專利名稱：Snx家族新基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，尤其是，本發(fā)明涉及SNXll基因及其用途。
背景技術(shù)：
內(nèi)涵體是真核細(xì)胞內(nèi)部眾多獨(dú)立的膜泡結(jié)構(gòu)，分布于整個(gè)細(xì)胞質(zhì)之中，負(fù)責(zé)在細(xì)胞不同部位之間的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，對細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)意義重大。一旦內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)混亂，就會(huì)影響細(xì)胞的正常生理進(jìn)程，例如內(nèi)涵體負(fù)責(zé)的信號(hào)分子受體轉(zhuǎn)運(yùn)障礙會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖，分化失控等。Sorting Nexins(SNXs)是對內(nèi)涵體進(jìn)行精細(xì)調(diào)控的蛋白家族,這個(gè)家族發(fā)現(xiàn)的比較晚，在人(Homo sapiens)中共有33個(gè)成員，都具有PX結(jié)構(gòu)域(phox-homology domain)作為這一家族的特征結(jié)構(gòu)域。
目前對于SNX家族的研究仍有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明g在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種分離的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該多肽具有SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列。發(fā)明人經(jīng)過分析，該多肽在SNX家族進(jìn)化樹上與SNX10最為接近，二者PX結(jié)構(gòu)域的相似性為78%，為此將該多肽在本文中命名為SNX11。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)SNXll后發(fā)現(xiàn)它不產(chǎn)生和SNX10相似的成泡現(xiàn)象。而當(dāng)發(fā)明人將SNX10和SNXll共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以顯著的抑制SNX10誘導(dǎo)的成泡現(xiàn)象。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll抑制了晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大和成熟，但對Rab7的募集不產(chǎn)生影響。進(jìn)ー步，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過表達(dá)SNXll可以抑制VacA在細(xì)胞中的空泡化作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在VacA處理后的細(xì)胞中，出現(xiàn)大量的擴(kuò)大的晚期內(nèi)涵體。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽SNXll后，雖然Rab7依然出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，但晚期內(nèi)涵體的進(jìn)ー步擴(kuò)大則被抑制。另外，發(fā)明人建立了 SNXll基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的増殖，并有較高比率的小鼠存活，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細(xì)胞在體外表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌與抗瘧疾免疫力相關(guān)的白介素12(IL-12)和Y干擾素，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠中可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產(chǎn)生了高水平的抗瘧疾抗體。SNXll基因表達(dá)水平分析表明，該基因在腦組織中表達(dá)豐富；在主要免疫細(xì)胞(⑶4T細(xì)胞、⑶8T細(xì)胞B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)中，SNXll都有表達(dá)，其中，SNXll基因在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達(dá)在所分析的上述主要免疫細(xì)胞中均有顯著下降。在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該寡核苷酸能夠編碼前面所述的多肽。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的寡核苷酸能夠編碼前面所述的多肽，由此，可以有效地實(shí)現(xiàn)體外表達(dá)本發(fā)明所分離的多肽，并且適于大規(guī)模表達(dá)分離所述的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。由此，可以進(jìn)一步提聞表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多妝的效率。在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了ー種表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該表達(dá)載體包含編碼前面所述分離的多肽的核酸分子。由此，利用該表達(dá)載體，能夠有效地在體外表達(dá)體系例如重組細(xì)胞中,表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽。在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了ー種重組細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述重組細(xì)胞中包含前面所述多肽的核酸分子，優(yōu)選地包含如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，任選地所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選小鼠細(xì)胞。在本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提出了前面所述的多肽、寡核苷酸、或 者表達(dá)載體在制備藥物中的用途。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物可以用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述重組細(xì)胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括使用前面所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及分離重組細(xì)胞，任選地所述宿主細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選小鼠細(xì)胞。利用該方法，能夠有效地獲得根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例所述的重組細(xì)胞。在本發(fā)明的第七方面，本發(fā)明提出了ー種藥物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該藥物包含前面所述的多肽、寡核苷酸、表達(dá)載體和重組細(xì)胞的至少ー種，該藥物用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。在本發(fā)明的第八方面，本發(fā)明提出了ー種動(dòng)物細(xì)胞及其衍生物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該動(dòng)物細(xì)胞的SNXll基因的表達(dá)量下降。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該動(dòng)物細(xì)胞的基因組中，至少ー個(gè)SNXll等位基因被敲除。由此，構(gòu)建了基因組中缺失了 SNXll基因的動(dòng)物細(xì)胞，進(jìn)ー步可以利用該細(xì)胞構(gòu)建缺失SNXll的動(dòng)物，例如小鼠。在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種用于SNXll基因敲除的載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該載體包含插入序列，所述插入序列不具有SNXll基因的全部活性；第一同源臂，所述第一同源臂位于所述插入序列的上游；以及第二同源臂，所述第二同源臂位于所述插入序列的下游，其中，所述第一同源臂和第二同源臂適于與基因組上SNXll基因的側(cè)翼區(qū)發(fā)生同源重組。由此，利用該載體，能夠有效地構(gòu)建基因敲除細(xì)胞/動(dòng)物。在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建SNXll基因敲除動(dòng)物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括通過同源重組向胚胎干細(xì)胞基因組內(nèi)導(dǎo)入前面所述的用于SNXll基因敲除的載體；從胚胎干細(xì)胞中繁殖雜合和/或純合的基因敲除動(dòng)物，以及獲得SNXlI基因敲除動(dòng)物，優(yōu)選動(dòng)物為非人哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物，最優(yōu)選小鼠。在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提出了抑制SNXll基因表達(dá)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制瘧原蟲的増殖。在本發(fā)明的第十二方面，本發(fā)明提出了ー種篩選用于抑制瘧原蟲的増殖的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括將前面所述的重組細(xì)胞與藥物候選物接觸；檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述重組細(xì)胞中SNXll基因的表達(dá)量，以便分別獲得第一表達(dá)量和第二表達(dá)量；以及第二表達(dá)量低于第一表達(dá)量為所述藥物候選物為用于抑制瘧原蟲増殖的藥物的指示。本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。


