專利名稱：胸腺素α原在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及胸腺素α原，尤其是涉及一種胸腺素α原在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中的用途。
背景技術(shù)：
1984年，Haritos等從大鼠胸腺分離出一種含有111個(gè)氨基酸殘基的多肽，由于其N端含已發(fā)現(xiàn)的所有胸腺素α原家族成員的序列，因此命名為胸腺素α原。人ProTa 由109個(gè)氨基酸殘基組成，與大鼠ProT α的序列相比，有6個(gè)位點(diǎn)的差異，包括4個(gè)位點(diǎn)的替代和 2 個(gè)位點(diǎn)的缺失(I、Haritos AA, Goodall GJ, Horecker BL, Prothymosin alpha isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alphal in rat thymus. Proc Natl Acad Sci U S A，1984,81 :1008 ;2、Haritos AA. Alpha-thymosins relationships in structure，distribution，and function. Isozymes Curr Top Biol Med Res 1987，14 :123-152 ;3、Goodall GJjDominguez FiHorecker BL. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci USA 1986 ；83 (23) 8926-8928 ;4、Pan LXiHaritos AAiWideman JiKomiyama T,Chang M,Stein S et al. Human prothymosin alpha amino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys 1986 ；250(1) :197-201) 1985 年，Haritos 等(5、Komiyama T，Pan LX, Haritos AA, et al. The primary structure of rat parathymosin. Proc Natl Acad Sci USA 1986 ；83 (5) :1242-1245) 發(fā)現(xiàn)大鼠ProTA能增強(qiáng)小鼠抗白色念珠菌(Candida albicans)感染的能力，1986年P(guān)an又發(fā)現(xiàn)Ρι Τ α能剌激轉(zhuǎn)移抑制因子(MIF)的釋放，其作用比Ta I強(qiáng)10 20倍(6.Haritos AA,r.Blacher,S. Stein,J. . Horecker. Parathymosin alpha a peptide from rat tissues with structural homology to prothymosin alpha. Proc Natl Acad Sci U S A，82: 1050-1053 ;7、Pan LX, Haritos AA, Wideman J，et al. Human prothymosin alpha amino acid sequence and immunologic properties.Arch Biochem Biophys 1986 ；250 (I) 197-201)，1987年，S a Ivin等發(fā)現(xiàn)腹腔注射ProT α能增強(qiáng)RF/J小鼠產(chǎn)生抗體的能力，鋅能加強(qiáng)這種作用，能使青年大鼠和老年大鼠的細(xì)胞免疫和體液免疫都增強(qiáng)(8、Salvin SB， Horecker BL, Pan LX, Rabin BS.The effect of dietary zinc and prothymosin alpha on cellular immune responses of RF/J mice. Clin Immunol Immunopathol 1987 ； 43(3) :281_2880 )。Papanastasiou (9、Papanastasiou M, Baxevanis CN，Papamichail M. Promotion of murine antitumor activity by prothymosin alpha treatment I.Induction of tumoricidal peritoneal cells producing high levels of tumour necrosis factor alpha. Cancer Immunol Immunother 1992 ；35 (2) :145_150o )發(fā)現(xiàn)， CBA/2小鼠如果腹腔接種腫瘤細(xì)胞，一般8-12天之內(nèi)產(chǎn)生腹水，10-14天后死亡，20 %的經(jīng)過(guò)ProTa處理的小鼠不產(chǎn)生腹水，并能夠使不產(chǎn)生腹水中的40% -60%的小鼠壽命可以延長(zhǎng)到70天。當(dāng)腹腔注射ProTa時(shí)，能夠增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、提高N K，LA K細(xì)胞的活性(10、Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) :175-182 ；1K Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV, . Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994 ；38 (4) :281-286);增強(qiáng) MHC 限制的細(xì)胞免疫(12、Baxevanis CN,Thanos D，Reclos GJ,J et al. Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation. J Immunol 1992 ；148 (7) :1979-1984 ;13、Baxevanis CN, Thanos D，Reclos GJ, et al. Prothymosin alpha enhances human and murine MHC class II surface antigen expression and messenger RNA accumulation. J Immunol 1992; 148 (7) : 1979-1984)，抑制系統(tǒng)性紅斑狼瘡(14、Baxevanis CN, Reclos CJ, Papamichail M et al. Prothymosin alpha restores the depressed autologous and allogenic mixed lymphocyte responses in patient with systemic lupus erythematosus. Immuopharmaco immunotoxico，1987，9 :429。)，促進(jìn)IL-2，MIF的分泌和TN F-α，IFN-Y的合成；促進(jìn)IL-2受體的表達(dá)(15.Baxevanis CN， Gritzapis AD, Spanakos G，. Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1995 ；40 (6) :410-418; 16、Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) :175-182 ;17、Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV, . Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994 ；38 (4) :281-286 ;18、Voutsas IF，Baxevanis CN, Gritzapis AD, et al. Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytes against autologous human carcinomas. Cancer Immunol Immunother 2000 ；49 (8) :449-458 ; 19、Cordero OJ, Sarandeses CS， Lopez JL, et al. Prothymosin alpha enhances IL_2receptor expression in norma human T-lymphoctyes. Int J Immunpharmacol, 1991,13 1059o )，從而產(chǎn)生非特異性腫瘤殺傷作用，同時(shí)，誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒T細(xì)胞(CD8+)和輔助性T細(xì)胞(CD4+)的特異性抗腫瘤作用。ProTa在疾病早期可以剌激淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞(lymphokien activated killer cells, LAK)活性，它是通過(guò)增加淋巴細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)而增加IFN-Y和IL-2 的分泌來(lái)實(shí)現(xiàn)的(20、Lopez-Rodriguez 幾，Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) : 175-182 ;21、Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV, . Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1994 ；38 (4) :281-286)。單獨(dú)使用 ProTa時(shí)可以剌激TNF-a和IL_2的分泌，如果與IL_2聯(lián)合使用時(shí)，可增加NK細(xì)胞CD25及 ⑶18/11黏附分子的表達(dá)。在IFN-Y存在的條件下，PiOTa主要通過(guò)增加⑶54(細(xì)胞黏附分子配體)的表達(dá)，剌激單核細(xì)胞與集結(jié)的腫瘤細(xì)胞的結(jié)合，達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的(22、 Baxevanis CN,Gritzapis AD,Spanakos G,. Induction of tumor-specific T lymphocyte responses in vivo by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunother 1995 ；40 (6)410-418 ;23、Lopez-Rodriguez JL, Cordero OJ, Sarandeses C，. Interleukin-2 killer cells in vitro evaluation of combination with prothymosin alpha. Lymphokine Cytokine Res 1994 ；13 (3) :175-182 ;24、Baxevanis CN, Gritzapis AD, Dedoussis GV,. Induction of