專利名稱：口蹄疫病毒病毒(fmdv)共有蛋白質(zhì)、其編碼序列及由其制備的疫苗的制作方法
驟還可包括測(cè)量電穿孔細(xì)胞的阻抗，相對(duì)于測(cè)量的阻抗調(diào)整脈沖能量的能量水平以維持電穿孔細(xì)胞中的恒定電流，其中測(cè)量和調(diào)整步驟在脈沖能量的壽命內(nèi)進(jìn)行。電穿孔步驟還可包括按照以分散模式遞送脈沖能量的脈沖序列模式將脈沖能量遞送至多個(gè)電極。還提供了診斷被FMDV感染的哺乳動(dòng)物的方法，其中所述方法包括從哺乳動(dòng)物分離液體樣品，從哺乳動(dòng)物的液體樣品分離抗體，以及將從步驟b分離的抗體與已用權(quán)利要求3的疫苗接種的對(duì)照哺乳動(dòng)物相比較，其中對(duì)照哺乳動(dòng)物只具有針對(duì)FMDV VPI-4蛋白的抗體，被感染的FMDV哺乳動(dòng)物具有針對(duì)FMDV VP1-4蛋白和FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白的抗體。非結(jié)構(gòu)蛋白可以是FMDV 2C、3A和3D聚合酶。提供了分離的核酸分子，所述核酸分子包含編碼具有如下的蛋白質(zhì)的序列一個(gè)或多個(gè)具有或不具有前導(dǎo)序列的選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、
28、30、32、34、36、38、40和42中的一個(gè)或多個(gè)的序列、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段的序列、與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、
34、36、38、40和42具有80%或更多同源性的變體、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段及其互補(bǔ)序列。在某些實(shí)施方案中，所述核酸序列選自具有或不具有前導(dǎo)序列的SEQ ID N0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41、其互補(bǔ)序列、其編碼至少20個(gè)氨基酸的片段、其互補(bǔ)序列、與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、
29、31、33、35、37、39和41具有80%同源性的核酸分子、其互補(bǔ)序列、其編碼至少20個(gè)氨基酸的片段及其互補(bǔ)序列。提供了疫苗，所述疫苗包含此類核酸分子和/或一種或多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自具有或不具有前導(dǎo)序列的 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段、與SEQ ID NO :2、4、6、8、
10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 具有 80%或更多同源性的變體和其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段。還提供了組合物，其包含一種或多種選自具有或不具有前導(dǎo)序列的SEQ ID NO 2,
4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 的蛋白質(zhì)、其包含至少20 個(gè)氨基酸的免疫原性片段、與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、
30、32、34、36、38、40和42具有80%或更多同源性的變體和其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段。提供了用于在哺乳動(dòng)物中引起抗一個(gè)或多個(gè)FMDV病毒亞型的免疫反應(yīng)的方法。所述方法包括使用此處公開(kāi)的疫苗并且，在某些實(shí)施方案中，可包括如下步驟給哺乳動(dòng)物的組織施用編碼具有FMDV免疫原性序列的蛋白質(zhì)的核酸分子；和以有效地允許DNA質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的恒定電流用脈沖能量對(duì)組織的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。還提供了用于在按照本文中公開(kāi)的方法接種的哺乳動(dòng)物中診斷被FMDV感染的哺乳動(dòng)物的方法。所述方法包括從接種的哺乳動(dòng)物分離液體樣品，和檢測(cè)未包括在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或抗未包括在所述疫苗中的FMDV蛋白的抗體的存在。這類FMDV蛋白和/或抗這類FMDV蛋白的抗體的存在表明接種的哺乳動(dòng)物已被FMDV感染。發(fā)明詳述 已產(chǎn)生了用于融合蛋白的共有氨基酸序列，所述融合蛋白包含來(lái)自不同血清類型的多種FMDV蛋白和單個(gè)FMDV蛋白。還產(chǎn)生了編碼所述蛋白質(zhì)的核酸分子。 在本發(fā)明的一個(gè)方面，存在融合蛋白，包含共有FMDV蛋白VPI、VP2、VP3、VP4和/或3C和編碼此類蛋白的核酸，所述融合蛋白可被產(chǎn)生并且用于疫苗中從而為哺乳動(dòng)物提供抗跨一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型(包括A、Asia I、O、C、SAT1、SAT2和SAT3)的口蹄疫的保護(hù)作用。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在來(lái)自兩個(gè)不同亞型的融合蛋白，包含共有FMDV蛋白VPl和編碼此類蛋白的核酸，所述融合蛋白可被產(chǎn)生并且用于疫苗中從而為哺乳動(dòng)物提供抗跨一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型(包括A、Asia I、O、C、SATl、SAT2和SAT3)的口蹄疫的保護(hù)作用。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，存在的共有FMDV蛋白VPl和編碼它們的核酸序列。它們/可被產(chǎn)生并且用于疫苗中從而為哺乳動(dòng)物提供抗跨一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型(包括A、Asia I、O、C、SATl、SAT2和SAT3)的口蹄疫的保護(hù)作用。然而不受特定理論的束縛，抗一個(gè)或多個(gè)MDV亞型的VP1、VP2、VP3和/或VP4的共有氨基酸序列的疫苗將提供在引發(fā)有效的抗每一個(gè)FMDV亞型內(nèi)的大部分種類的免疫反應(yīng)(體液、細(xì)胞或兩者)中是有效的一大組表位。本發(fā)明涉及使用FMDV亞型的這些共有氨基酸VPl、VP2、VP3和/或VP4序列產(chǎn)生待用于疫苗(所述疫苗用于給哺乳動(dòng)物施用以提供抗FMDV的預(yù)防性保護(hù))的適當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒和蛋白質(zhì)。同樣地，本發(fā)明還涉及使用FMDV VPUVP2.VP3和/或VP4抗原的這些共有序列鑒定和區(qū)分已被適當(dāng)接種并且未被感染的哺乳動(dòng)物與已被FMDV感染(通過(guò)對(duì)針對(duì)FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)例如3D聚合酶的抗體的檢測(cè))的哺乳動(dòng)物的診斷方法。然而不受特定理論的束縛，VPl為抗VPl的共有氨基酸序列的疫苗的優(yōu)良免疫原性靶。VPl為優(yōu)勢(shì)免疫原。I.定義本文中所使用的術(shù)語(yǔ)僅僅為了描述特定實(shí)施方案并且無(wú)意進(jìn)行限定。除非上下文中明確另有說(shuō)明，否則說(shuō)明書(shū)和所附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式“一種/個(gè)(a)”、“一種/個(gè)(an) ”和“該/所述(the) ”包括復(fù)數(shù)所指物。對(duì)于本文中數(shù)值范圍的引用，明確地包括以相同的精度存在于其間的每一個(gè)插入數(shù)值。例如，對(duì)于6-9的范圍，除了 6和9外還包括數(shù)值7和8，對(duì)于范圍6. 0-7. 0，明確地包括數(shù)值 6. 0,6. 1,6. 2,6. 3,6. 4,6. 5,6. 6,6. 7,6. 8,6. 9 和 7. O。a.佐劑本文中所使用的“佐劑”可以意指添加至本文中描述的DNA質(zhì)粒疫苗以增強(qiáng)口蹄疫病毒(FMDV)抗原(其由在下文中描述的DNA質(zhì)粒和編碼核酸序列編碼)的抗原性的任何分子。b.抗體“抗體”可意指種類IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的抗體或其片段或衍生物，包括Fab、F(ab' ) 2、Fd和單鏈抗體、雙抗體、雙特異性抗體、雙功能抗體及其衍生物。抗體可以是從哺乳動(dòng)物的血清樣品分離的抗體、多克隆抗體、親和純化的抗體或其混合物，所述抗體顯示足夠的對(duì)期望的表位或來(lái)源于其的序列的結(jié)合特異性。c.編碼序列
本文中所使用的“編碼序列”或“編碼核酸”可以意指包含編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列還可包括起始信號(hào)和終止信號(hào)，所述起始信號(hào)和終止信號(hào)有效地連接于能夠在對(duì)其施用了所述核酸的個(gè)體或哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中指導(dǎo)表達(dá)的調(diào)控元件(包括啟動(dòng)子和多腺苷酸化信號(hào))。d.互補(bǔ)序列本文中所使用的“互補(bǔ)序列(Complement) ”或“互補(bǔ)的(complementary) ”可以意指核酸，可以意指核酸分子的核苷酸或核苷酸類似物之間的沃爾森-克里克(例如，A-T/U和C-G)或Hoogsteen喊基配對(duì)。e.共有區(qū)或共有序列本文中所使用的“共有區(qū)”或“共有序列”可以意指基于特定流感抗原的多個(gè)亞型 的比對(duì)分析構(gòu)建的合成的核酸序列或相應(yīng)多肽序列，其可用于誘導(dǎo)抗特定流感抗原的多個(gè)亞型或血清型的廣泛免疫。共有FMDV抗原可包括VPI、VP2、VP3、VP4和C2蛋白酶核苷酸和氨基酸序列。同樣地，還可將合成抗原例如融合蛋白操作成共有序列(或共有抗原)。f.恒定電流本文中所使用的“恒定電流”定義了在被遞送至相同組織的電脈沖的持續(xù)時(shí)間中被組織或界定所述組織的細(xì)胞接收或經(jīng)受的電流。電脈沖源自從本文中描述的電穿孔裝置。該電流在電脈沖的壽命期間以恒定的安培度保持在所述組織中，因?yàn)楸疚闹刑峁┑碾姶┛籽b置具有反饋元件，從而優(yōu)選具有瞬時(shí)反饋。反饋元件可在整個(gè)脈沖持續(xù)過(guò)程中測(cè)量組織(或細(xì)胞)的電阻并且引起電穿孔裝置改變其電能輸出(例如，增加電壓)，這樣相同組織中的電流在整個(gè)電脈沖過(guò)程中(在微秒的量級(jí)上)以及脈沖之間保持恒定。在某些實(shí)施方案中，反饋元件包括控制器。g.電流反饋或反饋本文中所使用的“電流反饋”或“反饋”可互換使用并且可以意指提供的電穿孔裝置的活動(dòng)響應(yīng)，其包括測(cè)量電極之間的組織中的電流和相應(yīng)地改變由EP裝置遞送的能量輸出，以將電流維持在恒定水平上。該恒定水平是由用戶在開(kāi)始脈沖序列或電處理之前預(yù)先設(shè)置的。反饋可通過(guò)電穿孔裝置的電穿孔組件例如控制器來(lái)實(shí)現(xiàn)，因?yàn)槠渲械碾娐纺軌蜻B續(xù)監(jiān)控電極之間的組織中的電流并且將該監(jiān)控的電流(或組織內(nèi)的電流)與預(yù)設(shè)電流相比較，以及不斷地進(jìn)行能量輸出調(diào)整以將監(jiān)控的電流維持在預(yù)設(shè)水平上。由于反饋回路為模擬閉合環(huán)反饋，因此其可以是瞬時(shí)的。h.分散電流本文中所使用的“分散電流”可以意指從本文中描述的電穿孔裝置的各種針電極陣列傳遞的電流的模式，其中所述模式使待被電穿孔的組織的任何區(qū)域上的電穿孔相關(guān)熱應(yīng)激的發(fā)生降至最低或優(yōu)選消除其發(fā)生。i.電穿孔本文中可互換使用的“電穿孔”、“電通透作用(electro-permeabilization) ”或“電動(dòng)力學(xué)增強(qiáng)(electro-kinetic enhancement) ”( “EP”)可以指使用跨膜電場(chǎng)脈沖來(lái)在生物膜上誘導(dǎo)極微小的路徑(孔)；它們的存在允許生物分子例如質(zhì)粒、寡核苷酸、siRNA,藥物、離子和水從細(xì)胞膜的一側(cè)穿過(guò)進(jìn)入另一側(cè)。j.反饋機(jī)制
本文中所使用的“反饋機(jī)制”可以指通過(guò)軟件或硬件(或固件)進(jìn)行的過(guò)程，所述過(guò)程接收和比較期望的組織的阻抗(在遞送脈沖能量之前、期間和/或之后)與預(yù)設(shè)值(優(yōu)選電流)，然后調(diào)整所遞送的脈沖能量以達(dá)到所述預(yù)設(shè)值?？赏ㄟ^(guò)模擬閉環(huán)回路進(jìn)行反饋機(jī)制。k 片段本文中所使用的“片段”可以意指核酸的一部分，所述部分編碼能夠在哺乳動(dòng)物中引起與至少一個(gè)FMDV亞型例如A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3的非片段引起的免疫反應(yīng)大體上相似的免疫反應(yīng)的多肽。所述片段可以是選自本發(fā)明的各種編碼核苷酸序列(包括SEQ ID NO :1-7和15-21)的至小一個(gè)的DNA片段。所述片段可包括SEQ ID N0:l、3、
5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的核酸序列的至少 10%,至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少 95%。片段可包括 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、 35、37、39和41的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少95%，提供的片段包括氨基酸21、86、127、129、154、156、182、195、206、218、220、237、249、255、265、271或275的一個(gè)或多個(gè)。所有此類片段也可任選地不包括氨基酸。DNA片段在長(zhǎng)度上可以為30或更多個(gè)核苷酸，在長(zhǎng)度上為45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多、720或更多、780或更多、840或更多、900或更多、960或更多、1020或更多、1080或更多、1140或更多、1200或更多、1260或更多、1320或更多、1380或更多、1440或更多、1500或更多、1560或更多、1620或更多、1680或更多、1740或更多、1800或更多、1860或更多、1820或更多、1880或更多、1940或更多、2000或更多、2600或更多、2700或更多、2800或更多、2900或更多、2910或更多、2920或更多、2930或更多、2931或更多、2932或更多、2933或更多、2934或更多、2935或更多、2936或更多、2937或更多或2938或更多個(gè)核苷酸。DNA片段可包括免疫球蛋白前導(dǎo)序列例如IgE或IgG序列的編碼序列。DNA片段可少于10個(gè)核苷酸、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于720、少于780、少于840、少于900、少于960、少于1020、少于1080、少于1140、少于1200、少于1260、少于1320、少于1380、少于1440、少于1500、少于1560、少于1620、少于1680或少于1740個(gè)核苷酸、少于1800、少于1860、少于1820、少于1880、少于1940、少于2000、少于2600、少于2700、少于2800、少于2900、少于2910、少于2920、少于2930、少于2931、少于2932、少于2933、少于2934、少于2935、少于2936、少于2937或少于2938個(gè)核苷酸?！捌巍边€可表示能夠在哺乳動(dòng)物中引起與至少一個(gè)FMDV亞型例如A、Asia 1、C、