本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中圖I顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，SNXll通過抑制V-ATPase，抑制晚期內(nèi)涵體的成熟，其中，A顯示SNXll抑制細(xì)胞中SNXlO導(dǎo)致的空泡化現(xiàn)象，B顯示SNXlO在細(xì)胞中導(dǎo)致晚期內(nèi)涵體的異常成熟，C顯示SNXll抑制SNXlO作用下晚期內(nèi)涵體的成熟，D顯示SNXll與V-ATPase的VlD亞基相互作用；圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，SNXll抑制VacA在細(xì)胞的空泡化作用，其 中，A顯示SNXll抑制VacA在細(xì)胞中誘導(dǎo)空泡，B顯示了 A的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，C顯示SNXll抑制VacA作用下晚期內(nèi)涵體的擴(kuò)大；圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的SNXll晶體結(jié)構(gòu)，其中，(a)顯示了SNX11-142C的總體結(jié)構(gòu)，(b)顯示了 SNX11-170C的總體結(jié)構(gòu)；圖4顯示了 SNXll磷脂結(jié)合及表面電勢分析，其中，(a)顯示了 SNX11-142C和P40ph°x-pX結(jié)構(gòu)域的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋中關(guān)鍵氨基酸殘基的比對，(b)顯示了 SNX11-142C的B分子可能的膜結(jié)合界面的表面電勢圖；圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，SNXll中的兩個(gè)堿性ロ袋與硫酸根離子結(jié)合，其中，(a)顯示了磷脂酰肌醇結(jié)合口袋與硫酸根離子結(jié)合，(b)顯示了 SNX11-142C的A分子中第二個(gè)堿性ロ袋與硫酸根離子結(jié)合，(c)顯示了 SNX11-142C的B分子中第二個(gè)堿性ロ袋與硫酸根離子結(jié)合；圖6顯示了 SNXll膜結(jié)合模型，其中，(a)W32和F88插入到膜雙分子層中，L76遠(yuǎn)離胞膜。(b)F88和L76插入到膜雙分子層中，W32不與膜結(jié)合；圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化(A)和存活率(B)；圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例，來自SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的脾臟細(xì)胞體外増殖反應(yīng)水平(A)和分泌ga_a干擾素(B)及白介素12(C)的能力；圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，瘧疾感染5周后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)血清抗瘧原蟲特異性抗體水平；圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，SNXll基因在不同組織器官中㈧和分離純化的免疫細(xì)胞(B)中的表達(dá)水平；以及圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，構(gòu)建SNXll基因敲除載體的流程示意圖㈧以及對利用該載體制備的基因敲除小鼠的PCR鑒定結(jié)果(B)以及該小鼠大腦中SNXll的mRNA的RT-PCR檢測結(jié)果(C)。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。SNXll及其編碼基因本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的發(fā)明人分離了ー種多肽，該多肽具有如下所示的氨基酸序列MGFWCRMSENQEQEEVITVRVQDPRVQNEGSWNSYVDYKIFLHTNSKAFTAKTSCVRRRYREFVWLRKQLQRNAGLVPVPELPGKSTFFGTSDEFIEKRRQGLQHFLEKVLQSVVLLSDSQLHLFLQSQLSVPEIEACVQGRSTMTVSDAILRYAMSNCGWAQEERQSSSHLAKGDQPKSCCFLPRSGRRSSPSPPPSEEKDHLEVWAPVVDSEVPSLESPTLPPLSSPLCCDFGRPKEGTSTLQSVRRAVGGDHAVPLDPGQLETVLEK(SEQ ID NO : I)。該多肽在本文中被命名為“SNXl 1”，其編碼基因被命名為“SNXlI基因”。在本文中所使用的表達(dá)方式“SNX11”與“根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽”或者“多肽”是可以替換使用的。需要說明的是，該命名本身，并不對本發(fā)明實(shí)施例的肽本身作出任何限制。另外，本發(fā)明還提出了一種分離的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該寡核苷酸能夠編碼前面所述的多肽。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的寡核 2所示的核苷酸序列atgggctttt ggtgtaggat gtcggagaac caagaacagg aggaggtgat tacagtgcgtgttcaggacc cccgagtgca gaatgagggc tcctggaact cttatgtgga ttataagatattcctccata ccaacagcaa agcctttact gccaagactt cctgtgtgcg gcgccgctaccgtgagttcg tgtggctgag aaagcagcta 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:2)。由此，可以進(jìn)ー步提高表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽即SNXll的效率。如本文使用的，術(shù)語“多肽”指氨基酸的任何聚合鏈。術(shù)語“肽”和“蛋白”可與術(shù)語多肽互換使用，且同樣指氨基酸的聚合鏈。術(shù)語“多肽”是包含天然或人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽類似物。多肽可以是單體或聚合的。除非另外與上下文矛盾，此處使用“多肽”意在包含多肽和其片段及變體(包括變體的片段)。術(shù)語“分離的蛋白”或“分離的多肽”是這樣的蛋白或多肽，其由于其衍生起源或來源不與天然結(jié)合的組分結(jié)合，所述天然結(jié)合的組分在其天然狀態(tài)下與其伴隨；基本上不含來自相同物種的其他蛋白；由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或在自然界中不存在。因此，化學(xué)合成或在不同于其天然起源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將是與其天然結(jié)合的組分“分離的”。還可以通過分離，使用本領(lǐng)域眾所周知的蛋白純化技術(shù)，使得蛋白基本上不含天然結(jié)合的組分。發(fā)明人經(jīng)過分析，該多肽在SNX家族進(jìn)化樹上與SNXlO最為接近，二者PX結(jié)構(gòu)域的相似性為78%，為此將該多肽在本文中命名為SNXlI。PX結(jié)構(gòu)域是一種磷脂結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其主要的結(jié)合祀點(diǎn)是PI3P(phosphatidyIinositol-3-monophosphate)。這是一種廣泛的分布于內(nèi)涵體膜上的磷脂，SNX家族通過PX結(jié)構(gòu)域與磷脂的結(jié)合定位到內(nèi)涵體表面，從而發(fā)揮對內(nèi)涵體轉(zhuǎn)運(yùn)多樣的調(diào)節(jié)。如SNXl的PX結(jié)構(gòu)域以PI(3，5)P2為靶點(diǎn)，定位到內(nèi)涵體膜上，對EGFR向晚期內(nèi)涵體/溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)和降解起到重要的調(diào)節(jié)作用。在這個(gè)過程中，SNXl與 Hrs (Hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate)、EGFR (表皮生長因子受體)形成大的復(fù)合體并定位在早期內(nèi)涵體上，調(diào)節(jié)了 EGFR從早期內(nèi)涵體向晚期內(nèi)涵體的轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)SNXl與SNX2 —起調(diào)節(jié)向內(nèi)涵體向TGN(反面高爾基體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，Trans-Golgi Network)的逆轉(zhuǎn)運(yùn)(retrograde transport)。SNXI/SNX2 通過 PX 定位內(nèi)涵體膜上時(shí)，它們將VPS26/29/35復(fù)合體募集到膜上，形成Retromer復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體將引導(dǎo)有關(guān)受體如M6PR向TGN方向的轉(zhuǎn)運(yùn)。為了研究該分離多肽的功能，發(fā)明人首先從人類基因組中克隆出了編碼根據(jù)本發(fā) 明實(shí)施例的所分離多肽的基因，并將它構(gòu)建到真核表達(dá)載體上。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)SNXll后發(fā)現(xiàn)它不產(chǎn)生和SNXlO相似的成泡現(xiàn)象。而當(dāng)發(fā)明人將SNXlO和SNXll共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以顯著的抑制SNXlO誘導(dǎo)的成泡現(xiàn)象。為了研究SNXll顯著抑制SNXlO誘導(dǎo)成泡現(xiàn)象的機(jī)理，發(fā)明人進(jìn)一步分析了 SNXlO在內(nèi)涵體中的分布。發(fā)明人采用內(nèi)涵體體特異性的Rab蛋白來標(biāo)記不同的內(nèi)涵體，發(fā)現(xiàn)由于SNXlO作用下的巨大空泡表面都呈現(xiàn)Rab7陽性。Rab7主要定位于晚期內(nèi)涵體和溶酶體，Rab7陽性意味著SNXlO誘導(dǎo)了晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大和成熟。隨后，發(fā)明人分析了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的SNXll作用下內(nèi)涵體的變化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll與SNXlO定位在相同的內(nèi)涵體上，這些內(nèi)涵體都呈現(xiàn)Rab陽性，但與SNXlO單獨(dú)作用下情況相比，這些內(nèi)涵體的進(jìn)一步擴(kuò)大過程被抑制了。即SNXll抑制了晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大和成熟，但對Rab7的募集不產(chǎn)生影響。進(jìn)一步，發(fā)明人對SNXll調(diào)節(jié)晚期內(nèi)涵體的機(jī)制進(jìn)行了研究。SNXlO對內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)是通過V-ATPase來實(shí)現(xiàn)的，SNXlO通過與VlD的相互作用來激活細(xì)胞中的V-ATPase活性，從而造成內(nèi)涵體的擴(kuò)大。