專利名稱：：抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯a及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
的化合物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及一種從植物線葉旋覆花中分離得到的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：旋覆花屬(InulaL.)植物是菊科(Compositae)中的一屬，全世界約有100種，分別于亞洲、歐洲和非洲，以地中海地區(qū)為主。我國有20余種，本屬多種植物常供藥用，如土木香(I.helenium)可作為健胃、利尿、祛痰和驅(qū)蟲藥；歐亞旋覆花(I.britarmica)具有消痰、下氣、軟堅、行水等功效。倍半萜類化合物是本屬植物的特征性成分，以桉烷型、吉馬烷型和愈創(chuàng)木烷型為主，還包括偽愈創(chuàng)木烷型、裂環(huán)桉烷型、欖烷型、蒼耳烷型和少量的無環(huán)倍半萜及倍半萜二聚體。研究表明，該屬植物中的倍半萜類化合物具有驅(qū)蟲殺蟲、抗菌抗腫瘤、抗病毒、免疫抑制的功效。旋覆花屬植物在我國分布廣，種類多，具有較長的臨床應(yīng)用歷史。近年來，旋覆花在抗菌、抗炎、抗腫瘤等多方面的不同生物活性引起了越來越多的關(guān)注，對該屬植物化學(xué)成分的研究也逐漸成為一個熱點。線葉旋覆花[InulalineariifoliaTurcz.(syn.Inulalinariaefolia)]是菊科旋覆花屬植物，多年生草本，俗名窄葉旋覆花、條葉旋覆花、小朵旋覆花。廣產(chǎn)于我國東北部、北部、中部和東部，如河南、河北等省。也分布于蒙古、朝鮮、俄羅斯(遠(yuǎn)東地區(qū))和日本。生于山坡、荒地、路旁、河岸，極常見。中藥旋覆花即為旋覆花或大花旋覆花等的頭狀花序，而植物全草(金沸草)亦供藥用。線葉旋覆花過去在華東等部分地區(qū)也作旋覆花使用，并且作為下氣、行水、消炎、軟堅之藥，曾被收載于1963年版中國藥典(一部)，但病人服后有惡心、嘔吐等反應(yīng)，目前已停止使用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明對采集自安徽長豐縣的線葉旋覆花進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎活性，可用于制備抗炎的藥物。本發(fā)明涉及的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>本發(fā)明還涉及的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備方法，包括步驟如下(1)提取將線葉旋覆花干燥全草粉碎，以8095%乙醇820倍體積W/V回流提取13次，每次23小時，合并提取液，提取液減壓濃縮成流浸膏，流浸膏相當(dāng)于Iml含線葉旋覆花0.8-1.2g，流浸膏加水13倍量W/V稀釋后，以石油醚0.52倍量V/V萃取35次，得到石油醚部位；(2)分離將上述石油醚部位應(yīng)用硅膠柱層析，以體積比為100011的石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析檢測，分別收集含線葉旋覆花內(nèi)酯A的流分，再經(jīng)C18反相柱層析，以重量比為50100-70100的甲醇-水進行洗脫，薄層層析檢測，得線葉旋覆花內(nèi)酯A純品。所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A為無色四角形結(jié)晶、熔點181-184°c；[a]D20-23.20(c1.00，CHC13)，由電噴霧離子質(zhì)譜信號m/z389.2[M+Na]+，m/z365.0[M_H]_，高分辨質(zhì)譜得該化合物精密質(zhì)量數(shù)為367.1767[M+H]+，推算其分子式為C19H2707。所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A是從生長于安徽長豐縣的線葉旋覆花中提取分離得到的一種倍半萜化合物。本發(fā)明對所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A進行了X-衍射，晶胞參數(shù)為a=9.3534(7)A，a=90°；b=9.3534(7)A,^=90°；c=42.209(5)A,Y=90°；V=3692.7(6)A3,Z=8,Dcalc=1.318mg/m3，晶體大小0.320X0.285X0.197mm3.MoKa(k=0.71073A),F(000)=1568，T=293(2)K.R因子為=0.0458，wR2=0.1013[I>(2o(I)]。所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A的X-衍射結(jié)構(gòu)如下線葉旋覆花內(nèi)酯A的NMR數(shù)據(jù)如表1.OH本發(fā)明還涉及的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A的應(yīng)用，實驗表明，線葉旋覆花內(nèi)酯A具有良好的抗炎活性，可用于制備抗炎的藥物。表1線葉旋覆花內(nèi)酯A的^和13C核磁共振數(shù)據(jù)碳原子序號碳化學(xué)位移氫化學(xué)位移(J)151.11.91m4<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>溶劑CDC13，'HNMR500MHz,13C匪R125MHZ.J偶合常數(shù)本發(fā)明對采集自安徽長豐縣的線葉旋覆花進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從植物線葉旋覆花中分離得到，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎活性，可用于制備抗炎的藥物。