0、SAT1、SAT2或SAT3的非片段引起的免疫反應(yīng)大體上相似的免疫反應(yīng)的多肽片段。片段可以是選自本發(fā)明的各種編碼多肽序列(包括SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42)的至少一個(gè)的多肽片段。可分析多肽片段以接觸由公共可獲得的數(shù)據(jù)庫(kù)例如LosAlamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的FMDV序列數(shù)據(jù)庫(kù)提供的至少一個(gè)抗原性表位。蛋白質(zhì)的片段可包括 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的至少10 %、至少20 %、至少30 %、至少40 %、至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、至少90 %或至少95 %。多肽可包括免疫球蛋白前導(dǎo)序列例如IgE或IgG的氨基酸序列。多肽片段在長(zhǎng)度上可為30或更多個(gè)氨基酸，在長(zhǎng)度上可為45或更多、60或更多、75或更多、90或更多、120或更多、150或更多、180或更多、210或更多、240或更多、270或更多、300或更多、360或更多、420或更多、480或更多、540或更多、600或更多、660或更多或710個(gè)氨基酸或更多氨基酸。肽片段在長(zhǎng)度上可少于10個(gè)氨基酸、少于20、少于30、少于40、少于50、少于60、少于75、少于90、少于120、少于150、少于180、少于210、少于240、少于270、少于300、少于360、少于420、少于480、少于540、少于600、少于660、少于700、少于701、少于702、少于703、少于704、少于705、少于706、少于707、少于708、少于709或少于710個(gè)氨基酸。I.同源性可使用 Clustalff (http: IIwm. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index, html)產(chǎn)生 多個(gè)序列比對(duì)的同源性。m.同一性本文中所使用的“相同的”或“同一性”在兩個(gè)或更多個(gè)核酸或多肽序列的上下文中可以意指序列具有指定百分比的在指定區(qū)域內(nèi)相同的殘基?？扇缦掠?jì)算百分比通過(guò)任選地將兩個(gè)序列對(duì)齊，在指定的區(qū)域中比較兩個(gè)序列，測(cè)定兩個(gè)序列中在其上存在相同殘基的位點(diǎn)的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位點(diǎn)的數(shù)目，將匹配位點(diǎn)的數(shù)目除以指定區(qū)域的位點(diǎn)總數(shù)，然后將結(jié)果乘以100來(lái)產(chǎn)生序列同一性的百分比。在其中兩個(gè)序列具有不同長(zhǎng)度或比對(duì)產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)交錯(cuò)末端并且指定的比較區(qū)域只包括單一序列的情況下，將單個(gè)序列的殘基包括在計(jì)算的分母中而非分子中。當(dāng)比較DNA和RNA時(shí)，可認(rèn)為胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)是等同的?？墒止せ蛲ㄟ^(guò)使用計(jì)算機(jī)序列算法例如BLAST或BLAST 2. 0來(lái)計(jì)算同一性。n.阻抗當(dāng)討論反饋機(jī)制時(shí)可使用本文中所使用的“阻抗”，可按照歐姆定律將其轉(zhuǎn)換成電流值，從而使得能夠與預(yù)設(shè)電流進(jìn)行比較。0.免疫反應(yīng)本文中使用的“免疫反應(yīng)”可以意指宿主的免疫系統(tǒng)例如哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)響應(yīng)FMDV共有序列的引入(通過(guò)提供的DNA質(zhì)粒疫苗)的激活。免疫反應(yīng)可以以細(xì)胞或體液反應(yīng)或兩者的形式存在。p.核酸本文中所使用的“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”可意指至少兩個(gè)共價(jià)連接在一起的核苷酸。單鏈的描述也確定了互補(bǔ)鏈的序列。因此，核酸還包括被描述的單鏈的互補(bǔ)鏈。核酸的許多變體可用于與給定的核酸相同的目的。因此，核酸還包括大體上相同的核酸及其互補(bǔ)序列。單鏈提供了可在嚴(yán)格雜交條件下與靶序列雜交的探針。因此，核酸還包括在嚴(yán)格雜交條件下雜交的探針。核酸可以是單鏈或雙鏈的，或可包含雙鏈和單鏈序列的部分。核酸可以是DNA (基因組DNA和cDNA)、RNA或雜交體，其中核酸可包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的組合，以及堿基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶和異鳥(niǎo)嘌呤)的組合。核酸可通過(guò)化學(xué)合成法或通過(guò)重組法獲得。
核酸通常包括磷酸二酯鍵，雖然可包括核酸類似物，所述核酸類似物可具有至少一個(gè)不同的連接例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或0-甲基亞磷酰胺連接以及肽核酸主鏈和連接。其它核酸類似物包括具有帶正電荷主鏈(positive backbone)、非離子型主鏈和非核糖主鏈的核酸類似物，包括美國(guó)專利No. 5，235，033和5，034，506 (將所述專利通過(guò)引用并入本文)中描述的核酸類似物。包括一個(gè)或多個(gè)非天然存在或修飾的核苷酸的核酸也包括在核酸的定義內(nèi)。修飾核苷酸類似物可位于例如核酸分子的5'末端和/或3'末端。核苷酸類似物的代表性實(shí)例可選自糖-或主鏈-修飾的核糖核苷酸。然而應(yīng)當(dāng)指出，包含非天然存在的核堿基而非天然存在的核堿基的核堿基修飾的核苷酸即核糖核苷酸，例如在5-位上被修飾的尿苷或胞苷例如5-(2-氨基)丙基尿苷、5-溴尿苷；在8_位上被修飾的腺苷和鳥(niǎo)苷例如8-溴鳥(niǎo)苷；脫氮核苷酸例如7-脫氮-腺苷；0_和N-燒基化的核苷酸例如N6-甲基腺苷也是合適的。2' -OH-基團(tuán)可被選自H、OR、R、鹵素、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基團(tuán)替代，其中R為C1-C6烷基、烯基或炔基并且齒素為F、Cl、Br或I。修飾核苷酸還包括通過(guò)例如Krutzfeldt等人,Nature (2005年10月30日)，Soutschek等人，Nature 432 :173-178(2004)和美國(guó)專利公布No. 20050107325 (將所述文獻(xiàn)和專利公布通過(guò)引用并入本文)中描述的羥脯氨醇連接與膽固醇綴合的核苷酸。修飾核苷酸和核酸還可/包括鎖核酸(locked nucleic acid) (LNA)，如美國(guó)專利No. 20020115080 (將其通過(guò)引用并入本文)中所描述的。其它修飾核苷酸和核酸描述于美國(guó)專利公布No. 20050182005(將其通過(guò)引用并入本文)中?？梢蚨鄠€(gè)原因進(jìn)行磷酸核糖主鏈的修飾例如以增加這類分子在生理環(huán)境中的穩(wěn)定性和半衰期，以增強(qiáng)穿過(guò)細(xì)胞膜的擴(kuò)散，或作為生物芯片上的探針?？芍苽涮烊淮嬖诘暮怂岷皖愃莆锏幕旌衔铮豢蛇x擇地，可制備不同核酸類似物的混合物和天然存在的核酸與類似物的混合物。q.有效連接的本文中所使用的“有效連接的”可以意指基因的表達(dá)處于與其空間上連接的啟動(dòng)子的控制之下。啟動(dòng)子可位于處于其控制之下的基因的5'(上游)或3'(下游)。啟動(dòng)子與基因之間的距離可以與所述啟動(dòng)子所源自的基因中啟動(dòng)子與其控制的基因之間的距離大致相同。這在本領(lǐng)域是已知的，該距離的變化可被容納而不喪失啟動(dòng)子功能。r.啟動(dòng)子本文中所使用的“啟動(dòng)子”可以意指能夠賦予、激活或增強(qiáng)核酸在細(xì)胞中表達(dá)的合成或天然來(lái)源的分子。啟動(dòng)子可包括一個(gè)或多個(gè)特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列以進(jìn)一步增強(qiáng)表達(dá)和/或改變相同基因的空間表達(dá)和/或時(shí)間表達(dá)。啟動(dòng)子還可包括離轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)多至數(shù)千堿基對(duì)的遠(yuǎn)側(cè)增強(qiáng)子或抑制元件Oppressor element)。啟動(dòng)子可源自包括病毒、細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)和動(dòng)物的來(lái)源。啟動(dòng)子可組成型地或差異地(針對(duì)其中表達(dá)發(fā)生的細(xì)胞、組織或器官或針對(duì)表達(dá)發(fā)生時(shí)所處的發(fā)育階段，或響應(yīng)外部刺激例如生理應(yīng)激、病原體、金屬離子或誘導(dǎo)劑)調(diào)節(jié)基因組件的表達(dá)。啟動(dòng)子的代表性實(shí)例包括細(xì)菌噬菌體17啟動(dòng)子、細(xì)菌噬菌體T3啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、Iac操縱子-啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、SV40晚期啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、RSV-LTR啟動(dòng)子、CMV IE啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子或SV40晚期啟動(dòng)子和CMV IE啟動(dòng)子。s.嚴(yán)格雜交條件本文中所使用的“嚴(yán)格雜交條件”可以意指在其下第一核酸序列(例如，探針)將與例如核酸的復(fù)雜混合物中的第二核酸序列(例如，靶)雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴性的并且在不同的情況下不同。嚴(yán)格條件可經(jīng)選擇為比特定序列在確定的離子強(qiáng)度PH下的熱解鏈溫度(thermal melting point) (Tm)低約5_10°C。Tm可以是平衡時(shí)50%的與革巴互補(bǔ)的探針與靶序列雜交(由于靶序列過(guò)量存在，因此在Tm下，50%的探針在平衡時(shí)被占據(jù))所處的溫度(在確定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下)。嚴(yán)格條件可以是這樣的條件，其中鹽濃度低于約I. OM的鈉離子，例如在pH 7. 0至8. 3下約0. 01-1. OM的鈉離子濃度(或其它鹽)并且溫度為至少約30°C (對(duì)于短探針(例如，約10-50個(gè)核苷酸)而言)和至少約60°C (對(duì)于長(zhǎng)探針(例如，超過(guò)約50個(gè)核苷酸)而言)。嚴(yán)格雜交還可通過(guò)添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺來(lái)獲得。對(duì)于選擇性或特異性雜交，正信號(hào)可以為至少2至10倍于本底的雜交。示例性嚴(yán)格雜交條件包括下列條件50%甲酰胺，5x SSC和1% SDS，于42°C下溫育，或5x SSC，1% SDS，于65°C下溫育，在65°C下于0.2x SSC和0. I % SDS中進(jìn)行洗滌。t.大體上互補(bǔ)本文中所使用的“大體上互補(bǔ)”可以意指第一序列與8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或
更多個(gè)核苷酸或氨基酸的區(qū)域上與第二序列的互補(bǔ)序列具有至少60%、65%、70%、75%、80 %、85 %、90 %、95 %、97 %、98 %或99 %的同一性，或兩個(gè)序列在嚴(yán)格雜交條件下雜交。u.大體上相同的本文中所使用的“大體上相同的”可以意指第一與第二序列在8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95,100或更多個(gè)核苷酸或氨基酸的區(qū)域上具有至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90^^95^^97^^98%或99%的同一性，或?qū)τ诤怂岫?，如果第一序列與第二序列的互補(bǔ)序列大體上互補(bǔ)。V.亞型或血清型在本文中可互換所使用并且關(guān)于FMDV病毒的“亞型”或“血清型”意指FMDV病毒抗原的遺傳變體，以便一個(gè)亞型與不同亞型可被免疫系統(tǒng)識(shí)別區(qū)分開(kāi)來(lái)。w.變體本文中所使用的針對(duì)核酸的“變體”可以意指(i)參照的核苷酸的部分或片段；(ii)參照的核苷酸序列或其部分的互補(bǔ)序列；(iii)與參照的核酸或其互補(bǔ)序列大體上相同的核酸；或(iv)在嚴(yán)格條件下與參照的核酸、其互補(bǔ)序列或與其大體上相同的序列雜交的核酸。針對(duì)肽或多肽的“變體”意指在氨基酸序列上相異在于氨基酸的插入、缺失或保守置換，但保留至少一種生物活性的肽或多肽。變體還可以指具有在氨基酸序列上與參照蛋白質(zhì)大體上相同的氨基酸序列的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)保留至少一種生物活性。氨基酸的保守置換，即用具有相似性質(zhì)(例如，親水性、帶電荷區(qū)域的程度和分布)的不同氨基酸替代氨基酸，在本領(lǐng)域被認(rèn)為通常包括較小的改變。這些較小的改變可部分地通過(guò)考慮氨基酸的親水指數(shù)來(lái)鑒定，如本領(lǐng)域中所理解的。Kyte等人，J. Mol. Biol. 157 :105-132 (1982)。氨基酸的親水指數(shù)基于其疏水性和電荷的考慮。在本領(lǐng)域中已知具有相似親水指數(shù)的氨基酸可被置換并且仍保持蛋白質(zhì)功能。在一個(gè)方面，具有為±2的親水指數(shù)的氨基酸被置換。氨基酸的親水性也可用于展現(xiàn)可導(dǎo)致保留生物功能的蛋白質(zhì)的置換。在肽的上下文中氨基酸的親水性的考慮允許計(jì)算該肽的最大局部平均親水性，這是已被報(bào)導(dǎo)與抗原性和免疫原性充分相關(guān)的有用測(cè)量。美國(guó)專利No. 4，554，101，通過(guò)引用整體并入本文。具有相似親水性值的氨基酸的置換可導(dǎo)致保留生物活性例如免疫原性的肽，這在本領(lǐng)域是被理解的?？衫帽舜司哂性凇?內(nèi)的親水性值的氨基酸進(jìn)行置換。氨基酸的疏水性指數(shù)和親水性值都受到該氨基酸的特定側(cè)鏈影響。與該觀察相一致地，與生物功能相容的氨基酸置換經(jīng)理解取決于氨基酸(特別是這些氨基酸的側(cè)鏈)的相對(duì)相似性，如通過(guò)疏水性、親水性、電荷、大小和其它性質(zhì)所揭示的。X.載體本文中所使用的“載體”可以意指包含復(fù)制起始點(diǎn)的核酸序列。載體可以是質(zhì)粒、細(xì)菌噬菌體、細(xì)菌人工染色體或酵母人工染色體。載體可以是DNA或RN A載體。載體可以是自主復(fù)制染色體外載體或整合入宿主基因組的載體。2. FMDV 蛋白本文中提供了能夠在哺乳動(dòng)物中引起抗一個(gè)或多個(gè)口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應(yīng)的抗原。所述抗原可以是包含衣殼蛋白VPl、VP2、VP3、VP4、其共有序列、其變體、其片段或其組合的FMDV抗原。FMDV抗原可來(lái)自FMDV亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3。FMDV抗原可包含至少一個(gè)抗原性表位，所述表位可以對(duì)于可針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特定FMDV免疫原是有效的。FMDV抗原的空病毒衣殼蛋白VP1-4提供了一整套存在于完整FMDV病毒中的免疫原性位點(diǎn)和表位。共有FMDV抗原序列可源自來(lái)自一個(gè)FMDV亞型的多種FMDV病毒的FMDV抗原序列。共有FMDV抗原可包括VP1、VP2、VP3和VP4 FMDV亞型共有蛋白質(zhì)序列，其可以是共有VP1-4蛋白。共有VP1-4蛋白可包括至少一個(gè)FMDV蛋白3C的切割位點(diǎn)。蛋白3C的切割位點(diǎn)可存在于共有VP1-4蛋白的每一個(gè)共有VP1、VP2、VP3和VP4序列之間。蛋白3C對(duì)共有VP1-4蛋白的切割可切割共有VP1-4蛋白以產(chǎn)生共有VPl-蛋白、共有VP2-蛋白、共有VP3-蛋白和共有VP4蛋白?？蛇x擇，天然蛋白水解切割位點(diǎn)可存在于每一個(gè)共有抗原序列之間，例如氨基酸序列SEQ ID NO 45 RGRKRRS0提供了包含共有VP1、VP2、VP3和VP4以及蛋白酶3C的共有序列的融合蛋白。存在分別作為亞型 A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2 和 SAT3 的共有序列的 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12 和 14。SEQ ID NO : 16為共有3C蛋白酶序列。提供了包含共有VP1、VP2、VP3和VP4的融合蛋白。存在SEQ ID NO :18、20、22、24、26、28和30，它們分別為亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2和SAT3的共有序列。SEQ ID NO :32、34、36和38分別為VPl亞型Asia、O、A和C的共有序列。這些序列包括IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO :44，所述前導(dǎo)序列在每一種情況下可被不同前導(dǎo)序列置換或可被缺失且被甲硫氨酸置換。SEQ ID NO :40和42為VPl的兩個(gè)共有序列的融合蛋白。SEQ ID NO :40為共有VPl亞型A和VPl亞型C。SEQ ID NO 42為共有VPl亞型Asia和VPl亞型O。這些序列包括IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO :44，所述前導(dǎo)序列在每一種情況下可被不同前導(dǎo)序列置換或可被缺失且被甲硫氨酸置換。