專利名稱：增強(qiáng)的瘧疾msp-1亞單位疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及重組亞單位蛋白，其已經(jīng)被設(shè)計(jì)用作疫苗來針對(duì)瘧疾進(jìn)行保護(hù)。具體地，所述重組亞單位蛋白源自惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)的裂殖子表面蛋白I (Merozoite Surface Protein 1,“MSP_1”)的C-端區(qū)域,且被進(jìn)一步修飾以增強(qiáng)免疫原性潛力。MSP-IC-端區(qū)域的核心是pl9。pl9核心區(qū)域含有表位，所述表位是寄生生物生長(zhǎng)抑制抗體的靶標(biāo)；但是，P19核心區(qū)域自身具有較差的免疫原性。已經(jīng)證實(shí)，在pl9核心區(qū)域之前緊鄰處的MSP-I的p33區(qū)域含有T細(xì)胞表位。已經(jīng)假定，這些T細(xì)胞表位可以增強(qiáng)針對(duì)P19核心區(qū)域的抗體應(yīng)答。這些潛在T細(xì)胞表位在重組蛋白的背景下能夠引起增強(qiáng)的且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答的功能性和實(shí)用性尚未完全證實(shí)。在目前的應(yīng)用中，通過選擇性地添加源自MSP-I的p33區(qū)域的片段，增強(qiáng)了 pl9核心區(qū)域的免疫原性潛力。將這些選定的片段連接至P19核心區(qū)域，以生產(chǎn)具有增強(qiáng)的免疫原性潛力的新穎蛋白。這些新穎的蛋白在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)。在細(xì)胞生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)具有增強(qiáng)的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白，并且在純化以后，將其配制為疫苗，以生成適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答。經(jīng)證實(shí)，與生成不穩(wěn)定的或減少的寄生生物生長(zhǎng)抑制抗體的其它MSP-IC-端亞單位相比，所述增強(qiáng)的重組亞單位蛋白會(huì)誘導(dǎo)強(qiáng)寄生生物生長(zhǎng)抑制抗體。所述增強(qiáng)的亞單位蛋白具有用作人用疫苗來保護(hù)免于瘧疾的潛力。
背景技術(shù)：
據(jù)估計(jì)，瘧疾的每年發(fā)病率是約2. 5億病例，每年導(dǎo)致大于100萬人死亡(WH0，2008)。大多數(shù)病例發(fā)生在非洲，盡管該威脅擴(kuò)大至世界上的許多其它熱帶和亞熱帶區(qū)域。全世界有大約30億人處于感染風(fēng)險(xiǎn)中。為此，非常需要控制該疾病的傳播，因?yàn)槲米虞d體和瘧原蟲屬寄生生物已經(jīng)形成對(duì)以前的控制措施的抗性。在過去的10至15年中，主要焦點(diǎn)已經(jīng)放在針對(duì)寄生生物的不同發(fā)育階段的瘧疾疫苗的開發(fā)上。盡管已經(jīng)有大量工作來建立重組亞單位瘧疾疫苗的技術(shù)，并且?guī)追N候選亞單位已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)，然而尚未完全實(shí)現(xiàn)基于重組亞單位蛋白技術(shù)的有效瘧疾疫苗。一種靶向瘧疾的環(huán)子孢子階段的候選疫苗仍然在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)價(jià)，盡管關(guān)于它進(jìn)一步成為被許可疫苗的潛力存在不同意見。迄今為止，在臨床試驗(yàn)中的靶向于寄生生物的裂殖子階段的疫苗候選物已經(jīng)失敗。因此，尚不存在被許可的可用于瘧疾的疫苗。存在許多瘧疾寄生生物物種，每個(gè)物種具有確定的宿主范圍。存在多個(gè)感染人類的物種。惡性瘧原蟲是在人類中造成疾病的主要物種。除非另外指出，術(shù)語“寄生生物”在本文中是指瘧原蟲屬物種。瘧疾寄生生物的生命周期是復(fù)雜的。所述寄生生物在它的生命周期的許多階段發(fā)生眾多發(fā)育的和形態(tài)的變化。當(dāng)被感染的蚊子給它的宿主接種子孢子時(shí)，該周期開始。所述子孢子快速地滲入肝細(xì)胞中，它們?nèi)缓笤谶@里發(fā)育成肝裂殖體。在成熟后，裂殖子被釋放進(jìn)血流中。所述裂殖子接著侵入紅細(xì)胞中，并在紅細(xì)胞中無性地繁殖，直到受感染的細(xì)胞破裂，導(dǎo)致釋放出額外的裂殖子，隨后所述額外的裂殖子侵入額外的紅細(xì)胞中。裂殖子的繁殖和紅細(xì)胞的裂解與瘧疾的臨床癥狀有關(guān)。有些裂殖子繼續(xù)發(fā)育成雄性和雌性配子母細(xì)胞，他們?nèi)缓蟊灰允芨腥緜€(gè)體為食的蚊子攝入。一旦進(jìn)入蚊子中，雄性配子對(duì)雌性配子的受精會(huì)導(dǎo)致進(jìn)一步發(fā)育成所述寄生生物的子孢子階段。因而，所述周期再次開始。所述生命周期被分成3個(gè)階段前紅細(xì)胞階段、無性紅細(xì)胞階段和有性階段。關(guān)于疫苗開發(fā)，所述3個(gè)階段經(jīng)常被稱作子孢子或肝階段(前紅細(xì)胞階段)、血液階段(無性紅細(xì)胞階段)和傳播阻斷(有性階段)。