lymphokine-activated killer activity in mice by prothymosin alpha. Cancer Immunol Immunotherl994 ;38 (4) :281-286 ;25、Voutsas IF, Baxevanis CN, Gritzapis AD, et al. Synergy between interleukin-2 and prothymosin alpha for the increased generation of cytotoxic T lymphocytes against autologous human carcinomas. Cancer Immunol Immunother 2000,49(8) :449-458) 近來(lái)研究表明，ProTa 在DNA疫苗中還可以起到疫苗佐劑的效果(26、Jin Y，Cao C，Li P，Liu X，Huang W，Li C et al. Boosting immune response to hepatitis B DNA vaccine by coadministration of Prothymosin alpha-expressing plasmid. Clin Diagn Lab Immunol 2005 ；12 (12) 1364-1369 ;27、Shiau ALiChen CC,Yo YT,Chu CYiWang SY,Wu CL.Enhancement of humoral and cellular immune responses by an oral Salmonella choleraesuis vaccine expressing porcine prothymosin alpha. Vaccine 2005 ;23 (48-49) :5563_5571。)。但是目前還沒(méi)有任何關(guān)于胸腺素α原通過(guò)抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性的途徑來(lái)預(yù)防和治療肝癌相關(guān)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的在于提供胸腺素α原在抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性中的用途。本發(fā)明的第二目的在于提供胸腺素α原在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中的應(yīng)用。以下給出重組人前胸腺素α原的制備方法從健康中國(guó)人外周血淋巴細(xì)胞通過(guò)提取RNA后，采用RT-PCR的方法獲得中國(guó)人特有胸腺素α原cDNA，利用基因工程技術(shù)體外重組包含胸腺素α原基因的重組表達(dá)載體，再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)純化獲得重組胸腺素α原蛋白。詳細(xì)過(guò)程參見(jiàn)中國(guó)專利(ZL2008. 10072084. 4 ;發(fā)明人周克夫等)以下給出胸腺素α原在肝癌預(yù)防和治療中的功能實(shí)驗(yàn)1)Η22原位肝癌小鼠模型的制備選擇腹腔接種Η22后15d，生長(zhǎng)狀況良好的荷瘤鼠，從腹腔用一次性注射器無(wú)菌吸取腹水，以生理鹽水稀釋細(xì)胞，洗滌2次，再用生理鹽水稀釋細(xì)胞數(shù)為8X IO6個(gè)/ml，活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于95%，取O. 2ml瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠右腋皮下。于接種7 8日皮下腫瘤長(zhǎng)至0.3 O. 4cm大小后，分離腫瘤組織，無(wú)菌條件下剪成 O. 5mm大小的組織。2)將30只小鼠無(wú)菌條件下進(jìn)行開(kāi)腔手術(shù)，露出部分肝臟，用針頭將腫瘤組織推進(jìn)肝臟隨即用生物膠封閉開(kāi)口，再將腹腔縫合。3)實(shí)驗(yàn)分組將30只經(jīng)過(guò)手術(shù)的原位移植肝癌小鼠模型混勻后，再按A，B，C，D四組每組10只分籠飼養(yǎng)。A，B組為用藥組，腹腔注射胸腺素α原劑量分別為150 μ g/只和 300 μ g/只。C組為對(duì)照組注射同樣劑量的生理鹽水，另外選擇同樣大小的10只小鼠為正常對(duì)照組，不移植腫瘤但同樣注射生理鹽水。每3天測(cè)體重I次。實(shí)驗(yàn)以21天為周期。4)指標(biāo)測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)束后分離肝腫瘤稱重，并測(cè)量腹水體積。5)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的檢測(cè)