此外，蛋白質(zhì)可以為SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的片段。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的20%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的20%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的30%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的40%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的50%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的60%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的70%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的80%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的90。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的95 。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的96%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的97%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的98%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為共有蛋白質(zhì)的99%。此外，蛋白質(zhì)與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有80%同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有90%同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有95%同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有96%同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有97%同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有98%同源性。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)具有99%同源性。此外，蛋白質(zhì)為與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白質(zhì)的片段。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的20%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的20%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的30%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的40%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的50%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的60%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的70%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的80%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的90%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的95%。在某些實(shí)施方案中，p蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的96%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的97%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的98%。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)為同源蛋白質(zhì)的99%。3.編碼序列本文中提供了能夠在哺乳動(dòng)物中引起抗一個(gè)或多個(gè)口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應(yīng)的抗原的編碼序列。抗原可以是包含衣殼蛋白VP1、VP2、VP3、VP4、其共有序列、其變體、其片段或其組合的FMDV抗原。FMDV抗原可來(lái)自FMDV亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2或SAT3。FMDV抗原可包含至少一個(gè)抗原性表位，所述表位可以對(duì)于可針對(duì)其誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的特定FMDV免疫原是有效的。FMDV抗原的空病毒衣殼蛋白VP1-4提供了一整套存在于完整FMDV病毒中的免疫原性位點(diǎn)和表位。共有FMDV抗原序列可源自來(lái)自一個(gè)FMDV亞型的多種FMDV病毒的FMDV抗原序列。共有FMDV抗原可包含VP1、VP2、VP3和VP4FMDV亞型共有蛋白質(zhì)序列，其可以是共有VP1-4蛋白。共有VP1-4蛋白可包含至少一個(gè)FMDV蛋白3C的切割位點(diǎn)。蛋白3C的切割位點(diǎn)可存在于共有VP1-4蛋白的每一個(gè)共有VP1、VP2、VP3和VP4序列之間。蛋白3C對(duì)共有VP1-4蛋白的切割可切割共有VP1-4蛋白以產(chǎn)生共有VPl-蛋白、共有VP2-蛋白、共有VP3-蛋白和共有VP4蛋白。可選擇，天然蛋白水解切割位點(diǎn)可存在于每一個(gè)共有抗原序列之間，例如氨基酸序列SEQ ID NO :45 :RGRKRRS。提供了包含共有￥ 1、￥ 2、￥ 3和￥ 4以及蛋白酶3C的共有序列的融合蛋白的編 碼序列。存在分別作為亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2和SAT3的共有序列的SEQ ID NO:
1、3、5、7、9、11和 132。
SEQ ID NO :15編碼共有3C蛋白酶序列。提供了包含共有VPI、VP2、VP3和VP4的融合蛋白的編碼序列。存在SEQ ID NO
17、19、21、23、25、27 和 29，它們分別為亞型 A、Asia I、C、O、SATU SAT2 和 SAT3 的共有序列。SEQ ID NO :31、33、35和37分別編碼VPl亞型Asia、O、A和C的共有序列。這些序列包括IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO :44的編碼序列，所述編碼序列在每一種情況下可被不同前導(dǎo)序列的編碼序列置換或可被缺失且僅被起始密碼子置換。SEQ ID NO :40和42為VPl的兩個(gè)共有序列的融合蛋白。SEQ ID NO :40為共有VPl亞型A和VPl亞型C。SEQ ID NO 42為共有VPl亞型Asia和VPl亞型O。這些序列包括IgE前導(dǎo)序列SEQ ID NO :44，所述前導(dǎo)序列在每一種情況下可被不同前導(dǎo)序列的編碼序 列置換或可被缺失且僅被起始密碼子置換。此外，編碼序列可編碼可為SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的片段的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的20%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的30%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的40%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的50%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的60%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的70%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的85%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的90%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的95%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的96%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為共有蛋白質(zhì)的97%的蛋白質(zhì)。此外，編碼序列編碼與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、
30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有80%同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有90%同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有95%同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有96%同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有97%同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有98%同源性的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼具有99%同源性的蛋白質(zhì)。此外，編碼序列編碼作為與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有同源性的蛋白質(zhì)的片段的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的20%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的30%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的40%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的50%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的60%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的70%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的80%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的90%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的95%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的96%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的97%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的98%的蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施方案中，編碼序列編碼為同源蛋白質(zhì)的99%的蛋白質(zhì)。此外，編碼序列可以為SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41的片段、在某些實(shí)施方案中，片段為SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的 20 % ,30 % ,40 % ,50 % ,60 % ,70 %,80%、90%、95%、96%、97%、98% 或 99%。此外，編碼序列可以與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、
31、33、35、37、39和41同源。在某些實(shí)施方案中，編碼序列與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 具有 80 % ,90 % ,95 % ,96 % ,97 % ,98 %
或99%同源性。此外，編碼序列可以與SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、
31、33、35、37、39和41的片段同源。在某些實(shí)施方案中，片段為SEQ ID NO :1、3、5、7、9、
11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的 20 %,30 %,40 %,50 %,60 %,70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%，并且所述編碼序列與SEQ ID N0:l、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39 和 41 的片段具有 80%,90%,95%,96%、97%、98%或 99% 同源性。4.質(zhì)粒本文中提供了能夠以有效地引起哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)的量在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中表達(dá)一種或多種FMDV抗原的載體。所述載體可包括編碼FMDV抗原的異源核酸。載體可以為質(zhì)粒。所述質(zhì)粒對(duì)于利用編碼FMDV抗原的核酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞是有用的，培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，將其維持在其中FMDV抗原的表達(dá)發(fā)生的條件下。所述質(zhì)?？砂幋a選自SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42的FMDV抗原、其片段、其同源序列和同源序列的片段的核酸。所述質(zhì)粒還可包含起始密碼子或前導(dǎo)序列(所述密碼子和序列可位于編碼序列的上游)和終止密碼子(其可位于編碼序列的下游)。起始和終止密碼子可與編碼序列在框內(nèi)。質(zhì)粒還可包含有效地連接于編碼序列的啟動(dòng)子。有效地連接于編碼序列的啟動(dòng)子可以是來(lái)自猿猴病毒40(SV40)的啟動(dòng)、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動(dòng)子、人免疫缺陷病毒(HIV)啟動(dòng)子例如牛免疫缺陷病毒(BIV)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)啟動(dòng)子、莫洛尼病毒啟動(dòng)子、禽類白血病病毒(ALV)啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子例如CMV立即早期啟動(dòng)子、EB病毒(Epstein Barr virus) (EBV)啟動(dòng)子或勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以是來(lái)自人基因例如人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或人金屬硫蛋白的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以是組織特異性啟動(dòng)子，例如肌肉或皮膚特異性啟動(dòng)子(天然或合成的)。此類啟動(dòng)子的實(shí)例描述于第US20040175727號(hào)美國(guó)專利申請(qǐng)公布(將其內(nèi)容通過(guò)弓I用整體并入本文)中。質(zhì)粒還可包括多腺苷酸化信號(hào)，其可位于編碼區(qū)的下游。多腺苷酸化信號(hào)可以是SV40多腺苷酸化信號(hào)、LTR多腺苷酸化信號(hào)、牛生長(zhǎng)激素(bGH)多腺苷酸化信號(hào)、人生長(zhǎng)激素(hGH)多腺苷酸化信號(hào)或人￠-珠蛋白多腺苷酸化信號(hào)。SV40多腺苷酸化信號(hào)可以是來(lái)自pCEP4質(zhì)粒(Invitrogen, San Diego, CA)的多腺苷酸化信號(hào)。質(zhì)粒還可包括編碼序列的上游增強(qiáng)子。增強(qiáng)子可以為人肌動(dòng)蛋白、人肌球蛋白、人血紅蛋白、人肌肉肌酸或病毒增強(qiáng)子例如來(lái)自CMV、FMDV、RSV或EBV的增強(qiáng)子。多核苷酸功能增強(qiáng)描述于美國(guó)專利No. 5，593，972、5，962，428和W094/016737 (將每一個(gè)專利的內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)中。質(zhì)粒還包括哺乳動(dòng)物復(fù)制起始點(diǎn)以在細(xì)胞中染色體外維持質(zhì)粒和產(chǎn)生多拷貝的質(zhì)粒。質(zhì)粒可以是來(lái)自Invitrogen (San Diego, CA)的pVAXl、pCEP4或pREP4,其可包括EB病毒的復(fù)制起始點(diǎn)和細(xì)胞核抗原EBNA-I編碼區(qū)，其可產(chǎn)生高拷貝附加型復(fù)制而無(wú)需整合。質(zhì)粒的主鏈可以是PAV0242。質(zhì)?？梢允菑?fù)制缺陷型腺病毒5型(Ad5)質(zhì)粒。質(zhì)粒還可包含調(diào)控序列，其可以十分適合在已將質(zhì)粒施入其中的細(xì)胞中進(jìn)行基因表達(dá)。編碼序列可包含密碼子，所述密碼子可以允許編碼序列在宿主細(xì)胞中更高效地轉(zhuǎn)錄。編碼序列可包含Ig前導(dǎo)序列。所述前導(dǎo)序列可位于編碼序列的5’。由該序列編碼的共有蛋白質(zhì)可包含N-末端Ig前導(dǎo)序列，然后共有蛋白質(zhì)。N-末端Ig前導(dǎo)序列可以為IgE 或 IgG0