過去十年的工作已經(jīng)證實(shí)，盡管這樣的疫苗存在開發(fā)瘧疾疫苗的潛 力，但疫苗的開發(fā)是一項(xiàng)艱難的任務(wù)。在鑒別和開發(fā)作為瘧疾疫苗候選物的蛋白中，已經(jīng)取得了進(jìn)展。選擇用于瘧疾疫苗中的蛋白的主要方法是，篩選對(duì)人免疫血清具有反應(yīng)性的那些蛋白。以此方式，已經(jīng)將在每個(gè)生命周期階段中的許多蛋白鑒別為疫苗候選物?？勺鳛橐呙绾蜻x物的蛋白中，大多數(shù)是在寄生生物的表面上表達(dá)的蛋白。因?yàn)檩^難培養(yǎng)寄生生物來作為抗原的來源，瘧疾疫苗的開發(fā)必須依賴于替代方法，諸如重組DNA。該技術(shù)已經(jīng)成功地用于確定重要的肽序列、表達(dá)亞單位抗原和開發(fā)基于DNA的疫苗。盡管靶向所述寄生生物的每個(gè)發(fā)育階段的瘧疾疫苗的開發(fā)工作正在進(jìn)行中，靶向血液階段的疫苗可能具有最大影響，因?yàn)檫@是導(dǎo)致疾病表現(xiàn)的階段(Good等人，1998)。在已經(jīng)鑒別出的許多血液階段的抗原中，主要的裂殖子表面蛋白l(Merozoite SurfaceProtein, MSP-1)是已經(jīng)被充分研究的一種。天然的MSP-I蛋白具有大約195kD的分子量。它是一種主要出現(xiàn)在裂殖子表面上的膜錨定分子。它被加工成4個(gè)主要片段,根據(jù)它們的相對(duì)分子量,將它們稱作p83、p28、p38和p42(Hall等人，1984，Lyon等人，1986和Holder等人，1987)。所有片段的功能是未知的。已經(jīng)確定，C-端p42片段(它錨定在裂殖子表面上)被進(jìn)一步加工成叫做p33和pl9的2個(gè)片段,并且該加工是紅細(xì)胞侵入的必要條件(Blackman等人，1990,1991及Blackman和Holder，1992)。FUP菌株的MSP_lp42的氨基酸序列顯示在圖I中。許多發(fā)現(xiàn)都支持MSP-I作為重要的瘧疾疫苗候選物。已經(jīng)證實(shí)，當(dāng)用源自培養(yǎng)的寄生生物的MSP-I進(jìn)行免疫時(shí)，可以保護(hù)猴免受惡性瘧原蟲攻擊(Hall等人1984，Siddiqui等人1987，和Etlinger等人1991)。另外，在攻擊研究中也已經(jīng)證實(shí)，代表MSP-I的不同部分的重組肽或合成肽會(huì)引起不同水平的保護(hù)(Hall等人，1984, Cheung等人，1986,Patarroyo 等人，1987, Herrera 等人，1990, Kumar 等人，1995,和 Chang 等人，1996, Kumar 等人，2000, Stowers等人,2001, Darko等人,2005)。另外,從生活在病區(qū)的人中收集的血清的分析結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，針對(duì)MSP-IC-端區(qū)域的IgG抗體的生成與對(duì)抗瘧原蟲瘧疾的臨床免疫的形成有關(guān)(Riley 等人，1992，Shai 等人，1995，Al-Yaman 等人，1996，和 Shi 等人，1996)。最后，已經(jīng)證實(shí)，針對(duì)MSP-I的單克隆抗體能夠在體外防止寄生生物侵入紅細(xì)胞中(Pirson和 Perkins, 1985 和 Blackman 等人，1990)。已經(jīng)將MSP-IC-端p42片段和它的pl9加工片段鑒別為源自MSP-I蛋白的主要亞單位疫苗候選物。P19核心區(qū)域的序列(在圖I中顯示為粗斜體)在不同的惡性瘧原蟲菌株中是高度保守的。圖2提供了來自3個(gè)惡性瘧原蟲菌株FUP、3D7和FVO的MSP-lp42蛋白的氨基酸序列的比對(duì)。P33區(qū)域在FUP和3D7菌株之間是保守的，但是，F(xiàn)VO菌株的p33稍微不同于其它2個(gè)惡性瘧原蟲菌株。pl9核心區(qū)域在3個(gè)菌株之間是高度保守的，且也含有6個(gè)二硫鍵，所述二硫鍵導(dǎo)致高度折疊的結(jié)構(gòu)，所述結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為2個(gè)表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域(Blackman等人,1991)。已經(jīng)證實(shí),針對(duì)pl9核心區(qū)域的多克隆和單克隆抗體會(huì)在體外抑制寄生生物發(fā)育(Blackman 等人，1990, Chang 等人，1992, Chappel 和 Holder, 1993)。開發(fā)基于MSP-I的p42或pl9片段的重組亞單位疫苗的工作中，已經(jīng)利用了幾種不同的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。在下面總結(jié)了這些亞單位在大腸桿菌、酵母和桿狀病毒載體系統(tǒng)中的表達(dá)。在大腸桿菌中表達(dá)抗原的早期工作，在免疫接種以后僅誘導(dǎo)了低水平的可與天然蛋白反應(yīng)的抗體(Holder等人，1988, Burghaus等人，1996)。因此,大多數(shù)工作目前聚焦于具有引導(dǎo)MSP-I亞單位的天然樣折疊的能力的表達(dá)系統(tǒng)上，以嘗試生產(chǎn)更多的具有更大的誘導(dǎo)相關(guān)免疫應(yīng)答潛力的相關(guān)產(chǎn)物。 