發(fā)明人推測SNXll也可能通過V-ATPase來調(diào)節(jié)內(nèi)涵體形態(tài)。進(jìn)一步，發(fā)明人通過利用293T細(xì)胞的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)SNXll也與VlD相互作用。這一結(jié)果說明，SNXll抑制了 SNX10對V-ATPase的激活作用，從而抑制了 SNX10造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。VacA誘導(dǎo)的細(xì)胞空泡化是幽門螺旋桿菌誘導(dǎo)的胃潰瘍發(fā)生過程中的一個(gè)重要致病因素。VacA通過激活V-ATPase導(dǎo)致胃表皮細(xì)胞空泡化，使得這些細(xì)胞變得脆弱，容易脫落或死亡，導(dǎo)致了胃表面潰瘍的發(fā)生。基于發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以抑制V-ATPase的異?；罨?，進(jìn)而抑制晚期內(nèi)涵體空泡的產(chǎn)生，那么SNXll也有可能對胃表面潰瘍過程起作用。發(fā)明人對細(xì)胞進(jìn)行VacA處理，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中出現(xiàn)大量的晚期內(nèi)涵體空泡，而在轉(zhuǎn)染表達(dá)SNXll的細(xì)胞中，這個(gè)空泡數(shù)量顯著下降。即發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過表達(dá)SNXll可以抑制VacA在細(xì)胞中的空泡化作用。分析這個(gè)過程，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在VacA處理后的細(xì)胞中，出現(xiàn)大量的擴(kuò)大的晚期內(nèi)涵體。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽SNXll后，雖然Rab7依然出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，但晚期內(nèi)涵體的進(jìn)一步擴(kuò)大則被抑制。另外，發(fā)明人首次解析成功SNXll的晶體結(jié)構(gòu)(圖3)。圖3顯示了 SNXll晶體結(jié)構(gòu)。如圖3所示，(a)顯示了 SNX11-142C的總體結(jié)構(gòu)，(b)顯示了 SNX11-170C的總體結(jié)構(gòu)，其中，品紅色的是傳統(tǒng)的PX結(jié)構(gòu)域，藍(lán)紫色的是傳統(tǒng)的PX結(jié)構(gòu)域C端附加的螺旋。發(fā)明人用硫酸根離子模擬PI3P的結(jié)合，發(fā)現(xiàn)SNX11-142C的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋中的硫酸根離子與P40phox-PX結(jié)構(gòu)域中PI3P 3-磷酸基團(tuán)的取向是一致的(如圖4)。圖4顯示了 SNXll磷脂結(jié)合及表面電勢分析。如圖4所示，(a)顯示了 SNX11-142C和P40ph°x-PX結(jié)構(gòu)域的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋中關(guān)鍵氨基酸殘基的比對，其中，SNX11-142C的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋用白色的表面和藍(lán)綠色的飄帶表示；SNX11-142C的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋中結(jié)合磷脂酰肌醇氨基酸側(cè)鏈用品紅色表示，P40phox-PX結(jié)構(gòu)域的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋中結(jié)合磷脂酰肌醇氨基酸側(cè)鏈用深綠色表示；SNX11-142C的磷脂酰肌醇結(jié)合口袋中的硫酸根離子(用品紅色棍狀模型表示)與P40ph°x-PX結(jié)構(gòu)域中PI3P 3-磷酸基團(tuán)的取向是一致的。(b)顯示了 SNX11-142C的B分子可能的膜結(jié)合界面的表面電勢圖，紅色表示帶負(fù)電區(qū)域，藍(lán)色表示帶正電荷區(qū)域，白色表示疏水區(qū)域，兩個(gè)堿性口袋結(jié)合的硫酸根離子用棍狀模型表示，SNX11-142C的A分 子(品紅色)、SNX11-142C的B分子(藍(lán)綠色)和SNXl 1_170C(藍(lán)紫色)中主要疏水殘基(W32、L76、F88和F89，用棍狀模型表示)的結(jié)構(gòu)比對。同時(shí)硫酸根離子也更多的參與與SNXll的三維構(gòu)象上(如圖5)。圖5顯示了 SNXll中的兩個(gè)堿性口袋與硫酸根離子結(jié)合，其中，(a)顯示了磷脂酰肌醇結(jié)合口袋與硫酸根離子結(jié)合，參與硫酸根離子結(jié)合的殘基側(cè)鏈用棍狀模型表示，參與硫酸根離子結(jié)合的水分子用紅色的球體表示，氫鍵用虛線表示；(b)顯示了 SNX11-142C的A分子中第二個(gè)堿性口袋與硫酸根離子結(jié)合，其中，“Sulfate”指硫酸根離子；(c)顯示了 SNX11-142C的B分子中第二個(gè)堿性口袋與硫酸根離子結(jié)合。通過其晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)明人分析了 SNXll膜結(jié)合的可能形式，發(fā)現(xiàn)除了與PI3P結(jié)合外，SNXll本身也需要插入到膜雙分子層中。圖6顯示了 SNXll膜結(jié)合模型。結(jié)合圖6可知，這有兩種可能的形式(a)W32和F88插入到膜雙分子層中，L76遠(yuǎn)離胞膜；(b)F88和L76插入到膜雙分子層中，W32不與膜結(jié)合，其中，PI3P用球狀模型表示，磷脂酰肌醇結(jié)合口袋之外的參與膜結(jié)合的殘基側(cè)鏈用黃色的棍狀模型表示。通過這些結(jié)構(gòu)的解析，有助于針對其功能尋找藥物靶點(diǎn)，并設(shè)計(jì)可能與之特異性作用的藥物，應(yīng)用到胃潰瘍的治療中。為進(jìn)一步研究本發(fā)明所分離多肽SNXll的功能，發(fā)明人建立了 SNXll基因敲除小鼠，并對敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染瘧原蟲的情況進(jìn)行了比較，進(jìn)而對SNXll基因?qū)垢腥久庖哐δ苓M(jìn)行了分析研究，結(jié)果見圖7。圖7顯示了 SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化㈧和存活率⑶。結(jié)果顯示，與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活(如圖7)。進(jìn)一步免疫學(xué)分析顯示，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細(xì)胞在體外表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌與抗瘧疾免疫力相關(guān)的白介素12(IL-12)和Y干擾素(如圖8)，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產(chǎn)生了高水平的抗瘧疾抗體(如圖9)。SNXll基因表達(dá)水平分析表明，該基因在腦組織中表達(dá)豐富；在主要免疫細(xì)胞中SNXlI都有表達(dá)，其中，在SNXlI基因在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達(dá)在所分析的多種細(xì)胞(CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)中均有顯著下降(如圖10)。具體地，圖8顯示了來自SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的脾臟細(xì)胞體外增殖反應(yīng)水平(A)和分泌ga_a干擾素(B)及白介素12(C)的能力；圖9顯示了瘧疾感染5周后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)血清抗瘧原蟲特異性抗體水平；圖10顯示了 SNXll基因在小鼠不同組織器官中㈧和分離純化的免疫細(xì)胞⑶中的表達(dá)水平，其中，在A中H，心臟；Li，肝臟；K，腎臟；Lo，肺臟；S，脾臟；Sto，胃組織；Thy，胸腺；B，腦組織；Int，腸組織；M，肌肉組織。在B中⑶4，⑶4T細(xì)胞KD8，⑶8T細(xì)胞；B，B細(xì)胞；DC，樹突狀細(xì)胞；Mac，巨噬細(xì)胞；Neut，中性粒細(xì)胞；NK，自然殺傷細(xì)胞。表達(dá)載體本發(fā)明還提出了一種能夠有效地表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽SNXll的表達(dá)載體。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該表達(dá)載體中包含核酸分子，該核酸分子能夠編碼分尚的多肽。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該核酸分子具有如SEQ ID NO :2所示的核酸序列。由此，利用該表 達(dá)載體，能夠有效地在體外表達(dá)體系例如重組細(xì)胞中，表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽，即SNXlI。術(shù)語“載體”意指能夠運(yùn)輸它已與之連接的另一種核酸的核酸分子。一種類型的載體是“質(zhì)?！?，它指另外的DNA區(qū)段可以連接到其內(nèi)的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中另外的DNA區(qū)段可以連接到病毒基因組內(nèi)。某些載體能夠在它們已引入其內(nèi)的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型哺乳動(dòng)物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動(dòng)物載體)在引入宿主細(xì)胞內(nèi)后可以整合到宿主細(xì)胞基因組內(nèi)，且因此連同宿主基因組一起進(jìn)行復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們與之可操作地連接的基因表達(dá)。此種載體在本文中被稱為“重組表達(dá)載體”(或簡單地，“表達(dá)載體”)。一般而言，在重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常為質(zhì)粒的形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的載體形式。然而，本發(fā)明預(yù)期包括此種其他形式的表達(dá)載體，例如提供等價(jià)功能的病毒載體(例如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。載體的RNA形式(其包括RNA病毒載體)也可在本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)用途。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“核酸”可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于經(jīng)過修飾的或者未經(jīng)修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構(gòu)建重組細(xì)胞的表達(dá)載體，優(yōu)選所述核酸為DNA，因?yàn)镈NA相對于RNA而言，其更穩(wěn)定，并且易于操作。