專利名稱：豬鏈球菌病三價滅活疫苗及制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于動物疫苗制備技術領域，具體涉及一種馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型的三價滅活疫苗及制備方法與應用。本發(fā)明的疫苗主要適用于母豬，公豬及仔豬對豬鏈球菌病的防治。
背景技術：
近年來豬鏈球菌病在國內(nèi)外集約化養(yǎng)豬場的感染率和發(fā)病率日益提高，所造成的經(jīng)濟損失日漸嚴重，已成為危害現(xiàn)代化養(yǎng)豬業(yè)的主要疫病之一。已知豬鏈球菌有33種血清型，其中的2型可引起豬急性敗血癥、腦膜腦炎、關節(jié)炎和急性死亡，也可導致生豬從業(yè)人員中的特定人群感染和死亡，是一種重要的人畜共患傳染病(Wisselink等,2002)。國外自1968年荷蘭首次報道人感染腦膜炎病例以來，已有300多人因感染豬鏈球菌而死亡。在我國，自七十年代以來，該病已在全國二十多個省市發(fā)生或流行，造成了不同程度的經(jīng)濟損 失。2005年6 8月，四川省資陽市、內(nèi)江市等地區(qū)暴發(fā)了豬鏈球菌2型病，并導致204人感染，38人死亡(趙戰(zhàn)勤等，畜牧獸醫(yī)學報，2007)。近年來豬鏈球菌2型病在我國廣泛存在并嚴重流行，已成為當前嚴重危害我國養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一種主要疫病，而且給人類也造成了嚴重的危害；同時發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌7型致病有不斷上升的趨勢，其發(fā)病率高、潛伏期長、造成飼料報酬率降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失；而馬鏈球菌獸疫亞種(蘭氏分群中為C群鏈球菌)在我國豬場仍時有發(fā)生，嚴重危害著我國的養(yǎng)豬業(yè)。目前市售商品疫苗只有豬鏈球菌2型及豬鏈球菌2型+馬鏈球菌獸疫亞種二價疫苗，但當前豬鏈球菌7型也較常見，現(xiàn)有疫苗不能對其起到預防作用，而且市售商品疫苗需多次免疫，成本較高，對豬只的應激較大。因此市場上急需發(fā)明一種新的能同時預防豬鏈球菌2型病，豬鏈球菌7型病和馬鏈球菌獸疫亞種三種疾病滅活疫苗以解決上述問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種豬鏈球菌三價滅活疫苗，該滅活疫苗為馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型的三價滅活疫苗，該滅活疫苗能同時有效的預防豬鏈球菌2型病，豬鏈球菌7型病和馬鏈球菌獸疫亞種三種疾病，而且只需一針免疫，減少了豬只的應激，降低了成本，達到“一針多防”的效果，且不存在散毒的隱患。本發(fā)明的滅活
疫苗安全可靠。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種豬鏈球菌三價滅活疫苗的制備方法。為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術方案申請人:制備了一種豬鏈球菌病三價滅活疫苗，該滅活疫苗含有保藏號為CCTCCNO M2011405的馬鏈球菌獸疫亞種XS的抗原，保藏號為CCTCC NO M2011282的豬鏈球菌2-LT的抗原和保藏號為CCTCC NO M2011160的豬鏈球菌7-YZ的抗原及佐劑；所述的抗原已滅活；所述佐劑為白油。上述三種菌株的抗原在所述的滅活疫苗中的配比比例相等(I I I)，所述的三種菌株的抗原的總體積占所述疫苗總體積的40% 45%。申請人:提供了一種豬鏈球菌病三價滅活疫苗的制備方法，其步驟包括如下內(nèi)容a.將豬鏈球菌2-LT (保藏號為CCTCC NO :M2011282)、豬鏈球菌7-YZ (保藏號為CCTCCNO M2011160)和馬鏈球菌獸疫亞種XS (保藏號為CCTCC NO M2011405)分別在TSB培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)(該培養(yǎng)基購自美國BD公司)，分別得到豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液。b.分別向步驟a培養(yǎng)好的豬鏈球菌2-LT株菌液、豬鏈球菌7_YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液，按總量(體積比)加入O. 3% O. 4%的甲醛溶液，置于37°C滅活48 72小時，期間每隔3 4小時攪拌I次，收集得到各滅活菌液。 