專利名稱：施用抗TNFα抗體的方法
施用抗TNF a抗體的方法本申請是2002年6月5日提交的200880107108.3號發(fā)明專利申請(名稱為“施用抗TNF a抗體的方法”的分案申請。
背景技術(shù)：
腫瘤壞死因子(TNFa)是一種由多種細(xì)胞(包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，最初是根據(jù)其誘導(dǎo)某些鼠腫瘤壞死的能力而鑒定出的(參見Old，L.(1985)Science 230:630-632)。隨后，確定了一種與惡病相關(guān)的，命名為惡液質(zhì)素(cachectin)的細(xì)胞因子和TNFa是同一分子。TNFa參與介導(dǎo)休克(參見Beutler，B.和Cerami，A.(1998)Annu.Rev.Biochem.57:505-518 ；Beutler, B.和 Cerami, A.(1998)Annu.Rev.1mmunol.7:625-655)。此外，TNFa與其它多種人類疾病和失調(diào)的病理生理學(xué)有關(guān)，包括膿血癥、感染、自身免疫病、移植排斥和移植物抗宿主疾病(參見Vasilli，P.(1992)Annu.Rev.1mmunol.10:411-452 ；Tracey, K.J.和 Cerami, A.(1994) Annu.Rev.Med.45:491-503)。鑒于人TNF a (hTNF a )在多種人類失調(diào)中所扮演的有害角色，治療策略被設(shè)計為抑制或中和hTNFa的活性。尤其是，能夠結(jié)合并中和hTNF a的抗體已被作為一種抑制hTNF a活性的手段(means)。某些最早的這類抗體是鼠的單克隆抗體(mAbs)，由用hTNF a免疫的鼠淋巴細(xì)胞制備的雜交瘤 分泌(參見Hahn T.等，(1985)Pro Natl Acad Sci USA82:3814-3818 ；Liang, C-M 等(1986)Biochem.Biophys.Res.Commun.137:847-854 ；Hirai, M等(1987)J.1mmunol.Methods 96:57-62 ；Fendly, B.M.等(1987)Hybridoma 6:359-370 ；Moller, A.等(1990) Cytokine 2:162-169 ;Moeller 等的美國專利 N0.5231024 ;wallach，D.的歐洲專利出版物N0.186833B1 ;01d等的歐洲專利申請N0.218868A1 ;*Moeller A.等的歐洲專利出版物如.26061( 1)。這些鼠抗於即[1抗體通常顯示較高的與hTNF a的親和力(如:Kd彡10_9M)并能中和hTNF a活性，但體內(nèi)應(yīng)用這些抗體可能受制于施用這些鼠抗人抗體相關(guān)的問題，如:血清半衰期短、不能觸發(fā)某些人體效應(yīng)器功能以及人體內(nèi)誘發(fā)不期望的對鼠抗體的免疫應(yīng)答(“人抗鼠抗體”(HAMA)的反應(yīng))。為了解決人體內(nèi)使用完全的(full)鼠抗體所帶來的問題，用基因工程的方法將鼠抗hTNFa抗體改造得更為“人化”。比如，已經(jīng)制備了嵌合抗體，其中抗體鏈的可變區(qū)是鼠源性的，而恒定區(qū)則是人源性的(Knight, D.M.等(1993)Mol.1mmunol.30:1443-1453 ；Daddona，P.E.等的PCT出版物N0.W092/16553)。此外，也制備了人源化抗體，其中抗體可變區(qū)的超變區(qū)是鼠源性的，但可變區(qū)的其余部分和抗體恒定區(qū)是人源性(Adair，J.R.等的PCT出版物N0.W092/11383)。然而，因為這些嵌合和人源化抗體仍保留一些鼠序列，它們?nèi)钥赡苷T發(fā)不期望的免疫反應(yīng)，即人抗嵌合抗體(HACA)反應(yīng)，尤其是長期施用時，如治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)等慢性適應(yīng)癥時(參見Elliott, M.J.等(1994)Lancet 344:1125-1127 ；Elliot, M.J.等(1994)Lancet344:1105-1110)。一種針對鼠單抗或其衍生物(如嵌合或人源化抗體)的優(yōu)選的hTNF a抑制劑應(yīng)當(dāng)是完全的人抗hTNFa抗體，因為這類藥劑即使是長期使用也不會誘發(fā)HAMA反應(yīng)。應(yīng)用人雜交瘤技術(shù)已經(jīng)制備了人抗hTNFa的單克隆自身抗體(Boyle，P等(1993)Cell.Immunol.152:556-568 ；Boyle, P.等(1993)Cell.1mmunol.152:569-581 ；Boyle 等的歐洲專利申請出版物N0.614984A2)。然而，據(jù)報道這些雜交瘤來源的單克隆自身抗體對hTNF a有親和力，但親和力太低以至于用常規(guī)方法測不出來，也不能夠結(jié)合可溶性的hTNF a，也不能夠中和hTNF a誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(參見Boyle等；同上)。而且，人雜交瘤技術(shù)的成功依賴于人周血中天然存在的產(chǎn)生特異性抗hTNF a自身抗體的淋巴細(xì)胞。某些研究檢測了人體中的抗 hTNF a 的血清自身抗體(Fomsgaard, A 等(1989) Scand.J.Tmmuno1.30:219_223 ；Bendtzen, K 等(1990) Prog.Leukocyte Biol IOB:447-452),而其它的研究沒有進(jìn)行檢測(Leusch, H-G 等(1991) J.1mmunol.Methods 139:145-147)。除天然存在的人抗hTNF a外可選擇重組hTNF a抗體。與hTNF a以相對低的親和力(如Kd約10_7M)和快的解離速率(如Ktjff約10_2/秒)結(jié)合的重組人抗體已有報道(Griffiths, A.D.等(1993)EMBO J.12:725-734)。然而，由于它們的相對快速的解離動力學(xué)，這些抗體不適于治療用。此外，已報道一種重組人抗hTNF a不能中和hTNF a活性，反而強(qiáng)化hTNFa與細(xì)胞表面的結(jié)合,加速其內(nèi)吞(Lidbury,A等(1994)Biotechnol.Ther.5:27-45 ；Aston, R 等的 PCT 出版物 N0.W092/03145)。也有報道描述了重組人抗體，能夠以高的親和力以及慢的解離速率結(jié)合可溶的hTNFa，這種抗體能夠中和hTNF a活性，包括hTNF a誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(體內(nèi)和體外)和hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞活化(參見美國專利N0.6090382)。施用抗體的典型方案為每周靜脈用藥。每周施用抗體和/或任何藥物是昂貴的、繁瑣的，而且由于頻繁施用而導(dǎo)致副反應(yīng)次數(shù)的增加。另外，靜脈施用通常需要受過醫(yī)學(xué)訓(xùn)練的人來操作，這也是一種限制。發(fā)明概述本發(fā)明提供一種治療TNFa相關(guān)失調(diào)的每兩周進(jìn)行一次的用藥方法，優(yōu)選地通過皮下用藥。每兩周用藥一次與每周用藥一次相比有許多優(yōu)點，包括但不限于，較少的注射總數(shù)，較少的注射部位反應(yīng)(如局部疼痛與腫脹)，患者接受程度提高(歸因于注射頻率降低)，對患者和衛(wèi)生保健機(jī) 構(gòu)(health care provider)而言較低的花費(fèi)。皮下用藥本身也有優(yōu)點，即患者可自己施用治療劑，如人TNF a抗體，這方便了患者和衛(wèi)生保健機(jī)構(gòu)。本發(fā)明提供了治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。該方法包括給受試者每兩周皮下注射抗體一次。優(yōu)選的抗體是能夠特異性結(jié)合人TNF a的重組人抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供了治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。這些方法包括利用聯(lián)合治療方法，其中人抗體與其它治療藥劑一同給受試者施用，所述其它治療藥劑如一種或多種可與其它靶物質(zhì)結(jié)合的抗體(如結(jié)合其它細(xì)胞因子或細(xì)胞表面分子的抗體)，一種或多種細(xì)胞因子，可溶性TNFa受體(見例如PCT出版物N0.W094/06476)和/或一種或多種能夠抑制TNF a產(chǎn)生或抑制其活性的化學(xué)藥劑(諸如PCT 出版物N0.W093/19751中所述的cyclohexaneylidene衍生物)，優(yōu)選藥劑是氨甲蝶呤?？贵w優(yōu)選能夠特異性結(jié)合人TNF a的重組人抗體。本發(fā)明抗體的特征是以高親和力和低解離動力學(xué)與hTNF a結(jié)合，而且能夠中和hTNFa活性，包括hTNF a誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(體內(nèi)和體外)和hTNF a誘導(dǎo)的細(xì)胞活化。這些抗體可以是全長的(如IgGl或IgG4抗體)，也可僅包含抗原結(jié)合部分(如Fab，F(xiàn)(ab’)2，scFv片段或單結(jié)構(gòu)域)。本發(fā)明最優(yōu)選的重組抗體命名為D2E7，其輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(在附錄B中列出)。優(yōu)選地，D2E7抗體輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。這些抗體在美國專利N0.6090382中有描述，其全文在此引入作為參考。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。這些方法包括每兩周皮下施用一次抗TNF a抗體，抑制人TNFa活性而治療失調(diào)。失調(diào)可以是例如膿血癥、自身免疫性疾病(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化、自身免疫性糖尿病、自身免疫性色素層炎以及腎病綜合征)、感染性疾病、惡性腫瘤、移植排斥或移植物抗宿主疾病、肺失調(diào)、骨失調(diào)、腸道失調(diào)或心臟失調(diào)。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。這些方法包括通過皮下施用抗TNF a抗體和氨甲蝶呤,抑制人TNF a活性,從而治療失調(diào)。在一方面中，氨甲蝶呤與抗TNFa抗體一同施用。在另一方面中，在施用抗TNFa抗體之前施用氨甲蝶呤。在另一方面中，在施用抗TNF a抗體之后施用氨甲蝶呤。在一優(yōu)選實施方案中，用于治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的抗TNF a抗體是人抗TNFa抗體。更優(yōu)選的是，通過每兩周皮下施用分離的人抗體或抗體的抗原結(jié)合部分來進(jìn)行治療。優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié)合部分以Kd為I X 10_8M或更小，Ktjff速率常數(shù)為I X 10_3/秒或更小從人TNFa解離,這兩者都是由表面等離子共振(surface plasmonresonance)測定；而且按照標(biāo)準(zhǔn)的體外L929檢測方法以IC5tl為I X ICT7M或更低中和人TNF a細(xì)胞毒性。更優(yōu)選地，分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff為5X 10_4/秒或更小，更優(yōu)選地以Ktjff為I X 10_4/秒或更小，從人TNF a解離。更優(yōu)選地，分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，按照標(biāo)準(zhǔn)的體外L929檢測方法檢測，以IC5tl為I X 10_8M或更低，進(jìn)一步優(yōu)選以IC5tl為I X 10_9M或更低，更進(jìn)一步優(yōu)選以IC5tl為I X KTwM或更低，中和人TNF a細(xì)胞毒性。再另一實施方案中，本發(fā)明提供了通過給受試者每兩周皮下施用人抗體或其抗原結(jié)合部分來治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。所述抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選具有下列特征:a)由表面等離子共振測定，以Ktjff為I X 10_3/秒或更小從人TNF a解離；b)具有輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過在1，4，5，7或8位進(jìn)行單一丙氨酸替代，或在1，3，4，6，7，8和/或9位進(jìn)行I至5個保守氨基酸替代由SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過在2，3，4，5，6,8,9,10或11位進(jìn)行單一丙氨酸替代，或在2，3，4，5，6，8，9，10，11和/或12位進(jìn)行I至5個保守氨基酸替代由SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列；更優(yōu)選地，抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff值為5X10_4/秒或更小從人TNF a解離。進(jìn)一步優(yōu)選地，抗體或抗體的抗原結(jié)合部分以Ktjff值為I X 10_4/秒或更小從人TNF a解離。