專利名稱：一種促進水貂增重的藥物組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物制藥領域中的促增重藥物組合物，特別是涉及ー種促進水貂增重的藥物組合物。
背景技術：
水貂皮具有細密柔軟，手感爽滑，色澤美觀，結實輕巧，又能防潮去濕的優(yōu)點，用其制成的裘服華貴、保暖、美觀、耐用，因而水貂皮有世界皮毛之冠的美稱，也有人稱其為“軟黃金”。由于水貂的主要經(jīng)濟價值在其皮毛，因此迫切需要促進水貂增重的藥物，以提高水貂的經(jīng)濟價值。本發(fā)明涉及的Exendin9_39是含有31個氨基酸殘基的小肽，它是由exendin_4的39個氨基酸殘基缺失N端的前8個氨基酸殘基后得到的。Exendin-4發(fā)現(xiàn)于美國毒蜥蜴分泌的毒液中(Eng J等，1992)。其作用主要是動物體內的類胰高血糖素樣肽_1(glucagon-like peptide-1, GLP-I)受體的激活劑，促進GLP-1與受體結合，誘導cAMP的產生，從而發(fā)揮出類似GLP-I的作用増加葡萄糖依賴性的胰島素分泌，抑制胰高血糖素的分泌，加速葡萄糖清除，延緩胃排空和誘發(fā)飽腹感、抑制食欲，還可以改善外周胰島素抵抗等。而缺少8個氨基酸的Exendin9-39卻是GLP-I受體的抑制劑，其作用也與exendin-4完全相反降低胰島素的分泌、增加胰高血糖素的分泌、増加食欲等(Goke R等，1993 ;Schepp W 等，1994 ;Thorens B 等，1993)。早在 1999 年，Karim Meeran 等用大鼠的實驗證明，exendin9-39能夠提高動物食欲，并能增加動物的體重。他們姆天注射30nmol的exendin9_39于大鼠的側腦室中，連續(xù)注射3天,與注射生理鹽水的對照組相比，實驗組大鼠平均每天的飼料消耗是21. 9±0. 5vs. 19. 5±0. 4g，P〈0. 001，最終體重增加(7±2vs. 2±lg，P〈0. 02)。人們可以利用exendin9_39的特性使毛皮動物達到增肥的目的。但exendin9_39化學合成的成本較高。經(jīng)分析各種文獻和專利，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)與exendin-4有關的國內公開專利有54項、美國專利有51項、歐洲專利有10項，但都與exendin9-39的序列和真核表達無關，關于eXendin9-39基因的優(yōu)化和真核表達，至今沒有報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種促進狐貍增重的藥物組合物，其有效成分為含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體；該藥物組合物優(yōu)選為注射劑。所述exendin9_39編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. I所示。所述真核表達載體中eXendin9-39編碼基因的5’端緊密鏈接有人生長激素的信號肽編碼序列，所述人生長激素的信號肽編碼序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。所述5’端緊密鏈接有人生長激素的信號肽編碼序列的eXendin9-39編碼基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示。用于構建所述含有eXendin9-39編碼基因的真核表達載體的出發(fā)載體為pVAXl(Invitrogen 公司)、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP-Nl (ClonTech 公司)、pCMV (Stratagene 公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI_neo (Promega 公司)、pPICZa、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)；其中，優(yōu)選 pVAXl，以 pVAXl 為出發(fā)載體構建的含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體為pVAXl-EXMK。上述重組表達載體均可按照常規(guī)方法構建。所述注射劑中含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體的濃度為100-200 μ g/ml ο所述注射劑的溶劑的選擇是多種多樣的，如pH 7. 5-8. 5的TE緩沖液、生理鹽水、PBS或滅菌蒸餾水等，優(yōu)選為pH 7. 5-8. 5的TE緩沖液。 需要的時候，在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學上可接受的載體。所述載體包括藥學領域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進劑、表面活性劑等。上述藥物一般在10月份應用于水貂肌肉注射，用量為每只水貂注射3_5ml，根據(jù)增重情況，可適時追加注射一次，直至11月中下旬水貂取皮。劑量和療程都可調整。為提高療效，本發(fā)明的藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑等進行組合治療。