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的表達(dá)載體還可以進(jìn)一步包含其他的元件，從而為表達(dá)載體賦予額外的有益效果。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要，選擇這些元件在表達(dá)載體上與編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的相對位置。即可以設(shè)置在編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的上游，也可以設(shè)置在編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的下游，只要這些元件能夠發(fā)揮其相應(yīng)的功能即可。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“5’側(cè)”可以與“上游”互換使用，“3’側(cè)”可以與“下游”互換使用。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，表達(dá)載體可以進(jìn)一步包含啟動(dòng)子序列，所述啟動(dòng)子序列與所述編碼目的基因(SNXll)的核酸分子可操作地相連。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”指的是這樣一種核酸序列，其能夠指導(dǎo)與其可操縱地連接的核酸分子的轉(zhuǎn)錄。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“可操縱地”指的是核酸表達(dá)控制序列例如啟動(dòng)子、信號(hào)序列、增強(qiáng)子等與目標(biāo)核酸序列之間的功能連接，其中當(dāng)合適的分子例如轉(zhuǎn)錄活化分子與表達(dá)控制序列結(jié)合時(shí)，表達(dá)控制序列影響著對應(yīng)于目標(biāo)核酸序列的核酸的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。由此，可以直接通過表達(dá)載體在動(dòng)物細(xì)胞中引入特定的啟動(dòng)子，并且該啟動(dòng)子可以用于啟動(dòng)編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，由此，可以提高所獲得的重組細(xì)胞中編碼目的基因(SNXll)的核酸分子的表達(dá)效率。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)例，所述啟動(dòng)子為CAG啟動(dòng)子。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用該啟動(dòng)子時(shí)，可以有效地在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)突變型生長激素受體基因。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括編碼報(bào)告蛋白的序列。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“報(bào)告蛋白”是指這樣的一種蛋白質(zhì)，其在表達(dá)后，能夠產(chǎn)生可以直接或者間接檢測的信號(hào)，進(jìn)而能夠反映表達(dá)載體所攜帶的外源 核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，報(bào)告蛋白的種類并不受特別限制，只要其具有可檢測的活性即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，報(bào)告蛋白可以是一種能夠產(chǎn)生光學(xué)信號(hào)的蛋白質(zhì)例如發(fā)光蛋白或者熒光蛋白例如綠色熒光蛋白等?；蛘邎?bào)告蛋白可以是一種能夠與底物相互作用以產(chǎn)生可檢測信號(hào)的酶，例如IacZ基因編碼的β -半乳糖苷酶。β -半乳糖苷酶能催化一系列底物轉(zhuǎn)化成極易檢測的不同顏色的產(chǎn)物。但是IacZ在細(xì)胞內(nèi)本底表達(dá)較高，并且檢測需要破碎細(xì)胞壁，從而限制了其應(yīng)用。因而，根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，報(bào)告蛋白可以為選自發(fā)光蛋白、熒光蛋白、酶的至少一種。由此，可以根據(jù)常規(guī)的方法，對所述報(bào)告蛋白進(jìn)行監(jiān)測。例如可以采用比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免疫法(ELISA)及原位染色法對報(bào)告蛋白進(jìn)行檢測。這其中，優(yōu)選發(fā)光蛋白，因?yàn)榘l(fā)光蛋白能夠發(fā)出特定波長的光，因而能夠容易對發(fā)光蛋白進(jìn)行檢測，并且容易對其進(jìn)行定量檢測。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，報(bào)告蛋白為綠色熒光蛋白。由此，可以便捷地通過熒光顯微鏡，就能夠確定表達(dá)載體所攜帶的外源核酸序列是否已經(jīng)在細(xì)胞中被成功表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，表達(dá)載體可以進(jìn)一步包括篩選標(biāo)記基因。在本發(fā)明中所使用的術(shù)語“篩選標(biāo)記基因”指的是這樣的一種基因，其編碼的產(chǎn)物能夠賦予連同載體接受該基因的細(xì)胞一種特殊的性質(zhì)，該特殊的性質(zhì)使得接受該基因的細(xì)胞與未接受該基因的細(xì)胞很容易被區(qū)分開。由此，便于篩選接受表達(dá)載體的動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，篩選標(biāo)記基因的類型不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些示例，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)樗幬锟剐曰颉Ｓ纱?，容易地通過接受外源表達(dá)載體的重組細(xì)胞的抗藥性來進(jìn)行篩選，例如在培養(yǎng)基中添加抗生素，則相應(yīng)連同載體接受并表達(dá)抗生素抗性基因的細(xì)胞將在培養(yǎng)基上能夠存活下來。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，所述篩選標(biāo)記基因?yàn)樾旅顾乜剐曰?。由此，能夠進(jìn)一步提高篩選接受外源表達(dá)載體的重組細(xì)胞的效率。上面對根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的表達(dá)載體進(jìn)行了描述。當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解的，表達(dá)載體還可以包含其他常規(guī)的元件以促進(jìn)表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中并且整合到宿主細(xì)胞的基因組上，正常發(fā)揮功能，例如復(fù)制起點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)等。在此對這些元件不再贅述。重組細(xì)胞及其制備方法在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提出了一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞能夠表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽SNX11。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，重組細(xì)胞中可以包含編碼SEQ ID Ν01所示氨基酸序列的核酸分子，以便能夠使得該重組細(xì)胞表達(dá)具有SEQ ID NO :1所示氨基酸序列的多肽。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，該重組細(xì)胞中可以包含的編碼核酸分子的序列為SEQ ID Ν0:2。由此，可以進(jìn)一步提高重組細(xì)胞表達(dá)SNXll多肽的效率。在重組細(xì)胞中，編碼外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的SNX11)的分離核酸可以整合在重組細(xì)胞的基因組中，也可以游離在重組細(xì)胞的基因組之外，只要能夠有效表達(dá)外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID N0:1所示氨基酸序列的SNXlI)即可。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選編碼外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的SNX11)的分離核酸整合在重組細(xì)胞的基因組中，由此，可以進(jìn)一步提高表達(dá)外源多肽(在本發(fā)明中為具有SEQ ID NO: I所示氨基酸序列的SNXl I)的效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明還提出了制備上述重組細(xì)胞(在本文中，也可以稱為“轉(zhuǎn)基因細(xì)胞”)的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括可以以下步驟使用前面所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及分離重組細(xì)胞。利用該方法，能夠有效地制備前面所述的重組細(xì)胞。在本文中，所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指外源核酸(即DNA分子)通過其進(jìn)入宿主細(xì)胞的任何方法。轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域眾所周知的各種方法在天然或人工條件下發(fā)生。轉(zhuǎn)化可以依賴于用于將外來核酸序列插入原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)的任何已知方法。該方法基于待轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，且可以包括但不限于，吸收質(zhì)粒穿過細(xì)胞膜、病毒感染、電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染、和粒子轟擊。此種“轉(zhuǎn)化的”細(xì)胞包括其中插入的DNA能夠作為自主復(fù)制質(zhì)?；蜃鳛樗拗魅旧w部分復(fù)制的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。它們還包括瞬時(shí)表達(dá)插入的DNA或RNA 有限時(shí)間段的細(xì)胞。本文使用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”的類型并不受特別限制。