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。這些方法包括每兩周給受試者皮下施用人抗體或其抗原結(jié)合部分?？贵w或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含LCVR區(qū)和HCVR區(qū)，所述LCVR區(qū)具有⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過在I，4，5，7或8位進(jìn)行單一丙氨酸替代由SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列；所述HCVR區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過在2，3，4，5，6，8，9，10或11位進(jìn)行單一丙氨酸替代由SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。進(jìn)一步優(yōu)選地，LCVR區(qū)還具有⑶2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含S EQ ID NO:5的氨基酸序列，而HCVR還具有⑶2結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列。再進(jìn)一步優(yōu)選地，LCVR區(qū)還具有⑶Rl結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列，而HCVR具有⑶Rl結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO:8的氨基酸序列。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了通過每兩周給受試者皮下施用分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分來治療其中TNFa活性有害的失調(diào)的方法。所述抗體或抗體的抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含LCVR區(qū)和HCVR區(qū)，所述LCVR區(qū)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；而所述HCVR區(qū)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。在某些實施方案中，抗體具有IgGl重鏈的恒定區(qū)或IgG4重鏈的恒定區(qū)。在另一實施方案中，抗體是Fab片段、F(ab’)2片段或單鏈Fv片段。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了用于治療失調(diào)的方法，該方法通過每兩周給受試者皮下施用一種或多種抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分而使受試者獲益。所述抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含LCVR區(qū)或連同HCVR區(qū)，所述LCVR區(qū)具有⑶R3結(jié)構(gòu)域，其包含選自SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:11,SEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQID NO: 14,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ IDNO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 的氨基酸序列；而所述HCVR區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含選自SEQID NO:4，SEQ ID NO:27，SEQ IDNO:28,SEQ ID NO:29,SEQ IDNO:30,SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:33,SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:35的氨基酸序列。本發(fā)明的另一個方面涉及包含藥物制劑的試劑盒，所述藥物制劑包含藥物組合物。該試劑盒包含抗TNFa抗體和藥學(xué)上可接受的載體。試劑盒內(nèi)附有每兩周皮下施用治療失調(diào)的藥物組合物的說明，其中施用抗TNFa可使患者獲益。在另一個方面中，本發(fā)明涉及包含藥物制劑的試劑盒，所述藥物制劑包含藥物組合物，所述試劑盒進(jìn)一步包含抗TNF a抗體、氨甲蝶呤以及藥學(xué)上可接受的載體。試劑盒內(nèi)附有皮下施用治療失調(diào)的藥物組合物的說明，其中施用抗 TNFa抗體可使患者獲益。本發(fā)明的另一方面提供了一種含有藥物組合物的預(yù)裝的注射器，所述藥物組合物包含抗TNF a抗體和藥學(xué)上可接受的載體。在另一方面中，本發(fā)明提供了一種含有藥物組合物的預(yù)裝的注射器，所述藥物組合物包含抗TNF a抗體、氨甲蝶呤和藥學(xué)上可接受的載體。因此，本發(fā)明具體地涉及以下方面:1.一種治療人類受試者中的失調(diào)的方法，其中疾病可用TNFa抗體治療，所述方法包括給人類受試者每兩周施用一種組合物來治療失調(diào)，其中所述組合物包含抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分。2.如第1項中的方法，其中施用是通過皮下注射進(jìn)行的。3.如第1項中的方法，其中所述抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分是人抗TNF a抗體。4.如第3項中的方法，其中由表面等離子共振測定，人抗體或其抗原結(jié)合部分以Kd為I X 10_8M或更低，Ktjff速率常數(shù)為I X 10_3/秒或更低從人TNF a上解離，而且在標(biāo)準(zhǔn)的體外L929檢測方法中以IC5tl為I X 10_7M或更低中和人TNF a細(xì)胞毒性。5.如第3項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為5X1(T4/秒或更低從人TNF a上解離。
6.如第3項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為1X10_4/秒或更低從人TNF a上解離。7.如第3項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測方法中，以IC5tl為IX 10_8M或更低中和人TNFa細(xì)胞毒性。8.如第3項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測方法中，以IC5tl為IX 10_9M或更低中和人TNFa細(xì)胞毒性。9.如第3項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測方法中，以IC5tl為IX KTkiM或更低中和人TNFa細(xì)胞毒性。10.如第3項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分是一種重組抗體或其重組的抗原結(jié)合部分。11.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法,所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括每兩周施用一種組合物，所述組合物包含人抗TNF a抗體，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分具有下列特征:a)由表面等離子共振測定，以Ktjff速率常數(shù)為I X 10_3/秒或更低從人TNF a上解離；b)具有輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過在1、4、5、7或8位進(jìn)行單一丙氨酸替代，或在1、3、4、6、7、8和/或9位進(jìn)行I至5個保守氨基酸替代由SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位進(jìn)行單一丙氨酸替代，或在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位進(jìn)行I至5個保守氨基酸替代由SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。12.如第11項中的方法，其中施用是通過皮下施用。13.如第11項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為5X1(T4/秒或更低從人TNF a上解離。14.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法,所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物，所述組合物包含人抗TNF a抗體，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分具有輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)，輕鏈可變區(qū)具有⑶R3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID N0:3的氨基酸序列，或通過在1、4、5、7或8位進(jìn)行單一丙氨酸替代由SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)具有⑶R3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位進(jìn)行單一丙氨酸替代由SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。15.如第14項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分的LCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域，HCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域。16.如第14項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分的LCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域，HCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域。17.一種在人 受試者中抑制人TNF a活性的方法,所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物，所述組合物包含人抗TNF a抗體，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)。18.如第17項中的方法，其中人抗體具有IgGl重鏈恒定區(qū)。19.如第17項中的方法，其中人抗體具有IgG4重鏈恒定區(qū)。20.如第17項中的方法，其中人抗體是Fab片段。21.如第17項中的方法，其中人抗體是單鏈Fv片段。22.一種在人受試者中抑制人TNFa活性的方法，其中所述人受試者患有其中TNFa活性有害的失調(diào)，所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物，所述組合物包含人抗TNF a抗體，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分具有輕鏈可變區(qū)(LCVR)或重鏈可變區(qū)(HCVR)，輕鏈可變區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ IDN0:3、SEQ ID NO =IUSEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:2USEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含選自 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQID NO:30, SEQ ID NO:3USEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 的氨基酸序列。23.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法，所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括每兩周皮下施用一種組合物，所述組合物包含人抗TNF a抗體，其中所述人抗體是D2E7抗體或其抗原結(jié)合部分。24.一種試劑盒，它包含一種制劑，所述制劑包含:a) —種藥物組合物，其包含抗TNF a抗體和藥學(xué)上可接受的載體；b)每兩周施用一次藥物組合物以治療失調(diào)的說明，其中抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分在治療失調(diào)時有效。25.如第24項中所述的試劑盒，其中所述抗體包含第2-22項的任一項中的抗體或其抗原結(jié)合部分。26.一種包含藥物組合物的預(yù)裝注射器，所述藥物組合物中包含抗TNF a抗體和藥學(xué)上可接受的載體。27.如第26項中的注射器，其中人抗體包含第2-22項任一項中的抗體或其抗原結(jié)合部分。28.