本發(fā)明提供一種促進水貂增重的藥物組合物。該藥物組合物的活性成分為含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體，將其導入水貂體內，可使exendin9_39編碼基因在水貂體內進行表達，從而達到促進水貂增重的目的，以期獲得質優(yōu)價廉的貂皮。本發(fā)明的藥物組合物具有以下優(yōu)點I)與傳統(tǒng)的優(yōu)化水貂飼料配方和從飼養(yǎng)管理等角度出發(fā)研究的促進水貂增重的方法相比，本發(fā)明的藥物組合物具有成本低、起效快的優(yōu)點。2)該藥物組合物嚴格按照基因藥物生產標準進行制備及純化，具有較高的使用安全性，且經(jīng)過動物試驗結果表明，該藥物無任何毒、副作用。3)貂皮僅供人類穿戴，動物尸體一般進行銷毀或用于生產エ業(yè)用油，故不存在藥物的安全性問題肌肉注射的藥物組合物即使有殘留也只會殘留在肌肉中，退ー步講，如果本發(fā)明的藥物在毛皮內有殘留，也不會對人類健康造成威脅，因為水貂毛皮只被制成大衣或帽子等，不與人體直接接觸。4)本發(fā)明的藥物組合物可利用工程菌發(fā)酵培育獲得，培養(yǎng)及純化方法簡單，成本低廉，對設備要求低，便于進行エ廠化生產。本發(fā)明將在水貂及其他毛皮動物的養(yǎng)殖中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。


圖I為含有exendin9_39編碼基因的真核表達載體pVAXl-EXMK的物理圖譜。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見《Molecular Cloning:A LaboratoryManual)) (Sambrook, J. , Russell, David W·，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rdedition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。所有引物及DNA序列均由上海生工合成。實施例I制備促進水貂增重的藥物組合物
本發(fā)明促進水貂增重的藥物組合物的制備過程，包括如下步驟I)人工設計合成5’端緊密鏈接有人生長激素的信號肽編碼序列的eXendin9-39編碼基因的核苷酸序列Exendin9-39的氨基酸序列如下NH2-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-IIe-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Giy-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser—COOHo根據(jù)遺傳密碼表，并考慮到水貂密碼子的偏愛性，我們設計推導出eXendin9-39基因的真核表達編碼序列為ATGGACCTGTCCAAGCAGATGGAGGAGGAGGCCGTGCGGCTGTTCATCGAGTGGCTGAAGAACGGCGGC CCCTCCTCCGGCGCCCCCCCCCCCTCCTGA (SEQ ID No. I 所示)。而exendin-4失去N端的前8個氨基酸后的核苷酸序列為GACTTGTCAAAACAGATGGAAGAGGAGGCAGTGCGGTTATTTATTGAGTGGCTTAAGAACGGAGGACCAAGTAGCGGGGCACCTCCGCCATCG。(Chen YE 等，1997)。相比之下,我們設計的exendin9_39的核苷酸序列與exendin-4的核苷酸序列顯著不同，二者的同源性僅有74. 44%。為促進exendin9_39編碼基因的表達，我們在其5’端緊密鏈接上人生長激素的信號肽編碼序列(SEQ ID No. 2所示)，人工設計合成5’端緊密鏈接有人生長激素的信號肽編碼序列的exendin9-39編碼基因的核苷酸序列(并攜帶Hind III和BamH I酶切位點),其完整的表達框序列如SEQ ID No. 3所示。2)真核表達載體pVAXl-EXMK的構建將步驟I)合成的核苷酸序列經(jīng)Hind III和BamH I酶切后直接克隆入酶切后的PVAXI (購自北京中創(chuàng)先鋒科技有限責任公司，為invitrogen公司產品)中，構建成含有exendin9-39的真核表達載體，命名為pVAXl-EXMK。3)促進水貂增重的藥物組合物的獲得將步驟2)構建的真核表達載體pVAXl-EXMK轉化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆，將陽性克隆接種于LB培養(yǎng)基中，37°C下發(fā)酵培養(yǎng)16-18小吋，發(fā)酵結束后收集菌體，離心，棄上清，提取pVAXl-EXMK質粒DNA，用聚こニ醇沉淀法進行純化，檢測0D26(l/0D28(l比值為1.9:1，符合標準；再將pVAXl-EXMK質粒DNA溶解于TE緩沖液中(含終濃度IOmmol/L Tris-Cl和lmmol/L EDTA的溶液，pH值為8. 0)，得到促進水貂增重的藥物組合物(可根據(jù)需要調整pVAXl-EXMK質粒DNA和TE緩沖液的混合比例，得到不同濃度的藥物組合物，如將100 μ g的pVAXl-EXMK質粒DNA和ImlpH值為8. O的TE緩沖液混合均勻，即得到濃度為100 μ g/ml的促進水貂增重的藥物組合物)。