盡管能夠表達(dá)更多的具有更大抗原潛力的天然樣MSP-IC-端重組亞單位蛋白，迄今為止的所有工作卻導(dǎo)致了不穩(wěn)定的和/或不相關(guān)的抗體應(yīng)答。例如，Kumar等人(1995)能夠證實(shí)，當(dāng)用在酵母中表達(dá)的pl9亞單位進(jìn)行免疫時(shí),會(huì)在夜猴(Aotus Monkey)中產(chǎn)生保護(hù)作用；但是，沒有在免疫的所有猴中實(shí)現(xiàn)保護(hù)，這證實(shí)了使用P19亞單位的免疫應(yīng)答的不穩(wěn)定性。此外，來自受保護(hù)的猴的血清不能在體外抑制寄生生物生長(zhǎng)，這表明，免疫應(yīng)答的質(zhì)量(抗體特異性)不如預(yù)期。在另一組實(shí)例中，Chang等人(Infect. Immun. (1996)64 253-261和美國(guó)專利6，855，316)能夠證實(shí)使用在桿狀病毒系統(tǒng)中生產(chǎn)的p42產(chǎn)物對(duì)夜猴的保護(hù)作用；但是，所述保護(hù)是不穩(wěn)定的，因?yàn)椴⒎撬袆?dòng)物都受到保護(hù)。這違背來自受保護(hù)的猴的血清能夠在體外抑制寄生生物生長(zhǎng)的事實(shí)。在另一個(gè)實(shí)例中，Darko等人(2005)評(píng)價(jià)了桿狀病毒表達(dá)的P42產(chǎn)物在攻擊夜猴模型中的效力。盡管有相對(duì)高水平的抗體應(yīng)答，但該桿狀病毒表達(dá)的P42產(chǎn)物對(duì)于攻擊提供了非常少的保護(hù)作用。最后，由于免疫應(yīng)答水平較低而且不穩(wěn)定，現(xiàn)在已經(jīng)放棄了在大腸桿菌中生產(chǎn)并用于II期臨床試驗(yàn)的P42產(chǎn)物(Ogutu等人，2009)。從這些實(shí)例顯而易見，尚未實(shí)現(xiàn)從作為有效的疫苗候選物的MSP-IC-端區(qū)域生產(chǎn)重組亞單位蛋白的解決方案。如以前所述，MSP_lp42片段由p33和pl9片段組成。錨定在裂殖子表面上的MSP-I的pl9核心區(qū)域是裂殖子在紅細(xì)胞侵入過程中裂殖子的必要元件，其中在裂殖子與紅細(xì)胞結(jié)合以后，所述P33片段被釋放進(jìn)血漿中。所述pl9片段除了在紅細(xì)胞侵入中的作用以外，還是體外寄生生物生長(zhǎng)抑制抗體的靶標(biāo)。P33片段的作用不明。在p33區(qū)域內(nèi)已經(jīng)鑒別出許多T細(xì)胞表位(Udhayakumar等人，1995 ;Lee等人，2001 ;Malhotra等人，2008)，且有人建議p33在引起保護(hù)性免疫中起間接作用，這通過提供在pl9中缺少的T輔助表位來實(shí)現(xiàn)(Tian等人，1996 ;Lee等人，2001)。臨床研究已經(jīng)證實(shí)，MSPI-42疫苗接種會(huì)引起記憶T細(xì)胞應(yīng)答，并且這些應(yīng)答位于MSP1-33片段(Huaman等人，2008)。盡管如此，在重組亞單位蛋白和主動(dòng)免疫的背景下，尚未證實(shí)T細(xì)胞表位的對(duì)pl9特異性地增強(qiáng)抗體應(yīng)答的能力。為了實(shí)現(xiàn)重組MSP-IC-端亞單位蛋白作為可行候選疫苗的潛力，存在需要進(jìn)一步研究的關(guān)鍵問題。第一個(gè)問題涉及到，關(guān)于引起特異性的保護(hù)性抗體應(yīng)答，要鑒別出MSP-IC-端區(qū)域的有關(guān)的免疫原性片段。特異性的保護(hù)性抗體是能夠在體外抑制寄生生物生長(zhǎng)的那些抗體。第二個(gè)研究領(lǐng)域涉及到，鑒別出無關(guān)的免疫原性片段，所述片段產(chǎn)生的應(yīng)答不會(huì)引起所需的適當(dāng)?shù)奶禺愋詰?yīng)答。第三個(gè)研究領(lǐng)域涉及到，以生產(chǎn)具有增強(qiáng)的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白產(chǎn)物并作為疫苗候選物的方式，評(píng)價(jià)來自MSP-IC-端區(qū)域的不連續(xù)序列的連接。MSP-IC-端亞單位蛋白被定義為這樣的任意重組蛋白包括MSP_lpl9核心區(qū)域和來自MSP-lp33區(qū)域的額外序列，無論p33序列是否是連續(xù)的(像在自然界中一樣)或不連續(xù)的(產(chǎn)生新穎的蛋白)。在開發(fā)增強(qiáng)的MSP-IC-端亞單位蛋白的初期工作中，基于p33區(qū)域的N-端截短制備了 3種構(gòu)建體。截短點(diǎn)是基于p33中的假定的T細(xì)胞表位。在一種構(gòu)建體中，將來自p33區(qū)域的額外表位連接至截短處。來自這3種構(gòu)建體的初步數(shù)據(jù)沒有證實(shí)增強(qiáng)序列的存在， 因?yàn)椴淮嬖诩纳镆种瓶贵w方面的免疫增強(qiáng)。這前3種構(gòu)建體A、B和C的序列如圖3所示。意外的是，隨后在構(gòu)建體C上得到的數(shù)據(jù)顯示，在該構(gòu)建體中的31個(gè)氨基酸的p33片段含有抑制免疫應(yīng)答的序列(以寄生生物生長(zhǎng)抑制性抗體的方式)，除了強(qiáng)烈的總抗體應(yīng)答以外。