一種治療失調(diào)的方法，其中抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分在治療失調(diào)時有效，所述方法包括給人受試者皮下施用一種組合物，所述組合物包含抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分以及氨甲蝶呤，用以治療失調(diào)。29.如第28項中的方法，其中氨甲蝶呤與抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分一起施用。30.如第28項中的方法，其中氨甲蝶呤在施用抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分前施用。31.如第28項中的方法，其中氨甲蝶呤在施用抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分后施用。32.如第28項中的方法，其中抗TNFa抗體是人抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分。33.如第28項中的方法， 其中由表面等離子共振測定，人抗體或其抗原結(jié)合部分以Kd為IX 10_8M或更低，Ktjff速率常數(shù)為I X 10_3/秒或更低從人TNF a上解離，而且在標(biāo)準(zhǔn)的體外L929檢測方法中以IC5tl為I X 10_7M或更低中和人TNF a細(xì)胞毒性。34.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為5X10_4/秒或更低從人TNF a上解離。35.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為1X10_4/秒或更低從人TNF a上解離。36.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測方法中，以IC5tl為IX 10_8M或更低中和人TNFa細(xì)胞毒性。37.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測方法中，以IC5tl為IX 10_9M或更低中和人TNFa細(xì)胞毒性。38.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分，在標(biāo)準(zhǔn)體外L929檢測方法中，以IC5tl為I X KTkiM或更低中和人TNF a細(xì)胞毒性。39.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分是一種重組抗體或其重組的抗原結(jié)合部分。40.如第28項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分能夠抑制人TNFa誘導(dǎo)的ELAM-1在人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)。41.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法,所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括給人受試者施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa抗體，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分具有下列特性:a)由表面等離子 共振測定，以Ktjff速率常數(shù)為I X IO-3/秒或更低從人TNF a上解離；b)具有輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過在1、4、5、7或8位進(jìn)行單一丙氨酸替代，或在1、3、4、6、7、8和/或9位進(jìn)行I至5個保守氨基酸替代由SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列；c)具有重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位進(jìn)行單一丙氨酸替代，或在2、3、4、5、6、8、9、10、11和/或12位進(jìn)行I至5個保守氨基酸替代由SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。42.如第41項中的方法，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為5 X 10_4/秒或更低從人TNF a上解離。43.如第41項中的方法，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分以Ktjff速率常數(shù)為I X 1(T4/秒或更低從人TNF a上解離。44.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法,所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa抗體，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分具有輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)，輕鏈可變區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或通過在1、4、5、7或8位進(jìn)行單一丙氨酸替代由SEQ ID NO:3修飾的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)具有⑶R3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或通過在2、3、4、5、6、8、9、10或11位進(jìn)行單一丙氨酸替代由SEQ ID NO:4修飾的氨基酸序列。45.如第44項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分的LCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域，HCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域。46.如第44項中的方法，其中人抗體或其抗原結(jié)合部分的LCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域，HCVR進(jìn)一步具有包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域。47.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法,所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa抗體，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分具有包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LCVR)，和包含SEQID NO:2的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)。48.如第47項中的方法，其中人抗體具有IgGl重鏈恒定區(qū)。49.如第47項中的方法，其中人抗體具有IgG4重鏈恒定區(qū)。50.如第47項中的方法，其中人抗體是Fab片段。51.如第47項中的方法，其中人抗體是單鏈Fv片段。

52.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法，所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分具有輕鏈可變區(qū)(LCVR)或重鏈可變區(qū)(HCVR)，輕鏈可變區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含選自SEQ ID NO:3、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24,SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26的氨基酸序列；重鏈可變區(qū)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域包含選自 SEQ ID NO:4,SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQIDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33 和 SEQ ID NO:34 的氨基酸序列。53.一種在人受試者中抑制人TNF a活性的方法，所述人受試者患有其中TNF a活性有害的失調(diào)，所述方法包括施用氨甲蝶呤并皮下施用人抗TNFa抗體，其中所述人抗體是D2E7抗體或其抗原結(jié)合部分。54.一種試劑盒，它包含一種制劑，所述制劑包含:a) 一種藥物組合物，其包含抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分、氨甲蝶呤和藥學(xué)上可接受的載體；b)皮下施用用于治療失調(diào)的藥物組合物的說明，其中所述失調(diào)中TNFa活性是有害的。55.如第54項中的試劑盒，其中所述抗體包含第32_51項中任一項中的抗體或其抗原結(jié)合部分。56.一種包含藥物組合物的預(yù)裝注射器，所述藥物組合物中包含抗TNF a抗體、氨甲蝶呤和藥學(xué)上可接受的載體。57.如第56項中的注射器，其中所述抗體包含第32-52項任一項中的抗體或其抗原結(jié)合部分。58.如第I或28項中的方法，其中所述失調(diào)是敗血癥。59.如第I或28項中的方法，其中所述抗體與細(xì)胞因子白介素-6 (IL-6) —起給人受試者施用，或以血清或血漿IL-6濃度在500pg/ml以上給人受試者施用。
60.如第I或28項中的方法，其中所述疾病是自身免疫性疾病。61.如第60項中的方法，其中自身免疫性疾病選自類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。62.如第61項中的方法，其中自身免疫性疾病是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。63.如第60項中的方法，其中自身免疫性疾病選自變態(tài)反應(yīng)、多發(fā)性硬化病、自免性糖尿病、自免性色素層炎和腎病綜合征。64.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)是一種傳染病。65.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)是移植排斥或移植物抗宿主病。66.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)是惡性腫瘤。67.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)是肺病。68.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)是腸道失調(diào)。69.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)是心臟失調(diào)。70.如第I或28項中的方法，其中失調(diào)選自炎性骨病、骨吸收疾病、酒精性肝炎、病毒性肝炎、凝血障礙、燒傷、再輸注損傷、瘢痕瘤形成、瘢痕組織形成和發(fā)熱。71.—種試劑盒，其包含:a) 一種藥物組合物，其包含人抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上可接受的載體；b) 一種藥物組合物，其包含氨甲蝶呤和藥學(xué)上可接受的載體；c)皮下施用抗TNF a抗體藥物組合物和在施用抗TNF a抗體藥物組合物之前、之后或同時施用氨甲蝶呤藥物組合物的說明。72.如第71項中的試劑盒，其中抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分是D2E7或其抗原結(jié)合部分。附圖簡述