具體實施例方式以下實例對本發(fā)明作進一步說明。本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。實施例1線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備線葉旋覆花干燥全草10Kg，粉碎后，用95%乙醇100L回流提取2次，每次2小時，合并提取液，提取液減壓濃縮成每ml含線葉旋覆花lg的流浸膏，共10L，加入10L水稀釋，以20L石油醚萃取4次，得到石油醚部位120g。將石油醚部位上硅膠柱層析，以1000-11的石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含線葉旋覆花內(nèi)酯A的流分，再經(jīng)C18反相柱層析，以重量比為50100-70100的甲醇-水進行洗脫，薄層層析檢測，得到線葉旋覆花內(nèi)酯A2.5g。實施例2線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備線葉旋覆花干燥全草5Kg，粉碎后，用80%乙醇40L回流提取1次，每次3小時，合并提取液，提取液減壓濃縮成每ml含線葉旋覆花0.8g的流浸膏，共4L，加入12L水稀釋，以6L石油醚萃取3次，得到石油醚部位48g。將石油醚部位上硅膠柱層析，以1000-11的石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含線葉旋覆花內(nèi)酯A的流分，再經(jīng)C18反相柱層析，以重量比為50100-70100的甲醇-水進行洗脫，薄層層析檢測，得到線葉旋覆花內(nèi)酯A1.3g。實施例3線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備線葉旋覆花干燥全草5Kg，粉碎后，用90%乙醇100L回流提取3次，每次3小時，合并提取液，提取液減壓濃縮成每ml含線葉旋覆花1.2g的流浸膏，共6L，加入18L水稀釋，以36L石油醚萃取5次，得到石油醚部位57g。將石油醚部位上硅膠柱層析，以1000-11的石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含線葉旋覆花內(nèi)酯A的流分，再經(jīng)C18反相柱層析，以重量比為50100-70100的甲醇-水進行洗脫，薄層層析檢測，得到線葉旋覆花內(nèi)酯A1.7g。實施例4線葉旋覆花內(nèi)酯A的抗炎活性實驗在炎癥過程中，一般都認(rèn)為抑制NO的釋放可緩解炎癥的損傷。因此，我們測定了線葉旋覆花內(nèi)酯A對RAW264.7細(xì)胞中，由LPS誘導(dǎo)NO生成的抑制作用。用Griess試劑測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO分泌的水平。Griess試劑成分1%對氨基苯磺酸(溶于2.5%磷酸中)和0.1%N-1-奈乙二胺鹽酸鹽，臨用前等體積混合。將RAW264.7細(xì)胞按每孔1.OX105個細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后換液，加入含不同濃度藥液和相應(yīng)體積濃度的DMS0作為對照。藥物作用30min后各自加入LPS(1ug/mL)刺激24h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清檢測方法如下在96孔板中加入100uL待測上清樣品(每樣品設(shè)3個復(fù)孔)，加入混合后的Griess試劑100uL，室溫下避光反應(yīng)lOmin，在酶聯(lián)儀上檢測波長570nm處的OD值。以NaNO2與Griess試劑反應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算上清中NO濃度。結(jié)果見表2。表2線葉旋覆花內(nèi)酯對LPS誘導(dǎo)的NO活性測試結(jié)果~藥品濃g/μΜ均值士標(biāo)準(zhǔn)差抑制率/%IC50/μM“DMSO<0.5%1.66±0.21___LPSlug/mL7.58±0.160.00__氨基胍ΙμΗ1.62±0.1678.65---；---JO__0.76±0.0290.04線葉旋覆花J5__0.95±0.0687.510.11內(nèi)酯ΛJO__1.21±0.1283.99_I51.55+0.09I79.49]_結(jié)果表明LPS能顯著增加巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的Ν0(ρ<0.01)。線葉旋覆花內(nèi)酯A在5、10、25、50μΜ的濃度下能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NO的生成。抑制率分別為79.49%,83.99%,87.51%,90.04%，提示該化合物具有良好的抗炎活性。實施例5線葉旋覆花內(nèi)酯A對小鼠耳腫脹模型的抗炎活性評價(一)小鼠耳腫脹模型1實驗動物Swiss種小鼠，雄性，體重20_24g。2.實驗?zāi)Ｐ秃蜏y試方法取小鼠50只，隨機分成5組，按表3所示的劑量灌胃給藥3d，于末次給藥后lh，用0.05ml的二甲苯將小鼠左耳致炎，用直徑為7mm的打孔器將雙耳重疊打孔，將打下的圓片在扭力天平(靈敏度為萬分之一)上稱量，用鼠耳兩圓片的重量差表示其腫脹度。3統(tǒng)計分析全部實驗結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用studentt_檢驗比較各組數(shù)據(jù)與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗結(jié)果試驗結(jié)果見表3.