質(zhì)?？梢允莗SE420 (Invitrogen, San Diego, Calif.),可將其用于在大腸桿菌(Escherichia coli) (E. coli)中進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)。質(zhì)粒還可以是 pYES2 (Invitrogen,San Diego, Calif.),可將其用于在酵母的釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)株中進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)。質(zhì)粒還可具有MAXBAC 完整桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Invitrogen, SanDiego，Calif.)，可將其用于在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)。質(zhì)粒還可以是pcDNA I或pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, Calif.),可將其用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞例如中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中進(jìn)行蛋白質(zhì)生產(chǎn)。質(zhì)?？砂粋€(gè)或多個(gè)編碼序列，所述編碼序列編碼來(lái)自一個(gè)或多個(gè)亞型例如Asia、A、O、C、SATU SAT2 和 SAT3 的 VP1、VP2、VP3、VP4 和 3C 中的一個(gè)或多個(gè)。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含來(lái)自亞型Asia、A、O、C、SATl、SAT2或SAT3的多個(gè)不同的共有FMDV抗原VP1、VP2、VP3、VP4和3C的編碼序列。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含來(lái)自亞型Asia、A、O、C、SATl、SAT2或SAT3的多個(gè)不同的共有FMDV抗原VPl、VP2、VP3和VP4的編碼序列。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含來(lái)自亞型Asia、A、0和C中的兩個(gè)亞型的兩個(gè)不同的共有FMDV抗原VPl，例如來(lái)自亞型Asia的VPl和來(lái)自亞型0的VPl或來(lái)自t亞型A的VPl和來(lái)自亞型C的VPl。在某些實(shí)施方案中，質(zhì)粒包含共有FMDV抗原VPl例如VPl亞型Asia、VPl亞型A、VPl亞型0或VPl亞型C的編碼序列。編碼序列可由全部由有效連接的啟動(dòng)子調(diào)控的不同DNA質(zhì)粒例如具有由一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控的編碼序列(所述編碼序列包含多種共有FMDV抗原)的DNA質(zhì)粒編碼。5.疫苗然而不受科學(xué)理論束縛，可用于引起廣泛抗FMDV的免疫反應(yīng)(體液、細(xì)胞或兩者)的疫苗可包含上文中所示的一個(gè)或多個(gè)編碼序列，即編碼一種或多種來(lái)自亞型(選自FMDV亞型例如 A、As ia I、C、0、SATI、SAT2、SAT3 或其組合)的蛋白質(zhì) VPI、VP2、VP3、CVP4 和 3C的核酸序列。編碼序列還可包括包含同源序列、片段和片段的同源序列的那些編碼序列。可選擇地或此外，誘導(dǎo)抗FMDV免疫反應(yīng)的組合物還可包括一種或多種選自FMDV亞型例如A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3 或其組合的蛋白質(zhì)。本文中提供了能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型的免疫反應(yīng)的疫苗。所述疫苗可包含上述質(zhì)粒。疫苗可包含多種各自針對(duì)一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型例如A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的質(zhì)粒。疫苗還可包含本身針對(duì)一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型例如A、Asia I、C、O、SATU SAT2、SAT3或其組合的FMDV抗原。疫苗還可包括針對(duì)來(lái)自世界的特定區(qū)域例如亞洲、歐洲和南非(sub-Africa)的FMDV亞型的質(zhì)粒?？蛇x擇地或此外，疫苗還可包括一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型例如A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的蛋白質(zhì)。疫苗還可包括本身針對(duì)一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型例如A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的FMDV抗原。疫苗還可包括針對(duì)來(lái)自世界的特定區(qū)域例如亞洲、歐洲和南非的FMDV亞型的質(zhì)粒和/或蛋白質(zhì)?？商峁┮呙缫哉T導(dǎo)治療性或預(yù)防性免疫反應(yīng)。疫苗還可包含編碼FMDV C3蛋白酶的核酸，其可以是共有C3蛋白酶核酸。共有蛋白質(zhì)3C核酸可以是蛋白3C編碼序列?？蛇x擇地或此外，疫苗還可包含F(xiàn)MDV C3蛋白酶，例如共有C3蛋白酶例如蛋白3C。疫苗還可包含編碼全長(zhǎng)或部分VP1-4編碼序列和全長(zhǎng)或部分C3編碼序列的嵌合基因?？蛇x擇地或此外，疫苗還可包含含有全長(zhǎng)或部分VP1-4以及全長(zhǎng)或部分C3的融合蛋白。/
本文中提供了根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物,所述藥物組合物包含約I納克至約IOmg的DNA。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含1)至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或至少 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895. 900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或 1000 微克，或至少 I. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5,6,6. 5,7,7. 5、8、8. 5,9,9. 5 或 IOmg 或更多；和 2)達(dá)到并且包括 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100 納克，或達(dá)到并且包括 1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、200、205、210、215、220、225、230、235、240、245、250、255、260、265、270、275、280、285、290、295、300、305、310、315、320、325、330、335、340、345、350、355、360、365、370、375、380、385、390、395、400、405、410、415、420、425、430、435、440、445、450、455、460、465、470、475、480、485、490、495、500、605、610、615、620、625、630、635、640、645、650、655、660、665、670、675、680、685、690、695、700、705、710、715、720、725、730、735、740、745、750、755、760、765、770、775、780、785、790、795、800、805、810、815、820、825、830、835、840、845、850、855、860、865、870、875、880、885、890、895. 900、905、910、915、920、925、930、935、940、945、950、955、960、965、970、975、980、985、990、995 或 1000 微克，或達(dá)到并且包括 I. 5,2,2. 5,3,3. 5,4,4. 5,5,5. 5、6、6. 5、7、7. 5、8、8. 5、9、9. 5或IOmg之間的DNA。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約5納克至約IOmg的DNA。在某些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物包含約25納克至約5mg的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約50納克至約Img的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約0. I至約500微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約5至約250微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約10至約200微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約15至約150微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約20至約100微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約25至約75微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約30至約50微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約35至約40微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA0在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約10微克至約100微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約20微克至約80微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約25微克至約60微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約30納克至約50微克的DNA。在某些實(shí)施方案中，藥物組合物包含約35納克至約45微克的DNA。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物包含約0. I至約500微克的DNA。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物包含約I至約350微克的DNA。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物包含約25至約250微克的DNA。在某些優(yōu)選實(shí)施方案中，藥物組合物包含約100至約200微克DNA。
根據(jù)待使用的施用模式配制根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在其中藥物組合物為可注射藥物組合物的情況下，它們是無(wú)菌、無(wú)熱源和無(wú)微粒的。優(yōu)選使用等滲制劑。通常地，用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。在某些情況下，等滲溶液例如磷酸緩沖鹽溶液是優(yōu)選的。穩(wěn)定劑包括明膠和白蛋白。在某些實(shí)施方案中，向制劑中加入血管收縮劑。優(yōu)選地藥物組合物為疫苗，更優(yōu)選為DNA疫苗。所述疫苗可以是DNA疫苗。DNA疫苗可包含多個(gè)相同或不同的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒包含一種或多種共有前列腺抗原的核酸編碼序列。DNA疫苗可包含一種或多種核酸序列,所述核酸序列編碼一種或多種共有前列腺抗原。當(dāng)DNA疫苗包含超過(guò)一種共有前列腺抗原的編碼序列時(shí)，所有此類序列可存在于單個(gè)質(zhì)粒上，或每一種此類序列可存在于不同質(zhì)粒上。在某些實(shí)施方案中，疫苗可包含編碼與一種或多種共有前列腺抗原組合的一種或多種共有前列腺抗原的核酸序列。DNA 疫苗公開(kāi)于美國(guó)專利 No. 5，593，972,5, 739，118,5, 817，637,5, 830，876、5，962，428,5, 981，505,5, 580，859,5, 703，055 和 5，676，594 (將所述專利通過(guò)引用整體并
入本文)中。DNA疫苗還可包含抑制其整合入染色體的元件或試劑。疫苗可以是前列腺抗原的RNA?？蓪NA疫苗引入細(xì)胞。疫苗可以是包含上述基因構(gòu)建體或抗原的重組疫苗。疫苗還可包含一種或多種共有前列腺抗原，所述抗原以一種或多種蛋白質(zhì)亞單位或一種或多種包含一種或多種共有抗原的減毒病毒顆粒的形式存在。減毒疫苗可以是減毒活疫苗、殺死的疫苗和使用重組載體遞送編碼一種或多種共有前列腺抗原的外源基因的疫苗，以及亞單位和蛋白質(zhì)疫苗。減毒活疫苗的實(shí)例，使用重組載體遞送前列腺抗原的那些疫苗、亞單位疫苗和糖蛋白疫苗，描述于美國(guó)專利 No. :4，510，245 ;4，797，368 ;4，722，848 ;4，790，987 ;4，920，209 ;5，017，487 ；5，077，044 ;5，110，587 ;5，112，749 ;5，174，993 ;5，223，424 ;5，225，336 ;5，240，703 ；5，242，829 ;5，294，441 ;5，294，548 ;5，310，668 ;5，387，744 ;5，389，368 ;5，424，065 ；5，451，499 ；5, 453，364 ；5, 462，734 ；5, 470，734 ；5, 474，935 ；5, 482，713 ；5, 591，439 ；5，643，579 ；5, 650，309 ；5, 698，202 ；5, 955，088 ；6, 034，298 ；6, 042，836 ；6, 156，319 和6，589，529 (將所述專利各自通過(guò)弓I用并入本文)中。疫苗可包含與其它疫苗組分例如FMDV蛋白或編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)載體組合的質(zhì)粒?？蓪⑻峁┑囊呙缬糜谡T導(dǎo)免疫反應(yīng),包括治療性或預(yù)防性免疫反應(yīng)?？僧a(chǎn)生針對(duì)共有前列腺抗原的抗體和/或殺傷T細(xì)胞?？煞蛛x此類抗體和細(xì)胞。疫苗還可包含藥學(xué)上可接受的賦形劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是功能分子如媒介物、佐劑、載體或稀釋劑。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑，其可包括表面活性劑，例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物、媒介物(vesicle)例如角鯊烯和角鯊烯、透明質(zhì)酸、脂質(zhì)、脂質(zhì)體、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽(yáng)離子或納米顆?；蚱渌阎霓D(zhuǎn)染促進(jìn)劑。 轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚陰離子、聚陽(yáng)離子，包括聚-L-谷氯酸(LGS)或脂質(zhì)。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚-L-谷氨酸，更優(yōu)選地，聚-L-谷氨酸以低于6mg/ml的濃度存在于疫苗中。