專(zhuān)利名稱(chēng)：藥用真菌瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，屬于天然產(chǎn)物有效成分的提取領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
瓦尼木層孔菌(Phellinus vaninii Ljub),又名楊黃,屬于擔(dān)子菌綱非裙菌目銹革孔菌科木層孔菌屬真菌。瓦尼木層孔菌在我國(guó)主要分布于吉林的長(zhǎng)白山和黑龍江的小興安嶺地區(qū)，多生長(zhǎng)在楊樹(shù)活立木或倒木上，是楊樹(shù)特有的一種寄生菌。
瓦尼木層孔菌在有些地區(qū)也被當(dāng)作桑黃(鮑式層孔菌(Phellinus baumii)、裂蹄層孔菌(Phellinus Iinteus)、火木層孔菌(Phellinus igniarius))入藥。由于過(guò)度開(kāi)發(fā)采集，野生桑黃資源迅速枯竭，急需尋找新來(lái)源或替代品，瓦尼木層孔菌與桑黃有相近或相似的藥理活性與功效，被認(rèn)為是未來(lái)能夠代替桑黃藥用的品種來(lái)源。
早在1968年，日本科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，野生桑黃子實(shí)體的提取物對(duì)小鼠肉瘤S180腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，其抑制率為96.7%，并發(fā)現(xiàn)桑黃中發(fā)揮抗癌作用的物質(zhì)為多糖。近幾十年來(lái)，日本、韓國(guó)等對(duì)桑黃的藥用價(jià)值進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)桑黃抗癌效果比靈芝、加里斯茸、 PL-2、PL-5還好，是目前國(guó)際公認(rèn)的生物抗癌領(lǐng)域中藥效最好的藥用真菌之一。大量的研究結(jié)果表明桑黃多糖能有效抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并防止其擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，這主要是通過(guò)細(xì)胞調(diào)節(jié)和體液免疫而起作用的。另外，國(guó)內(nèi)外研究表明，桑黃還具有肝纖維化抑制、抗氧化、抗血管生成、降血糖、抗菌消炎等藥理作用。
目前，關(guān)于瓦尼木層孔菌的研究報(bào)道比較少，中國(guó)知網(wǎng)上僅有20余篇相關(guān)文獻(xiàn)， 文獻(xiàn)顯示其化學(xué)成分主要是多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)和留醇類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗氧化等作用。為了開(kāi)發(fā)瓦尼木層孔菌，需要對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。為提高藥效、富集純化有效部位，需要一種能夠?qū)ν吣崮緦涌拙亩嗵遣课贿M(jìn)行進(jìn)富集的制備工藝。發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，提取分離純化并最終得到較高純度的瓦尼木層孔菌多糖，有效地富集瓦尼木層孔菌的多糖有效成分，降低提取物中的雜質(zhì)含量。
本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是:提供一種藥用真菌瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于包括以下步驟:
(1)取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)篩；
(2)用乙醇水溶液浸提脫脂2 3次，棄去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；
(3)將干燥后的原料用熱水提取三次，濾液用紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮，放置冷卻至室溫；
(4)向冷卻后的濃縮液中加乙醇，攪拌均勻，冷藏醇沉；
(5)將醇沉物離心，用乙醇洗滌沉淀，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。
所述步驟⑴中，粉碎后的原料過(guò)5 30目篩。
所述步驟⑵中，脫脂所用乙醇濃度為70 100%，瓦尼木層孔菌原料與乙醇的比例為1:1 50，浸提時(shí)間為I 24小時(shí)。
所述步驟(3)中，瓦尼木層孔菌原料與水的比例為1:1 50，提取溫度為70 100°c，提取時(shí)間為I 5小時(shí)，濃縮后的體積與提取液體積比為1: 5 20。
所述步驟(4)中，乙醇的濃度為70 90%，冷藏溫度為O 5°C，醇沉?xí)r間為I 72小時(shí)。
所述步驟(5)中，離心時(shí)間為5 30分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 10000r/min，洗滌次數(shù)為I 3次。
本發(fā)明所用的瓦尼木層孔菌(Phellinus vaninii Ljub)采集自遼寧省丹東市,標(biāo)本保存于山東大學(xué)藥學(xué)院天然藥物化學(xué)標(biāo)本室，編號(hào)為PV20100901。
優(yōu)選的一種瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)5 30目篩；用70 100%濃度的乙醇水溶液浸提脫脂 2 3次，浸提時(shí)間為I 24小時(shí)，料液比為1:1 50，棄去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；將干燥后的原料用熱水提取三次，料液比為1:1 50，提取溫度為70 100°C， 提取時(shí)間為I 5小時(shí)，濾液用細(xì)紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮至適當(dāng)體積，濃縮后的體積與提取液體積比為1: 5 20，放置冷卻至室溫；向冷卻后的濃縮液中加乙醇至濃度為 70 90%，攪拌均勻，冷藏醇沉，冷藏溫度為O 5°C，醇沉?xí)r間為I 72小時(shí)；將醇沉物離心5 30分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 10000r/min，用乙醇洗滌沉淀I 3次，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。
更優(yōu)選的一種瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)5 30目篩；用70 95%濃度的乙醇水溶液浸提脫脂 2 3次，浸提時(shí)間為I 24小時(shí)，料液比為1: 10 30，棄去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；將干燥后的原料用熱水提取三次，料液比為1: 10 50，提取溫度為100°C，提取時(shí)間為I 5小時(shí)，濾液用細(xì)紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮至適當(dāng)體積，濃縮后的體積與提取液體積比為1: 5 20，放置冷卻至室溫；向冷卻后的濃縮液中加乙醇至濃度為80%， 攪拌均勻，冷藏醇沉，冷藏溫度為O 5°C，醇沉?xí)r間為I 72小時(shí)；將醇沉物離心10分鐘， 離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min，用乙醇洗滌沉淀3次，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。