(I)無(wú)菌分離小鼠脾臟，用無(wú)菌針管頭部研磨后用200，300目過(guò)濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液在氯化銨溶液作用下去除紅細(xì)胞獲得淋巴細(xì)胞溶液。(2)用淋巴細(xì)胞分離液分離獲得純淋巴細(xì)胞。(3)應(yīng)用檢測(cè)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的熒光抗體，⑶4，⑶25，⑶127-FITC分別標(biāo)記進(jìn)行三色染色后，上流式細(xì)胞儀分析記錄結(jié)果。同時(shí)用同型作為陰性對(duì)照?？刹捎猛饪剖中g(shù)方法成功建立體內(nèi)移植肝癌H22模型。采用腹腔注射胸腺素α原，觀察該重組蛋白在預(yù)防及治療肝癌中的作用，包括肝腫瘤的大小以及防止腹水的形成。經(jīng)過(guò)胸腺素α原的注射治療和預(yù)防，能夠明顯抑制肝腫瘤的生長(zhǎng)同時(shí)能夠減少腹水的形成。通過(guò)檢測(cè)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平，證明肝癌對(duì)照組脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平明顯比正常小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平高差異極顯著(P <0.01)； 而用藥組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平則明顯比正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組低，差異極顯著(P
<O. 01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組胸腺素α原能夠明顯抑制體內(nèi)小鼠肝癌Η22的生長(zhǎng)，通過(guò)分析小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平，進(jìn)一步證實(shí)該作用的機(jī)理是通過(guò)下調(diào)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性 T淋巴細(xì)胞水平，從而解除對(duì)小鼠免疫功能的抑制條件，調(diào)動(dòng)機(jī)體正常自身免疫功能，達(dá)到抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。結(jié)果分析證明，重組人前胸腺素α原在預(yù)防和治療體內(nèi)肝癌具有明顯作用，效果顯著。并且明確闡明其中作用機(jī)理。因此，利用該蛋白能夠用于預(yù)防和治療肝癌的發(fā)生和發(fā)展。對(duì)于開(kāi)發(fā)相應(yīng)的預(yù)防和治療藥物具有重要意義。由此可見(jiàn)，胸腺素α原可用于抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性，并且可在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中應(yīng)用。所述胸腺素α原包括所有哺乳動(dòng)物提取的胸腺素α原以及基因工程表達(dá)的胸腺素α原。所述肝癌包括各型肝癌。所述藥物包括口服藥物、皮下注射藥物和腹腔注射藥物等。


圖I為ProT α體內(nèi)抑制小鼠肝癌細(xì)胞Η22 (原位移植型)的作用(Kl Κ3代表正常小鼠肝臟；C1 C3代表對(duì)照組小鼠肝臟及生長(zhǎng)的腫瘤；T1 T3用藥組小鼠肝臟及生長(zhǎng)的腫瘤)。圖2為ProT α體內(nèi)抑制小鼠肝癌細(xì)胞Η22 (原位移植型)的效果分析(K代表正常小鼠肝臟；c代表對(duì)照組小鼠腫瘤克數(shù)；τ用藥組小鼠腫瘤克數(shù)；*代表顯著性差異)。圖3為流式細(xì)胞儀分析圖，Rl代表圈定的淋巴細(xì)胞，橫坐標(biāo)FS代表(forword scatter)前向散射光；縱坐標(biāo)ss代表側(cè)向散射光(side scatter)。圖4為流式細(xì)胞儀分析圖，R2代表⑶4+/⑶127表達(dá)的細(xì)胞；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；Q)4 :代表白細(xì)胞分化抗原；縱坐標(biāo)PE-⑶127 :代表PE染色的熒光二抗。
圖5為流式細(xì)胞儀分析圖，R3代表CD25表達(dá)的細(xì)胞。橫坐標(biāo)FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗KD4 :代表白細(xì)胞分化抗原；縱坐標(biāo) PRP-CY5-CD25代表白細(xì)胞分化抗原圖6為流式細(xì)胞儀分析圖，同型陰性對(duì)照，橫坐標(biāo)代表FITC (Fluorescein Isothiocyanate),異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；CT4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo) PRP-CY5-CD25代表白細(xì)胞分化抗原圖7為流式細(xì)胞儀分析圖，正常小鼠I調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖8為流式細(xì)胞儀分析圖，正常小鼠2調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖9為流式細(xì)胞儀分析圖，正常小鼠3調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC (Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖10為流式細(xì)胞儀分析圖，對(duì)照組小鼠I調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原。