C.將步驟b收集得到的滅活的豬鏈球菌2-LT菌液、豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液按體積比I : I : I混合，得到混合滅活菌液，再將吐溫-80與上述制備 的混合滅活菌液按體積比4 6 94 96，優(yōu)選為4 96，制成水相。將白油(購自?？松梨诠?、司本-80和硬脂酸鋁按體積比為94 6 I 2，優(yōu)選為94 6 I的比例制成油相。將水相與油相按40% 45% 55% 60%體積比混合，優(yōu)選為40% 60%。將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，制成均勻乳劑，即為油乳劑滅活疫苗。本發(fā)明的三價油乳劑滅活疫苗的保存條件為2 8°C。d、將步驟c得到的油乳劑滅活疫苗進行分裝即為產(chǎn)品。上述抗原菌株的分離鑒定方法如下所述I.豬鏈球菌2型菌株LT株(豬鏈球菌2-LT)的分離、篩選和鑒定申請人:從2004年9月湖北省羅田縣某豬場送檢的有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血中分離得到一株具有致病性的豬鏈球菌2型菌株(編號LT株)。經(jīng)鑒定后將該菌株命名為豬鏈球菌2-LT (Streptococcus suis 2-LT),于2011年8月9日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO :M2011282(具體分離及鑒定方法見實施例I)。2.豬鏈球菌7-YZ的分離、篩選和鑒定申請人:于2005年8月從湖南省永州市某豬場送檢的病料中分離得到一株豬鏈球菌7型菌株(編號為YZ株)，經(jīng)鑒定后將該菌株命名為豬鏈球菌7-YZ (Streptococcus suis7-YZ)。該菌株于2011年5月5日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO :M2011160(具體分離及鑒定方法見實施例2)。3.馬鏈球菌獸疫亞種XS株的分離、篩選和鑒定申請人:從浙江省蕭山某豬場患病豬關節(jié)中分離得到一株馬鏈球菌獸疫亞種(編號為XS株)，經(jīng)鑒定后將該菌株命名為馬鏈球菌獸疫亞種XS(Str印tococcus equi subsp.zooepidimicusXS)。該菌株于2011年11月22日送交湖北省武漢市武漢大學內(nèi)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏編號為CCTCC NO :M2011405(具體分離及鑒定見實施例3)。上述三個抗原菌株的微生物學特征豬鏈球菌2型，豬鏈球菌7型和馬鏈球菌獸疫亞種菌株均為鏈球菌屬，其中豬鏈球菌2型和豬鏈球菌7型細菌大小為0. lmm-1. 0mm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊，革蘭氏染色呈陽性、成雙或短鏈狀。馬鏈球菌獸疫亞種菌種大小約為0. 5 1cm，陳舊培養(yǎng)物中菌體呈卵圓形，固體培養(yǎng)基中該菌以單個或短鏈形式存在，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)物形成長鏈，菌體表面能形成莢膜。本發(fā)明的豬鏈球菌三價滅活疫苗主要應用于豬場中種豬和仔豬對豬鏈球菌病的預防，降低豬場豬鏈球菌病的發(fā)病率，提高仔豬存活率。本發(fā)明的優(yōu)點是可以同時預防豬鏈球菌2型，豬鏈球菌7型和馬鏈球菌獸疫亞種引起的疾病，對于同血清型的免疫保護效果達到85%以上，相對于目前的商品疫苗來講，可以單針免疫較多的血清型，達到“一針防多病”的目的，且使用方便，減少了豬只應激，而且不存在散毒的隱患，安全可靠。更詳細的技術方案見《具體實施方式
》所述。