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包括選自任何生物界的原核和真核細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，真核細(xì)胞包括原生生物、真菌、植物和動(dòng)物細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包括但不限于原核物種，例如大腸桿菌(Escherichia coli);哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，例如CHO、HEK 293、COS、NSO、SP2和PER. C6 ；昆蟲細(xì)胞系Sf9和真菌細(xì)胞物種，例如釀酒酵母?？梢詫?biāo)準(zhǔn)技術(shù)用于重組DNA、寡核苷酸合成、以及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)。需要說明的是，在本文中所使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”與“轉(zhuǎn)染”是可以互換使用的，均是指將外源核酸序列引入宿主細(xì)胞中的操作。在分離重組細(xì)胞后，可以通過PCR方法驗(yàn)證重組細(xì)胞中是否含有目的核酸序列。當(dāng)然也可以通過分析目的核酸序列表達(dá)蛋白的酶活性來驗(yàn)證。但從效率角度來考慮，優(yōu)選通過PCR方法驗(yàn)證，因而，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還可以進(jìn)一步包括通過PCR方法驗(yàn)證重組細(xì)胞中含有所述目的核酸序列的步驟。基因敲除在本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了用于從非人動(dòng)物細(xì)胞中敲除SNXll基因的手段。首先，提供了一種可以用于從非人動(dòng)物細(xì)胞中敲除SNXll基因的載體(在本發(fā)明中，該載體也被稱為“敲除載體”)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該敲除載體包含與染色體上SNXl I外顯子側(cè)翼的上游和下游序列同源的基因組DNA序列。選擇此同源序列的長度為允許與SNXll等位基因定向同源重組的長度。該同源序列的長度可為2.5kb直至300kb。優(yōu)選地，此同源序列的長度是3kb至6kb。優(yōu)選地，該同源序列包含SNXll啟動(dòng)子的至少一部分。如圖11所示，發(fā)明人按照以下步驟構(gòu)建用于SNXll基因敲除的載體并將其轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞首先，為了研究SNXll的體內(nèi)作用，發(fā)明人利用Neo-PGK基因框取代了 exon 4和5的靶載體構(gòu)建SNXll基因敲除載體(圖11A)。然后，將上述構(gòu)建好的線性SNXll基因敲除載體轉(zhuǎn)入129/6S胚胎干細(xì)胞中，并篩選獲得298個(gè)胚胎干細(xì)胞克隆。獲得的四個(gè)陽性克隆中的其中之一被注入C57BL/6J囊胚以繁殖嵌合體小鼠。接著，將其與C57BL/6J小鼠雜交，以獲得混合遺傳背景的雜合子小鼠。然后，將這些雜合子小鼠自交獲得SNXll敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)。然后，通過PCR鑒定這些雜合子小鼠的后代的基因型，其中PCR是利用I個(gè)野生型等位基因上共有的反義引物(P3)和2個(gè)分別位于目標(biāo)等位基因(P2)和野生型等位基因(Pl)上的正義引物進(jìn)行的。其中，PCR檢測結(jié)果如圖IlB所示。對小鼠大腦中SNXll的mRNA進(jìn)行RT-PCR分析證實(shí)，SNXll缺陷小鼠完全缺乏SNXll的mRNA(見圖11C)。其中，上述基因敲除小鼠由上海南方模式生物研究中心制備。上述引物P1、P2、P3的序列如下所示Pl :5，-GTTCCCGACAGAAGATTTACAAG-3’ (SEQ ID NO 3)；P2 :5，-CGGAGATGAGGAAGAGGAGAACA-3，(SEQ ID NO 4)；P3 :5，-GCTGCCTATCAAGCCACTAGG-3’ (SEQ ID NO :5)。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該敲除載體可以額外地包含報(bào)道基因。所述報(bào)道基因位于同源的SNXll側(cè)翼序列之間。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，在向基因組內(nèi)整合后，所述報(bào)道基因表達(dá)受到SNXll啟動(dòng)子及任選地受到其它SNXll調(diào)節(jié)元件的控制。報(bào)道基因可選自LacZ或其衍生物、堿性磷酸酶、熒光蛋白質(zhì)、螢光素酶或可在多種組織或細(xì)胞中特異性檢測和定量的其它酶或蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，優(yōu)選地，該報(bào)道基因是LacZ。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在SNXlI基因組序列內(nèi)插入此報(bào)道基因，從而保留了 SNXlI基因的內(nèi)源起始密碼子。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，還可以進(jìn)一步包含選擇標(biāo)記基因，以便便于篩選。選擇標(biāo)記基因可以是正選擇標(biāo)記。正選擇標(biāo)記可選自新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、殺稻瘟素S抗性基因、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基因或zeomycin抗性基因?？梢栽谡x擇標(biāo)記外側(cè)加入重組酶識(shí)別位點(diǎn)，此識(shí)別位點(diǎn)允許在選擇了成功同源重組事件后切除正選擇標(biāo)記基因。因此，可以避免正選擇標(biāo)記表達(dá)對報(bào)道基因表達(dá)的任何影響。此重組酶識(shí)別位點(diǎn)可選自包含針對flp重組酶的frt位點(diǎn)和針對ere重組酶的IoxP位點(diǎn)(包括突變的IoxP位點(diǎn))。優(yōu)選地，正選擇標(biāo)記是新霉素抗性基因。選擇標(biāo)記基因還可以是負(fù)選擇標(biāo)記。負(fù)選擇標(biāo)記可選自但不限于白喉毒素基因和HSV-胸苷激酶基因。優(yōu)選地，負(fù)選擇標(biāo)記是白喉毒素基因。優(yōu)選地，該敲除載體同時(shí)包含正選擇標(biāo)記和負(fù)選擇標(biāo)記。更優(yōu)選地，該敲除載體包含新霉素抗性基因和白喉毒素基因。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，敲除載體是整合在質(zhì)粒中(如圖11A)。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生非人的基因敲除動(dòng)物的方法，該動(dòng)物SNXll基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因發(fā)生突變和/或截短以致于表達(dá)較低活性或無活性的SNXll蛋白質(zhì)，優(yōu)選地，非人的基因敲除動(dòng)物中SNXll基因的Exon 4和5被neo替換，見圖11A。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該產(chǎn)生非人的基因敲除動(dòng)物的方法包括(a)通過同源重組向胚胎干細(xì)胞基因組內(nèi)導(dǎo)入如上所述的敲除載體，(b)從所述的胚胎干細(xì)胞中繁殖雜合和/或純合的基因敲除動(dòng)物，以及(c)產(chǎn)生非人的基因敲除動(dòng)物，該動(dòng)物SNXll基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因被突變和/或截短以致于表達(dá)較低活性或無活性的SNXll蛋白質(zhì)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，在該產(chǎn)生非人的基因敲除動(dòng)物的方法的步驟(C)中可產(chǎn)生非人的基因敲除動(dòng)物，該方法還進(jìn)一步包括將所產(chǎn)生的基因敲除動(dòng)物進(jìn)一步與可識(shí)別正選擇標(biāo)記基因外側(cè)的識(shí)別位點(diǎn)的重組酶轉(zhuǎn)基因動(dòng)物雜交繁殖。如通過Joyner，A. L. (Gene Targeting. 1999,第二版,The PracticalApproach Series,Oxford UniversityPress, New York)和 Hogan, B.等(Manipulating the mouse embryo. 1994,第二版，ColdSpring HarborPress, Cold Spring Harbor,通過參照將其并入本文)所提供的方法,本領(lǐng)域可常規(guī)地得到包含定向突變的基因敲除動(dòng)物。例如，可通過如下步驟產(chǎn)生上述方法中的雜合和/或純合的基因敲除動(dòng)物對攜帶如上所述的靶向SNXll等位基因的胚胎干(ES)細(xì)胞克隆進(jìn)行選擇、驗(yàn)證重組胚胎干細(xì)胞克隆中的定向突變、向野生型動(dòng)物的胚泡中注入已驗(yàn)證的重組胚胎干細(xì)胞、將這些已注射的胚泡轉(zhuǎn)移至假孕代孕母體中、將來自胚泡的嵌合體培育為野生型動(dòng)物、檢驗(yàn)來自這些繁殖體的后代中定向突變的存在、繁殖雜合動(dòng)物以任選地產(chǎn)生純合基因敲除動(dòng)物。本領(lǐng)域所用且還可在本發(fā)明方法中利用的胚胎干細(xì)胞包括例如源自小鼠品系如C57BL/6、BALB/c、DBA/2、CBA/和SV129的胚胎干細(xì)胞。優(yōu)選地，使用源自C57BL/6小鼠的胚胎干細(xì)胞(Seong, E 等(2004) TrendsGenet. 20, 59-62 ；ffolfer, D. P.等，TrendsNeurosci. 25 (2002) :336_340，通過參照將其并入本文)。
本發(fā)明還提供了通過以上所述的任一方法所產(chǎn)生的非人的基因敲除動(dòng)物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提供了非人的基因敲除動(dòng)物，該動(dòng)物SNXll基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因被突變和/或截短以致于表達(dá)較低活性或無活性的SNXll蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，可以用報(bào)道基因替代非人的基因敲除動(dòng)物SNXll基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因。優(yōu)選地，該報(bào)道基因是 LacZ0在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，提供了非人的基因敲除動(dòng)物，該動(dòng)物SNXll基因的一個(gè)或兩個(gè)等位基因包含IacZ等位基因。非人的基因敲除動(dòng)物可以是本領(lǐng)域內(nèi)所知的任意可用于本發(fā)明方法的動(dòng)物。優(yōu)選地，本發(fā)明動(dòng)物是哺乳動(dòng)物，更為優(yōu)選地本發(fā)明基因敲除動(dòng)物是嚙齒動(dòng)物。最優(yōu)選的非人的基因敲除動(dòng)物為小鼠。甚至更優(yōu)選地，非人的基因敲除動(dòng)物是C57BL/6的同類系突變小鼠品系。本發(fā)明還涉及如本發(fā)明所提供的非人的基因敲除動(dòng)物的后代(也可稱為后裔)，其通過與相同或另一基因型的動(dòng)物繁殖得到。還可以通過與相同遺傳背景的動(dòng)物繁殖得到后代。基因敲除動(dòng)物可用于制備原代細(xì)胞培養(yǎng)物以及用于制備源自這些動(dòng)物的原代細(xì)胞制品的次代細(xì)胞系。此外，基因敲除動(dòng)物可用于制備組織外植體或器官外植體及其培養(yǎng)物。此外，基因敲除動(dòng)物還可用于制備組織提取物或細(xì)胞提取物，如膜制品或突觸小體制