縱坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖11為流式細(xì)胞儀分析圖，對(duì)照組小鼠2調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖12為流式細(xì)胞儀分析圖，對(duì)照組小鼠3調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖13為流式細(xì)胞儀分析圖，用藥組小鼠I調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖14為流式細(xì)胞儀分析圖，用藥組小鼠2調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖15為流式細(xì)胞儀分析圖，用藥組小鼠3調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況；橫坐標(biāo) FITC(Fluorescein Isothiocyanate),代表異硫氰酸突光素標(biāo)記的二抗；0)4 :代表白細(xì)胞分化抗原?？v坐標(biāo)PRP-CY5-⑶25代表白細(xì)胞分化抗原。圖16為用藥組、對(duì)照組及正常小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況比較分析圖(K 代表正常小鼠，C代表對(duì)照組，Tl代表使用胸腺素α原組小鼠；Treg/Rl，代表調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞與所有淋巴細(xì)胞總數(shù)的比值，*代表顯著性差異；**代表極顯著差異；***代表極顯著差異)。從以上附圖的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重組胸腺素α原能夠明顯抑制體內(nèi)小鼠肝癌Η22的生長(zhǎng)，通過(guò)分析小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)該作用的機(jī)理是通過(guò)下調(diào)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平，從而解除對(duì)小鼠免疫功能的抑制條件，調(diào)動(dòng)機(jī)體正常自身免疫功能。達(dá)到抑制體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。綜合以上結(jié)果分析證明重組人前胸腺素α原在預(yù)防和治療體內(nèi)肝癌具有明顯作用，效果顯著。并且明確闡明其中作用機(jī)理。因此，利用該蛋白能夠用于預(yù)防和治療肝癌的發(fā)生和發(fā)展。對(duì)于開(kāi)發(fā)相應(yīng)的預(yù)防和治療藥物具有重要意義。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例所采用的材料與方法說(shuō)明如下。I.實(shí)驗(yàn)取材重組人前胸腺素α原制備從健康中國(guó)人外周血淋巴細(xì)胞通過(guò)提取RNA后，采用 RT-PCR的方法獲得中國(guó)人特有胸腺素α原cDNA，利用基因工程技術(shù)體外重組包含胸腺素 α原基因的重組表達(dá)載體，再將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入原核細(xì)胞大腸桿菌中進(jìn)行克隆表達(dá)純化獲得重組胸腺素α原蛋白。詳細(xì)過(guò)程可參見(jiàn)中國(guó)專利(ZL2008. 10072084. 4 ;發(fā)明人周克夫等)。試驗(yàn)動(dòng)物為昆明種小鼠，SPF級(jí)，(20±2)g，6_7周齡，雄性，廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)0501452。腫瘤種鼠由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。CD4 FITC(rat anti-mouse) ；CD25 PERCP-CY5. 5(rat anti-mouse) ；CD127 PE(rat anti-mouse);同型IGG2A FITC Control突光單抗均購(gòu)自BD公司。2.實(shí)施方法2. I腫瘤抑制率實(shí)驗(yàn)重組人前胸腺素α原蛋白抑制小鼠肝癌Η22及抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)， 選擇腹腔接種Η22后15d，生長(zhǎng)狀況良好的荷瘤鼠，從腹腔用一次性注射器無(wú)菌吸取腹水， 以生理鹽水稀釋細(xì)胞，洗滌2次，再用生理鹽水稀釋細(xì)胞數(shù)為8X IO6個(gè)/ml，活細(xì)胞計(jì)數(shù)大于95%,取0. 2ml瘤細(xì)胞懸液接種于小鼠右腋皮下。于接種7 8日皮下腫瘤長(zhǎng)至0. 3 0. 4cm大小后，分離腫瘤組織，無(wú)菌條件下剪成0. 5mm大小的組織，同時(shí)將30只小鼠無(wú)菌條件下進(jìn)行開(kāi)腔手術(shù)，露出部分肝臟，用針頭將腫瘤組織推進(jìn)肝臟隨即用生物膠封閉開(kāi)口，再將腹腔縫合。將30只經(jīng)過(guò)手術(shù)的原位移植肝癌小鼠模型混勻后，再按A，B, C，D 4組每組 10只分籠飼養(yǎng)。A，B組為用藥組，腹腔注射胸腺素原劑量分別為150 μ g/只和300 μ g/只。 C組為對(duì)照組注射同樣劑量的生理鹽水，另外選擇同樣大小的10只小鼠為正常對(duì)照組，不移植腫瘤但同樣注射生理鹽水。每3天測(cè)體重I次。實(shí)驗(yàn)以21天為周期。實(shí)驗(yàn)結(jié)束之后解剖小鼠分離肝臟腫瘤并測(cè)腫瘤重量。統(tǒng)計(jì)分析采用Graph prime統(tǒng)計(jì)軟件分析,顯著性差異按(P < 0. 05);差異極顯著按(P < 0. 01) ο結(jié)果見(jiàn)圖I和圖2，從圖中可以看出用藥組腫瘤重量明顯比對(duì)照組小，差異顯著(P