所需設(shè)備包括:高速中藥粉碎機(jī)(粉碎細(xì)度5 40目)、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、高速離心機(jī)、 真空干燥箱、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。
真菌多糖的含量測(cè)定方法在本領(lǐng)域是公知的，如硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法、3，5- 二硝基水楊酸法等，本發(fā)明瓦尼木層孔菌多糖含量測(cè)定所使用的方法為硫酸苯酚法。
本發(fā)明是先用較高濃度的乙醇將瓦尼木層孔菌原料浸提脫脂，再用熱水提取多糖成分，然后醇沉離心得到粗多糖。
本發(fā)明的有益效果是:有效地富集瓦尼木層孔菌的多糖有效成分，降低提取物中的雜質(zhì)含量，根據(jù)該方法制備得到的瓦尼木層孔菌粗多糖含量高·達(dá)60.5% ;工藝簡(jiǎn)單、成本低，在較小能耗、較少有機(jī)溶劑使用的情況下對(duì)瓦尼木層孔菌多糖進(jìn)行提取分離并純化，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述:
實(shí)施例1
取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)10目篩；取過(guò)篩后的原料50克，用濃度為90%的乙醇水溶液浸提脫脂3次，浸提時(shí)間為24小時(shí)，料液比為1: 5，棄去浸提液，剩余原料自然晾干；將干燥后的原料用熱水提取三次，料液比為 I: 10，提取溫度為100°C，提取時(shí)間為3小時(shí)，濾液用細(xì)紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮至體積與提取液體積比為1: 10，放置冷卻至室溫；向冷卻后的濃縮液中加乙醇至濃度為 90%，攪拌均勻，冷藏醇沉4小時(shí)，冷藏溫度為O 5°C ;將醇沉物離心20分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為4000r/min，用乙醇洗滌沉降物3次，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。粗多糖共 1.5克，產(chǎn)率為生藥材的3.0%，多糖含量用硫酸苯酚法測(cè)定為60.5%。
實(shí)施例2
取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)30目篩；取過(guò)篩后的原料50克，用濃度為70%的乙醇水溶液浸提脫脂2次，浸提時(shí)間為2小時(shí)，料液比為1: 45，棄去浸提液，剩余原料自然晾干；將干燥后的原料用熱水提取三次，料液比為I: 40，提取溫度為80°C，提取時(shí)間為1.5小時(shí)，濾液用細(xì)紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮至體積與提取液體積比為1: 20，放置冷卻至室溫；向冷卻后的濃縮液中加乙醇至濃度為 80%，攪拌均勻，冷藏醇沉72小時(shí)，冷藏溫度為O 5°C ;將醇沉物離心10分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為8000r/min，用乙醇洗滌沉降物3次，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。粗多糖共1.4克，產(chǎn)率為生藥材的2.8%，多糖含·量用硫酸苯酚法測(cè)定為59.7%。
權(quán)利要求
1.一種藥用真菌瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于包括以下步驟:(1)取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)篩；(2)用乙醇水溶液浸提脫脂2 3次，棄去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；(3)將干燥后的原料用熱水提取三次，濾液用紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮，放置冷卻至室溫；(4)向冷卻后的濃縮液中加乙醇，攪拌均勻，冷藏醇沉；(5)將醇沉物離心，用乙醇洗滌沉淀，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟(I)中，粉碎后的原料過(guò)5 30目篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟⑵中，脫脂所用乙醇濃度為70 100%，瓦尼木層孔菌原料與乙醇的比例為1:1 50，浸提時(shí)間為I 24小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟⑶中，瓦尼木層孔菌原料與水的比例為1:1 50，提取溫度為70 100°C，提取時(shí)間為I 5小時(shí)，濃縮后的體積與提取液體積比為1: 5 20。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟⑷中，乙醇的濃度為70 90%，冷藏溫度為O 5°C，醇沉?xí)r間為I 72小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中所述的瓦尼木層孔菌多糖的提取純化方法，其特征在于，在所述步驟(5)中，離心時(shí)間為5 3 0分鐘，離心機(jī)轉(zhuǎn)速為1000 10000r/min，洗滌次數(shù)為I 3次。
全文摘要
本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物有效成分的提取領(lǐng)域，其特征在于包括以下步驟取瓦尼木層孔菌原料，挑選剪除附著的木屑，將原料烘干，粉碎，過(guò)篩；用乙醇水溶液浸提脫脂，棄去浸提液，剩余原料自然晾干或烘干；將干燥后的原料用熱水提取三次，濾液用紗布過(guò)濾，合并濾液后減壓濃縮，放置冷卻至室溫；向冷卻后的濃縮液中加乙醇，攪拌均勻，冷藏醇沉；將醇沉物離心，用乙醇洗滌沉淀，沉降物烘干后即得瓦尼木層孔菌粗多糖。降低提取物中的雜質(zhì)含量，根據(jù)該方法制備得到的瓦尼木層孔菌粗多糖含量高達(dá)60.5％；工藝簡(jiǎn)單、成本低，在較小能耗、較少有機(jī)溶劑使用的情況下對(duì)瓦尼木層孔菌多糖進(jìn)行提取分離并純化，特別適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/04GK103254321SQ20121003792
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月20日
發(fā)明者何茂群, 婁紅祥, 李偉, 曹桂東, 仝加, 朱敘偉, 劉德杰, 楊文寧, 李雪改, 吳煥軍 申請(qǐng)人:瑞陽(yáng)制藥有限公司, 山東大學(xué)