品O本發(fā)明還提供了如本發(fā)明所提供的非人的基因敲除動(dòng)物或其后代的原代細(xì)胞培養(yǎng)物及次代細(xì)胞系。此外，本發(fā)明提供了如本發(fā)明所提供的非人的基因敲除動(dòng)物或其后代的組織外植體或器官外植體和其培養(yǎng)物，以及組織提取物或細(xì)胞提取物。組織提取物或細(xì)胞提取物是例如膜制品或突觸小體制品。可使用例如從該動(dòng)物的尾部活組織檢查中分離的DNA，通過包括基因組DNA印跡和PCR分析的多種方法檢測遺傳性構(gòu)建體整合入基因組。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，存在可用于檢測報(bào)道基因表達(dá)的多種分析性方法，其包括RNA水平的方法，如通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)或RNA印跡、原位(insitu)雜交對mRNA定量，以及蛋白質(zhì)水平的方法，包括組織化學(xué)、免疫印跡分析和體外(invitro)結(jié)合研究。還可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的ELISA技術(shù)確定靶基因表達(dá)水平的量可使用多種標(biāo)準(zhǔn)測定法完成定量性測量。例如，可使用RT-PCR和包括RNA酶保護(hù)作用、RNA印跡分析和RNA點(diǎn)印跡分析的雜交方法測量轉(zhuǎn)錄水平。通過ELISA、蛋白質(zhì)印跡分析以及通過比較免疫組織化學(xué)或組織化學(xué)染色的組織切片分析蛋白質(zhì)水平。還可用免疫組織化學(xué)染色、酶組織化學(xué)染色及免疫電子顯微鏡法評估存在或不存在SNXll蛋白質(zhì)。還可以使用組織切片的免疫組織化學(xué)IacZ染色或組織化學(xué)IacZ染色，或者用組織勻漿物或組織提取物所開展的定量性酶IacZ測定法，利用在SNXll非人的基因敲除動(dòng)物中的NLSlacZ報(bào)道分子定量SNXll表達(dá)。由此，本發(fā)明的又一方面提出了一種動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該動(dòng)物細(xì)胞的SNXll基因的表達(dá)量下降。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，在該動(dòng)物細(xì)胞的基因組中，SNXll被敲除。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該動(dòng)物為小鼠。發(fā)明人在建立SNXll基因敲除小鼠之后，并對敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染瘧原蟲的情況進(jìn)行了比較，進(jìn)而對SNXll基因?qū)垢腥久庖哐δ苓M(jìn)行了分析研究。結(jié)果顯 示，與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活(如圖7)。進(jìn)一步免疫學(xué)分析顯示，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細(xì)胞在體外表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌與抗瘧疾免疫力相關(guān)的白介素12IL-12)和Y干擾素(如圖8)，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產(chǎn)生了高水平的抗瘧疾抗體(如圖9)。SNXll基因表達(dá)水平分析表明，該基因在腦組織中表達(dá)豐富；在主要免疫細(xì)胞中SNXll都有表達(dá)，其中，在SNXll基因在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達(dá)在所分析的多種細(xì)胞(CD4T細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)中均有顯著下降(如圖10)。具體地圖7顯示了 SNXl I敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化(A)和存活率(B)，其中，如圖所示，WT表示野生型小鼠，KO表示基因敲除小鼠，圖7A的縱軸為紅細(xì)胞中寄生蟲血癥的比例，圖7B的縱軸為小鼠的存活比例，兩圖的橫軸均為感染后的天數(shù)；圖8顯示了來自SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的脾臟細(xì)胞體外增殖反應(yīng)水平(A)和分泌ga_a干擾素(B)及白介素12(C)的能力，其中，如圖所示，WT表示未感染的野生型小鼠，KO表示未感染的基因敲除小鼠，WT Pb-inf表示感染后的野生型小鼠，KO Pb-inf表示感染后的基因敲除小鼠，圖8A顯示了未感染(WT/K0)，感染后(WT Pb-inf,KO Pb-inf)小鼠的脾臟細(xì)胞樣品在對照(Medium)及瘧原蟲抗原(Pb-Ag)再刺激后的體外增殖反應(yīng)水平，其中CPM(count per minute)是用3H_Thymidine標(biāo)記細(xì)胞增殖時(shí)液閃的讀數(shù)，圖SB和圖SC分別顯示了前述相同樣品中的ga_a-干擾素及白介素12的水平；圖9顯示了瘧疾感染5周后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)血清抗瘧原蟲特異性抗體水平，其中從左至右的三個(gè)圖分別顯示了感染后，SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)的血清中總的瘧原蟲特異抗體(Ig)及其亞型(IgGl和IgG2a)的水平；圖10顯示了 SNXll基因在小鼠不同組織器官中㈧和分離純化的免疫細(xì)胞(B)中的表達(dá)水平，其中，如圖IOA所示，橫軸中H，心臟；Li，肝臟；K,腎臟；Lo，肺臟；S，脾臟；Sto,胃組織；Thy，胸腺；B，腦組織；Int，腸組織；M，肌肉組織；T，睪丸。如圖IOB所示，橫軸中:CD4，CD4陽性細(xì)胞;CD8，CD8陽性細(xì)胞;B，B細(xì)胞;DC，樹突狀細(xì)胞；Mac,巨噬細(xì)胞；Neut,中性粒細(xì)胞；NK，自然殺傷細(xì)胞。應(yīng)用如前所述發(fā)明人經(jīng)過分析，發(fā)現(xiàn)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)的新型多肽在SNX家族進(jìn)化樹上與SNXlO最為接近，二者PX結(jié)構(gòu)域的相似性為78%。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)SNXll后發(fā)現(xiàn)它不產(chǎn)生和SNXlO相似的成泡現(xiàn)象。而當(dāng)發(fā)明人將SNXlO和SNXll共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll可以顯著的抑制SNXlO誘導(dǎo)的成泡現(xiàn)象。另外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXll抑制了晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大和成熟，但對Rab7的募集不產(chǎn)生影響。進(jìn)一步，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與SNXlO相反，SNXll結(jié)合V-ATPase，抑制了 SNXlO對它的激活，從而抑制了 SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。并且通過表達(dá)SNXll可以抑制VacA在細(xì)胞中的空泡化作用。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在VacA處理后的細(xì)胞中，出現(xiàn)大量的擴(kuò)大的晚期內(nèi)涵 體。當(dāng)細(xì)胞轉(zhuǎn)染表達(dá)根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的多肽SNXll后，雖然Rab7依然出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，但晚期內(nèi)涵體的進(jìn)一步擴(kuò)大則被抑制。因而，本發(fā)明的SNXll及其編碼基因、表達(dá)載體以及表達(dá)該基因的重組細(xì)胞，可以用于治療胃潰瘍、降低抑制V-ATPase或抑制SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出了 SNXll及其編碼基因、表達(dá)載體以及表達(dá)該基因的重組細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于下列至少之一治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的SNXll蛋白和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物。包含本發(fā)明的SNXll蛋白的藥物組合物用于在下述方面使用，但不限于下述方面，病癥診斷、檢測或監(jiān)控，病癥或其一種或多種癥狀的預(yù)防、治療、管理或改善和/或研究。在具體實(shí)施例中，還可以包含其他已知已經(jīng)在該病癥例如胃潰瘍的預(yù)防、治療、管理或改善中有用，或已在其中使用或目前正在其中使用的藥物。依照這些實(shí)施方案，組合物可以進(jìn)一步包含藥學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。本發(fā)明的SNXll蛋白可以摻入適合于給受試者施用的藥物組合物內(nèi)。一般地，藥物組合物包含本發(fā)明的SNXll蛋白和藥學(xué)可接受的載體。如本文使用的，“藥學(xué)可接受的載體”包括生理學(xué)相容的任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。藥學(xué)可接受的載體的例子包括下述一種或多種水、鹽水、磷酸緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，及其組合。在許多情況下，將優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇、或氯化鈉。藥學(xué)可接受的載體可以進(jìn)一步包含少量輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，所述輔助物質(zhì)增強(qiáng)結(jié)合蛋白的保存期限或效力。各種遞送系統(tǒng)是已知的，且可以用于施用本發(fā)明的SNXll蛋白或本發(fā)明的SNXll與其他藥物的組合，用于預(yù)防、管理、治療或改善病癥或其一種或多種癥狀，例如治療胃潰瘍。