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑還可包括表面活性劑例如免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐劑、LPS類似物(包括單磷酰脂質(zhì)A)、胞壁酰肽、醌類似物以及媒介物(vesicle)例如角鯊烯和角鯊烯，還可將透明質(zhì)酸與基因構(gòu)建體結(jié)合施用。在某些實(shí)施方案中，DNA質(zhì)粒疫苗還可包括轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體(包括卵磷脂脂質(zhì)體或本領(lǐng)域已知的其它脂質(zhì)體)如DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物(參見(jiàn)例如W09324640)、鈣離子、病毒蛋白質(zhì)、聚陰離子、聚陽(yáng)離子或納米顆?；蚱渌阎霓D(zhuǎn)染促進(jìn)劑。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑為聚陰離子、聚陽(yáng)離子(包括聚-L-谷氨酸(LGS)或脂質(zhì))。疫苗中轉(zhuǎn)染劑的濃度低于4mg/ml，低于2mg/ml，低于lmg/ml，低于0. 750mg/ml，低于0. 500mg/ml,低于 0. 250mg/ml,低于 0. 100mg/ml,低于 0. 050mg/ml 或低于 0. 010mg/ml。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是佐劑。所述佐劑可以是在替代質(zhì)粒中表達(dá)或作為與疫苗的上述質(zhì)粒組合的蛋白質(zhì)進(jìn)行遞送的其它基因。佐劑可選自《-干擾素(IFN-ci)、^ -干擾素(IFN- ￠), Y-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TNF a、TNF ^、GM-CSF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(cutaneous T cell-attracting chemokine)(CTACK)、上皮胸腺表達(dá)趨化因子(epithelial thymus-expressed chemokine) (TECK)、粘膜結(jié)合上皮趨化因子(mucosae-associated epithelial chemokine) (MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86 (包括具有缺失信號(hào)序列和任選地包含來(lái)自IgE的信號(hào)肽的IL-15)。佐劑可以為 11-12、11-15、0^0(、了￡0(、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TNF a、TNF0、GM_CSF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18 或其組合?？捎米髯魟┑钠渌虬ㄟ@樣的基因，所述基因編碼MCP_1、MIP-la、MIP_lp、IL-8、RANTES, L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, I CAM-3, CD2、LFA-3、M-CSF, G-CSF, IL-4,IL-18的突變形式、⑶40、⑶40L、血管生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-7、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、天胱酶 ICE、Fos、c_jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、無(wú)活性 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素應(yīng)答基因、NFkB, Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段。疫苗還可包括1994年4月I日提交的美國(guó)專利No. 021,579(將其通過(guò)引用整體并入本文)中描述的基因疫苗促進(jìn)劑。可根據(jù)待使用的施用模式配制疫苗。可注射疫苗藥物組合物可以是無(wú)菌、無(wú)熱源和無(wú)微粒的?？墒褂玫葷B制劑或溶液。用于等滲性的添加劑可包括氯化鈉、葡萄糖、甘露醇、山梨醇和乳糖。疫苗可包含血管收縮劑。等滲溶液可包含磷酸緩沖鹽溶液。疫苗還可包含穩(wěn)定劑(包括明膠和白蛋白)。穩(wěn)定化可允許制劑在室溫下或環(huán)境溫度下長(zhǎng)期穩(wěn)定，例如向疫苗制劑中加入LGS或聚陽(yáng)離子或聚陰離子。6.遞送疫苗的方法本文中提供了用于遞送疫苗以提供FMDV抗原的基因構(gòu)建體和蛋白質(zhì) 的方法，所述FMDV抗原包含使它們特別有效地抗FMDV的免疫原(可誘導(dǎo)針對(duì)其的免疫反應(yīng))的表位?？商峁┻f送疫苗或接種的方法以誘導(dǎo)治療性和預(yù)防性免疫反應(yīng)。接種方法可在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗多個(gè)FMDV亞型的免疫反應(yīng)。可將疫苗遞送至個(gè)體以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)的活性和增強(qiáng)免疫反應(yīng)。疫苗的遞送可以是以核酸分子的形式轉(zhuǎn)染FMDV抗原，所述核酸在細(xì)胞中表達(dá)并且被遞送至細(xì)胞的表面，然后免疫系統(tǒng)識(shí)別所述抗原并且誘導(dǎo)細(xì)胞、體液或細(xì)胞及體液反應(yīng)。通過(guò)給哺乳動(dòng)物施用上述疫苗，可將疫苗的遞送用于在哺乳動(dòng)物中誘導(dǎo)或引起抗多種FMDV病毒的免疫反應(yīng)。在將疫苗和質(zhì)粒遞送入哺乳動(dòng)物的細(xì)胞后，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞將表達(dá)和分泌從疫苗注射的每一種質(zhì)粒的共有衣殼。這類分泌的衣殼蛋白將被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來(lái)物，并且將產(chǎn)生抗它們的抗體。這類抗體將由免疫系統(tǒng)維持并且允許快速清除隨后的FMDV攻擊?？山o哺乳動(dòng)物施用疫苗以引起哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)。哺乳動(dòng)物可以是人、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、母牛、牛、綿羊、山羊、羚羊、野牛、水牛、野牛、?？苿?dòng)物(bovid)、鹿、豪豬、大象、駱馬、羊駝、小鼠、大鼠和雞。a.聯(lián)合治療可將疫苗與其它蛋白質(zhì)或基因組合施用，所述基因編碼a-干擾素、Y-干擾素、血小板衍生生長(zhǎng)因子(I3DGF)、TNF a、TNF0、GM-CSF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、皮膚T細(xì)胞虜獲趨化因子(CTACK)、上皮胸腺表達(dá)趨化因子(TECK)、粘膜結(jié)合上皮趨化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、⑶80、⑶86 (包括具有缺失信號(hào)序列和任選地包含來(lái)自IgE的信號(hào)肽的IL-15)、IL-12、IL-15、CTACK, TECK、血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)、TNF a、TNF^、GM-CSF、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、IL-U IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、MCP-1、MIP-la、MIP-lp、IL-8、RANTES、L-選擇蛋白、P-選擇蛋白、E-選擇蛋白、CD34、GlyCAM-I、MadCAM-I、LFA-I、VLA-I、Mac-1、pl50. 95、PECAM、ICAM-U I CAM-2, I CAM-3, CD2、LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4,IL-18的突變形式、⑶40、⑶40L、血管生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、IL-7、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、Fas、TNF 受體、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo_3、AIR、LARD、NGRF, DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、天胱酶 ICE、Fos、c_jun、Sp-I、Ap-I、Ap_2、p38、p65Rel、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、來(lái)活的 NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干擾素應(yīng)答基因、NFkB, Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK 配體、0x40、0x40LIGAND、NKG2D、MICA、MICB, NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAPI、TAP2 及其功能片段或其組合。還可將疫苗與CTACK蛋白、TECK蛋白、MEC蛋白或其功能片段組合施用。
可通過(guò)不同途徑(包括口服、胃腸外、舌下、經(jīng)皮膚、經(jīng)直腸、轉(zhuǎn)粘膜、局部、通過(guò)吸入、通過(guò)頰部施用、胸膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、硬膜內(nèi)和關(guān)節(jié)內(nèi)途徑或其組合)施用疫苗。為了進(jìn)行獸醫(yī)學(xué)使用，可按照標(biāo)準(zhǔn)獸醫(yī)實(shí)踐將組合物配制為適當(dāng)?shù)乜山邮艿闹苿?。獸醫(yī)可容易地確定最適合于具體動(dòng)物的給藥方案和施用途徑?？梢酝ㄟ^(guò)常規(guī)注射器、無(wú)針注射裝置、“微粒轟擊基因槍(microprojectile bombardment gone guns)”或其它物理方法例如電穿孔(“EP”)、“水動(dòng)力學(xué)法(hydrodynamic method) ”或超聲波來(lái)施用疫苗?？衫脦讉€(gè)公知的技術(shù)將疫苗的質(zhì)粒遞送至哺乳動(dòng)物，所述技術(shù)包括利用和不利用體內(nèi)電穿孔的、脂質(zhì)體介導(dǎo)的、納米顆粒促進(jìn)的重組載體例如重組腺病毒、重組腺病毒相關(guān)病毒和重組牛痘的DNA注射(也稱為DNA接種)。可通過(guò)DNA注射以及體內(nèi)電穿孔來(lái)遞送FMDV抗原。b.電穿孔可使用電穿孔裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)通過(guò)疫苗的質(zhì)粒的電穿孔進(jìn)行的疫苗施用，所述電穿孔 裝置被構(gòu)造用來(lái)將脈沖能量(所述脈沖能量產(chǎn)生與由用戶輸入的預(yù)設(shè)電流相似的恒定電流)遞送至哺乳動(dòng)物的期望的組織。電穿孔裝置可包括電穿孔組件和電極總成(electrodeassembly)或把手總成(handle assembly)。電穿孔組件可包括并且整合有電穿孔裝置的各種元件中的一個(gè)或多個(gè)元件，包括控制器、電流波形發(fā)生器、阻抗測(cè)試儀、波形記錄器、輸入元件、狀態(tài)報(bào)告元件、通信端口、存儲(chǔ)組件(memory component)、電源和電源開(kāi)關(guān)。電穿孔可使用幫助利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的VGXP Cellectra 系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。電穿孔組件可用作電穿孔裝置的一個(gè)元件，并且其它元件是與電穿孔組件通信的分開(kāi)的元件(或組件)。電穿孔組件可用作電穿孔裝置的超過(guò)一個(gè)元件，其仍然可與電穿孔裝置的與所述電穿孔組件分開(kāi)的其它元件通信。作為一個(gè)電機(jī)或機(jī)械裝置的部分存在的電穿孔裝置的元件可以不限為可用作一個(gè)裝置的元件或彼此通信的分開(kāi)的元件。電穿孔組件可以能夠遞送在期望的組織中產(chǎn)生恒定電流的脈沖能量，并且包括反饋機(jī)制。電極總成可包括將多個(gè)電極按空間排布的電極陣列，其中電極總成接收來(lái)自電穿孔組件的脈沖能量，并且通過(guò)電極將所述脈沖遞送至期望的組織。多個(gè)電極中的至少一個(gè)在遞送脈沖能量的過(guò)程中是中性的，并且測(cè)量期望的組織中的阻抗，以及將所述阻抗傳達(dá)給電穿孔組件。反饋機(jī)制可接收測(cè)量的阻抗并且可調(diào)整通過(guò)電極組件遞送的脈沖能量以維持恒定電流。多個(gè)電極可以以分散模式遞送脈沖能量。多個(gè)電極可通過(guò)處于程控次序(programmed sequence)下的電極的控制以分散模式遞送脈沖能量,所述程控次序由用戶輸入至電穿孔組件。程控次序可包括多個(gè)按次序遞送的脈沖，其中通過(guò)至少兩個(gè)有效電極和一個(gè)測(cè)量阻抗的中性電極遞送多個(gè)脈沖的每一個(gè)脈沖，并且其中通過(guò)至少兩個(gè)有效電極中的不同一個(gè)和測(cè)量阻抗的一個(gè)中性電極遞送多個(gè)脈沖的隨后的脈沖?？赏ㄟ^(guò)硬件或軟件來(lái)進(jìn)行反饋機(jī)制。可通過(guò)模擬閉環(huán)回路來(lái)進(jìn)行反饋機(jī)制。反饋可每50 ii s、20 ii S、10 ii s或I ii s發(fā)生一次，但優(yōu)選為實(shí)時(shí)反饋或瞬時(shí)反饋(S卩，大體上即時(shí)，如通過(guò)用于測(cè)定響應(yīng)時(shí)間的可用技術(shù)測(cè)定的)。中性電極可測(cè)量期望的組織中的阻抗并且將所述阻抗傳達(dá)給反饋機(jī)制，然后反饋機(jī)制響應(yīng)于該阻抗并且調(diào)整脈沖能量以將恒定電流維持在與預(yù)設(shè)電流相似的值上。反饋機(jī)制可在脈沖能量的遞送過(guò)程中連續(xù)且即時(shí)地維持恒定電流。
可幫助遞送本發(fā)明的DNA疫苗的電穿孔裝置和電穿孔方法的實(shí)例包括屬于Draghia-Akli等人的美國(guó)專利No. 7，245，963、由Smith等人提交的美國(guó)專利公布No. 2005/0052630(將所述專利和專利公布的內(nèi)容通過(guò)引用整體并入本文)中描述的那些裝置和方法?？捎糜趲椭f送DNA疫苗的其它電穿孔裝置和電穿孔方法包括2007年10月17日提交的共同未決和共同擁有的美國(guó)專利申請(qǐng)No. 1/874072(所述申請(qǐng)根據(jù)35 USC119(e)要求2006年10月17日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/852，149的利益)和2007年10月10日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/978，982(將全部所述專利申請(qǐng)通過(guò)引用整體并入本文)中提供的那些裝置和方法。Draghia-Akli等人的美國(guó)專利No. 7，245，963描述了標(biāo)準(zhǔn)電極系統(tǒng)以及它們用于幫助將生物分子引入身體或植物內(nèi)的選定組織的細(xì)胞中的用途。標(biāo)準(zhǔn)電極系統(tǒng)可包括多個(gè)針電極；皮下注射針；提供從程序控制的恒定電流脈沖控制器至多個(gè)針電極的導(dǎo)電連接的電連接器；和電源。操作員可緊握多個(gè)被安裝在支持結(jié)構(gòu)上的針電極并且將它們牢固地插入身體或植物內(nèi)的選定組織。隨后通過(guò)皮下注射針將生物分子遞送到選定組織。啟動(dòng)程序控制的恒定電流脈沖控制器，將恒定電流電脈沖施加至多個(gè)針電極。所施加的恒定電流電脈沖幫助將生物分子引入多個(gè)電極之間的細(xì)胞。將美國(guó)專利No. 7，245，963的全部?jī)?nèi)容通 過(guò)引用并入本文。由Smith等人提交的美國(guó)專利公布2005/0052630描述了可用于有效地促進(jìn)將生物分子弓I入身體或植物內(nèi)的選定組織的細(xì)胞的電穿孔裝置。電穿孔裝置包括電動(dòng)裝置(“EKD裝置”)，其操作由軟件或固件指定。EKD裝置基于用戶控制和脈沖參數(shù)的輸入在陣列中的電極之間產(chǎn)生一系列程序控制的恒定電流脈沖模式，并且允許存儲(chǔ)和獲取電流波形數(shù)據(jù)。電穿孔裝置還包括具有針電極的陣列的可替換電極盤(pán)、用于注射針的中央注射通道和可移動(dòng)的導(dǎo)盤(pán)。將美國(guó)專利公布2005/0052630的整體內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。美國(guó)專利No. 7，245，963和美國(guó)專利公布2005/0052630中描述的電極陣列和方法可適合于不僅深滲透到組織例如肌肉，而且還深滲透到其它組織或器官中。