序列表SEQ ID NO : I是擴增⑶H基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 2是擴增CPS2J基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 3是擴增CPS7J基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 4是擴增SodA基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 5是擴增類M蛋白基因的核苷酸序列。序列表SEQ ID NO 6是擴增Fnz基因的核苷酸序列。圖I :一種豬鏈球菌通用引物擴增的PCR示意圖。圖中M DNA分子Marker ; I 4 :豬鏈球菌分離菌株和豬鏈球菌2型標準菌株；5 :豬鏈球菌LT分離株。圖2 :—種豬鏈球菌2型引物擴增的PCR示意圖。圖中I :豬鏈球菌2-LT分離株；2 =DNA分子Marker3 5 :豬鏈球菌分離株；6 陰性對照(H20。圖3 : —種豬鏈球菌通用引物擴增的PCR示意圖。圖中I 4 :挑取的待鑒定的豬鏈球菌；5 :豬鏈球菌7型標準菌株，6 :豬鏈球菌YZ分離株。圖4:豬鏈球菌7型引物擴增的PCR示意圖。圖中I :豬鏈球菌7-YZ ;2 4 :挑取的待鑒定的豬鏈球菌5 陰性對照。圖5 :馬鏈球菌獸疫亞種乳膠凝集示意圖。圖中1，2和4 6分別為A，B，D，F(xiàn)，G群標準乳膠，3為C群標準乳膠。圖6 :馬鏈球菌獸疫亞種引物擴展的PCR示意圖。圖中M =DNA分子marker ;1_3 :待鑒定的馬鏈球菌獸疫亞種菌株；4 :分離的馬鏈球菌獸疫亞種XS株
具體實施例方式為了使本發(fā)明更加容易理解，下面將進一步闡述本發(fā)明的實施例。結(jié)合實施對本發(fā)明做進一步的描述和論證。但是本實施例不是對本發(fā)明的限制。實施例I :豬鏈球菌2-LT株的分離和鑒定。待分離的病料——各組織病料是申請人的發(fā)明人于2004年9月分離于湖北羅田某豬場有神經(jīng)癥狀、急性死亡豬的心血中分離得到。其具體分離方法為無菌采集心血接種于TSA (購自美國BD公司)平皿上，370C培養(yǎng)12-24小時后觀察。挑取直徑為O. lmm-1. Omm、灰白色、半透明、表面光滑、圓形、邊緣整齊的小菌落接種于TSB液體培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)過夜。將純培養(yǎng)后的細菌進行革蘭氏染色鏡檢。然后用光學顯微鏡觀察，革蘭氏染色呈陽性、成雙或短鏈狀球菌，對其傳代純化。豬鏈球菌2型的分類鑒定，采用PCR方法、生化鑒定及玻片凝集試驗進行了鑒定，具體步驟如下(I)PCR方法鑒定根據(jù)參考文獻(趙戰(zhàn)勤，2007年)合成豬鏈球菌通用引物和豬鏈球菌2型特異性引物。其中豬鏈球菌通用引物JP4和JP5是根據(jù)谷氨酸鹽脫氫酶基因(gdh，基因登錄號gblEF539838. Il)設計上游引物為JP4(5’ -CCATGGACAGATAAAGATGG-3’ )； 下游引物為JP5 (5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3，)，可擴增長度為 689bp 的目的 DNA片段(見SEQ ID NO: I)(其PCR圖片見附圖I)。豬鏈球菌2型的特異性引物是根據(jù)豬鏈球菌具有型特異性的莢膜多糖抗原基因cps2J (基因登錄號JN024705. I)設計上游引物為 Cps2J-F (5，-TGATAGTGATTTGTCGGGAGGG-3，)，下游引物為cps2J-R(5’-GAGTATCTAAAGAATGCCTATTG-3’)，可擴增長度為 557bp 目的DNA片段(見SEQ ID NO 2)(其PCR圖片見附圖2)。PCR模板的制備取Iml培養(yǎng)的菌液到無菌的1.5ml離心管中，12000r/min離心5分鐘，去掉上清,用200 μ I無菌水懸浮混勻，100°C水浴中煮10分鐘，然后迅速置于冰上冷卻5分鐘，12000r/min離心2分鐘，上清即為PCR模板。PCR反應體系(總體積25 μ I)IOXTaq Buffer2. 5 μ 1,2 μ M dNTPs I. 5 μ 1，20 μ M 上、下游引物各 I μ 1，TaqDNA聚合酶I μ I，無菌水14 μ I,模板4 μ I。退火溫度為94°C30 秒，58°C 60 秒，72°C 40 秒，30 循環(huán)。PCR結(jié)果觀察取PCR 擴增反應產(chǎn)物 10 μ I 和 Mark2000plus 5 μ 1，加到含 EB 的 O. 8% (V/V)瓊脂糖膠中，在80伏電壓下電泳30分鐘，然后在紫外線燈下觀察。(2)生化鑒定從TSA平板上挑取步驟(I)中鑒定為陽性的單菌落，進行常規(guī)的生化鑒定試驗。微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司，按照該公司產(chǎn)品說明書進行操作。結(jié)果豬鏈球菌2-LT株的各項生化指標均符合(見表I)。(3)玻片凝集試驗將分離的豬鏈球菌2-LT株接種TSB培養(yǎng)基(購自美國BD公司)，置37°C搖床170rpm/min，培養(yǎng)8小時，使0D600達到I. 3 I. 5，采用玻片凝集的方法對該菌液進行血清學分型鑒定。