例如，被囊化在脂質(zhì)體中、微粒、微膠囊、能夠表達(dá)SNXll的表達(dá)載體和重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的胞吞(參見，例如，Wu和ffu, J. Biol. Chem. 262 =4429-4432 (1987))、作為逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體部分的核酸構(gòu)建等等。施用本發(fā)明的預(yù)防或治療劑的方法包括但不限于，腸胃夕卜施用(例如，皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下)，硬膜外施用，瘤內(nèi)施用和粘膜施用(例如，鼻內(nèi)和經(jīng)口途徑)。在具體實(shí)施方案中,本發(fā)明的藥物通過肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、瘤內(nèi)、經(jīng)口、鼻內(nèi)、肺、或皮下施用。預(yù)防或治療劑可以通過任何方便的途徑施用，例如通過輸注或單次快速靜脈注射，通過經(jīng)由上皮或粘膜皮膚襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)吸收，且可以連同其他生物學(xué)活性劑一起施用。施用可以是全身或局部的。在具體實(shí)施方案中，可能需要使本發(fā)明的預(yù)防或治療劑局部施用在需要治療的區(qū)域；這可以通過例如但不限于局部輸注、注射、或通過植入物來完成，所述植入物為多孔或無孔材料，包括I吳和基質(zhì)，例如娃橡I父I吳、聚合物、纖維基質(zhì)(例如，Tissuel )、或I父原基質(zhì)。另外，發(fā)明人建立了 SNXll基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活，來自SNXll缺陷鼠的脾臟細(xì)胞在體外表現(xiàn)出更強(qiáng)的細(xì)胞增殖反應(yīng)和分泌與抗瘧疾免疫力相關(guān)的白介素12 (IL-12)和Y干擾素，表明瘧疾感染在SNXll缺陷鼠可誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。瘧原蟲感染后檢測血清特異性抗體水平顯示，SNXll小鼠產(chǎn)生了高水平的抗瘧疾抗體。SNXll基因表達(dá)水平分析表明，該基因在腦組織中表達(dá)豐富；在主要免疫細(xì)胞中SNXll都有表達(dá)，其中，在SNXll基因在中性粒細(xì)胞中表達(dá)最高，而且在瘧原蟲感染后，該基因表達(dá)在所分析的多種細(xì)胞(CD4T細(xì)胞、 CD8T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)中均有顯著下降。由此，發(fā)明人提出了一種抑制哺乳動(dòng)物中瘧原蟲增殖的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括降低所述哺乳動(dòng)物中SNXll基因的表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可以通過將哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的SNXll基因進(jìn)行沉默，例如敲除，通過使用SNXll活性抑制劑、SNXll表達(dá)抑制劑諸如RNAi技術(shù)，抑制哺乳動(dòng)物中瘧原蟲增殖。由此，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，本發(fā)明提出了抑制SNXll基因表達(dá)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制瘧原蟲的增殖。關(guān)于藥物的賦形劑等方面的描述，前面針對胃潰瘍所描述的內(nèi)容，同樣適用，不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提出了一種篩選可以用于抑制瘧原蟲增殖的藥物的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，該方法包括將前面所述的表達(dá)SNXll的重組細(xì)胞與藥物候選物接觸，并檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述表達(dá)SNXlI的重組細(xì)胞中SNXll基因的表達(dá)量，以便分別獲得第一表達(dá)量和第二表達(dá)量；以及第二表達(dá)量低于第一表達(dá)量為所述藥物候選物為用于抑制瘧原蟲增殖的藥物的指示。與藥物候選物接觸后，SNXll基因的表達(dá)量比接觸前有所降低，可以確定該藥物候選物可以作為抑制SNXll基因表達(dá)的試劑，進(jìn)而，可以用于抑制瘧原蟲的增殖。因而利用該方法，能夠有效地篩選抑制瘧原蟲的增殖的藥物。下面參考具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行說明，需要說明的是，這些實(shí)施例僅僅是說明性的，而不能理解為對本發(fā)明的限制。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，可以參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版或者相關(guān)產(chǎn)品進(jìn)行，所采用的試劑和產(chǎn)品也均為可商業(yè)獲得的。未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，所用試劑的來源、商品名以及有必要列出其組成成分者，均在首次出現(xiàn)時(shí)標(biāo)明，其后所用相同試劑如無特殊說明，均以首次標(biāo)明的內(nèi)容相同。實(shí)施例I :SNX11基因的擴(kuò)增提取HEK293T細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank發(fā)表的人SNXll序列(NCBIgene ID :29916)，設(shè)計(jì)引物，在293T cDNA中擴(kuò)增出SNXll基因片段，連入PCR3. l-GFP-flag載體。用于擴(kuò)增的引物hSNXlIU ATGGGCTTTTGGTGTAGGATGTCGG(SEQ ID NO :6)hSNXlIL CTTTTCCAAAACTGTTTCTAACTGACCAGGG(SEQ ID NO :7)將PCR產(chǎn)物連入PCR3. I載體的EcoRV位點(diǎn)，用載體上游引物T7 (TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO :8))和 SNXll 下游引物hSNXllL鑒定基因插入方向，并測序鑒定序列。最終構(gòu)建完成PCR3. 1-hSNXl l-GFP-flag真核表達(dá)載體，用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)SNX11。
實(shí)施例2 =SNXll晶體的解析蛋白表達(dá)和純化發(fā)明人構(gòu)建了 2個(gè)SNXll片段，用于SNXll的結(jié)構(gòu)研究。其中一個(gè)是具有殘基7-142的SNX11-142C，另一個(gè)是具有殘基7-170的SNX11-170C。這兩個(gè)cDNA片段被插入pET21a中，并通過測序驗(yàn)證。蛋白在生長于LB培養(yǎng)基上的Rosetta2(DE3)細(xì)胞中表達(dá)。其中，當(dāng)0D_的值為O. 6-0. 8時(shí)，于16°C下，將細(xì)胞用O. 3毫米的IPTG誘導(dǎo)22小時(shí)后，細(xì)胞中SNX11-142C表達(dá);當(dāng)OD600的值為O. 6-0. 8時(shí)，于25°C下，將細(xì)胞用O. 3毫米的IPTG誘導(dǎo)14小時(shí)后，細(xì)胞中SNX11-170C表達(dá)。通過離心、洗滌收集細(xì)菌，并于4°C下將其重懸于裂解液(20mM Tris-HCl，pH 8. 0,300mM NaCl，7mM β-巰基乙醇)中。然后，通過3次超聲將細(xì)胞進(jìn)行裂解。最后，利用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程的Ni2+親和柱(GE醫(yī)療)純化SNX11-142C。而將洗脫的蛋白進(jìn)一步純化是通過凝膠過濾進(jìn)行的，其中，凝膠過濾使用經(jīng)過包含20mM MES, pH 6.5,IOOmM NaCl and 5mM DTT 的緩沖液平衡的 Superdex 75 柱(GE 醫(yī)療)。SNX11-170C 的純化方法與SNX11-142C —樣，只是在經(jīng)過Ni2+親和層析柱純化后，會(huì)產(chǎn)生還原甲基化37。結(jié)晶、數(shù)據(jù)收集和結(jié)構(gòu)確定在293K 溫度下，通過 Sitting-drop Vapor Diffraction 方法，利用來自 HamptonResearch 的 Sparse Matrix Crystallization Kit 對 SNX11-142C(濃度為 6. 5mg/ml)和甲基化的SNXl 1-170C(濃度為5. 5mg/ml)進(jìn)行結(jié)晶。SNX11-142C晶體從0. 2M硫酸銨，0. IMpH 6. 5的二甲砷酸鈉三水和30%聚乙二醇8000中長出。甲基化的SNX11-170C晶體在含有0. IM pH7. 5的羥乙基和20%聚乙二醇8000的情況下出現(xiàn)。在數(shù)據(jù)收集之前，利用添加有30% PEG400作為冷凍保護(hù)劑的母液，將晶體進(jìn)行低溫冷卻。衍射數(shù)據(jù)是在上海同步輻射裝置(the Shanghai Synchrotron Radiation Facility)的 17U 光束線下，于 100K 溫度下，波長為0.9792 A時(shí)測定的。SNX11-142C晶體屬于在不對稱單位中具有兩個(gè)分子的空間群P2lt)甲基化的SNX11-170C晶體屬于每一個(gè)不對稱單位包含一個(gè)分子的空間群Ρ〗,*。利用程序Mosflm38處理數(shù)據(jù)集。通過以Grdl9p(PDB code 10CS)作為搜索模型的分子替換解析SNX11-142C的結(jié)構(gòu)。利用DM39對初始階段的數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化。利用ARP/wARP40完成建模。甲基化SNX11-170C的晶體結(jié)構(gòu)是利用SNX11-142C模型的分子替換進(jìn)行解析的。利用Buccaneer41進(jìn)行模型建立。使用Refmac42對以上兩種晶體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)化。盡管對SNX11-170C進(jìn)行了甲基化處理，但其賴氨酸殘基顯示，與那些未甲基化的SNX11-142C相t匕，兩者沒有顯著差異。實(shí)施例3 =SNXll與SNX10功能的研究一、SNXll抑制晚期內(nèi)涵體(late endosome, LE)的成熟