由于電極陣列的構(gòu)型的原因，還可將注射針(遞送選擇的生物分子)完全插入靶器官中，將注射垂直于靶組織施用至利用電極預(yù)先描繪的區(qū)域中。美國(guó)專利No. 7，245，963和美國(guó)專利公布2005/005263中描述的電極優(yōu)選為20_長(zhǎng)和21規(guī)格。此外，預(yù)期在某些整合電穿孔裝置和其用途的實(shí)施方案中，存在下列專利中描述的電穿孔裝置1993年12月28日公布的美國(guó)專利5，273，525，2000年8月29日公布的美國(guó)專利6，110, 161,2001年7月17日公布的6，261，281和2005年10月25日公布的6，958，060，以及2005年9月6日公布的美國(guó)專利6，939，862。此外，在本文中預(yù)期涵蓋2004年2月24日公布的美國(guó)專利6，697，669 (其涉及使用多種裝置的任一種遞送DNA)和2008年2月5日公布的美國(guó)專利7，328，064(涉及注射DNA的方法)中提供的主題的專利。將上述專利通過(guò)引用整體并入本文。c.制備疫苗的方法本文中提供了用于制備疫苗的方法。在某些實(shí)施方案中，所述方法為制備包含DNA質(zhì)粒的疫苗的方法。在最終通過(guò)亞克隆步驟克隆入哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)粒后，可使用本領(lǐng)域已知的方法將DNA質(zhì)粒用于在大規(guī)模發(fā)酵罐中接種細(xì)胞培養(yǎng)物。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入可相容的宿主細(xì)胞，在其中FMDV抗原的表達(dá)發(fā)生的條件下培養(yǎng)和維持所述細(xì)胞。可通過(guò)裂解細(xì)胞從培養(yǎng)物或從培養(yǎng)基回收FMDV抗原，分離抗原?？蓪⒎蛛x的VP1-4共有蛋白質(zhì)用于作為抗體的天然來(lái)源用于疫苗?？墒褂米詣?dòng)化合成儀，通過(guò)重組技術(shù)產(chǎn)生FMDV抗原，也可將所述FMDV抗原用于產(chǎn)生分離的基本上純的FMDV抗原。這些技術(shù)可用于引入FMDV的特定亞型的FMDV抗原的變體?？墒褂靡阎b置和技術(shù)的組合配制或制備與本發(fā)明的EP裝置一起使用的DNA質(zhì)粒，但優(yōu)選地使用最優(yōu)化的質(zhì)粒制備技術(shù)制備它們，所述技術(shù)描述于2007年5月23日提交的得到許可的共同未決的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)No. 60/939,792中。在某些實(shí)施例中，可以以大于或等于10mg/mL的濃度配制用于這些研究的DNA質(zhì)粒。除了 2007年7月3日公布的美國(guó)專利No. 60/939792中描述的那些裝置和方案(包括得到許可的美國(guó)專利No. 7，238，522中描述的那些裝置和方法)外，制備技術(shù)還包括或整合對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是公知的不同裝置和方案。將上文中提及的申請(qǐng)和專利(美國(guó)專利No. 60/939，792和美國(guó)專利No. 7，238，522)分別地通過(guò)引用整體并入本文。d.用于制備VP1-4表達(dá)構(gòu)建體的方法通過(guò)首先使用來(lái)自FMDV亞型Asia、O、A、C、SATU SAT2和SAT3的至少10個(gè)不同序列最優(yōu)化所述FMDV亞型之一的VP1、VP2、VP3和VP4氨基酸序列來(lái)構(gòu)建多靶向性FMDVDNA疫苗。產(chǎn)生各自編碼亞型最優(yōu)化的VP1-4蛋白的核酸。將亞型最優(yōu)化的VP1-4核酸序列克隆為連接編碼序列，VP通過(guò)間插FMDV蛋白3C蛋白酶切割位點(diǎn)分隔。在操縱子的控制下將最優(yōu)化的VP1-4編碼序列插入表達(dá)載體pVAX或pAV0242。將IgE前導(dǎo)序列置于最優(yōu)化的VP1-4編碼序列的上游以便編碼的蛋白質(zhì)包括N末端IgE前導(dǎo)序列。將兩個(gè)終止密碼子置于VP1-4編碼序列的3’末端。此外，通過(guò)使用來(lái)自FMDV亞型Asia 1、0、A、C、SAT1、SAT2和SAT3的至少10個(gè)不同序列最優(yōu)化所述FMDV亞型之一的3C核酸序列來(lái)構(gòu)建編碼FMDV蛋白3C的核酸。產(chǎn)生編碼亞型最優(yōu)化的3C蛋白的核酸，將其克隆入pVAX或pAV0242質(zhì)粒。e.使用疫苗作為標(biāo)記的方法本文中還提供了區(qū)分用疫苗接種的哺乳動(dòng)物與被FMDV感染的哺乳動(dòng)物的方法。所述方法可包括從哺乳動(dòng)物取樣，從所述樣品分離哺乳動(dòng)物的抗體。已用疫苗接種的哺乳動(dòng)物可具有僅特異于FMDV抗原的空衣殼蛋白即針對(duì)FMDV亞型A、Asia I、0、C、SAT1、SAT2、 SAT3或其組合的病毒外殼蛋白VP1-4的抗體。已被FMDV感染的哺乳動(dòng)物將具有抗特定FMDV亞型例如A、Asia 1、0、C、SAT1、SAT2或SAT3的FMDV病毒外殼蛋白VP1-4的抗體和此外抗FMDV的非結(jié)構(gòu)(NS)蛋白的抗體。FMDV的NS蛋白可包括蛋白酶3C蛋白酶以及FMDV蛋白2C、3A、3B和3D(聚合酶)。所述方法可包括鑒定抗FMDV的NS蛋白例如高度抗原性3D蛋白的抗體。所述方法還包括比較接種的哺乳動(dòng)物的血清樣品以確定FMDV NS蛋白的存在或不存在。感染的哺乳動(dòng)物具有抗FMDV的NS蛋白的抗體，然而接種的哺乳動(dòng)物不具有抗NS蛋白的抗體，因?yàn)樵摬溉閯?dòng)物具有充足的抗FMDV感染的免疫力。所述方法可包括區(qū)分具有針對(duì)VP1-4的抗體的哺乳動(dòng)物與具有針對(duì)FMDV的VP1-4和3D聚合酶的抗體的哺乳動(dòng)物。通常，可使用試劑。試劑可以是VP1-4或NS蛋白例如3D聚合酶。利用FMDV抗體分離來(lái)自哺乳動(dòng)物的樣品，將其與所述試劑反應(yīng)以鑒定FDMV抗體的特異性?？蓮牟溉閯?dòng)物分離所述方法的樣品，其可包括來(lái)自血液的血清樣品、唾液、眼淚、腦脊髓液、眼房水、胸膜液、心包液、淋巴結(jié)液、chime、乳糜、膽汁、尿、滑液、嘔吐物、腹膜液、糞便水(Stool water)、精液、羊水、奶、血清、間質(zhì)液和胰液。用于進(jìn)行診斷測(cè)試的方法包括對(duì)特定FMDV蛋白例如VP1-4和3D聚合酶進(jìn)行利用來(lái)自哺乳動(dòng)物的[35S]甲硫氨酸-標(biāo)記的細(xì)胞裂解物的免疫沉淀、蛋白質(zhì)印跡和免疫印跡?？梢砸远喾N公知的檢測(cè)系統(tǒng)執(zhí)行本文中描述的檢測(cè)方法以確定針對(duì)FMDV VPI-4或3D聚合酶的抗體在測(cè)試樣品或?qū)φ諛悠分械拇嬖?。檢測(cè)系統(tǒng)可包括從結(jié)合至特定FMDV蛋白例如VP1-4和3D聚合酶的檢測(cè)標(biāo)記產(chǎn)生的信號(hào)與預(yù)定值之間的熒光或其它方式的比較以確定針對(duì)FMDV VP1-4或3D聚合酶的抗體在測(cè)試樣品中的存在或不存在。預(yù)定值可以是從測(cè)試樣品測(cè)量的信號(hào)對(duì)從對(duì)照樣品測(cè)量的信號(hào)的比率。通常，測(cè)試樣品產(chǎn)生高于從對(duì)照樣品測(cè)量的平均信號(hào)3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的信號(hào)，所述對(duì)照樣品不包含可被認(rèn)為是FMDV 3D聚合酶陽(yáng)性并由此被認(rèn)為是感染的哺乳動(dòng)物的FMDV 3D聚合酶抗體。
可選擇地，可將儀器例如密度計(jì)用于測(cè)量可檢測(cè)標(biāo)記的數(shù)值?？墒褂肧ackett 等人，Clinical Epidemiology A Basic Science for Clinical Medicine,p. 106-107 (Little Brown and Co. , 1985)的方法，利用接受操作者曲線(ReceiveOperator Curve) ( “R0C”)測(cè)定預(yù)定值。預(yù)定值可基于通過(guò)突光成像儀或上述其它方法產(chǎn)生的相對(duì)光單位。簡(jiǎn)而言之，可從對(duì)應(yīng)于診斷測(cè)試結(jié)果的每一個(gè)可能值的真陽(yáng)性率(即，靈敏度)和假陽(yáng)性率(即，100%特異性)對(duì)的曲線測(cè)定預(yù)定值。與左上角最接近的曲線上的預(yù)定值(即，包圍最大面積的值)是最精確的預(yù)定值，并且產(chǎn)生比通過(guò)此方法測(cè)定的預(yù)定值更高的信號(hào)的樣品被認(rèn)為是陽(yáng)性的?？蛇x擇地，可將預(yù)定值沿著曲線向左偏移以使假陽(yáng)性率降至最低。(a)免疫印跡法可將檢測(cè)方法用于免疫印跡檢測(cè)系統(tǒng)以在測(cè)試樣品或?qū)φ諛悠分袡z測(cè)針對(duì)FMDVVP1-4或3D聚合酶的抗體。免疫印跡法可使用固體支持物以固定試劑。免疫印跡法可使用兩個(gè)分別的對(duì)照樣品(即，第一對(duì)照和第二對(duì)照)，可將所述樣品固定在固體支持物上。免疫印跡法可使用3個(gè)分開(kāi)的、不連續(xù)對(duì)照樣品(即，第一對(duì)照、第二對(duì)照和第三對(duì)照)。如果存在超過(guò)一種的對(duì)照樣品，則對(duì)照可以彼此相同或彼此不同。對(duì)照樣品中的兩種樣品可以相同(例如，第一對(duì)照與第二對(duì)照)。如果對(duì)照樣品中的兩種樣品相同，則對(duì)照樣品之一的濃度(第一對(duì)照或第二對(duì)照或如果存在3種對(duì)照，則第一對(duì)照或第三對(duì)照或第二對(duì)照或第三對(duì)照的水平)可高于(或大于)其它對(duì)照。對(duì)照樣品可在濃度上高于另一種對(duì)照，并且可被稱為“高對(duì)照”。以比高對(duì)照更低的濃度固定在條帶、盤(pán)或薄板上的對(duì)照可被稱為“低對(duì)照”。低對(duì)照對(duì)高對(duì)照的濃度比可以為約I : 2至約I : 10，優(yōu)選約I : 5至約I : 6。例如，第一對(duì)照可以為低對(duì)照并且第二對(duì)照可以為高對(duì)照?？蛇x擇地，第一對(duì)照可以為高對(duì)照并且第二對(duì)照可以為低對(duì)照。以另一個(gè)例子為例，3個(gè)對(duì)照檢測(cè)系統(tǒng)可包括低對(duì)照和高對(duì)照以及第三對(duì)照(其可被用于例如驗(yàn)證樣品添加)。低對(duì)照和高對(duì)照可以為人血漿(其中低對(duì)照對(duì)高對(duì)照的比率為約I : 2至約I : 10)并且第三對(duì)照可以為SDB Chagas或人血衆(zhòng)。在流過(guò)式分析形式(flow-through format)中，可將固體支持物上的固定的試劑浸入含有測(cè)試樣品的溶液中。可選擇地，可將固體支持物與稀釋劑一起置于反應(yīng)盤(pán)(reaction tray)中，然后向反應(yīng)盤(pán)中加入測(cè)試樣品。使用本文中先前描述的相同時(shí)間和技術(shù)將測(cè)試樣品和試劑溫育充足的時(shí)間?？墒褂帽疚闹邢惹懊枋龅募夹g(shù)除去未結(jié)合的測(cè)試樣品。在該形式中，當(dāng)測(cè)試樣品通過(guò)膜時(shí)，測(cè)試樣品中針對(duì)VP1-4或NS結(jié)構(gòu)蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體可結(jié)合固定的試劑(和至少一種對(duì)照)?？杉尤胫辽僖环N檢測(cè)試劑(例如本文中先前描述的包含可檢測(cè)標(biāo)記的檢測(cè)試劑)。至少一種檢測(cè)試劑可結(jié)合每一個(gè)試劑-抗體復(fù)合物(當(dāng)含有檢測(cè)試劑的溶液流過(guò)條帶時(shí)形成的)。為了確定針對(duì)VP1-4或NS結(jié)構(gòu)蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體在測(cè)試樣品中的存在或不存在，可如上所述使用截?cái)嘀祷蛉缦赂敿?xì)地論述的通過(guò)比較由一個(gè)或多個(gè)對(duì)照產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)結(jié)合的檢測(cè)試劑。當(dāng)可將上述低對(duì)照和高對(duì)照用于流過(guò)式分析形式中時(shí)，可通過(guò)鑒定來(lái)自可檢測(cè)標(biāo)記的信號(hào)在每一個(gè)試劑的測(cè)試條帶(或斑或點(diǎn))上的存在來(lái)確定針對(duì)VP1-4或NS結(jié)構(gòu)蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體在測(cè)試樣品中的存在或不存在。如果信號(hào)在試劑的測(cè)試條帶上得到鑒定，那么使用0至4+的等級(jí)將該檢測(cè)到的信號(hào)的強(qiáng)度與來(lái)自低對(duì)照條帶(或斑或點(diǎn))和高對(duì)照條帶(或斑或點(diǎn))的信號(hào)的強(qiáng)度相比較。當(dāng)無(wú)條帶可見(jiàn)時(shí)讀數(shù)為O?？蓪⒌蛯?duì)照條帶和高對(duì)照條帶的強(qiáng)度分別確定為1+(對(duì)于低對(duì)照)和3+(對(duì)于高對(duì)照)。具有/可與低對(duì)照的強(qiáng)度相比較的強(qiáng)度的測(cè)試條帶可被評(píng)級(jí)為I+。具有低對(duì)照的強(qiáng)度與高對(duì)照的強(qiáng)度之間的強(qiáng)度的條帶可被評(píng)級(jí)為2+。具有可與高對(duì)照的強(qiáng)度相比較的強(qiáng)度的條帶可被評(píng)級(jí)為3+。高于高對(duì)照的條帶強(qiáng)度的條帶強(qiáng)度可被評(píng)級(jí)為4+。(b)競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定可將檢測(cè)方法用于競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)鑒定具有針對(duì)VP1-4或NS結(jié)構(gòu)蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體的測(cè)試樣品?？蓪⑺鲈噭┕潭ㄔ谏鲜龉腆w支持物上。隨后可將固定的試劑與被可檢測(cè)標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性抗體接觸，已知所述競(jìng)爭(zhēng)性抗體結(jié)合所述試劑并且與測(cè)試樣品中的針對(duì)VP1-4或NS結(jié)構(gòu)蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體競(jìng)爭(zhēng)。還可將固定的試劑與測(cè)試樣品接觸。來(lái)自可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體的信號(hào)在含有針對(duì)VP1-4或NS結(jié)構(gòu)蛋白例如3D聚合酶的抗FDMV抗體的測(cè)試樣品中可能更低，因?yàn)閮山M抗體都競(jìng)爭(zhēng)所述固定的試劑。f.診斷試劑盒本文中提供了用于進(jìn)行鑒定已用疫苗接種的哺乳動(dòng)物與被FMDV感染的哺乳動(dòng)物的診斷方法的試劑盒。所述試劑盒提供了材料，所述材料允許鑒定已被FMDV感染的哺乳動(dòng)物以鑒定抗FS蛋白(包括FMDV的3D聚合酶蛋白)的抗體對(duì)僅針對(duì)接種的哺乳動(dòng)物的空衣殼蛋白VP1-4的抗體。測(cè)試試劑盒可包括一種或多種試劑例如用于實(shí)施一個(gè)或多個(gè)根據(jù)本發(fā)明的免疫測(cè)定的試劑。測(cè)試試劑盒通常包括具有一個(gè)或多個(gè)容器的包裝，所述容器裝有試劑如一種或多種分開(kāi)的組合物或任選地其中允許試劑的相容性的混合物。測(cè)試試劑盒還可包括從用戶的角度來(lái)看可能是想要的其它材料，例如緩沖液、稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)和/或用于樣品處理、洗滌或進(jìn)行測(cè)定的任何其它步驟的任何其它材料。根據(jù)本發(fā)明的試劑盒可包括固相和附著至固體支持物的試劑?？蓪⒃噭┖杏糜谶M(jìn)行夾心免疫測(cè)定法，且試劑盒可包括標(biāo)記的檢測(cè)抗體。標(biāo)記的檢測(cè)抗體可以是抗人IgG標(biāo)記抗體。所述試劑盒還可包括可檢測(cè)的標(biāo)記物。測(cè)試試劑盒可包括至少一種直接標(biāo)記物例如吖啶-9-甲酰胺。根據(jù)本發(fā)明的測(cè)試試劑盒還可包括至少一種間接標(biāo)記物。如果所使用的標(biāo)記物通常需要指示劑來(lái)產(chǎn)生可檢測(cè)的信息，那么測(cè)試試劑盒可包括一種或多種適當(dāng)?shù)闹甘緞y(cè)試試劑盒可包括用于進(jìn)行本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)免疫測(cè)定法的說(shuō)明書(shū)?？蓪⒈景l(fā)明的試劑盒中包括的說(shuō)明書(shū)粘貼至包裝材料或可將其以包裝說(shuō)明書(shū)的形式包括在試劑盒中。雖然說(shuō)明書(shū)通常是書(shū)寫(xiě)或印刷的材料，但它們不限于此。本發(fā)明涉及能夠存儲(chǔ)此類說(shuō)明書(shū)并且將它們傳送至終端用戶的任何介質(zhì)。這樣的介質(zhì)包括但不限于電子存儲(chǔ)介質(zhì)(例如，磁盤(pán)、磁帶、盒式忙存器(cartridge)、芯片)、光學(xué)介質(zhì)(例如，⑶ROM)等。如本文中所使用的，術(shù)語(yǔ)“說(shuō)明書(shū)”可包括提供該說(shuō)明書(shū)的互聯(lián)網(wǎng)站的地址。