圖1A和IB顯示了患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者在每周皮下施用一次D2E7抗體，共施用12周后的美國風(fēng)濕病學(xué)會20(ACR20)和ACR50反應(yīng)結(jié)果(圖1A)，或在隔周皮下施用一次D2E7抗體和氨甲蝶呤，共施用24周后的美國風(fēng)濕病學(xué)會20(ACR20)和ACR50反應(yīng)結(jié)果(圖1B)。這些資料表明隔周施用與每周施用一樣有效。圖2顯示了患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗體和氨甲蝶呤，施用24周后的ACR20、ACR50和ACR70反應(yīng)結(jié)果。圖3顯示了患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗體和氨甲蝶呤，施用24周后的疼痛關(guān)節(jié)計數(shù)(3A)和腫脹關(guān)節(jié)計數(shù)(3B)隨時間的結(jié)果。圖4顯示了患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在隔周皮下施用一次D2E7抗體和氨甲蝶呤，施用24周后的體檢結(jié)果簡表(SF-36)。RP，身體狀況(role physical) ;PF，身體功能；BP，身體疼痛；GH，總體健康狀態(tài)；V，活力；SF，社會功能；RE，情緒狀況；和ME，精神健康。圖5顯示了患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者在靜脈注射一次D2E7抗體和氨甲蝶呤后ACR反應(yīng)的百分比。發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及治療失調(diào)的方法，在所述失調(diào)中施用抗TNFa抗體對患者有益，所述方法包括施用分離的人抗體或其抗原結(jié)合部分，所述抗體或其抗原結(jié)合部分以高親和力、低解離速率和高的中和能力與人TNF a結(jié)合，從而治療失調(diào)。本發(fā)明的各個方面涉及用抗體和抗體片段進(jìn)行治療，以及它們的藥物組合物。為了使本發(fā)明更易于理解，首先定義某些術(shù)語。本文所用術(shù)語“用藥(dosing)”，是指施用一種物質(zhì)(如抗TNFa抗體)以獲得治療目的(如治療TNF a相關(guān)的失調(diào))。本文所用術(shù)語“兩周一次用藥方案”，“兩周一次用藥”，“兩周一次施用”，是指為獲得治療目的(如治療TNFa相關(guān)的疾病)而給受試者用藥(如抗TNFa抗體)的時間間隔。兩周一次用藥方案并不包括每周一次用藥方案。優(yōu)選每9-19天用藥一次，進(jìn)一步優(yōu)選的是每11-17天用藥一次，更優(yōu)選的是每13-15天用藥一次，最優(yōu)選的是每14天用藥一次。本文所用術(shù)語“聯(lián)合治療”是指施用兩種或兩種以上的治療物質(zhì)，如抗TNFa抗體和氨甲蝶呤。氨甲蝶呤可以與抗TNFa抗體同時施用，也可以在施用抗TNFa抗體前施用，或者在施用抗TNF a抗體后施用。本文所用術(shù)語“人TNFa ”(縮寫為hTNFa或hTNF)，是指一種人的細(xì)胞因子，該因子以分泌形式存在時分子量為17kD，以膜相關(guān)形式存在時分子量為26kD，生物活性形式是由17kD的分子以非共價鍵方式結(jié)合的三聚體形式存在。TNFa的結(jié)構(gòu)在如Pennica, D 等(1984)Nature 312:724-729 ；Davis, J.M.等(1987)Biochemistry 26:1322-1326和Jones，E.Y.等Nature 338:225-228中有進(jìn)一步的描述。人TNF a包括重組人TNFa (rhTNFa)，該蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組表達(dá)方法制備或購自商品化的產(chǎn)品(R&Dsystems, catalog N0.210-TA, Minneapolis, MN)。本文所用術(shù)語“抗體”，是指由四條多肽鏈組成的免疫球蛋白分子，其中兩條重鏈
(H)和兩條輕鏈(L)通過二硫鍵相互鏈接。每條重鏈又由重鏈可變區(qū)(縮寫為HCVR或VH)和重鏈恒定區(qū)組成，重鏈恒定區(qū)由CH1、CH2和CH3三個結(jié)構(gòu)域組成；每條輕鏈又由輕鏈可變區(qū)(縮寫為LCVR或VL)和輕鏈恒定區(qū)組成，輕鏈恒定區(qū)由CL 一個結(jié)構(gòu)域組成。VH和VL又進(jìn)一步的細(xì)分為超變區(qū)，命名為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，分散分布的較保守的區(qū)域，命名為框架區(qū)(FR)。每條VH和VL又由三個⑶R區(qū)和4個FR區(qū)組成，從氨基端至羧基端按照下列順序排列:FR1, CDRl，F(xiàn)R2, CDR2, FR3, CDR3, FR4。本文所用的術(shù)語抗體的“抗原結(jié)合部分”(或簡寫為“抗體部分”)，是指抗體的一個或多個片段，該片段保留了特異性與抗原(如hTNFa)結(jié)合的能力?？贵w的抗原結(jié)合功能可由全長抗體的片段來實現(xiàn)?？贵w的“抗原結(jié)合部分”一詞所包含的結(jié)合片段實例，包括
(I)Fab片段，由VL、VH、CL和CHl結(jié)構(gòu)域組成的單價片段；(2)F (ab’)2片段，由兩個Fab片段在鉸鏈區(qū)通過一個二硫鍵結(jié)合在一起的雙價片段；(3)由VH和VL組成的Fd片段；(4)由抗體的單臂的VL和VH結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段；(5) dAb片段(Ward等，(1989) Nature 341:544-546)，由VH結(jié)構(gòu)域組成；(6)分離的互補(bǔ)決定區(qū)(OTR)。雖然Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH是由獨(dú)立的基因編碼，但通過重組方法，可以用合成的接頭鏈接而成為一個蛋白，其中的VL和VH配對形成單價分子(稱為單鏈Fv (scFv);參見Bird等(1988) Science 242:423-426 ;以及Huston 等(1988) Natl.Acad.Sc1.USA 85:5879-5883)。這類單鏈抗體也包括在抗體的“抗原結(jié)合部分”中。其它形式的單鏈抗體，如diabodies也包括在內(nèi)。Diabodies是雙價、雙特異性的抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達(dá)在單一的多肽鏈上，但由于所用的接頭太短而不能使同一條鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域配對，因而迫使其與另一條鏈上的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對而產(chǎn)生了兩個抗原結(jié)合位點(參見 Holliger, P.等(1993)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:6444-6448 ；Poljak, R.J.等(1994)Structure 2:1121-1123)。進(jìn)一步來講，抗體或其抗原結(jié)合部分可以是一個大的免疫粘附分子的部分，可以由抗體或抗體部分通過共價或非共價方式與一個或多個其它的蛋白或多肽連接形成。這類免疫粘附分子的實例包括，用鏈霉抗生物素核心區(qū)制得的scFv的四聚體(Kipriyanov,S.M.等(1995) Human antibodies and Hybridomas 6:93-101)和用一個半胱;氛酸殘基，一個標(biāo)記肽和C末端多聚組氨酸標(biāo)記而制成的雙價和生物素化的scFv分子(Kipriyanov,S.M.等(1994)Mol.1mmunol.31:1047-1058)。用常規(guī)技術(shù)如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶分別消化完整抗體，可以從完整抗體制備抗體部分，如Fab和F(ab’)2片段。而且，應(yīng)用如本文所述的標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)，可以制備抗體、抗體部分和免疫粘附分子。本文所用的術(shù)語“人抗體”，包括那些具有從人種系(germline)免疫球蛋白序列衍生的可變區(qū)和恒定區(qū)的抗體。本發(fā)明的人抗體可以包括并非由人種系免疫球蛋白序列編碼的氨基酸殘基(如體外隨機(jī)或位點特異性的突變或體內(nèi)細(xì)胞突變)，如在CDR區(qū)，尤其是在⑶R3區(qū)。然而，本文所用的“人抗體”，并不包括那些⑶R區(qū)序列源自其它哺乳動物種類(如鼠)的種系，然后移植至人框架序列的抗體。本文所用的術(shù)語“重組人抗體”，包括那些通過重組方法制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的所有人抗體，如用重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞表達(dá)的抗體(在下面第二部分詳述)，分離自重組、組合人抗體文庫的抗體(在下面第三部分詳述)，分離自轉(zhuǎn)入人免疫球蛋白基因的轉(zhuǎn)基因動物(如鼠)的抗體(參見 Taylor，L.D 等(1992)Nucl.Acids Res.20 =6287-6295)，或者是通過其它涉及人免疫球蛋白基因序列剪切至其它DNA序列的方法而制備、表達(dá)、創(chuàng)造或分離的抗體。這類重組人抗體具有源自人種系免疫球蛋白序列的可變區(qū)和恒定區(qū)。在某些實施方案中，對這類重組人抗體進(jìn)行體外誘變(或，當(dāng)使用轉(zhuǎn)入人Ig序列的轉(zhuǎn)基因動物時，進(jìn)行體內(nèi)體細(xì)胞誘變)，因而這類重組人抗體的VH和VL區(qū)的氨基酸序列是這樣一些序列，它們來源于人種系VH和VL序列且與之相關(guān)，但不是體內(nèi)人抗體種系所有組成部分(repertoire)中天然存在的序列。本文所用的“分離抗體”，是指基本上不含具有不同抗原特異性的其它抗體的抗體(如特異性結(jié)合hTNF a的分離抗體，基本上不含與除hTNF a外的抗原特異性結(jié)合的抗體)。然而，特異性結(jié)合hTNFa的分離抗體可以與其它抗原(如源于其它物種的hTNF a)有交叉反應(yīng)性(下面將進(jìn)一步討論)。而且，分離的抗體可以基本上不含其它的細(xì)胞物質(zhì)或化學(xué)物質(zhì)。本文所用的“中和抗體”(或“能夠中和hTNF a活性的抗體”)，是指能夠與hTNF a結(jié)合并導(dǎo)致其生物活性被抑制的一類抗體。hTNFa生物活性的抑制，可以通過檢測hTNFa生物活性的一種或多種指標(biāo)來測定，如檢測hTNF a誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性(無論體內(nèi)還是體外)，hTNFa誘導(dǎo)的細(xì)胞活化以及 hTNFa與其受體的結(jié)合。這些hTNF a的生物活性指標(biāo)可以通過本領(lǐng)域已知的幾種體內(nèi)或體外標(biāo)準(zhǔn)方法中一種或多種測定(見實施例4)。優(yōu)選通過hTNFa誘導(dǎo)的L929細(xì)胞的細(xì)胞毒性的抑制測定抗體中和hTNF a活性的能力。作為一種附加或可選的hTNF a活性指標(biāo)，可測定抗體抑制hTNF a誘導(dǎo)HUVEC上ELAM-1的表達(dá)能力，作為hTNF a誘導(dǎo)細(xì)胞活化的量度。本文所用的術(shù)語“表面等離子共振”，是指一種光學(xué)現(xiàn)象，可通過檢測生物傳感器基質(zhì)(matrix)中蛋白濃度的變化實時地分析生物特異性反應(yīng)，比如用BIAcore系統(tǒng)(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ)。進(jìn)一步的描述參見實施例1 和 Jonsson U.等(1993) Ann.Biol.Clin.51:19-26 ； JonSSOn U.等(1991)Biotechniquesl1:620-627 ；Johnsson, B 等(1995)J.Mol.Recognit.8:125-131 ；和Johnsson, B.等(1991)Anal.Biochem.198:268_277。本文所用的術(shù)語“K。:’，是指抗體從抗體/抗原復(fù)合物上解離下來的解離速率常數(shù)。本文所用的術(shù)語“Kd”，是指特定抗體-抗原反應(yīng)的解離常數(shù)。本文所用的術(shù)語“核酸分子”，包括DNA和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，優(yōu)選雙鏈的。本文在提及編碼與hTNF a結(jié)合的抗體或抗體部分(例如VH、VL、CD3)的核酸時所用的“分離的核酸分子”，是指一種核酸分子，其中編碼抗體或抗體部分的核苷酸序列沒有編碼可結(jié)合非hTNFa的抗原的抗體或抗體部分的其它核苷酸序列，所述其它序列可以天然位于人基因組DNA序列的兩側(cè)。比如，本發(fā)明的分離的編碼抗TNFa抗體VH區(qū)的核酸序列不包括編碼結(jié)合非hTNF a抗原的其它VH區(qū)的序列。本文所用的術(shù)語“載體”，是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一種核酸分子的核酸分子。載體類型之一是“質(zhì)?！?，是一種環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，能夠連接附加的DNA片段。另一類型的載體是病毒載體，其中附加的DNA片段連接至病毒基因組。某些載體在引入的宿主細(xì)胞中能夠自主復(fù)制(如具有細(xì)菌復(fù)制啟動子的細(xì)菌載體和游離的哺乳動物載體)。其它的載體(如非游離的哺乳動物載體)可以在引入宿主細(xì)胞后整合進(jìn)宿主細(xì)胞的基因組，隨基因組的復(fù)制而復(fù)制。而且，某些載體能夠表達(dá)其連接的基因。這類載體在本文中稱為“重組表達(dá)載體”(或簡稱“表達(dá)載體”)?？偟膩碚f，重組DNA技術(shù)中所用的表達(dá)載體通常是質(zhì)粒。在本文中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以混用，因為質(zhì)粒是最常用的載體。然而，本發(fā)明也包括其它形式的表達(dá)載體，如病毒載體 (如復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒)，它們同樣具有一樣的功能。本文所用的術(shù)語“重組宿主細(xì)胞”(或簡稱“宿主細(xì)胞”)，是指引入重組表達(dá)載體的細(xì)胞。應(yīng)理解，這一術(shù)語包括的不僅是特指的受試者細(xì)胞，而且包括其傳代細(xì)胞。由于突變或環(huán)境影響在隨后的傳代中會發(fā)生某些修飾，這樣事實上其傳代細(xì)胞可能與親代細(xì)胞不一樣，但仍屬于本文所用的“宿主細(xì)胞”范疇。在下面的各個小部分中詳細(xì)描述本發(fā)明的不同方面。1.結(jié)合人TNF a的人抗體本發(fā)明提供了用抗TNFa抗體而治療失調(diào)的方法，這些方法包括每兩周皮下施用一次分離的人抗體或抗體的抗原結(jié)合部分，其中抗體或抗原結(jié)合部分可以與人TNFa以高親和力、低解離常數(shù)和高中和能力結(jié)合。