因此，基于MSP-IC-端區(qū)域的應(yīng)用而進(jìn)一步開發(fā)可行的瘧疾重組亞單位疫苗，需要鑒別在P33區(qū)域內(nèi)的適當(dāng)序列，所述序列可以與pl9核心區(qū)域相組合以產(chǎn)生具有增強(qiáng)的免疫原性的組合序列。更具體地，所述增強(qiáng)的免疫原性是指，誘導(dǎo)穩(wěn)定的且特異性的抗體的能力，所述抗體能夠在體外抑制寄生生物生長(zhǎng)，并針對(duì)由瘧疾造成的疾病提供保護(hù)。此外，為了完全實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)序列的潛力，去除這樣的序列也是重要的所述序列抑制具有增強(qiáng)性質(zhì)的那些序列的免疫原性潛力。最終的目的是選擇“增強(qiáng)性”p33序列，選擇性去除“抑制性”p33序列，以及將“增強(qiáng)性”序列連接至P19核心區(qū)域，以產(chǎn)生能夠在靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型和人類中引起穩(wěn)定的且增強(qiáng)的保護(hù)性免疫應(yīng)答的新穎的重組蛋白。但是，以前尚未報(bào)道“增強(qiáng)性”和“抑制性”序列的鑒別。因此，要解決的技術(shù)問題是(I)鑒別P33區(qū)域中含有假定T細(xì)胞表位的序列，所述序列當(dāng)與P19核心區(qū)域相組合時(shí)，會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答(“增強(qiáng)性序列”)，(2)鑒別和去除P33區(qū)域中的抑制pl9表位的免疫原性潛力的序列(“抑制性序列”)，和(3)證實(shí)能夠通過將來自P33區(qū)域的不連續(xù)增強(qiáng)性序列與pl9核心區(qū)域連接來生產(chǎn)重組亞單位蛋白產(chǎn)物的能力，所述連接的方式使得所述產(chǎn)物可以在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中有效地表達(dá)。以此方式生產(chǎn)的重組亞單位蛋白具有下述潛力克服使用以前的基于P42的疫苗所出現(xiàn)的問題，并穩(wěn)定地誘導(dǎo)特異性的抗-裂殖子抗體，所述抗體會(huì)在動(dòng)物模型和人類中提供針對(duì)瘧疾的保護(hù)性免疫。因此，要解決的總技術(shù)問題是基于源自MSP-IC-端區(qū)域的序列，設(shè)計(jì)、構(gòu)建和表達(dá)一種新穎的重組亞單位蛋白，以產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫原性和提高的保護(hù)效力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種具有增強(qiáng)的免疫原性的重組亞單位蛋白，所述性質(zhì)使所述蛋白適合作為疫苗來在動(dòng)物模型和人類中針對(duì)瘧疾提供保護(hù)。重組亞單位蛋白包含所述蛋白的MSP-IC-端pl9核心區(qū)域和選自MSP-IC-端p33區(qū)域的選定片段。添加選定的p33片段導(dǎo)致增強(qiáng)的免疫原性。具體地，所述增強(qiáng)的免疫原性潛力在于，引起穩(wěn)定的且保護(hù)性的抗體應(yīng)答的能力。所述增強(qiáng)的抗體應(yīng)答具有在體外和在體內(nèi)抑制寄生生物生長(zhǎng)的潛力，針對(duì)由瘧疾寄生生物造成的疾病提供保護(hù)。本發(fā)明的重組亞單位蛋白是由轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞表達(dá)，所述昆蟲細(xì)胞含有整合在所述細(xì)胞基因組內(nèi)的適當(dāng)表達(dá)盒的拷貝。所述昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)會(huì)提供具有天然樣構(gòu)象的重組亞單位蛋白的高產(chǎn)率。具體地，所述重組亞單位蛋白由轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞分泌，并表現(xiàn)為在自然界中未發(fā)現(xiàn)的瘧疾MSP-IC-端區(qū)域的新穎形式。更具體地，所述重組亞單位蛋白是新穎的衍生物，它們已經(jīng)被制備以提供提高的免疫原性潛力，針對(duì)由瘧疾寄生生物造成的疾病提供保護(hù)。在動(dòng)物模型中，在具有增強(qiáng)的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白的疫苗接種中所產(chǎn)生的抗體能夠在體外抑制寄生生物生長(zhǎng)。本發(fā)明也提供了使用所述重組亞單位蛋白作為疫苗來誘導(dǎo)抗體生產(chǎn)的方法，所述抗體能夠在哺乳動(dòng)物宿主中賦予針對(duì)瘧疾的保護(hù)作用。