實(shí)施例實(shí)施例I
重組VP1-4的表達(dá)通過(guò)使用上述最優(yōu)化的VP1-4和3C表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行體內(nèi)翻譯測(cè)定來(lái)表達(dá)亞型最優(yōu)化的VP1-4蛋白和最優(yōu)化的3C蛋白。此類蛋白的翻譯在SDS-PAGE凝膠上產(chǎn)生預(yù)期的條帶。為了確認(rèn)VP1-4蛋白的表達(dá)，將編碼亞型最優(yōu)化的VP1-4蛋白和N末端IgE前導(dǎo)序列的核酸克隆入HIS-標(biāo)記細(xì)菌表達(dá)載體。也將編碼亞型最優(yōu)化的3C蛋白的核酸克隆入HIS-標(biāo)記細(xì)菌表達(dá)載體。使用細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)最優(yōu)化的VP1-4和3C蛋白，使用鎳柱分離來(lái)進(jìn)行親和層化。使用SDS-PAGE凝膠分析純化的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE顯示預(yù)期的條帶。實(shí)施例2接種方法為了測(cè)試DNA質(zhì)粒的功效，用最優(yōu)化的VP1-4-和3C-編碼pVAX質(zhì)粒免疫Balb/C小鼠。將空PVAX和人IL-15-編碼pVAX載體用作對(duì)照。在第O、14和28天每天免疫小鼠3次。在最后一次免疫后3天處死免疫小鼠。收集小鼠的血清，分析其抗-VP1、-VP2、-VP3和-VP4ELISA。將來(lái)自實(shí)施例I的HIS-標(biāo)記的重組蛋白用作捕捉抗原。pVAX對(duì)照的血清不能識(shí)別任何亞型最優(yōu)化的VP1-4。相反地，用亞型最優(yōu)化的VP1-4DNA疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生針對(duì)亞型最優(yōu)化的VPl、-2、-3和-4的抗體，這表明最優(yōu)化的VP1-4融合疫苗正引起小鼠產(chǎn)生抗所有4種VP的免疫反應(yīng)。實(shí)施例3制備表達(dá)構(gòu)建體構(gòu)建多靶向性FMD DNA疫苗。首先用來(lái)自每一個(gè)亞型的至少10個(gè)不同的序列對(duì)來(lái)自亞型Asial、O、A、C、SATl、SAT2和SAT3的VPl序列進(jìn)行共有序列最優(yōu)化。然后，將兩個(gè)VPl序列插入在一個(gè)啟動(dòng)子下，并且通過(guò)兩個(gè)連續(xù)切割位點(diǎn)分隔。將IgE前導(dǎo)序列插入在第一 ORF之前，將兩個(gè)終止密碼子插入在第二 ORF之后。第一質(zhì)粒編碼Asia和0 VPl，其為1362bp。編碼A和C VPl的第二質(zhì)粒為1356bp。第三和第四質(zhì)粒靶向具有第一編碼SATl和SAT2 VPl以及第二編碼SAT3 VPl的南非亞型。實(shí)施例4重組VP1-4的表達(dá)隨后利用體外翻譯測(cè)定法表達(dá)克隆的質(zhì)粒。所有單個(gè)VPl構(gòu)建體_A、Asia、C和0的翻譯-產(chǎn)生預(yù)期的條帶[約24. 5kDa]并且A+CVP1和Asia+0 VPl結(jié)構(gòu)域產(chǎn)生更高的二聚體條帶。它們構(gòu)建件體具有用于免疫沉淀中的FLAG-表位。實(shí)施例5接種方法為了確認(rèn)抗FMD的免疫反應(yīng)，我們從所有4種VPl亞型(A、Asia、C和0)重組共有FMDV VPl序列(在N端以下劃線標(biāo)示IgE前導(dǎo)序列)產(chǎn)生重組FMD VPl蛋白。將蛋白質(zhì)克隆入HIS-標(biāo)記的細(xì)菌表達(dá)載體，然后表達(dá)載體。通過(guò)鎳柱分離來(lái)純化蛋白質(zhì)，以箭頭標(biāo)不表達(dá)的蛋白質(zhì)。然后為了測(cè)試DNA質(zhì)粒的功效，免疫Balb/C小鼠。使用CELLECTRA電穿孔利用每次免疫15 y g DNA來(lái)免疫小鼠。存在7個(gè)免疫組
I. pVax2. pVax-FMDV VPlA+pVAXl-IL-153.pVax-FMDV VPl Asia+pVAXl-IL-154. pVax-FMDV VPl C+pVAXl-IL-155.pVax-FMDV VPl 0+pVAXl_IL_156.pVax-FMDV VPl A-C+pVAXl_IL_157. pVax-FMDV VPl Asia-O+pVAXl-IL-15在第0、14和28天免疫小鼠3次，在最后一次免疫后3天處死小鼠。收集小鼠的血清，分析其抗VPl ELISA。將重組蛋白質(zhì)用作捕捉抗原。來(lái)自pVAX對(duì)照小鼠的血清不能識(shí)別A、Asia、C和0 VPl蛋白。相反地，用A、Asia、C和0 DNA疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生分別針對(duì)A、Asia、C和0 VPl蛋白的抗體。更重要地，用VPl A-C或API Asia-O疫苗免疫的小鼠產(chǎn)生針對(duì)所有4種VPl亞型的抗體，這表明共有-VPl融合疫苗正產(chǎn)生抗所有4種亞洲-歐洲FMD亞型的免疫反應(yīng)。ctggagctgc ccaccgacca ccacggcgtg Ucggcxacc tggtggacag ctacgcctac 600 atgcgcaacg gctgggacgt ggaggtgagc gccgtgggca accagttcaa cggcggctgc 660 ctgctggtgg ccatggtgcc cgagtggaag gagttcgaca cccgcgagaa gtaccagctg 720 wcnctgttoc Cccwnc3gttn&Jtc&3gncnc cgnwcnwwca tgwccgnccwnBtcancgtg *7030 ccctacctgg gcgtgaaccg ctacgaccag tacaagaagc acaagccctg gaccctggtg 84-0 gtgatggtgg tgagcccrcct gaccgtgaac accgccgccc agatcaaggt gtacgccaac 900 atcgccccca cctacgtgca cgtggccggc gacrqctgcccaOQcaaggaggg catcttcccc 960 gtggcctgcg ccgacggcta cggcggcctg gtgaccaccg accccaagac cgccgacccc 1020 gcctacggca aggtgtacaanocc ccccgc accaactacc ccggccgctt caccaacctg 1080 Ctgg3c%gg ccgmggcctg Ccccwccttc ctgtgottcg wogftjcggcwajgccctsucgtg 11-40 accacccgca ccgacgagac ccgcctgctgQrqccaagttccrqaogtgacrqccl: ggccorQccaag 1200 cacatgagca Woacctacct gagcgQTQcatc gcccagtact acacccacrqta cacrQcggcacc 1260 atcaacctgc acttcatgtt caccggcagc accgacagca aggcccgcta catggtggcc 1320 tacatccccc ccgOQcgtgga gacccccccc gacacccccCTQagcgccfQccorqc ccactgcatc 1380 cacgccgagt gggacaccgOQoor-fgawoagc aagttcacct tcaOQcatccc ctacQrqtgaQrqc 1440 gccQTQccgact ac 扣 cctacac cgccaQrqcgac accQTQccOQacraa Ocaccaacgtcrqcaggcrqctgg 1500 gtgtgcgtgt accagatcac ccacggcaag gccgagaacg acaccctggt ggtgagcgtg 1560 a 的 ccrqccggca aggacttcgaOQntgccrqcctg cccatcQrqacc cccgccacfQca 的 accacccracc 1620 accggcgaga gcgccgaccc cgtgaccacc accgtggaga actacggcgg cgagacccag 1680 gtgcagcgcc gccaccacac cgacgtgggc ttcatcatgg acccrqcttcgtQTQaa Watcaac 174*0 agccccaagc ccacccacgt gatcgacctg atgcagaccc accagcacgg cctggtgggc 1800 gccctgctgc gcgccgccac ctactacttc agcgacctgg aOQatcgtggt 的 cQrQccacQrqac 1860 ggcctgacct gg%gcccaa cggcgccccc gagagcgccc tgagcaacac cagcaacccc 1920 Wccgcct 以 C&3如nwOJggococ cttc&Jcnogc ctggccctgc Cctwcwccgcocccnyccgc lVOODo OQtgctggcca ccgtgtacaa cggcaccagc aagtacaccCTQtgacraccragcaop門(mén) 3Qrqnngnngc 204-0 ggcgacctgg gcagcctggc cgcccgcgtg gccaagcagc tgcccgccag cttcaactac 2100 ggcgccatca aggccgacac catccacgaQTQotgctggtgcoqcatgaagcg cgccgagctg 2160 Iiactgcgtga^crq33gnocgtcrQgccctgaaQrq的 tgaagQrqcca ygwwcaccct 的 atcgtgacc 2220 gagagcggcg ccccccccac cgacctgcaOQaacrQatggtgar-fgggcaacac caaCTQcccgtg 2280 aqwaqctgatcc tgg&:cggcaw gaccgtggcc&itctgctgcgoowccggcgt gttcggcacn2340 gcctacctgg tgccccgcca cctgttcgcc gagaagtaccfQwoaagatcat 的 ctgorqaccrQQTQc 2 辦 00 cgcgccatga ccQrqacagccfqa ctaccCTQcgtg ttcQrQacrqttcffq&JQTQ&Jr1-caaggt gaagggccaoq24^60 gacatgctga gcgacgccgc cctgatggtg ctgcaccgcg gcaaccgcgt gcgcgacatc 2520 accaaQTQcact tcccrQcQrqacac cgcccQTQcatg aacrQaaQraggca cccccgtggt gggcgtgatc 2S80
〔0§2J
29aacaacgccg acgtgggccg cctgatcttc agcggcgagg ccctgaccta caaggacatc2640
gtggtgtgca tggacggcga caccatgccc ggcctgttcg cctacaaggc cgccaccaag2700
gccggctact gcggcggcgc cgtgctggcc aaggacggcg ccgacacctt catcgtgggc2760
acccacagcg ccggcggccg caacggcgtg ggctactgca gctgcgtgag ccgcagcatg2820
ctgctgaaga tgaaggccca catcgacccc gagccccacc acgagggcct gatcgtggac2880acccgcgacg tggaggagcg cgtgcacgtg atgtga 2916
SEQ ID NO:2共有序列VP1-VP4亞型A和共有序列C3
Met Leu Asn Gly Asp Trp Lys Ala Lys Val Gln Arg Lys Leu Lys GlyAla Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly AsnThr Gly Ser He He Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala He Ser Gly Gly Ser Asn GluGly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn AsnAsp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Thr Gly Leu Phe GlyAla Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu GIu Thr Thr Leu Leu Glu AspArg lie Leu Thr Thr Arg Asn GIy His Thr Thr Ser Thr Thr GIn SerSer Val Gly Val Thr Tyr Gly Tyr Ser Thr Thr Glu Asp His Val AlaGly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Val Gln Ala Glu ArgPhe Phe Lys Lys Phe Leu Phe Asp Trp Thr Thr Asp Lys Pro Phe GlyHis Leu His Lys Leu Glu Leu Pro Thr Asp His His Gly Val Phe GlyHis Leu Val Asp Ser TyrAla Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val GluVal Ser Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val AlaMet VaI Pro Glu Trp Lys Glu Phe Asp Thr Arg Glu Lys Tyr Gln LeuThr Leu Phe Pro His Gln Phe He Ser Pro Arg Thr Asn Met Thr AlaHis He Thr Val Pro Tyr Leu Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr LysLys His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ser Pro Leu ThrVal Asn Thr Ala Ala Gln He Lys Val Tyr Ala Asn lie Ala Pro ThrTyr Val His Val Ala Gly Glu Leu Pro Ser Lys Glu Gly He Phe ProVal Ala Cys Ala Asp Gly Tyr Gly Gly Leu Val Thr Thr Asp Pro LysThr Ala Asp Pro Ala Tyr Gly Lys Val Tyr Asn Pro Pro Arg Thr AsnTyr Pro Gly Arg Phe Thr Asn Leu Leu Asp Val Ala Glu Ala Cys ProThr Phe Leu Cys Phe Asp Asp Gly Lys Pro Tyr Val Thr Thr Arg ThrAsp Glu Thr Arg Leu Leu Ala Lys Phe Asp Val Ser Leu Ala Ala LysHis Met Ser Asn Thr Tyr Leu Ser GIy He AIa GIn Tyr Tyr Thr GInTyr Ser Gly Thr He Asn Leu His Phe Met Phe Thr Gly Ser Thr AspSer Lys Ala Arg Tyr Met Val Ala Tyr He Pro Pro Gly Val Glu ThrPro Pro Asp Thr Pro Glu Arg Ala Ala His Cys He His Ala Glu TrpAsp Thr Gly Leu Asn Ser Lys Phe Thr Phe Ser He Pro Tyr Val SerAla Ala Asp Tyr Ala Tyr Thr Ala Ser Asp Thr Ala Glu Thr Thr AsnVal Gln Gly Trp Val Cys Val Tyr Gln He Thr His Gly Lys Ala GluAsn Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys Asp Phe Glu LeuArg Leu Pro He Asp Pro Arg Gln Gln Thr Thr Ala Thr Gly Glu SerAla Asp Pro Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr GlnVal Gln Arg Arg His His Thr Asp Val Gly Phe He Met Asp Arg PheVal Lys He Asn Ser Pro Lys Pro Thr His Val He Asp Leu Met GlnThr His Gln His Gly Leu Val Gly Ala Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr
權(quán)利要求