本發(fā)明的人抗體優(yōu)選重組的、具有中和活性的人抗TNFa抗體。本發(fā)明最優(yōu)選的重組中和抗體在本文稱為D2E7(D2E7VL區(qū)氨基酸序列如SEQID N0:1所示，D2E7VH區(qū)氨基酸序列如SEQ IDN0:2所示)。D2E7抗體的性質(zhì)在Salfeld等的美國專利N0.6090382中已經(jīng)描述過，在本文中引入作為參考。一方面，本發(fā)明涉及用抗TNF a抗體治療失調(diào)，治療包括每兩周皮下施用一次分離的D2E7抗體或抗體部分、D2E7相關(guān)抗體和抗體部分，或與D2E7抗體具有相當(dāng)?shù)奶匦缘娜丝贵w或抗體部分，所述特性如可以與人TNFa以高的親和力結(jié)合并具有低的解離動力學(xué)和高的中和能力。在某一方案中，本發(fā)明提供了用分離的人抗體或抗體的抗原結(jié)合部分進(jìn)行治療的方法，抗體以Kd為I X 10_8M或更小，Ktjff速率常數(shù)為I X 10_3/秒或更小從人TNF a上解離，這二者都由表面等離子共振測定，而且用體外標(biāo)準(zhǔn)L929檢測方法檢測中和人TNFa細(xì)胞毒性的IC5tl為I X KT7M或更小。進(jìn)一步優(yōu)選的分離人抗體或其抗原結(jié)合部分的Ktjff為5X 10_4/秒或更小，或進(jìn)一步優(yōu)選Ktjff為I X 10_4/秒或更小。再優(yōu)選的分離的人抗體或抗原結(jié)合部分，用體外標(biāo)準(zhǔn)的L929檢測方法檢測其中和人TNF a細(xì)胞毒性的IC5tl為I X 10_8M或更小，再一步優(yōu)選的IC5tl為I X 10_9M或更小，再優(yōu)選的IC5tl為I X IO^10M或更小。在某一優(yōu)選的方案中，抗體為分離的重組人抗體或其抗原結(jié)合部分。本領(lǐng)域中眾所周知，抗體的重鏈和輕鏈的CDR3結(jié)構(gòu)域在抗體與抗原的結(jié)合特異性/親和性中起重要作用。因而本發(fā)明的另一方面涉及施用抗TNFa抗體治療失調(diào)的方法，其中施用人抗體方法是皮下施用，該抗體與hTNFa結(jié)合的解離動力學(xué)常數(shù)低，其重鏈和輕鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域在結(jié)構(gòu)上與D2E7—致或相關(guān)。D2E7VL⑶R3區(qū)的第9位可以是丙氨酸或蘇氨酸，這基本上不影響其Ktjff值。相應(yīng)地，D2E7VL⑶R3區(qū)的共有基元包含Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID NO:3)的氨基酸序列。另外 D2E7VH CDR3 區(qū)的第 12 位可以是酪氨酸或天冬酰胺，這基本上不影響Ktjff值。相應(yīng)地，D2E7VH⑶R3區(qū)的共有基元包含V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。而且，如實施例2所證實的，D2E7抗體的輕和重鏈⑶R3結(jié)構(gòu)域，用單個丙氨酸替代(在VL的⑶R3區(qū)位置1，4，5，7或8或在VH的CDR3區(qū)位置 2，3，4，5，6，8，9，10或11替換)，基本上并不影響Ktjff。進(jìn)而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到:既然D2E7抗體VH和VL CDR3結(jié)構(gòu)域的氨基酸可以用丙氨酸替代，那么在保留抗體低解離常數(shù)的前提下，CDR3區(qū)內(nèi)的其它氨基酸的替代也是可能的，尤其是用保守的氨基酸替代。本文所用的“保守氨基酸替代”，是指某一氨基酸殘基被另一個具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基所替代。本領(lǐng)域的具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基家族已經(jīng)確定，包括堿性側(cè)鏈(如，賴氨酸，精氨酸和組氨酸)，酸性側(cè)鏈(如天冬氨酸，谷氨酸)，不帶電荷極性側(cè)鏈(如甘氨酸，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸和半胱氨酸)，非極性側(cè)鏈(如丙氨酸，纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和色氨酸)以及芳香族側(cè)鏈(如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和組氨酸)。D2E7VL和/或VH CDR3區(qū)內(nèi)的保守替代優(yōu)選不超過I 5個；D2E7VL和/或VH⑶R3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的保守替代進(jìn)一步優(yōu)選不超過I 3個。另外，保守氨基酸的替代不應(yīng)在與hTNFa結(jié)合的關(guān)鍵位置上，D2E7抗體VL的CDR3區(qū)的第2和5位的氨基酸和VH的CDR3區(qū)的第I和7位的氨基酸似乎對抗體與hTNF a的相互作用很重要，因此優(yōu)選這些位置的保守氨基酸不被替代(雖然在D2E7抗體VL CDR3第5位氨基酸用丙氨酸替代也可以接受，如上所述)(參見美國專利N0.6090382)。相應(yīng)地，在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療失調(diào)的方法，其通過每兩周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結(jié)合部分而進(jìn)行。抗體或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含下列特征:a)與人TNF a的解離常數(shù)Ktjff為I X 10_3/秒或更小，由表面等離子共振測定。b)其輕鏈CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列，或用丙氨酸在1，4，5，7或8替代SEQ ID NO:3的氨基酸序列后的修飾序列或在1，3，4，6，7，8和/或9位置上進(jìn)行I 5個保守氨基酸替代修飾的序列。
c)重鏈CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或用丙氨酸在2，3，4，5，6，8，9，10或11替代SEQ ID NO:4的氨基酸序列后的修飾序列或在2，3，4，5，6，8，9，10，11或12位置上進(jìn)行1 5個保守氨基酸替代修飾的序列。更優(yōu)選的抗體或抗體的抗原結(jié)合部分與人TNF α解離Ktjff值為5 X 10_4/秒或更?。贿M(jìn)一步優(yōu)選抗體或抗體的抗原結(jié)合部分與人TNF α解離Ktjff值為I X 10_4/秒或更小。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供了治療失調(diào)的方法，通過每兩周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結(jié)合部分而進(jìn)行治療?？贵w或抗原結(jié)合部分，優(yōu)選其輕鏈可變區(qū)(LCVR) CDR3結(jié)構(gòu)域包含SEQ IDNO:3的氨基酸序列，或用丙氨酸在1，4，5，7或8替代SEQ IDNO:3的氨基酸序列后的修飾序列，優(yōu)選其重鏈可變區(qū)(HCVR)⑶R3結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列，或用丙氨酸在2，3，4，5，6，8，9，10或11替代SEQ ID NO:4的氨基酸序列修飾序列。優(yōu)選LCVR進(jìn)一步包含一個⑶R2區(qū)，該區(qū)包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列(即D2E7抗體的VL中的⑶R2區(qū))以及HCVR進(jìn)一步包含⑶R2區(qū)，該區(qū)包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列(即D2E7抗體的VH中的⑶R2區(qū))。再進(jìn)一步優(yōu)選LCVR進(jìn)一步包含一個⑶Rl區(qū)，該區(qū)包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列(即D2E7抗體的VL中的⑶Rl區(qū))以及HCVR進(jìn)一步包含一個⑶Rl區(qū)，該區(qū)包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列(即D2E7抗體的VH中的⑶Rl區(qū))。VL區(qū)的框架區(qū)優(yōu)選來自V K I人種系家族，更優(yōu)選來自Α20人抗體產(chǎn)生種系家族Vk基因，最優(yōu)選美國專利N0.6090382中圖1A和IB中所示的D2E7的VL框架區(qū)序列。VH區(qū)的框架區(qū)優(yōu)選來自VH3人抗體產(chǎn)生細(xì)胞族，更優(yōu)選來自人抗體產(chǎn)生細(xì)胞DP31的VH基因，最優(yōu)選美國專利N0.6090382中圖2Α和2Β中所示的D2E7的VH框架區(qū)序列。本發(fā)明的再一個實施方案中提供了治療失調(diào)的方法，通過每兩周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結(jié)合部分而進(jìn)行治療?？贵w或抗原結(jié)合部分，優(yōu)選其輕鏈可變區(qū)(LCVR)包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列(即D2E7VL)，優(yōu)選其重鏈可變區(qū)(HCVR)包含SEQID NO:2的氨基酸序列(即D2E7VH)。在某些實施方案中，抗體包含重鏈的恒定區(qū)，如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD的恒定區(qū)；重鏈恒定區(qū)優(yōu)選IgGl或IgG4的重鏈恒定區(qū)，而且抗體包含輕鏈恒定區(qū)，無論是K鏈還是λ鏈的恒定區(qū)。優(yōu)選地，抗體包含K輕鏈恒定區(qū)。另外，抗體部分可以是例如Fab片段或是單鏈Fv片段。在另外的實施方案中，本發(fā)明提供了治療失調(diào)的方法，通過每兩周皮下施用一次分離的人抗體或其的抗原結(jié)合部分而進(jìn)行治療?？贵w或其抗原結(jié)合部分優(yōu)選包含D2E7相關(guān)的VL和VH的CDR3結(jié)構(gòu)域，例如下列的抗體或抗原結(jié)合部分，其中輕鏈可變區(qū)(LCVR)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含的氨基酸序列選自SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQ ID NO:17，SEQ ID NO:18，SEQ ID NO:19，SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:22，SEQ ID NO:23，SEQ IDNO:24, SEQ ID NO:25和SEQ ID N0:26，或重鏈可變區(qū)(HCVR)具有CDR3結(jié)構(gòu)域，其包含的氨基酸序列選自 SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:27，SEQ ID NO:28，SEQ ID NO:29，SEQ ID NO:30，SEQ ID NO:31，SEQ ID NO:32，SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34 和 SEQ ID NO:35。本發(fā)明的抗體或抗體部分可被衍化為或連接至另一個功能分子(如另一個肽或蛋白)。相應(yīng)地，被發(fā)明的抗體或抗體部分包含本文所述的人抗hTNFa抗體的衍生物或其它修飾體，包括免疫粘附分子。比如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以有效地結(jié)合(通過化學(xué)偶聯(lián)、基因融合以及非共價連接等)到一個或多個其它的分子實體上，如另一種抗體(如雙特異性抗體或diabody)、檢測試劑、細(xì)胞毒性試劑、藥物和/或蛋白或肽上，其中蛋白或肽能夠介導(dǎo)抗體或抗體部分與另一種分子(如鏈霉抗生物素核心區(qū)或多聚組氨酸標(biāo)記)相連接。通過交連兩種或兩種以上的抗體(相同或不同類型，如產(chǎn)生雙特異性抗體)可獲得一種衍生抗體。適于交連的物質(zhì)包括那些具有異質(zhì)雙官能，具有兩個不同的反應(yīng)基團(tuán)并被合適的間隔物分開的物質(zhì)(如 m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester)或同質(zhì)雙官能基團(tuán)(^ndisuccinimidyl suberate)。這些連接物可從Pierce ChemicalCompany, Rockford, IL 公司獲得(pl4_36)。能夠與本發(fā)明抗體或抗體部分連接的可檢測試劑包括熒光化合物。代表性的熒光檢測試劑包括熒光素、異硫氰熒光素，若丹明、5-二甲胺-1-萘磺酰氯，藻紅蛋白等。抗體也可以與檢測性的酶生成衍生物，如堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、葡糖氧化酶等。當(dāng)抗體與可檢測性的酶生成衍生物時，可以通過添加另外一種酶能夠利用而產(chǎn)生可檢測反應(yīng)產(chǎn)物的試劑而進(jìn)行檢測。比如，當(dāng)存在辣根過氧化物酶檢測試劑時，加入過氧化氫和聯(lián)苯胺就可產(chǎn)生可檢測的顏色反應(yīng)。