圖I示出了來自MAD型的惡性瘧原蟲菌株FUP (Uganda Palo Alto (烏干達(dá)帕洛阿 爾托))的MSP-lp42的氨基酸序列；p33區(qū)域以正常字體顯示，pl9核心區(qū)域以粗斜體顯示；圖2示出了來自3個(gè)惡性瘧原蟲菌株FUP、3D7和FVO的MSP_lp42氨基酸序列的比對(duì)；用+符號(hào)指示在3D7和FVO中與FUP菌株相同的氨基酸，顯示了與FUP菌株不同的氨基酸，pl9核心區(qū)域中的氨基酸以粗體顯示；用-符號(hào)指示在比對(duì)中的間隙；P19核心區(qū)域以粗斜體顯示；圖3示出了來自3個(gè)N-端截短的亞單位即構(gòu)建體A、構(gòu)建體B和構(gòu)建體C的氨基酸序列相對(duì)于FUP p42序列的比對(duì)；在p33序列中的CT、C72和p33_7表位顯示為粗體，并帶有下劃線；P19核心區(qū)域以粗斜體顯示；圖4示出了來自所有MSP-IC-端亞單位蛋白構(gòu)建體的氨基酸序列相對(duì)于FUPMSP-lp33序列的比對(duì)；圖5示出了所有MSP-IC-端亞單位構(gòu)建體的簡(jiǎn)圖按照據(jù)名稱排序；圖6示出了所有MSP-IC-端亞單位構(gòu)建體的簡(jiǎn)圖，按照組排序；圖7示出了第2組MSP-IC-端構(gòu)建體的ELISA抗體滴度；圖8示出了第I組和第2組MSP-IC-端亞單位的ELISP0T分析。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供了瘧疾MSP-IC-端重組亞單位蛋白，所述蛋白包含pl9核心區(qū)域和p33區(qū)域的選定片段。從已經(jīng)用適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的穩(wěn)定的昆蟲細(xì)胞系，生產(chǎn)和分泌得到這種重組亞單位蛋白。用本發(fā)明的重組亞單位蛋白免疫接種動(dòng)物，可以有效地誘導(dǎo)穩(wěn)定的抗體應(yīng)答。具體地，這些抗體應(yīng)答能夠抑制惡性瘧原蟲的生長(zhǎng)。選定的P33片段與pl9核心的組合，對(duì)于誘導(dǎo)特異性的且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的，所述免疫應(yīng)答會(huì)產(chǎn)生這樣的抗體所述抗體能夠抑制寄生生物生長(zhǎng)，并最終提供免受瘧疾的保護(hù)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，證實(shí)了本文所述的重組瘧疾MSP-IC-端亞單位蛋白能夠引起比MSP-lp42重組蛋白(在自然界中發(fā)現(xiàn)的形式)增強(qiáng)的且穩(wěn)定的免疫應(yīng)答。更優(yōu)選地，所述增強(qiáng)的重組MSP-IC-端亞單位蛋白能夠引起穩(wěn)定的寄生生物抑制性的抗體應(yīng)答。優(yōu)選地，所有的免疫受試者具有大于50%的體外生長(zhǎng)抑制性的抗體滴度。更優(yōu)選地，所有的免疫受試者具有大于60%的體外生長(zhǎng)抑制性的抗體滴度。甚至更優(yōu)選地，免疫受試者具有大于70%的體外生長(zhǎng)抑制性的抗體滴度。甚至更優(yōu)選地，免疫受試者具有大于80%的體外生長(zhǎng)抑制性的抗體滴度。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，“增強(qiáng)性”序列選自MSP_lp33區(qū)域，并與pl9核心區(qū)域相連，以產(chǎn)生新穎的MSP-IC-端重組亞單位蛋白。除了選擇“增強(qiáng)性”序列以外，還從MSP-lp33區(qū)域去除了“抑制性”序列，以進(jìn)一步增強(qiáng)新穎的MSP-IC-端重組亞單位蛋白的免疫原性潛力。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，與MSP-I的pl9核心區(qū)域相連的選自p33區(qū)域的選定片段含有T細(xì)胞輔助表位。這些T細(xì)胞輔助表位負(fù)責(zé)引導(dǎo)針對(duì)P19核心區(qū)域的增強(qiáng)的免疫應(yīng) 答，所述P19核心區(qū)域自身具有較差的免疫原性。更優(yōu)選地，選定的p33片段不含有抑制或遏制引起增強(qiáng)的抗體應(yīng)答(以針對(duì)P19核心區(qū)域的抑制性抗體的形式)的能力的序列和/或表位。因此，得到的重組蛋白與天然的P33區(qū)域的差別僅在于，提供益處的片段被保留，并且具有不利影響的那些片段被去除。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述重組瘧疾MSP-IC-端亞單位蛋白包含MSP-I的pl9核心和選定的p33片段，pl9核心和選定的p33片段以使重組蛋白可以在基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)為分泌產(chǎn)物的方式相連。然后純化分泌的重組亞單位蛋白，并用作免疫原。當(dāng)用于使動(dòng)物免疫時(shí)，所述純化的蛋白會(huì)產(chǎn)生增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，使用果蠅(Drosophila) S2細(xì)胞作為宿主細(xì)胞來表達(dá)“MSP-1C-端亞單位蛋白”?！癕SP-1C-端亞單位蛋白”是指這樣的任意重組蛋白其含有MSP-lpl9核心區(qū)域和來自MSP-lp33區(qū)域的額外序列，無論p33序列是否是連續(xù)的(像在自然界中一樣)或不連續(xù)的(產(chǎn)生新穎的蛋白)。這些“MSP-1C-端亞單位蛋白”可以源自任意惡性瘧原蟲菌株。圖4提供了在本申請(qǐng)所提及的所有“MSP-1C-端亞單位蛋白”中使用的P33序列的片段。