能夠使魚類抵御多種常見細(xì)菌病原的侵染。2.制備簡單，造價低廉。由于本發(fā)明的微生物的分子標(biāo)記CpG-DNA攜帶于質(zhì)粒上， 因而可以在細(xì)菌中擴(kuò)增，通過常規(guī)質(zhì)粒提取即可獲得，避免了昂貴的人工合成途徑。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例旨在對本發(fā)明進(jìn)行舉例描述，而 非以任何形式對本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實施例中所涉及到的常規(guī)性實驗方法均采用如下方法1.質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細(xì)菌基因組二 DNA提取 皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相應(yīng)試劑盒。2.質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook andRussell Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press 2001)；3.所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購自于“紐英倫生物技術(shù)有限公司”，北京。4.所有寡核苷酸合成皆由“上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司”合成。實施例1牙鲆特異性CpG-DNA序列具序列表SEQ ID中的堿基序列。序列表SFQ ID為GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTGGATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTAT(a)序列特征 長度84 類型核苷酸序列 鏈型單鏈 拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b)分子類型DNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源人工設(shè)計實施例2含有牙鲆特異性CpG-DNA序列的質(zhì)粒的構(gòu)建M M 14 pCN3(參 B Jiao X, Zhang M, Hu Y, and Sun L. Construction and evaluation of DNA vaccinesencoding Edwardsiella tarda antigens. Vaccine. 2009 ； 27 :5195-5202.進(jìn)行構(gòu)建)用 BamHI 酶切后與寡聚核苷酸 CPG43(5，-GATCGCGCGCGCGCGTCT ATTCGTCGTTGGTTGTCGTTTTGGTG-3，)用T4DNA連接酶于室溫連接2_4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌DH5 a后在含有100ug/ml的安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-30小時，挑取 轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pC2M。將pC2M用BamHI酶切后與寡聚核苷酸CPG40 (5’_GATCA CGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，)用 T4DNA 連接酶于室溫連接 2-4 小時，連接 液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5后在含有l(wèi)OOug/ml的安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-30小 時，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒，經(jīng)測序可知質(zhì)粒中含有有序列表SEQ ID中的堿基序列。實施例2pC4M的抑菌應(yīng)用1)遲緩愛德華氏菌和嗜水氣單胞菌懸液的制備。在LB培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)遲緩愛 德華氏菌TX1(保存于CGMCC，編號為CGMCC No. 2330)和嗜水氣單胞菌AH1. 927 (購于中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，編號1.927)使兩種菌的菌懸液分別培 養(yǎng)至0D_均為0. 6，然后分別以5000g，4°C離心lOmin，收集各自的菌體，將TX1懸浮于PBS 中至終濃度為5X 106cfu/ml，即為遲緩愛德華氏菌懸液；將T4懸浮于PBS中至終濃度為 2X 107cfu/ml，即為嗜水氣單胞菌懸液。所述LB組成成分按重量百分比計1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化鈉， 97. 5%蒸餾水；所述PBS組成成分按重量百分比計0. 8 % NaCl，0. 02 % KC1，0. 358 % Na2HP04. 12H20，0. 024% NaH2P04，98. 798%蒸餾水。2)將96條牙鲆(每條重約7g)隨機(jī)分為4組，每組24條。將這4組分別命名為 A、B、C和D組。將A和C組的每條魚腹腔注射lOOul具有序列表SEQ ID中的堿基序列的 質(zhì)粒的PBS溶液，其中每lOOul含有2ug具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒。將B和 D組(對照組)的每條魚腹腔注射lOOul PBS。2天后將A和B組魚每條腹腔注射lOOul上 述步驟1)的遲緩愛德華氏菌懸液；將C和D組魚每條腹腔注射lOOul上述步驟1)的嗜水 氣單胞菌懸液。在以后的20天中，每天觀察并記錄各組魚的死亡情況。20天后，統(tǒng)計各組 魚的總死亡數(shù)目A組，10條；B組，20條，C組，8條；D組，20條。利用下列公式計算相對免 疫保護(hù)效率(RPS)RPS = 100 X (1-免疫組魚的總死亡百分比/對照組魚的總死亡百分比)由此得出具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒針對遲緩愛德華氏菌和嗜水氣 單胞菌的免疫保護(hù)效率分別為50%和60%。結(jié)論具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒能夠顯著抑制遲緩愛德華氏菌和 嗜水氣單胞菌侵染。
權(quán)利要求
一種微生物的分子標(biāo)記，其特征在于微生物的分子標(biāo)記為牙鲆特異性CpG-DNA序列，為序列表SEQ ID中的堿基序列所示。
2.一種按權(quán)利要求1所述的微生物的分子標(biāo)記的構(gòu)建，其特征在于1)將質(zhì)粒PCN3用BamHI酶切后與寡聚核苷酸CPG43用T4DNA連接酶于室溫連接2_4 小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α后在含有安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24_30小 時，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，待用；所述 CPG43 為 5，-GATCGCGCGCGCGCGTCTATTCGTCGTTGGTTGT CGTTTTGGTG-3，；2)將上述所得質(zhì)粒用BamHI酶切后與寡聚核苷酸CPG40用T4DNA連接酶于室溫連 接2-4小時，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 α后在含有安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24-30小時，挑取轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒；所述 CPG 40 為 5’ -GATCACGTACGTACGTCTATGATCTCGCTCGCTCGCCTATG-3，。
3.一種按權(quán)利要求1所述的微生物的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述序列表SEQ ID中的堿基序列能顯著抑制致病性細(xì)菌的侵染。
4.按權(quán)利要求3所述的微生物的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所序列表SEQID中的 堿基序列能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水氣單胞菌侵染。
5.按權(quán)利要求3所述的微生物的分子標(biāo)記的應(yīng)用，其特征在于所述具有序列表SEQ ID中的堿基序列的質(zhì)粒的PBS溶液至濃度為20ug/ml，具有序列表SEQ ID中的堿基序列的 質(zhì)粒的PBS溶液以100-120ul的劑量腹腔注射牙鲆能顯著抑制遲緩愛德華氏菌或嗜水氣單 胞菌侵染。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)領(lǐng)域，具體的說是一種微生物的分子標(biāo)記及其構(gòu)建和應(yīng)用。微生物的分子標(biāo)記為牙鲆特異性CpG-DNA序列，為序列表SEQ ID中的堿基序列所示。所述序列表SEQ ID中的堿基序列能顯著抑制致病性細(xì)菌的侵染。本發(fā)明所得牙鲆特異性CpG-DNA序列對多種常見病原菌具有抑制作用，因而在牙鲆病害防治中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號A61K31/7088GK101851621SQ201010151850
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者劉春勝, 孫黎 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所