抗體也可以和生物素生成衍生物，然后通過間接地檢測親和素或鏈親和素來檢測。I1.抗體表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體部分能夠通過在宿主細(xì)胞中重組表達(dá)免疫球蛋白的輕鏈和重鏈而制備。為了表達(dá)重組抗體，用一個或多個攜帶編碼免疫球蛋白抗體輕鏈和重鏈的DNA片段的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，這樣在宿主細(xì)胞中就可以表達(dá)輕鏈和重鏈，優(yōu)選的宿主細(xì)胞能夠分泌表達(dá)物至培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基，從而可以回收培養(yǎng)基而制備抗體。正如Sambrrok,Fritsch和Maniatis編著的分子克隆:實驗室操作手冊，第二版，冷泉港，紐約(1989)；Ausubel F.M.等編著的分子生物學(xué)操作程序,Greene出版社(1989)以及Boss等的美國專利N0.4816397中所描述的，標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)可用于獲得抗體的輕鏈和重鏈基因，然后將這些基因克隆入重組表達(dá)載體，介導(dǎo)這些載體進(jìn)入宿主細(xì)胞。為了表達(dá)D2E7或D2E7相關(guān)的抗體，首先需要獲得編碼輕鏈和重鏈的可變區(qū)DNA片段。這些DNA片段可以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增和修飾抗體生產(chǎn)細(xì)胞的輕鏈和重鏈可變區(qū)而獲得。本領(lǐng)域中，擴(kuò)增人輕鏈和重鏈可變區(qū)基因的種系DNA序列是眾所周知的(參見“Vbase”人germline序列數(shù)據(jù)庫；參見Kabat EA等(1991) SequencesofProteins of Immunological Interest 第五版，US Department of Healthand HumanServices, NIH Publication N0.91-3242 ;Tomlinson 1.M.等(1992) “the Repertoireof Human Germline Vh Sequences Reveals aboutFifty Groups of Vh Segments withDifferent Hypervariable Loops” J.Mol.Biol.227:776-798 ;以及 Cox.J.P.L.等(1994)“A Directory of HumanGermline V78Segments Reveals a Strong Bias in theirUsage"Eur.J.1mmunol.24:827-836 ;這些文獻(xiàn)內(nèi)容在本文中引入作為參考)。為了獲得編碼D2E7或D2E7相關(guān)抗體重鏈的DNA片段，可用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法從人種系VH基因中VH3家族中的一員擴(kuò)增。最優(yōu)選擴(kuò)增DP-31VH種系序列。為獲得編碼D2E7或D2E7相關(guān)抗體輕鏈的DNA片段，可用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法從人種系細(xì)胞VL基因中Vk I家族中的一員擴(kuò)增。最優(yōu)選擴(kuò)增A20VL種系基因?；谏鲜鑫墨I(xiàn)所揭示 的核酸序列，用標(biāo)準(zhǔn)的方法設(shè)計擴(kuò)增DP-31VH和A20VL序列的PCR引物。
—旦獲得了種系VH和VL片段，可以突變成本文所述的編碼D2E7或D2E7相關(guān)的氨基酸序列。首先比較種系VH或VL DNA編碼的氨基酸序列和D2E7或D2E7相關(guān)VH和VL的氨基酸序列，找出與D2E7或D2E7相關(guān)抗體序列不同的氨基酸，然后根據(jù)基因密碼子確定需突變的核酸，適當(dāng)?shù)耐蛔儷@得的DNA序列而獲得突變的種系序列，該序列編碼D2E7或D2E7相關(guān)抗體的氨基酸。種系序列突變由標(biāo)準(zhǔn)的方法完成，如PCR介導(dǎo)的突變(其中突變的核酸置于PCR引物中，這樣PCR產(chǎn)物就包含了突變)或定點突變。一旦獲得了編碼D2E7或D2E7相關(guān)抗體的DNA片段(如上所述，通過抗體生產(chǎn)細(xì)胞的VH和VL擴(kuò)增和修飾獲得)，可以進(jìn)一步通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)操作這些DNA片段，比如將可變區(qū)基因轉(zhuǎn)化為全長抗體鏈基因、Fab片段基因或scFv基因。在這些操作中，編碼VL和VH的DNA片段可操作性連接至編碼另一種蛋白的DNA片段上，如抗體的恒定區(qū)或一個柔性接頭上。在此意義上，“可操作性連接”一詞，是指兩個DNA片段連接使得兩段DNA編碼的氨基酸序列保持在框架中。分離的編碼VH區(qū)的DNA可以轉(zhuǎn)化成全長的重鏈基因，方法是可操作性地連接編碼VH的DNA至另一個編碼重鏈恒定區(qū)(CH1，CH2和CH3)的DNA分子。人重鏈恒定區(qū)的序列在本領(lǐng)域是已知的(參見 Kabat EA 等(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest 第五版，US Department of Health and Human Services, NIH PublicationN0.91-3242)，而且包含這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增方法獲得。重鏈恒定區(qū)可以是IgGl, IgG2，IgG3，IgG4，IgA, IgE, IgM或IgD的恒定區(qū)，但最優(yōu)選的是IgGl或IgG4的恒定區(qū)。對Fab片段的重鏈基因，編碼VH的DNA可操作性的連接至另一僅編碼重鏈CHl恒定區(qū)的DNA分子上。分離的編碼VL區(qū)的DNA可以轉(zhuǎn)化成全長的輕鏈基因(和Fab輕鏈基因)，方法是可操作性的連接編碼VL DNA至另一個編碼輕鏈恒定區(qū)CL DNA分子。人輕鏈恒定區(qū)序列在本領(lǐng)域是已知的(參見 KabatEA 等(1991) Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest 第五版，US Department of Health and Human Services, NIH PublicationN0.91-3242)，而且包含這些區(qū)域的DNA片段可以通過標(biāo)準(zhǔn)的PCR擴(kuò)增方法獲得。輕鏈恒定區(qū)可以是K鏈或λ鏈恒定區(qū) ，但最優(yōu)選的是K鏈的恒定區(qū)。為構(gòu)建scFv基因，可將編碼VH和VL的DNA片段可操作性連接至編碼一柔性接頭的片段上，如編碼氨基酸序列(Gly4-Ser)3，這樣VH和VL就可以表達(dá)成一條連續(xù)的單鏈蛋白，其中VL和VH區(qū)被柔性接頭連接在一起(參見Bird等(1988) Science 242:423-426 ；Huston 等(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883 ；McCafferty 等Nature(1990) 348:552-554)。為表達(dá)本發(fā)明的抗體或抗體部分，如上述獲得的編碼部分或全部輕鏈和重鏈的DNA，可以插入表達(dá)載體，這樣基因就被可操作性的連接至轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控基因。在本文中，“可操作性連接”表達(dá)的意思是:抗體基因連接至載體后，載體中轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控基因就能夠如同設(shè)計的功能一樣調(diào)節(jié)抗體基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，選擇的載體和表達(dá)調(diào)控序列需與宿主細(xì)胞相容?？贵w的輕鏈基因和重鏈基因可插入獨(dú)立的載體，或更為普遍的是將兩段基因插入同一表達(dá)載體。抗體基因可用標(biāo)準(zhǔn)方法插入表達(dá)載體(如連接抗體基因片段和載體上互補(bǔ)的酶切位點，或如果沒有限制性酶切位點時用鈍端連接)。在D2E7或D2E7相關(guān)的輕鏈和重鏈序列插入之前，表達(dá)載體可已經(jīng)攜帶有抗體的恒定區(qū)基因序列。比如，一種轉(zhuǎn)化D2E7或D2E7相關(guān)VH和VL序列為全長抗體基因的方法是將它們分別插入至含編碼輕鏈和重鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體中，這樣VH片段就可操作性的連接至載體內(nèi)CH片段上，而VL片段就可操作性的連接至載體內(nèi)CL片段上。另外的或可選擇性的做法是:重組表達(dá)載體可編碼信號肽，這樣利于宿主細(xì)胞分泌抗體鏈。抗體鏈基因可被克隆入載體，就使信號肽與抗體鏈基因連接并保持了氨基酸讀碼框架不變。信號肽可以使免疫球蛋白的信號肽或異源的信號肽(即源于非免疫球蛋白的蛋白信號肽)。除抗體鏈基因外，本發(fā)明重組表達(dá)載體攜帶調(diào)控序列，能夠調(diào)節(jié)抗體鏈在宿主細(xì)胞中的表達(dá)。“調(diào)控序列”包括啟動子、增強(qiáng)子和其它表達(dá)控制元件(如多聚腺甘酸信號)，這些序列控制抗體基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯。這些調(diào)控序列在許多文獻(xiàn)中有詳述，比如在Goeddel所著的 Gene Expression Technology:Methods In Enzymology 185, AcademicPress, SanDiego, CA(1990)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解:表達(dá)載體的設(shè)計，包括調(diào)控序列的選擇，取決于如要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、欲表達(dá)的蛋白表達(dá)狀況等。優(yōu)選的調(diào)控哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的序列包括:能夠指導(dǎo)蛋白在哺乳動物細(xì)胞中高水平表達(dá)的病毒元件，如源于巨細(xì)胞病毒(如CMV的啟動子/增強(qiáng)子)，猴病毒40(SV40)(如SV40啟動子/增強(qiáng)子)，腺病毒(如腺病毒主要晚期啟動子(AdMLP))和多瘤病毒的啟動子和/或增強(qiáng)子。關(guān)于病毒調(diào)控元件的詳盡描述以及序列，參見Stinski的美國專利N0.5168062，Bell的美國專利N0.4510245以及Schaffner 等的美國專利 N0.4968615。除抗體鏈基因和調(diào)控序列外，本發(fā)明的重組病毒載體可攜帶其它的序列，如調(diào)控載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(如復(fù)制起點)和選擇性標(biāo)記基因。選擇性標(biāo)記基因利于將轉(zhuǎn)入載體的宿主細(xì)胞篩選出來(參見Axel等的美國專利N0.4399216,4634665和5179017)。比如，通常的選擇性標(biāo)記基因賦予轉(zhuǎn)入載體的細(xì)胞以藥物抗性，如抗G418、潮霉素和氨甲蝶呤抗性。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(將氨甲蝶呤用于篩選和擴(kuò)增培養(yǎng)dhfr-的宿主細(xì)胞)以及neo基因(用于G418篩選)。為了表達(dá)輕鏈和重鏈，用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可將編碼輕鏈和重鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染一種宿主細(xì)胞。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”的不同形式包括通常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細(xì)胞的廣泛技術(shù)，如電穿孔、磷酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖苷轉(zhuǎn)染等。雖然理論上無論原核還是真核細(xì)胞都可能表達(dá)本發(fā)明的抗體，但最優(yōu)選的是真核細(xì)胞表達(dá)抗體，尤其優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，因為這類真核細(xì)胞尤其是哺乳動物細(xì)胞比原核細(xì)胞更傾向于組裝和分泌出正確折疊的、有免疫學(xué)活性的抗體。有研究報告稱:抗體基因的原核病毒不能有效制備高產(chǎn)的活性抗體(BossMA 和 Wood CR(1995)Immunology Today 6:12-13)。