在本發(fā)明中，如下采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的果蠅S2細(xì)胞表達(dá)和分泌亞單位蛋白，所述亞單位蛋白包含MSP-IC-端pl9核心區(qū)域和源自MSP-IC-端p33區(qū)域的片段，所述表達(dá)和分泌使用標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA方法，將這些蛋白的編碼序列可操作地連接至功能性的分泌信號(hào)上，并使這些蛋白由經(jīng)證實(shí)在果蠅細(xì)胞中功能性的啟動(dòng)子來控制。本文所述的重組MSP-IC-端亞單位蛋白代表源自惡性瘧原蟲物種的3個(gè)不同菌株。編碼MSP-IC-端亞單位蛋白的序列來自2個(gè)惡性瘧原蟲菌株，S卩，MAD型的FUP (UgandaPalo Alto (烏干達(dá)帕洛阿爾托))、威爾卡姆(Wellcome)型的NF-54 (克隆3D7)和Kl型的FVO (Vietnam-Oak Noll)。將所有序列克隆進(jìn)果蠅表達(dá)質(zhì)粒中，然后用于轉(zhuǎn)化果蠅S2細(xì)胞。因而，本發(fā)明的MSP-IC-端亞單位都是相關(guān)的，因?yàn)樗鼈兌己袌D5所示的MSP-IC-端pl9核心區(qū)域。此外，盡管每個(gè)構(gòu)建體中的p33序列存在差異，但是所有構(gòu)建體都被設(shè)計(jì)成引導(dǎo)和增強(qiáng)針對(duì)P19核心區(qū)域的免疫應(yīng)答的能力和特異性。針對(duì)pl9核心區(qū)域的抗體應(yīng)答增強(qiáng)多少與針對(duì)由瘧疾感染造成的疾病提供保護(hù)作用的能力增加有關(guān)。所述MSP-IC-端亞單位蛋白由所述選定的S2細(xì)胞系表達(dá)和分泌，并首次通過免疫親和色譜法進(jìn)行純化。所述抗-MSP-I單克隆抗體5. 2 (Chang等人，1992) (“5. 2抗體”或“MAb5.2”)被用于純化。將 5. 2 抗體通過生產(chǎn)商(NHS-Sepharose, Pharmacia, Piscataway (皮斯卡塔韋)，NJ(美國(guó)新澤西州))推薦的標(biāo)準(zhǔn)方法，化學(xué)結(jié)合至適當(dāng)?shù)闹|(zhì)上，以制備合適的柱。
優(yōu)選地，所述MSP-IC-端亞單位源自惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白的部分，即p42 ；在FUP和3D7菌株中，p42包含MSP-I的氨基酸Ala1333至Ser17(l5。如本文所述，從穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞重組地生產(chǎn)和分泌MSP-IC-端亞單位蛋白。所述MSP-IC-端亞單位可能含有MSP-I的整個(gè)p42區(qū)域或部分p42區(qū)域。更優(yōu)選地，所述MSP-IC-端亞單位含有與MSP_lp33序列相連的MSP-IplO核心區(qū)域，MSP-IplO核心區(qū)域相對(duì)于天然p42而言是連續(xù)的或不連續(xù)的，但是所有MSP-IC-端亞單位蛋白的長(zhǎng)度比FUP和3D7菌株的天然p42短了至少28個(gè)氨基酸。所述MSP-IC-端亞單位可以源自惡性瘧原蟲的3個(gè)等位基因類型中的任一個(gè)；諸如，K、MAD20和威爾卡姆型，以及間日瘧原蟲(P. vivax)、三日瘧原蟲(P. malariae)和卵形瘧原蟲(P. ovale)的等位基因類型。在所有實(shí)施方式中，MSP-IC-端亞單位蛋白的分泌由功能性分泌信號(hào)來引導(dǎo)，所述分泌信號(hào)能夠引導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物穿過昆蟲細(xì)胞分泌途徑并進(jìn)入培養(yǎng)基中。在本文中，使用tPA 前/原分泌前導(dǎo)物和合成的分泌信號(hào)，證實(shí)MSP-IC-端亞單位蛋白的分泌。令人驚訝地是，且與以前描述的MSP_lpl9和MSP_lp42重組亞單位的報(bào)道(其中認(rèn)為，非常高的抗體滴度是寄生生物生長(zhǎng)活性的關(guān)鍵指示物)不同，在本申請(qǐng)中描述的幾種重組MSP-IC-端亞單位的引起顯著的寄生生物生長(zhǎng)抑制活性的能力，不依賴于對(duì)產(chǎn)生高滴度抗體應(yīng)答的需要。經(jīng)發(fā)現(xiàn)，引起中等抗體滴度的幾種MSP-IC-端亞單位蛋白也產(chǎn)生顯著的寄生生物生長(zhǎng)抑制活性。因而，所述MSP-IC-端蛋白是新穎的，因?yàn)樗鼈冊(cè)诠δ苌喜煌谝郧懊枋龅幕贛SP-I的重組蛋白之處在于，它們具有引起顯著的寄生生物生長(zhǎng)抑制活性的能力。本發(fā)明因而考慮并提供了重組亞單位蛋白，所述蛋白可以用于疫苗制劑中，作為用于預(yù)防或減弱瘧原蟲屬物種感染的措施。所述重組亞單位蛋白可以與佐劑聯(lián)合使用，作為針對(duì)由痕疾感染造成的疾病提供保護(hù)的措施。盡管上面提供的描述和下面的實(shí)施例主要涉及從惡性瘧原蟲表達(dá)MSP-IC-端亞單位，但所述方法也可以應(yīng)用于其它瘧原蟲屬物種。例如也危害人類健康的間日瘧原蟲、三日瘧原蟲(P. malariae)和卵形瘧原蟲物種也可以用于人類的健康治療?？梢苑謩e為間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲開發(fā)與本文所述的惡性瘧原蟲的那些構(gòu)建體類似的構(gòu)建體，用作預(yù)防由瘧疾感染造成的疾病的疫苗。