1.一種核酸，所述核酸包含編碼具有如下的蛋白質(zhì)的序列一個(gè)或多個(gè)具有或不具有前導(dǎo)序列的選自 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42中的一個(gè)或多個(gè)的序列、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段的序列、與 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42具有80%或更多同源性的變體、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段及其互補(bǔ)序列。
2.權(quán)利要求I所述的核酸，其中所述序列選自具有或不具有前導(dǎo)序列的編碼序列的SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41、其互補(bǔ)序列、其編碼至少20個(gè)氨基酸的片段、其互補(bǔ)序列、與SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和41具有80%同源性的核酸分子、其互補(bǔ)序列、其編碼至少20個(gè)氨基酸的片段及其互補(bǔ)序列。
3.權(quán)利要求I所述的核酸，其包含編碼選自具有或不具有前導(dǎo)序列的SEQID NO :2,4,6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 的蛋白質(zhì)的序列。
4.權(quán)利要求I所述的核酸，其包含選自SEQID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39和 41 的序列。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的核酸,其中所述前導(dǎo)序列為IgE前導(dǎo)序列。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述核酸為質(zhì)粒。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的核酸，其中所述核酸為作為表達(dá)載體的質(zhì)粒。
8.一種疫苗，其包含權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的核酸和/或一種或多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)選自具有或不具有前導(dǎo)序列的SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段、與SEQID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 具有 80%或更多同源性的變體、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段及其互補(bǔ)序列。
9.權(quán)利要求8所述的疫苗，其還包含佐劑。
10.權(quán)利要求8所述的疫苗，其還包含選自IL-12和/或IL-15或編碼IL-12和/或IL-15的核酸序列的佐劑。
11.一種組合物，其包含一種或多種選自具有或不具有前導(dǎo)序列的SEQ ID NO :2,4,6,8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40 和 42 的蛋白質(zhì)、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段、與SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40和42具有80%或更多同源性的變體、其互補(bǔ)序列、其包含至少20個(gè)氨基酸的免疫原性片段及其互補(bǔ)序列。
12.—種在哺乳動(dòng)物中引起抗一個(gè)或多個(gè)FMDV病毒亞型的免疫反應(yīng)的方法，包括施用根據(jù)權(quán)利要求8所述的疫苗。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述疫苗包含核酸分子，所述方法包括步驟 a)給所述哺乳動(dòng)物的組織施用所述核酸分子；和 b)以有效地允許DNA質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的恒定電流利用脈沖能量對(duì)所述組織的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。
14.權(quán)利要求13所述的方法，其中步驟a)包括將所述DNA質(zhì)粒疫苗注射入真皮內(nèi)、皮下或肌肉組織。
15.權(quán)利要求13或14所述的方法，其中預(yù)設(shè)用于遞送至所述組織的電流并且脈沖能量處于等于所述預(yù)設(shè)電流的恒定電流。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述電穿孔步驟還包括 (a)測(cè)量所述電穿孔細(xì)胞的阻抗； (b)相對(duì)于測(cè)量的阻抗調(diào)整所述脈沖能量的能量水平以維持所述電穿孔細(xì)胞中的恒定電流； 其中所述測(cè)量和調(diào)整步驟在所述脈沖能量的壽命內(nèi)進(jìn)行。
17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述電穿孔步驟包括按照以分散模式遞所述送脈沖能量的脈沖序列模式將所述脈沖能量遞送至多個(gè)電極。
18.權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物未被FMDV感染并且所述免疫反應(yīng)是保護(hù)性免疫反應(yīng)。
19.權(quán)利要求12-17中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物未被FMDV感染并且所述免疫反應(yīng)是治療性免疫反應(yīng)。
20.一種在用權(quán)利要求8所述的疫苗接種的哺乳動(dòng)物中診斷被FMDV感染的哺乳動(dòng)物的方法，所述方法包括 a)從所述哺乳動(dòng)物分離液體樣品；和 b)檢測(cè)未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或抗未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白的抗體的存在，其中未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白和/或抗未包含在所述疫苗中的FMDV蛋白的抗體的存在表明所述哺乳動(dòng)物已被FMDV感染?？谔阋卟《静《?FMDV)共有蛋白質(zhì)、其編碼序列及由其制備的疫苗發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及合成的共有(consensus) 口蹄疫病毒(FMDV)免疫原性蛋白和編碼此類蛋白的核酸分子、抗FMDV的疫苗、用于誘導(dǎo)抗FMVD的免疫反應(yīng)的方法、用于區(qū)分被FMDV感染的個(gè)體與已接種的抗FMDV的個(gè)體的方法以及預(yù)防性和/或治療性免疫個(gè)體以抗FMDV的方法。
發(fā)明背景
口蹄疫是馴養(yǎng)和野生偶蹄動(dòng)物(包括牛、豬、山羊和鹿)的高度接觸性傳染病，其在宿主細(xì)胞中快速?gòu)?fù)制并且傳播至接觸易感性動(dòng)物。該疾病的特征在于發(fā)熱、跛行以及舌、足、口鼻部和乳頭的水皰性病變，從而導(dǎo)致成年動(dòng)物的高發(fā)病率但死亡率較低。病原體(causative agent)為口蹄疫病毒(FMDV)(細(xì)小RNA病毒科的口瘡病毒屬的種的類型)。FMDV為由二十面體衣殼(具有4種結(jié)構(gòu)蛋白VP1-4，每一種蛋白60個(gè)拷貝)包圍的約8500個(gè)堿基的單鏈正義RNA基因組并且在抗原性上高度可變，具有幾個(gè)亞型(包括A、Asia 1、0、C、SAT1、SAT2和SAT3)。最近口蹄疫在許多先前無(wú)疾病國(guó)家(包括1997年在臺(tái)灣、2001年在英國(guó)和荷蘭的暴發(fā))以及在幾個(gè)南美國(guó)家的出現(xiàn)已提高了對(duì)該經(jīng)濟(jì)破壞性病毒的認(rèn)識(shí)。此外，全世界都在關(guān)注可能的恐怖分子襲擊可能利用FMDV攻擊例如1000億美元/年畜牧業(yè)的國(guó)家。
先前控制FMDV的措施包括宰殺感染的或接觸傳染病的動(dòng)物和排除污染。如果國(guó)家在最近暴發(fā)后3個(gè)月呈現(xiàn)無(wú)FMDV狀況，則因FMDV暴發(fā)而宰殺它們的家畜的國(guó)家才可有重新開(kāi)始家畜活動(dòng)。國(guó)家通常將接種動(dòng)物以治療FMDV暴發(fā)用作最后一著，因?yàn)橐呀臃N動(dòng)物并且未宰殺動(dòng)物的國(guó)家必須等待整整一年來(lái)恢復(fù)無(wú)FMD狀態(tài)。然而國(guó)家期望在任何FMDV暴發(fā)之前接種它們的動(dòng)物并且能夠保持它們的無(wú)FMD狀態(tài)。
過(guò)去，F(xiàn)MDV疫苗包括化學(xué)滅活的完整病毒抗原和佐劑；然而，對(duì)此存在不利方面，因?yàn)槠湫枰嘿F的高污染制造設(shè)施來(lái)生產(chǎn)疫苗。在過(guò)去25-30年中，研究者一直努力開(kāi)發(fā)在單次接種后提供保護(hù)作用的疫苗。這些努力包括從病毒顆粒純化的VP1、生物工程改造的VPU VPl肽、化學(xué)合成VPl肽、表達(dá)VPl表位的活載體的使用、利用編碼VPl表位的DNA的接種以及使用從FMDV感染的培養(yǎng)物產(chǎn)生的全長(zhǎng)衣殼蛋白VP1-4或通過(guò)復(fù)制缺陷型人腺病毒5型(Ad5)載體進(jìn)行的VP1-4的遞送。所有這些方法僅給接種的動(dòng)物提供有限數(shù)量的跨所有FMDV病毒亞型的表位。
因此，在本領(lǐng)域存在對(duì)診斷FMDV感染的哺乳動(dòng)物的疫苗和方法的需要，所述疫苗和方法適合于提供抗跨FDMV的不同亞型的多個(gè)表位的保護(hù)作用。發(fā)明概要
本文中提供了分離的核酸，所述核酸包含編碼口蹄疫病毒亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3、SAT4的VP1-4的共有氨基酸序列的序列或其互補(bǔ)序列。所述核酸可包括選自(a) SEQ ID NO :17-23 ； (b)編碼24-30的氨基酸序列的核苷酸序列；(c) (a)的80%變體；和(a)或(b)的互補(bǔ)序列的序列。還提供了包含異源序列的載體，其中所述異源序列由上述序列組成。
本文中還提供了能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗多個(gè)口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應(yīng)的疫苗，其中所述疫苗包含包括有效地連接于編碼序列(其編碼包含來(lái)自一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型的衣 殼蛋白VP1-4的共有FMDV抗原)的啟動(dòng)子的DNA質(zhì)粒和藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中DNA質(zhì)粒能夠在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中以有效地引起哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)的量表達(dá)共有FMDV抗原。所述疫苗可產(chǎn)生抗FMDV亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的免疫反應(yīng)。疫苗的質(zhì)粒的編碼序列可具有選自SEQ ID NO :1-7或其組合的FMDV抗原。疫苗的質(zhì)粒的編碼序列還可包括N末端前導(dǎo)序列,其中所述前導(dǎo)序列為IgG或IgE。疫苗的質(zhì)粒還可在編碼序列的3’末端之后包含多腺苷酸化序列。疫苗的質(zhì)粒還可包括編碼來(lái)自亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2或SAT3的共有FMDV 3C蛋白酶的核苷酸序列。FMDV 3C蛋白酶的核苷酸序列可以為SEQ ID NO 15并且可由SEQ ID NO 16所示的氨基酸序列編碼?？蓪?duì)疫苗的質(zhì)粒進(jìn)行密碼子最優(yōu)化。FMDV抗原的編碼序列還可包括VP1-4和3C蛋白酶(包括SEQ ID NO :7-14)。疫苗的藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是佐劑并且所述佐劑可以為IL-2或IL-15。疫苗的藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑可以是濃度低于6mg/ml的聚陰離子、聚陽(yáng)離子或脂質(zhì)例如聚-L-谷氨酸?？山o豬、反芻動(dòng)物、人或靈長(zhǎng)類動(dòng)物施用疫苗。所述疫苗可引起體液或細(xì)胞或體液及細(xì)胞反應(yīng)。
本文中還提供了能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗多個(gè)口蹄疫病毒(FMDV)亞型的免疫反應(yīng)的疫苗，其中所述疫苗包括一種或多種包含有效地連接于編碼序列(編碼包含來(lái)自選自亞型A、Asia 1、C、0、SAT1、SAT2、SAT3或其組合的一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型的衣殼蛋白VP1-4的共有FMDV抗原)的啟動(dòng)子的DNA質(zhì)粒和其藥學(xué)上可接受的賦形劑，其中所述DNA質(zhì)粒能夠在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中以有效地引起哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)的量表達(dá)共有FMDV抗原。FMDV抗原的編碼序列可選自SEQ ID NO :1-7或其組合。疫苗的質(zhì)粒還可包括編碼亞型A、Asial、C、O、SATl、SAT2或SAT3的FMDV的共有3C蛋白酶的核苷酸序列，并且可包括SEQ ID NO 15所示的核苷酸序列?？山o哺乳動(dòng)物例如豬、反芻動(dòng)物、人或靈長(zhǎng)類動(dòng)物施用疫苗。疫苗可在哺乳動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)例如體液、細(xì)胞或體液及細(xì)胞反應(yīng)。
本文中還提供了能夠在哺乳動(dòng)物中產(chǎn)生抗多個(gè)FDMV亞型的免疫反應(yīng)，其中所述疫苗包含包括一個(gè)或多個(gè)編碼口蹄疫病毒(FMDV)亞型A、Asia I、C、O、SAT1、SAT2或SAT3的衣殼蛋白VP1-4的共有氨基酸序列的抗原和其藥學(xué)上可接受的賦形劑。FMDV抗原的編碼氨基酸序列可以是SEQ ID勵(lì)24-30。藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是選自11-2和11-15的佐劑。疫苗的藥學(xué)上可接受的賦形劑可以是轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑。轉(zhuǎn)染促進(jìn)劑可以是濃度低于6mg/ml的聚陰離子、聚陽(yáng)離子或脂質(zhì)例如聚-L-谷氨酸。還可給哺乳動(dòng)物例如豬、反芻動(dòng)物、人或靈長(zhǎng)類動(dòng)物施用疫苗。疫苗可在哺乳動(dòng)物中引起免疫反應(yīng)例如體液、細(xì)胞或體液及細(xì)胞反應(yīng)。
本文中還提供了用于在哺乳動(dòng)物中引起抗多個(gè)FMDV病毒亞型的免疫反應(yīng)的方法，包括將權(quán)利要求I或21的DNA質(zhì)粒疫苗遞送至哺乳動(dòng)物的組織并且以有效地允許DNA質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的恒定電流利用脈沖能量對(duì)組織的細(xì)胞進(jìn)行電穿孔。方法中權(quán)利要求I的DNA質(zhì)粒的遞送可包括將DNA質(zhì)粒疫苗注射入真皮內(nèi)、皮下或肌肉組織。可通過(guò)預(yù)設(shè)電流來(lái)遞送所述方法的DNA質(zhì)粒，并且脈沖能量處于等于當(dāng)前電流的恒定電流。方法的電穿孔步
全文摘要
本文中提供了包含F(xiàn)MDV亞型A、Asia1、C、O、SAT1、SAT2和SAT3的口蹄疫FMDV VP1-4外殼蛋白的共有氨基酸序列的核酸以及表達(dá)所述序列的質(zhì)粒和疫苗。本文中還提供了使用上述疫苗產(chǎn)生抗一個(gè)或多個(gè)FMDV亞型的免疫反應(yīng)的方法，以及辨別利用所述疫苗接種的哺乳動(dòng)物和被FMDV感染的哺乳動(dòng)物的方法。
文檔編號(hào)A61K39/135GK102712931SQ201080050528
公開(kāi)日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2010年11月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月2日
發(fā)明者B·費(fèi)拉羅, D·B·韋納, D·R·科恩, K·穆圖瑪尼, M·P·拉馬納坦, N·Y·薩德賽, P·A·布朗, R·A·鮑林, 嚴(yán)健 申請(qǐng)人:賓夕法尼亞大學(xué)托管會(huì), 英諾維歐藥業(yè)股份有限公司