優(yōu)選的表達(dá)本發(fā)明重組抗體的哺乳動物宿主細(xì)胞，包括中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)(包括 dhfr-CHO 細(xì)胞，在 Urlaub 和 Chasin (1980) ProcNatl Acad Sci USA 77:4216-4220中有說明，用 DHFR 篩選標(biāo)志，如 R.J.Kaufman 和 P.A.Sharp (1982)Mol Bio 159:601-621)，NSO骨髓瘤細(xì)胞，COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動物宿主細(xì)胞后，將其培養(yǎng)一段時間使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)而獲得抗體，最優(yōu)選的是細(xì)胞將抗體分泌至培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。然后用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白純化方法從培養(yǎng)基中回收。宿主細(xì)胞可用于生產(chǎn)完整抗體的部分，如Fab片段或scFv分子?？梢岳斫馍鲜龇椒ǖ娜魏巫兺ǘ及ㄔ诒景l(fā)明的范圍之內(nèi)。比如，可能需要用編碼本發(fā)明輕鏈或重鏈的DNA (但不是兩個)轉(zhuǎn)染一宿主細(xì)胞。 重組DNA技術(shù)也可用于去除部分或全部的編碼輕鏈和重鏈中對結(jié)合TNF α不是必需的DNA。從這樣剪切后的DNA分子表達(dá)的分子也包括在本發(fā)明抗體范疇。另外，通過標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)交連方法將本發(fā)明的抗體與第二種抗體交連而生產(chǎn)出雙功能抗體，其中一條輕鏈和一條重鏈?zhǔn)潜景l(fā)明的抗體，另一條輕鏈和另一條重鏈?zhǔn)翘禺愋越Y(jié)合另一種抗原而非hTNFa的抗體。在優(yōu)選的表達(dá)本發(fā)明抗體或抗原結(jié)合部分的重組表達(dá)系統(tǒng)中，編碼抗體輕、重鏈的重組表達(dá)載體用磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)入dhfr-CHO細(xì)胞中，重組表達(dá)載體中抗體輕鏈和重鏈基因可操作性的連接至CMV增強(qiáng)子/AdMLP啟動子等調(diào)控元件，以使基因的轉(zhuǎn)錄水平提高。重組表達(dá)載體同時也攜帶DHFR基因，可以用氨甲蝶呤篩選/擴(kuò)增轉(zhuǎn)染了載體的宿主細(xì)胞。然后培養(yǎng)篩選出的宿主細(xì)胞，讓其表達(dá)抗體的輕鏈和重鏈并從培養(yǎng)基中回收完整的抗體。標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)用于制備重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，篩選轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞以及從培養(yǎng)基中回收抗體。II1.重組人抗體的選擇除D2E7或其抗原結(jié)合部分或本文所述的D2E7相關(guān)抗體外的重組人抗體，可以通過篩選重組聯(lián)合抗體文庫而分離，優(yōu)選scFv噬菌體展示文庫，該文庫是用源于人淋巴細(xì)胞mRNA制備的VL和VHcDNA構(gòu)建的。本領(lǐng)域內(nèi)，制備和篩選這類文庫的方法是已知的(如:the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catalog n0.27-9400-01 ;以及the Stratagene SurfZAP phage display kit, catalog n0.240612)。從下列文獻(xiàn)中可以找出確實可行的制備和篩選抗體展示文庫的方法和試劑的實例，如Ladner等的美國專利 N0.5223409 ；Kang 等的 PCT 出版物 W092/18619 ；Dower 等的 PCT 出版物 W091/17271 ；Winter 等的 PCT 出版物 W092/20791 ；Markland 等的 PCT 出版物 W092/15679 ；Breitling等的 PCT 出版物 WO 93/01288 ；MaCafferty 等的 PCT 出版物 WO 92/01047 ；Garrard 等的PCT 出版物 WO 92/09690 ；Fuchs 等(1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ；Hay 等(1992)Hum AntibodHydridoma 3:81-85 ；Huse 等(1989)Science 246:1275-1281 ;McCafTerty 等Nature(1990)348:552-554 !Griffiths 等(1993)EMBO J 12:725-734 ；Hawkins 等(1992)J.Mol Biol 226: 889-896 ;Clackson 等(1991)Nature352:624-628 ;Gram 等(1992)PNAS89:3576-3580 ;Garrard 等(1991)Bio/Technology 9:1373-1377 ;Hoogenboom 等(1991)Nuc AcidRes 19:4133-4137 ;以及 Barbas 等(1991)PNAS 88:7978_7982。在一優(yōu)選實施方案中，為了分離具有高親和力以及低解離常數(shù)的與hTNFa結(jié)合的人抗體，首先施用具有高親和力以及低解離常數(shù)的、與hTNFa結(jié)合的鼠抗hTNFa抗體(如MAK195雜交瘤，其保藏號為ECACC87050801)篩選具有相似結(jié)合hTNF α活性的人輕鏈和重鏈序列，所用方法為Hoogenboom等的PCT出版物WO 93/06213中所述的表位印跡方法，該方法中所用文庫優(yōu)選scFv文庫,文庫的制備與篩選參見McCafferty等的PCT出版物WO 92/01047，McCafferty 等 Nature 348:552-554 ;以及 Griffiths 等(1993) EMBO J 12:725-734。優(yōu)選用重組人TNFa作為抗原篩選scFv抗體文庫。一旦篩選出人VH和VL片段，可以進(jìn)行“混合和匹配”實驗，即將選出的不同對的VL和VH片段用于篩選其與hTNF α的結(jié)合，篩選出優(yōu)化的VL/VH對。此外，為進(jìn)一步提高親和力和/或降低從hTNF α的解離常數(shù)，可對優(yōu)選出的VL/VH對的VL和VH片段進(jìn)行隨機(jī)突變，優(yōu)選在VH和/或VL區(qū)的⑶R3區(qū)突變，其過程類似于體內(nèi)體細(xì)胞突變過程，該過程對應(yīng)于天然免疫反應(yīng)中抗體親和力的突變。體外親和力突變可以用分別與VH CDR3和/或VL⑶R3互補(bǔ)的PCR弓丨物來擴(kuò)增VH和VL區(qū)而實現(xiàn)，其中在引物的某位置嵌入隨機(jī)的四核甘酸，這樣獲得的編碼VH和VL的⑶R3區(qū)的PCR產(chǎn)物中就引入了隨機(jī)突變。這些隨機(jī)突變的VH和VL片段再用于hTNFa結(jié)合的篩選，選出具有高親和力以及低解離常數(shù)的與hTNF α結(jié)合的序列。從重組的免疫球蛋白展示文庫中篩選、分離出本發(fā)明的抗hTNFa抗體后，從噬菌體包裝體(如，從噬菌體基因組)中回收編碼選出的抗體核酸序列，然后亞克隆入其它的表達(dá)載體，方法為標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)。如果愿意，可對該核酸可以進(jìn)一步操作，以轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的其它的抗體形式(如與編碼免疫球蛋白的其它結(jié)構(gòu)域的核酸連接，比如恒定區(qū))。為了表達(dá)從聯(lián)合文庫中篩選的重組人抗體，可將編碼抗體的基因克隆入重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入哺乳動物宿主細(xì)胞，這在上面第二部分中已詳細(xì)論述過了。IV.藥物組合物和藥物施用本發(fā)明的抗體和抗體部分可以配伍至給受試者施用的藥物組合物中，適合的方法為本文所述，如每兩周皮下定量施用。通常，藥物組合物包含本發(fā)明的抗體(或抗體部分)和/或氨甲蝶呤以及藥學(xué)上接受的載體。本文所用的“藥學(xué)上可接受的載體”包括任意和全部的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗生素與抗真菌藥物、等滲和吸收緩釋藥物等，這些物質(zhì)是生理學(xué)上相容的、適用于本文所述的給受試者的用藥方法。藥學(xué)上可接受的載體實例包括水、鹽水、磷酸鹽緩沖液、葡萄糖、甘油、乙醇等的一種或多種，以及這些物質(zhì)聯(lián)用。多數(shù)情況下，組合物中優(yōu)選施用的物質(zhì)包括等滲試劑，如糖、多元醇諸如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。藥學(xué)上可接受的載體實例可能進(jìn)一步包含少量的附加物質(zhì)，如增濕或乳化試劑、保護(hù)劑或緩沖液，這些物質(zhì)可以提高抗體或抗體部分的保存限期或有效性。本發(fā)明的組合物可以多種形式出現(xiàn),包括比如液體、半固體和固體劑型,如液體溶液(注射和輸注溶液)，分散劑或懸液，片劑，丸劑，粉劑，脂質(zhì)體以及栓劑。優(yōu)選的形式因施用組合物的預(yù)想模式而定。優(yōu)選的組合物是注射和輸注溶液形式，如類似于用其他抗體被動免疫人時所用的組合物。用藥的優(yōu)選方式是胃腸外方式(如靜脈注射，皮下注射、腹膜注射、肌肉注射)。優(yōu)選實施方案中，通過靜脈注射和輸注方式施用抗體。在另一優(yōu)選實施方案中，通過肌肉注射方式施用抗體。在特別優(yōu)選實施方案中，通過皮下注射方式施用抗體(如每兩周皮下注射方式用藥一次)。治療組合物在制造和存儲時，通常必須是無菌而且穩(wěn)定的。這些組合物可以配制成溶液、微乳化劑、分散劑、脂質(zhì)體或其它適于高濃度施用的預(yù)定結(jié)構(gòu)。無菌注射溶液可通過將活性化合物(抗體或抗體部分)以所需的濃度在合適的溶劑中溶解后，與需要的其它聯(lián)用組分的一種或多種配伍，然后過濾除菌。通常，分散藥劑是通過將活性組分與無菌的載體配伍后制備，載體包含基本的分散基質(zhì)和其它所需的乳化組分。制備無菌注射溶液用的無菌粉末時，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，以獲得含有活性的組分以及前述的過濾的添加組分。溶液適當(dāng)?shù)牧鲃有钥梢酝ㄟ^使用，如卵磷脂等的包衣，或使用分散劑維持所需的顆粒大小或通過使用表面活性劑等維持。延緩注射組分的吸收可以通過在組分中添加延緩吸收的制劑，比如單硬脂酸鹽和凝膠。盡管對于多數(shù) 治療應(yīng)用而言，優(yōu)選的途徑/模式是皮下注射，但本發(fā)明抗體和抗體部分的許多施用方法在本領(lǐng)域內(nèi)都是已知的。如本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員理解的一樣，用藥途徑和/或模式取決于想要的結(jié)果。在某些實施方案中，活性組分與載體制備在一起，載體將阻止化合物的快速釋放，包括比如植入、皮膚貼劑以及微膠囊用藥等可控釋放制劑。生物降解性的、生物兼容性的多聚體，如乙烯乙酸乙烯酯，聚乙二醇(PEG)，聚酐，聚羥乙酸，膠原，polyorthoesters和聚乳酸等都可使用。許多制備這些制劑的方法已經(jīng)申請專利或?qū)Ρ绢I(lǐng)域的技術(shù)人員而言是已知的。參見Sustained and controlled release drugdeli very systems, J.R.Robinson 編著，Marcel Dekker, Inc., New York, 1978。在某些實施方案中，本發(fā)明抗體或抗體部分可以口服，如與無活性的稀釋液或可同化、消化的載體一起?；衔?和其它需要的組分)也可以包在硬或軟的膠囊殼中，壓縮在片劑中或配伍至受試者飲食中。為了口服治療，化合物可以摻入賦形劑，而且以可消化的片劑、咀嚼片、片劑、膠囊、藥液、懸浮液、糖漿、薄膜等方式施用。為了在消化道應(yīng)用，可以用其它物質(zhì)包裹本發(fā)明的化合物或共用施用，以免其失活。附加的活性化合物也可以配制進(jìn)該組合物中。在某些實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種附加治療藥物配伍或共同施用。比如，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以與氨甲蝶呤配伍或共同施用，可以與一種或多種結(jié)合其它抗原的抗體(如，與細(xì)胞因子或細(xì)胞表面分子結(jié)合的抗體)，一種或多種細(xì)胞因子，可溶性TNFa受體(參見PCT出版物TO93/06476)和/或一種或多種抑制hTNFa產(chǎn)生或其活性的化學(xué)物質(zhì)(如PCT出版物WO 93/19750lcyclohexaneyIidene的衍生物)。再者，本發(fā)明的一種或多種抗體可以與前述的兩種或兩種以上的治療劑施用。這類聯(lián)合治療便于施用小劑量的治療劑，因而避免了可能的毒性或與不同的單治療劑施用帶來的相關(guān)問題。本發(fā)明抗體或抗體部分與其它治療藥物的聯(lián)用將在第IV部分中進(jìn)一步詳細(xì)討論。可以與本發(fā)明抗 體或抗體部分聯(lián)用的、治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物非限制性實例包括:非類固醇抗炎性藥物(NSAIDs);細(xì)胞因子抑制性抗炎性藥物(CSAIDs) ;CDP_571/BAY-10-3356 (人源化的抗 TNFa 抗體；Celltech/Bayer) ;cA2(嵌合抗 TNF α 抗體；Centocor) ;75kdTNFR_IgG(75kd 的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Immunex ;參見 Arthritis &Rheumatism(1994)Vol.37，S295 ；J.1nvest.Med.