發(fā)明人首先在細(xì)胞中轉(zhuǎn)染構(gòu)建的SNXll真核表達(dá)載體。發(fā)現(xiàn)在Hela細(xì)胞中過表達(dá)SNXll并不能引起與SNXlO相似的細(xì)胞空泡化現(xiàn)象。相反，當(dāng)將SNXll與SNXlO載體同時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)Hela細(xì)胞時(shí)，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)SNXlO引起的空泡被顯著抑制(圖1，A)。通過用Rabs標(biāo)記不同的內(nèi)涵體形式，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在表達(dá)SNXlO的細(xì)胞中，空泡表面都被Rab7所標(biāo)記。這說明SNXlO的作用是促進(jìn)晚期內(nèi)涵體的擴(kuò)大化(圖1，B)。而在同時(shí)表達(dá)SNXlO，SNXlI的細(xì)胞中，SNX10, SNXll共定位在同一類內(nèi)涵體結(jié)構(gòu)上。這類內(nèi)涵體表面同時(shí)有Rab5(早期內(nèi)涵體標(biāo)記)和Rab7。這一結(jié)果說明盡管Rab7在這些內(nèi)涵體上的募集并沒有被阻止，SNXlO誘導(dǎo)下晚期內(nèi)涵體的進(jìn)一步擴(kuò)大被抑制了(圖l，c)。(在上述實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人用lipofectamin2000將SNX10，SNXll表達(dá)載體轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)用相差顯微鏡照相分析空泡化情況或?qū)⒓?xì)胞固定進(jìn)行免疫熒光操作，然后用激光共聚焦顯微鏡分析其內(nèi)涵體結(jié)構(gòu)和定位。)發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)SNXlO對內(nèi)涵體的調(diào)節(jié)通過V-ATPase來完成。發(fā)明人進(jìn)一步分析了 SNXll調(diào)節(jié)內(nèi)涵體的分子機(jī)制。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，SNXll與V-ATPase的一個(gè)亞基VlD與相互作用(圖1，D)。這說明SNXll也可能通過對V-ATPase活性的調(diào)節(jié)來完成其對內(nèi)涵體形 態(tài)的調(diào)節(jié)。(在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人將flag-tagged的SNXll或GFP載體和HA-tagged的VlD載體用PEI共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后裂解細(xì)胞做免疫共沉淀，用表面偶聯(lián)flag抗體的樹脂沉淀SNXll或GFP,然后用western blot檢驗(yàn)VlD蛋白水平。)二、SNXll抑制VacA引起細(xì)胞空泡化VacA是幽門螺旋桿菌分泌的空泡毒素，它進(jìn)入胃表皮細(xì)胞后可以引起劇烈的空泡化現(xiàn)象。在機(jī)制研究中，經(jīng)常用Hela來完成這一過程。發(fā)明人在Hela細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SNX11GFP或GFP對照，然后對這些細(xì)胞用VacA進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在表達(dá)SNXlIGFP的細(xì)胞中，VacA誘導(dǎo)空泡的能力顯著降低(圖2A，B)。進(jìn)一步分析這些細(xì)胞中的內(nèi)涵體變化。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在表達(dá)GFP的細(xì)胞中，VacA誘導(dǎo)出大量晚期內(nèi)涵體空泡(Rab7標(biāo)記)。而在表達(dá)SNXll的細(xì)胞中，只有很少Rab7標(biāo)記的膜泡被擴(kuò)大(圖2，C)。SNXll與Rab7有明顯的共定位。這些結(jié)果說明SNXll可以抑制VacA引起的晚期內(nèi)涵體擴(kuò)大，在一定程度上減弱VacA對細(xì)胞的毒性。實(shí)施例4、SNX11敲除小鼠的構(gòu)建發(fā)明人按照以下步驟構(gòu)建用于SNXll基因敲除的載體并將其轉(zhuǎn)入小鼠胚胎干細(xì)胞首先，為了研究SNXl I在體內(nèi)的作用，發(fā)明人通過一個(gè)利用Ne0-PGK基因盒取代了exon4和5的靶載體構(gòu)建SNXll基因敲除載體(圖11A)。然后，將上述構(gòu)建好的線性SNXll基因敲除載體轉(zhuǎn)入129/6S胚胎干細(xì)胞中，并篩選獲得298個(gè)胚胎干細(xì)胞克隆。獲得的四個(gè)陽性克隆中的其中之一被注入C57BL/6J囊胚，以繁殖嵌合體小鼠。其由C57BL/6J育成，以期獲得混合遺傳背景的雜合子小鼠。將這些雜合子小鼠進(jìn)行交配，以繁殖獲得SNXll敲除小鼠(KO)和野生型小鼠(WT)。然后，通過PCR鑒定這些雜合子小鼠的后代的基因型，其中PCR是利用I個(gè)野生型等位基因上共有的反義引物(P3)和2個(gè)分別位于目標(biāo)等位基因(P2)和野生型等位基因(Pl)上的正義引物進(jìn)行的。其中，PCR檢測結(jié)果如圖IlB所示。對小鼠大腦中SNXll的mRNA進(jìn)行RT-PCR分析證實(shí)，SNXll缺陷小鼠完全缺乏SNXll的mRNA(見圖 11C)。
實(shí)施例5、SNXll敲除小鼠活性觀察按照以下步驟檢測比較SNXll敲除小鼠及對照的活性將在液氮中保存的小鼠紅細(xì)胞期痕原蟲Plasmodium berghei蟲種經(jīng)腹腔注射到普通BALB/c小鼠；感染后6-9天檢測血液中瘧原蟲水平(方法見后述)，待血蟲水平達(dá)到15%左右時(shí)，從小鼠采血，用PBS稀釋到每毫升含IO6瘧原蟲感染的紅細(xì)胞。然后，對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物即SNXll敲除小鼠及其對照，經(jīng)腹腔注射上述獲得的瘧原蟲感染的紅細(xì)胞( ο6/只)。自感染后3天開始，從小鼠尾尖采血，制備血抹片，空氣中晾干后，用吉姆薩染液染色。并在晾干后于顯微鏡下計(jì)數(shù)被瘧原蟲感染的紅細(xì)胞的百分比，即血蟲水平(=每一百個(gè)紅細(xì)胞中感染了瘧原蟲的紅細(xì)胞數(shù)量)。對敲除鼠和未敲除的野生型鼠感染瘧原蟲的情況的比較結(jié)果見圖7。圖7顯示了SNXll敲除小鼠(KO)和野生對照小鼠(WT)感染小鼠瘧原蟲(Plasmodium berghei)后的血蟲水平變化(A)和死亡率(B)。結(jié)果顯示，與野生型對照組相比，SNXll缺陷鼠可顯著抑制 瘧原蟲的增殖，并有較高比率的小鼠存活。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。
權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列。
2.一種分離的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸編碼權(quán)利要求I所述的多肽，優(yōu)選地所述寡核苷酸具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列。
3.—種表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼權(quán)利要求I所述的分離的多肽的核酸分子，優(yōu)選地包含如SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列。
4.ー種重組細(xì)胞，其特征在于，所述重組細(xì)胞中包含編碼權(quán)利要求I所述多肽的核酸分子，優(yōu)選地包含如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列,任選地所述細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞,優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選小鼠細(xì)胞。
5.ー種制備權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞的方法，其特征在于，包括使用權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；以及分離重組細(xì)胞，任選地所述宿主細(xì)胞為動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選小鼠細(xì)胞。
6.權(quán)利要求I所述的多肽、權(quán)利要求2所述的寡核苷酸、權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。
7.—種藥物，其特征在于，包含選自權(quán)利要求I所述的多肽、權(quán)利要求2所述的寡核苷酸、權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體或權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞的至少ー種，所述藥物用于下列至少之ー治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNXlO造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。
8.ー種動(dòng)物細(xì)胞及其衍生物，其特征在于，所述動(dòng)物細(xì)胞的SNXll基因的表達(dá)量下降，任選地，所述動(dòng)物細(xì)胞的基因組中，至少ー個(gè)SNXll等位基因被敲除，優(yōu)選所述動(dòng)物細(xì)胞為非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，最優(yōu)選小鼠細(xì)胞。
9.一種用于SNXll基因敲除的載體，其特征在于包含摘入序列，所述摘入序列不具有SNXll基因的全部活性；第一同源臂，所述第一同源臂位于所述插入序列的上游；以及第二同源臂，所述第二同源臂位于所述插入序列的下游，其中，所述第一同源臂和第二同源臂適于與基因組上SNXll基因的側(cè)翼區(qū)發(fā)生同源重組。
10.一種構(gòu)建SNXll基因敲除動(dòng)物的方法，其特征在于，包括通過同源重組向胚胎干細(xì)胞基因組內(nèi)導(dǎo)入如上權(quán)利要求9所述的載體；從所述胚胎干細(xì)胞中繁殖雜合和/或純合的基因敲除動(dòng)物，以及獲得所述SNXll基因敲除動(dòng)物，優(yōu)選所述動(dòng)物為非人哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選嚙齒類動(dòng)物，最優(yōu)選小鼠。
11.抑制SNXll基因表達(dá)的試劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于抑制瘧原蟲的增殖。
12.—種篩選用于抑制瘧原蟲的増殖的藥物的方法，其特征在于，包括將權(quán)利要求4所述的重組細(xì)胞與藥物候選物接觸；檢測與所述藥物候選物接觸前后，所述重組細(xì)胞中SNXll基因的表達(dá)量，以便分別獲得第一表達(dá)量和第二表達(dá)量；以及 第二表達(dá)量低于第一表達(dá)量為所述藥物候選物為用于抑制瘧原蟲増殖的藥物的指示。
全文摘要
本發(fā)明提出了SNX家族的新基因及其用途。其中，一種分離的多肽，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。該多肽，能夠治療胃潰瘍、抑制V-ATPase活性和抑制SNX10造成的晚期內(nèi)涵體的異常擴(kuò)大。
文檔編號(hào)A61K38/17GK102827265SQ201210299799
公開日2012年12月19日 申請日期2012年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月21日
發(fā)明者舒曉東, 裴端卿, 劉勁松, 蘇鐘, 徐進(jìn)新, 吳斌, 張雷 申請人:中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院