結(jié)果表明，陽性對照藥氫化可的松、線葉旋覆花內(nèi)酯A對小鼠耳腫脹模型引起的炎癥有顯著的抑制作用。表3.線葉旋覆花內(nèi)酯A對小鼠耳腫脹試驗的影響組別劑量(mg/kg)η耳腫脹(mg)抑制率(%)空白____1018.61士1.42__-氫化可的松__20__1010.75士1.13*42.2線葉旋覆花5_1013.51士2.2"^~27.4內(nèi)酯Λ10__1013.07士0.82*29.8_201010.16+2.07**45.4實施例6線葉旋覆花內(nèi)酯A對大鼠角叉菜膠足腫脹模型的抗炎效果1實驗動物SD大鼠，雌雄兼用，體重180_220g。2.實驗?zāi)Ｐ秃蜏y試方法取大鼠50只，隨機分成5組，按表4所示的劑量灌胃給藥4d，于末次給藥前測量致炎前容積；末次給藥后30min，于大鼠右后肢足跎皮下注射角叉菜膠0.Iml致炎。分別于致炎后2、4、6h測量右踝關(guān)節(jié)以下容積。3統(tǒng)計分析全部實驗結(jié)果均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。用studentt_檢驗比較各組數(shù)據(jù)與空白組的顯著性差異，P<0.05，表示差異有顯著性意義。4試驗結(jié)果表4.線葉旋覆花內(nèi)酯A對大鼠角叉菜膠足腫脹試驗的影響mi劑量~η““產(chǎn)腫脹度(ml)“__(mg/kg)__2hI4hI6h空白__=__101.23±0.091.02士0.110.96±0.18地塞米松__300100.35±0.14**0.32±0.12**0.27±0.09**線葉旋覆花5__101.22±0.140.94±0.130.98±0.22內(nèi)酯A10101.04±0.58*0.82士0.27*0.84±0.39_20I10I0.66±0.11**0.29+0.06**0.48+0.結(jié)果表明，陽性對照藥地塞米松、線葉旋覆花內(nèi)酯A對大鼠角叉菜膠足腫脹模型所引起的炎癥有顯著的抑制作用。權(quán)利要求一種抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A，其特征在于，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下FDA0000022373130000011.tif2.一種如權(quán)利要求1所述的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備方法，其特征在于，包括步驟如下提取將線葉旋覆花干燥全草粉碎，以8095%乙醇820倍體積W/V回流提取13次，每次23小時，合并提取液，提取液減壓濃縮成流浸膏，流浸膏相當(dāng)于1ml含線葉旋覆花0.8-1.2g，流浸膏加水13倍量W/V稀釋后，以石油醚0.52倍量V/V萃取35次，得到石油醚部位；分離將上述石油醚部位應(yīng)用硅膠柱層析，以體積比為100011的石油醚/乙酸乙酯系統(tǒng)梯度洗脫，薄層層析檢測，收集含線葉旋覆花內(nèi)酯A的流分，再經(jīng)C18反相柱層析，以重量比為50100-70100的甲醇-水進行洗脫，薄層層析檢測，得線葉旋覆花內(nèi)酯A純品。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備方法，其特征是，所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A為無色四角形結(jié)晶、熔點181-184°C;[ag-23.20(c1.00，CHC13),由電噴霧離子質(zhì)譜信號m/z389.2[M+Na]+,m/z365.0[M_H]，高分辨質(zhì)譜得該化合物精密質(zhì)量數(shù)為367.1767[M+H]+，其分子式為C19H2707。4.根據(jù)權(quán)利要求2或者3所述的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A的制備方法，其特征是，所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A是從生長于安徽長豐縣的線葉旋覆花中提取分離得到的一種倍半萜化合物。5.一種如權(quán)利要求1所述的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A，其特征在于，所述的線葉旋覆花內(nèi)酯A在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。全文摘要一種醫(yī)藥
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的抗炎化合物線葉旋覆花內(nèi)酯A及其制備方法和應(yīng)用。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下。制備方法提取將線葉旋覆花干燥全草粉碎合并提取液，濃縮成流浸膏，稀釋后萃取，得到石油醚部位；分離將上述石油醚部位應(yīng)用硅膠柱層析，梯度洗脫，層析檢測，再經(jīng)C18反相柱層析，以甲醇-水進行洗脫，薄層層析檢測，得線葉旋覆花內(nèi)酯A純品。本發(fā)明對采集自安徽長豐縣的線葉旋覆花進行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，從植物線葉旋覆花中分離得到，發(fā)現(xiàn)其具有良好的抗炎活性，可用于制備抗炎的藥物。文檔編號A61P29/00GK101830875SQ20101020069公開日2010年9月15日申請日期2010年6月13日優(yōu)先權(quán)日2010年6月13日發(fā)明者張衛(wèi)東,聶利月,覃江江,金慧子,黃鷹申請人:上海交通大學(xué)