實(shí)施例下面的實(shí)施例證實(shí)了可以從MSP_lp33區(qū)域選擇并去除序列，以及將選定序列的與MSP_lpl9核心區(qū)域相連從而產(chǎn)生新穎的、具有增強(qiáng)的免疫原性潛力的重組亞單位蛋白，以作為疫苗候選物。還使用穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞，證實(shí)了所述新穎的MSP-IC-端亞單位蛋白的表達(dá)和分泌。也證實(shí)了表達(dá)的亞單位蛋白的純化。提供了證實(shí)所述新穎的MSP-IC-端亞單位蛋白的增強(qiáng)的免疫原性的實(shí)施例。下面顯示的結(jié)果表明，增強(qiáng)的免疫原性潛力的選擇和證實(shí)，會(huì)產(chǎn)生高度可變的結(jié)果，所述結(jié)果可以是缺少特異性免疫應(yīng)答，也可以是高度集中的免疫應(yīng)答。因而，為了是免疫應(yīng)答集中而從P33區(qū)域選擇的增強(qiáng)性序列即pl9核心區(qū)域，并不是完全可預(yù)測(cè)的，必須以經(jīng)驗(yàn)為依據(jù)來測(cè)定。幾種MSP-IC-端亞單位蛋白意外地能夠引起增強(qiáng)的顯著的免疫原性，即大于50%的寄生生物抑制活性，盡管實(shí)際上所述新穎的重組蛋白產(chǎn)生中等的普遍抗體應(yīng)答。因此,本文所述的發(fā)明在所述重組亞單位蛋白的組成以及由此得到的免疫原性方面是獨(dú)特的。下面的實(shí)施例旨在示意性說明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例IMSP-lp42的p33區(qū)域中的T細(xì)胞表位的評(píng)估為了開發(fā)瘧疾疫苗，在許多研究中都使用了 MSP-I的pl9或p42亞單位。已有報(bào)道記載每一種這些MSP-I亞單位的成功以及失敗，如上面所述的和在下面進(jìn)一步討論的。因?yàn)榻Y(jié)果互相矛盾，因此不清楚這些亞單位的哪些區(qū)域在它們作為抗原時(shí)的下列能力最相關(guān)所述抗原引起能夠在體外抑制寄生生物生長(zhǎng)的抗體應(yīng)答或所述抗原保護(hù)動(dòng)物免受攻擊。已經(jīng)存在的理論是，針對(duì)pl9核心區(qū)域的生長(zhǎng)抑制性抗體的誘導(dǎo)是由p33區(qū)域中的T 輔助表位的特異性決定。支持該理論的一項(xiàng)研究直接對(duì)比了重組的P19和p42亞單位的誘導(dǎo)寄生生物生長(zhǎng)抑制性抗體的能力(Hui等人，1994)。使用相同的佐劑(FCA)，基于ELISA測(cè)定，P19和p42重組體都引起高滴度的抗體。但是，由p42抗原產(chǎn)生的抗體對(duì)寄生生物生長(zhǎng)是抑制性的，由P19產(chǎn)生的抗體不能抑制寄生生物生長(zhǎng)。盡管pl9產(chǎn)生的抗體不能抑制寄生生物生長(zhǎng)，但是經(jīng)證實(shí)，P42產(chǎn)生的抗體能夠結(jié)合寄生生物衍生的MSP-I，使用所述pl9抗原可以交叉吸附所述p42產(chǎn)生的抗體。Udhayakumar等人(1995)的一項(xiàng)研究也支持了該理論，所述研究對(duì)于生活在肯尼亞(Kenya)(瘧原蟲瘧疾非常流行的地區(qū))的個(gè)體的免疫應(yīng)答，表征了在p42區(qū)域的B和T細(xì)胞表位。該研究揭示，B細(xì)胞表位主要在pl9核心區(qū)域中，并且能夠提供增殖應(yīng)答的T細(xì)胞表位位于p33區(qū)域中。Lee等人(2001)和Malhotra等人(2008)的研究也已經(jīng)鑒別出在p33區(qū)域中的其它潛在的T細(xì)胞表位，這些T細(xì)胞表位可能關(guān)系到MSP-IC-端區(qū)域的保護(hù)性免疫應(yīng)答的增強(qiáng)。盡管沒有確定在這些研究中鑒別出的T細(xì)胞表位會(huì)直接地提供T細(xì)胞輔助功能，但是已經(jīng)提出，這些T細(xì)胞表位可能負(fù)責(zé)使針對(duì)重要的寄生生物生長(zhǎng)抑制性表位P19的抗體應(yīng)答集中。盡管這些結(jié)果支持了在P33區(qū)域中的T細(xì)胞輔助功能的理論，但是沒有關(guān)于重組亞單位的表達(dá)的數(shù)據(jù)，其中所述重組亞單位被設(shè)計(jì)用來增強(qiáng)動(dòng)物模型中誘發(fā)寄生生物生長(zhǎng)抑制性抗體或保護(hù)性應(yīng)答的能力。使用計(jì)算機(jī)程序來輔助分析，以引導(dǎo)P33的適當(dāng)片段的選擇，保留相關(guān)的T細(xì)胞表位。首先，分析與為T細(xì)胞表位建立的模式擬合的序列在p33區(qū)域中的存在(Margalit等人，1987)。所述算法是Menendez-Arias和Rodriguez (1990)的為了選擇潛在T細(xì)胞表位而編寫的計(jì)算機(jī)程序的一部分。該分析得到14個(gè)T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)。含有最高兩親性分?jǐn)?shù)的表位，是在P33的N-端處的保守區(qū)域中的表位，LKPLAGVYRSLKKQ。