實施例2安全性試驗(I)毒性試驗將500yg pVAX I-EXMK 質粒 DNA 溶解在 Iml TE 緩沖液(pH 值 8. 0)中，配成 500 μ g/ml的藥物組合物，尾部靜脈注射10只實驗小鼠，注射后連續(xù)觀察5天，10只小鼠均未出現(xiàn)不良反應和死亡現(xiàn)象。將10. Omg pVAXl-EXMK 質粒 DNA 溶解在 Iml TE 緩沖液(pH 值 8. O)中，配成 IOmg/ml的藥物組合物，對10只成年貂進行肌肉注射，注射后連續(xù)觀察30天，均未出現(xiàn)體溫升高和異常臨床表現(xiàn)。上述試驗結果表明，注射本發(fā)明的促進水貂增重的藥物組合物具有較高的安全性。(2)藥物殘留檢測將10. Omg pVAXl-EXMK 質粒 DNA 溶解在 Iml TE 緩沖液(pH 值 8. O)中，配成 IOmg/ml的藥物組合物，對14只成年貂進行肌肉注射，取治療后水貂腿部肌肉進行藥物組合物殘留檢測，連續(xù)檢測14天，結果僅在注射后第3天PCR檢測為陽性，證明本發(fā)明藥物的殘留量較低。實施例3藥效實驗
隨機選取成年水貂40只，公母各半，隨機分為4組，每組10只，公母各5只。第I組腿部肌肉注射pVAXl-EXMK質粒DNA濃度為200 μ g/ml的促進水貂增重藥物組合物5ml ;第2組腿部肌肉注射pVAXl-EXMK質粒DNA濃度為400 μ g/ml的促進水貂增重藥物組合物5ml ;第3組腿部肌肉注射pVAXl-EXMK質粒DNA濃度為1000 μ g/ml的促進水貂增重藥物組合物5ml ;第4組注射TE緩沖液(pH值8. O) 5ml。用藥前和屠宰前分別稱重，對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，綜合判定藥效。與第4組對照組相比，第1、2、3組的平均增重分別為483±0. 5g、350±0. 7g、312±0. 4g。上述結果證明，本發(fā)明的藥物組合物對水貂的增重有明顯的效果。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作ー些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種促進水貂增重的藥物組合物，其有效成分為含有eXendin9-39編碼基因的真核表達載體。
2.根據(jù)權利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，所述eXendin9-39編碼基因具有SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
3.根據(jù)權利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，所述真核表達載體中exendin9-39編碼基因的5’端緊密鏈接有人生長激素的信號肽編碼序列，所述人生長激素的信號肽編碼序列如序列表中SEQID No. 2所示。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項所述的藥物組合物，其特征在于，所述真核表達載體含有如SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列。
5.根據(jù)權利要求I所述的藥物組合物，其特征在于，用于構建所述真核表達載體的出發(fā)載體為 PVAXK pSilencel. 0-U6、pEGFP-Nl、pCMV、pSV40、pSI、pCI、pCI-neo、pPICZa、pTEFl、pcDNA3. I 或pcDNA。
6.根據(jù)權利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述出發(fā)載體為pVAXl。
7.根據(jù)權利要求6所述的藥物組合物，其特征在于，所述真核表達載體為pVAXl-EXMK。
8.根據(jù)權利要求I所述的藥物組合物，其為100-200μ g/ml濃度含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體的注射劑。
9.根據(jù)權利要求8所述的藥物組合物，其特征在于，所述注射劑的介質為pH7.5-8.5的TE緩沖液、生理鹽水或PBS。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種促進水貂增重的藥物組合物，具體是以含有exendin9-39編碼基因的真核表達載體為有效成分的注射劑。通過將該藥物組合物導入水貂體內，可使exendin9-39編碼基因在水貂體內進行表達，促進水貂增重，從而獲得質優(yōu)價廉的貂皮。本發(fā)明的藥物組合物具有以下優(yōu)點成本低、起效快；通過該藥物組合物增重獲得的貂皮僅供人類穿戴，不存在藥物的安全性問題；該藥物組合物可利用工程菌發(fā)酵獲得，方法簡單、對設備要求低，便于進行工廠化生產。
文檔編號A61P43/00GK102688504SQ20121021199
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月20日 優(yōu)先權日2012年6月20日
發(fā)明者劉維全, 王吉貴 申請人:中國農業(yè)大學