<0. 05)2. 2胸腺素原對(duì)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的影響將以上實(shí)驗(yàn)分離獲得的小鼠脾臟，經(jīng)研磨和200目尼龍網(wǎng)和300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后， 采用小鼠淋巴細(xì)胞分離液分離獲得脾臟淋巴細(xì)胞，用2%多聚甲醛的PBS液中(4%)。再按進(jìn)行熒光抗體作用后采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行三色染色，分別檢測(cè)出正常小鼠脾臟，用藥組和對(duì)照組脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的比率。代表調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的流式細(xì)胞分析結(jié)果見(jiàn)圖3(為淋巴細(xì)胞)、圖4(CD4+/ ⑶127表達(dá)的細(xì)胞)、圖5 (⑶25表達(dá)的細(xì)胞)；采用無(wú)抗體的同型陰性對(duì)照?qǐng)D見(jiàn)圖6以正常小鼠脾臟分離的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞見(jiàn)圖7 9，可以看出正常小鼠調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞均能夠檢測(cè)到；移植性肝癌小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞見(jiàn)圖10 12，從圖中看出肝癌對(duì)照組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)量明顯比正常組高，差異極顯著(P < O. 01)。同樣移植性肝癌小鼠，但用胸腺素α原進(jìn)行干預(yù)，其脾臟中的調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平見(jiàn)圖13 15，從圖中看出，其水平明顯比肝癌對(duì)照組低。差異極顯著(P <0.01)三組小鼠調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的結(jié)果比較分析圖見(jiàn)圖16，從圖中看到，正常小鼠調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞水平適中，對(duì)照組最高，而用藥組最低。用藥組與對(duì)照組存在極顯著差異(P
<O. 01)；以上結(jié)果首次證明胸腺素α原通過(guò)抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平達(dá)到抑制肝癌的生長(zhǎng)的效果。
權(quán)利要求
1.胸腺素α原在抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性中的用途。
2.如權(quán)利要求I所述的用途，其特征在于所述胸腺素α原包括所有哺乳動(dòng)物提取的胸腺素α原以及基因工程表達(dá)的胸腺素α原。
3.胸腺素α原在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述胸腺素α原包括所有哺乳動(dòng)物提取的胸腺素α原以及基因工程表達(dá)的胸腺素α原。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述肝癌包括各型肝癌。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述藥物包括口服藥物、皮下注射藥物和腹腔注射藥物。
全文摘要
胸腺素α原在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中的應(yīng)用，涉及胸腺素α原。提供胸腺素α原在抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞活性中的用途，以及胸腺素α原在制備預(yù)防和治療肝癌藥物中的應(yīng)用。采用腹腔注射胸腺素α原，觀察該重組蛋白在預(yù)防及治療肝癌中的作用，包括肝腫瘤的大小以及防止腹水的形成。經(jīng)過(guò)胸腺素α原的注射治療和預(yù)防，能夠明顯抑制肝腫瘤的生長(zhǎng)同時(shí)能夠減少腹水的形成。通過(guò)檢測(cè)小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平，證明肝癌對(duì)照組脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平明顯比正常小鼠脾臟調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平高差異極顯著(P＜0.01)；而用藥組調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞的水平則明顯比正常對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)對(duì)照組低，差異極顯著(P＜0.01)。
文檔編號(hào)A61K38/22GK102580059SQ20121008616
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月28日
發(fā)明者周克夫, 朱苑婷, 王世媛, 粟華, 蔡報(bào)偉 申請(qǐng)人:廈門伯賽基因轉(zhuǎn)錄技術(shù)有限公司, 廈門大學(xué)