該表位被稱作CT (保守的T)。鑒別出的下一個(gè)表位位于pl9序列起點(diǎn)之前72個(gè)氨基酸處，AHVKITKLSDLKAID，并被稱作C72。第三個(gè)T細(xì)胞表位的鑒別是使用計(jì)算機(jī)程序ΤΕΡΙΤ0ΡΕ，且所述鑒別基于在p33區(qū)域中的 MHC II 類表位的進(jìn)一步分析(Sturniolo T.等人,Nat. Biotechnology (1999) 17 555-561 ；Singh,H.和 Raghava，G. P. S. (2001) Bioinformatics, 17 (12), 1236-37) 該表位位于pl9序列起點(diǎn)之前22個(gè)氨基酸處，LVQNFPNTIISKLIEGK,并被稱作p33_7。下面的表I列出了在惡性瘧原蟲的MSP_lp42的p33區(qū)域中的潛在MHC II類T細(xì)胞表位。這些表位通過計(jì)算機(jī)算法預(yù)測(cè)得出，或基于上述的公開報(bào)道得出。表I.在MSP_lp42的p33區(qū)域中的潛在T細(xì)胞表位
權(quán)利要求
1.一種具有增強(qiáng)的免疫原性的MSP-IC-端重組亞單位蛋白，包括 C-端區(qū)域的惡性瘧原蟲MSP-I蛋白的P19核心區(qū)域，所述P19核心區(qū)域添加有p33區(qū)域的選定片段； 所述重組亞單位蛋白在基于細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)和分泌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，所述增強(qiáng)的免疫原性通過增加的且穩(wěn)定的寄生生物生長(zhǎng)抑制活性來測(cè)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，所有被免疫的動(dòng)物產(chǎn)生大于50%的寄生生物生長(zhǎng)抑制活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，通過刪除在SEQID NO=USEQID N0:2、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7 和 SEQ ID NO :17 中所示的所述 p33 區(qū)域的 N-端，從而衍生出所述亞單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白，其特征在于，通過連接在SEQID N0:8、SEQID NO =IUSEQ ID NO :14和SEQ ID NO : 18中所示的選定的p33區(qū)域片段，從而衍生出所述亞單位。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組亞單位蛋白的表達(dá)，其特征在于，所述表達(dá)系統(tǒng)是真核細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組亞單位蛋白的表達(dá)，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)表達(dá)系統(tǒng)使用昆蟲細(xì)胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的重組亞單位蛋白的表達(dá)，其特征在于，所述昆蟲細(xì)胞是果蠅S2細(xì)胞。
9.一種疫苗制劑，其特征在于，包括能夠針對(duì)瘧疾感染提供保護(hù)的MSP-IC-端亞單位蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的疫苗制劑，其特征在于，所述MSP-IC-端亞單位蛋白示于SEQID NO: I、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:7、SEQ ID N0:8、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO: 14、SEQ ID NO :17 和 SEQ ID NO :18。
全文摘要
本發(fā)明提供一種源自寄生蟲惡性瘧原蟲的MSP-1C-端區(qū)域的重組亞單位蛋白，所述重組亞單位蛋白具有增強(qiáng)的免疫原性。將p33的選定區(qū)域與p19組合，以增強(qiáng)p19核心區(qū)域的免疫原性潛力。由于所述構(gòu)建體表現(xiàn)為不連續(xù)片段融合以建立獨(dú)特的蛋白，因此所表達(dá)的重組蛋白在自然界中沒有發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明揭露的重組蛋白的增強(qiáng)的免疫原性潛力會(huì)帶來強(qiáng)烈的、穩(wěn)定的且特異性的抗體應(yīng)答。本發(fā)明所揭露的重組亞單位蛋白是用于保護(hù)免受瘧疾感染的疫苗候選物。
文檔編號(hào)A61K39/002GK102648209SQ201080052479
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2010年11月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月18日
發(fā)明者D·E·克萊門茨, G·S·N·輝, K·M·普斯克 申請(qǐng)人:夏威夷大學(xué), 夏威夷生物技術(shù)公司