具體操作方法如下取潔凈玻片I張，用微量移液器吸取3 μ I豬鏈球菌(SS)標準陽性血清(購自丹麥哥本哈根國立血清研究所)滴于載玻片上，另吸取3μ I生理鹽水做對照，然后吸取3μ I菌液分別加入血清和生理鹽水中，充分混勻(注每次加樣都要更換移液器的TIP頭)。輕輕搖動載玻片，I 2min后觀察結(jié)果。血清與待檢菌液混合后出現(xiàn)明顯可見的凝集塊，液體變?yōu)橥该?，而鹽水對照滴仍為均勻混濁狀態(tài)，即判定為凝集反應陽性。若血清與菌液混合后為均勻混濁狀態(tài)，沒有出現(xiàn)明顯可見的凝集塊判定為陰性。玻片凝集試驗表明，本發(fā)明分離的豬鏈球菌2-LT株僅與豬鏈球菌2型標準陽性血清發(fā)生凝集反應，不與其他血清型凝集。表I豬鏈球菌2型生化鑒定試驗
權利要求
1.一種豬鏈球菌病三價滅活疫苗，其特征在于，該滅活疫苗含有保藏號為CCTCC NO:M2011405的馬鏈球菌獸疫亞種XS的抗原，保藏號為CCTCC NO M2011282的豬鏈球菌2-LT的抗原和保藏號為CCTCC NO M2011160的豬鏈球菌7-YZ的抗原及佐劑；所述的抗原已滅活；所述佐劑為白油。
2.如權利要求I所述的豬鏈球菌病三價滅活疫苗，其特征在于，所述的三種抗原的體積比為I : I : 1，所述的抗原的總體積為所述滅活疫苗總體積的40% 45%。
3.一種豬鏈球菌病三價滅活疫苗的制備方法，其特征在于，它包括如下步驟 a.將保藏號為CCTCCNO :M2011282的豬鏈球菌2-LT菌株，保藏號為CCTCC NO:M2011160豬鏈球菌7-YZ菌株和保藏號為CCTCC NO M2011405的馬鏈球菌獸疫亞種XS菌株分別增殖培養(yǎng)，得到豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液； b.分別向上述培養(yǎng)好的豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS株菌液中按菌液總體積加入O. 3% O. 4%的甲醛溶液，置于37°C滅活48 72小時，期間每隔4小時攪拌I次，即為滅活的菌液； c.將上述收集的滅活的豬鏈球菌2-LT菌液，豬鏈球菌7-YZ菌液和馬鏈球菌獸疫亞種XS菌液按體積為I : I : I的比例混合，再將吐溫-80與上述混合菌液按體積比為4 6 94 96混合，制成水相；將白油、司本-80和硬脂酸鋁按體積比為94 6 I 2的比例制成油相；將所述的水相與油相按體積比為I : I. 5的比例混合，將水相緩慢加入油相均質(zhì)3 5分鐘后，制成均勻乳劑，即為滅活疫苗； d.將步驟c得到的滅活疫苗分裝得產(chǎn)品。
4.一種專用于生產(chǎn)權利要求I所述的豬鏈球菌病三價滅活疫苗的菌株，其特征在于該菌株分別是豬鏈球菌2-LT，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCCNO M2011282 ;豬鏈球菌7-YZ，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號為CCTCC NO:Μ2011160和馬鏈球菌獸疫亞種-XS，保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其保藏號為CCTCC NO Μ2011405ο
全文摘要
本發(fā)明屬于動物疫苗制備技術領域，具體涉及一種馬鏈球菌獸疫亞種、豬鏈球菌2型、豬鏈球菌7型的三價滅活疫苗及制備方法與應用。本發(fā)明的滅活疫苗主要適用于母豬，公豬及仔豬對豬鏈球菌病的防治。本發(fā)明公開了三株專用于制備豬鏈球菌病三價滅活疫苗的菌株的分離、鑒定及應用，三株疫苗菌株分別為豬鏈球菌2-LT株(保藏號為CCTCC NOM2011282)；豬鏈球菌7-YZ株(保藏號為CCTCC NOM2011160)和馬鏈球菌獸疫亞種XS株(保藏號為CCTCC NOM2011405)。本發(fā)明的滅活疫苗能夠達到“一針多防”的效果，減少豬只應激，且滅活疫苗安全可靠，不存在散毒的隱患。
文檔編號A61P31/04GK102949714SQ201110376199
公開日2013年3月6日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權日2011年11月23日
發(fā)明者金梅林, 康超, 陳波, 尹珍艷, 徐高原, 陳關平, 滑亞峰, 陳章表 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學, 武漢科前動物生物制品有限責任公司