(1996)vol.44，235A) ；55kdTNFR-1gG(55kd的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ;IDEC_CE9.1/SB210396 (非消耗性靈長化抗 CD4 抗體；IDEC/SmithKline ；參見 Arthritis & Rheumatism(1995) Vol.38，S185) ；DAB486-1L-2 和 / 或 DAB389-1L-2 (IL2 融合蛋白；Seragen ；參見 Arthritis &Rheumatism(1993) Vol.36,1223) ;Anti_tac (人源化抗 IL-2R α ；Protein Design Labs/Roche) ；IL-4(抗炎性因子；DNAX/Schering) ； IL-1O (SCH52000 ；重組 ILlO，抗炎性因子；DNAX/Schering) ;IL_4 ;IL_10 和 / 或 IL-4 激動劑(如激動抗體)；IL-1RA(IL-1 受體拮抗劑；Synergen/Amgen) ;TNF_bp/s-TNFR(可溶性 TNF 結(jié)合蛋白；參見 Arthritis& Rheumatism(1996)vol.39, N0.9(supplement), S284；Amer.J.Physiol.-Heart andCirculatory Physiology (1995) vol 268, pp 37-42 ;R974301 (IV 型憐酸二酯酶抑制劑；參見 Arthritis &Rheumatism(1996)vol.39, N0.9(supplement), S282) ;MK_966(C0X-2抑制劑；參見 Arthritis & Rheumatism(1996) vol 39, N0.9 (supplement), S81)；Iloprost (參見 Arthritis & Rheumatism(1996) vol39, N0.9 (supplement), S82);氨甲蝶呤；酞胺哌唳酮(參見 Arthritis& Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement),S282)和酞胺哌啶酮相關(guān)藥物(例如Celgen) ;leflunomide (抗炎性和細(xì)胞因子抑制劑；參見 Arthritis & Rheumatism(1996)vol.39, N0.9(supplement), S131；InflammationResearch (1996) vol.45, pp.103-107);氨甲環(huán)酸(纖溶酶原激活抑制劑，參見Arthritis& Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement)，S284) ;T_614(細(xì)胞因子抑制劑；參JAL Arthritis&Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement), S282);前列腺素 El (參見Arthritis&Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement), S282) ;Tenidap (非類固醇類抗炎藥，參見 Arthritis&Rheumatism (I"6) vol.39, N0.9 (supplement), S280) ；Naproxen (非類固醇類抗炎藥；參見NeuroR印ort (1996) vol.7，pp.1209-1213);美洛昔康(非類固醇類抗炎藥)；布洛芬(非類固醇類抗炎藥)；吡羅昔康(非類固醇類抗炎藥)；二氯芬酸(非類固醇類抗炎藥)；indomethacin(非類固醇類抗炎藥)；水楊酸偶氮磺胺批唳(參JAL Arthritis & Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement), S281);硫唑嘌呤(參見Arthritis & Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement), S281) ;ICE 抑制劑(白介素1β轉(zhuǎn)化酶抑制劑)；zap-70和/或Ick抑制劑(酪氨酸激酶zap-70或Ick抑制劑)；VEGF抑制劑和/或VEGF-R抑制劑(血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子抑制劑或血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體；血管生成抑制劑)；類皮質(zhì)酮抗炎性藥物(例如SB203580) ;TNF蛋白轉(zhuǎn)化酶抑制劑；抗白介素 2 抗體；白介素 11 (參見 Arthritis &Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement)，S296)；白介素 13(參 JAL Arthritis & Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement),S308);白介素 17 (參見 Arthritis&Rheumatism(1996) vol.39, N0.9 (supplement), S120)；gold ;青霉胺；氯奎；羥氯喹；苯丁酸氮芥；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢霉素；全身淋巴放射治療藥物；抗胸腺細(xì)胞球蛋白；抗004抗體；CD5-毒素；口服肽和膠原蛋白；氯苯扎利二鈉；細(xì)胞因子調(diào)控藥物(CRAs) HP228 和 HP466 (Houghten Pharmaceuticals 公司)；ICAM_1 二硫代憐酸酯的反義寡聚脫氧核酸(ISIS2302 ；Isis醫(yī)藥公司);可溶性補(bǔ)體受體I (ΤΡΙΟ ;T細(xì)胞科學(xué)公司)；潑尼松；奧古蛋白；硫酸葡糖胺聚糖；美滿霉素；抗白介素2受體抗體；海產(chǎn)品和植物脂類(魚和植物種子脂肪酸；參見Deluca等(1995)Rheum.Dis.Clin.North Am.21:759-777);金諾芬；保泰松；甲氯芬那酸；氟奮那酸；靜脈用免疫球蛋白；齊留通；麥考酚酸(RS-61443) ；tacrolimus (FK-56);西羅莫司(雷怕霉素);氨普立糖(therafectin);克拉屈濱(2-氯脫氧腺苷)和阿扎立平?？梢耘c本發(fā)明抗體或抗體部分聯(lián)用的、治療炎性腸道疾病的藥物的非限制性實例包括Audenoside ;表皮生長因子；類皮質(zhì)酮；環(huán)孢菌素，水楊酸偶氮磺胺吡啶；氨基水楊酸鹽；巰基嘌呤；硫唑嘌呤；metronidazole ;脂加氧酶抑制劑；氨基水揚(yáng)酸；奧沙拉秦；巴柳氮；抗氧化劑；血栓素抑制劑；白介素I受體拮抗劑；抗白介素1β單抗；抗白介素6單抗；生長因子；彈性蛋白酶抑制劑；吡啶-咪唑化合物；CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNF α 抗體；Celltech/Bayer) ;cA2(嵌合抗 TNFa 抗體；Centocor) ;75kdTNFR_IgG (75kd的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Immunex ;參見 Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37, S295 ；J.1nvest.Med.(1996) vol.44235A) ；55kdTNFR-1gG (55kd 的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ；IL-1O (SCH52000 ；ScheringPlough) ;IL_4 ;IL_10 和 / 或 IL-4 激動劑(如激動抗體)；白介素11 ;葡糖苷酸或葡聚糖連接的潑尼松龍，地塞米松或布德松前藥；ICAM-1 二硫代磷酸酯的反義寡聚脫氧核酸(ISIS2302 ；Isis醫(yī)藥公司)；可溶性補(bǔ)體受體I (ΤΡΙΟ ；T細(xì)胞科學(xué)公司)；緩釋氨基水楊酸；氨甲蝶呤；血小板活化因子(PAF)拮抗劑；環(huán)丙沙星和利諾卡因。 可以與本發(fā)明抗體或抗體部分聯(lián)用的、治療多發(fā)性硬化病的藥物的非限制性實例包括:類皮質(zhì)酮；脫氫皮質(zhì)醇；甲基脫氫皮質(zhì)醇；咪唑硫嘌呤；環(huán)磷酰胺；環(huán)孢菌素；氨甲蝶呤，4-氨基卩比卩定；替托尼定；干擾素-β la(Avonex ;Biogen);干擾素β Ib (Betaseron ；Chiron/Berlex);共聚物 I (Cop-1 ;Copaxone ;Teva Pharmaceutical Industries, Inc.)；高壓氧法；靜脈用免疫球蛋白；clabribine ;CDP-571/BAY-10_3356 (人源化的抗TNF α抗體；Celltech/Bayer) ；cA2 (嵌合抗 TNF α 抗體；Centocor) ;75kdTNFR_IgG (75kd 的TNF 受體-1gG 融合蛋白;Immunex ;參見 Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37, S295 ；J.1nvest.Med.(1996) vol 44235A) ；55kdTNFR-1gG (55kd 的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ;IL_10 ;IL_4 ;IL_10 和 / 或 IL-4 激動劑(如激動抗體)?？梢耘c本發(fā)明抗體或抗體部分聯(lián)用的、治療敗血病的藥物的非限制性實例包括:高滲鹽溶液；抗生素；靜脈用Y免疫球蛋白；連續(xù)血液濾過；K青霉烯(如米諾配能)；如TNF α、IL-1 β、IL6和/或IL8細(xì)胞因子的拮抗劑；CDP-571/BAY-10_3356 (人源化的抗TNF α 抗體；Celltech/Bayer) ;cA2(嵌合抗 TNF α 抗體；Centocor) ;75kdTNFR_IgG (75kd的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Immunex ；參見 Arthritis &Rheumatism(1994) Vol.37,S295 ；J.1nvest.Med.(1996)vol.44，235A) ；55kdTNFR-1gG(55kd 的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Hoffmann_LaRoche);細(xì)胞因子調(diào)控藥物(CRAs) HP228 和 HP466 (HoughtenPharmaceuticals 公司)；SK & F107647 (小分子妝；SmithKline Beecham);四價丙咪腙CN1-1493 (Picower Institute);組織因子途徑抑制劑(TFPI ；Chiron) ;PHP(化學(xué)修飾的血色素；APEX Bioscience);鐵鰲合劑和鰲合物，包括二乙撐三胺五乙酸-鐵(III)復(fù)合物(DTPA鐵(III) ；MolichemMedicines);利索茶堿(合成的小分子甲基黃嘌呤；CellTherapeutics公司)；PGG_葡聚糖(水溶性的β 1，3葡聚糖；Alpha_Beta技術(shù)公司)；載脂的載脂蛋白A-1 ;手性異羥肟酸(合成的能夠抑制脂質(zhì)A生物合成的抗菌素)；抗內(nèi)毒素抗體；E5531 (合成的脂質(zhì)A拮抗劑；EisaiAmerica公司)；rBPI21 (重組的人殺菌/滲透性增強(qiáng)蛋白的N末端片段)；以及合成的抗內(nèi)毒素肽(SAEP ;BiosYnth研究實驗室)。可以與本 發(fā)明抗體或抗體部分聯(lián)用的、治療成人呼吸窘迫綜合征的藥物的非限制性實例包括:抗IL-8抗體；表面活性劑替代療法；CDP-571/BAY-10-3356(人源化的抗TNF α 抗體；Celltech/Bayer) ;cA2(嵌合抗 TNFa 抗體；Centocor) ;75kdTNFR_IgG (75kd的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Immunex ;參見 Arthritis & Rheumatism(1994) Vol.37, S295 ；J.1nvest.Med.(1996) vol.44235A) ；55kdTNFR-1gG (55kd 的 TNF 受體-1gG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche)。本發(fā)明藥物組合物包含“治療有效量”或“預(yù)防有效量”的本發(fā)明抗體或抗體部分?！爸委熡行Я俊笔侵冈谝欢▌┝亢捅匦璧囊欢螘r間下，有效地達(dá)到預(yù)期的治療效果的量。抗體或抗體部分的治療有效總量可根據(jù)如疾病狀態(tài)、年齡、性別或個體體重以及抗體或抗體部分在每個個體內(nèi)誘導(dǎo)預(yù)期反應(yīng)的能力等因素而不同。治療有效量同時也是一種抗體或抗體部分治療效果要大于其帶來的任何毒性或有害性的劑量?！邦A(yù)防有效量”是指在一定劑量和必需的一段時間下，有效地達(dá)到預(yù)期的預(yù)防效果的量。通常，由于預(yù)防用藥是預(yù)先或在發(fā)病的早期給受試者用藥，所以預(yù)防有效量低于治療有效量。用藥方案可以調(diào)整以達(dá)到最佳效果(如治療或預(yù)防效果)。比如，一次大劑量用藥、一段時間內(nèi)分幾次用藥或根據(jù)治療情形的緊迫程度按比例減少或增加劑量。以劑量單位形式配制的胃腸外組合物施用方便、劑量統(tǒng)一，這是其最大的優(yōu)點。本文所用的劑量單位形式是指:不連續(xù)劑量，且該劑量是適于給哺乳動物受試者治療用的單個劑量單位；每個單位含有預(yù)定量的活性化合物，與所需的藥學(xué)載體一起，預(yù)計可以產(chǎn)生預(yù)期的治療效果。本發(fā)明的劑量單位方式直接由下列因素確定和決定:(a)活性化合物的特性，要達(dá)到的確切的治療或預(yù)防效果；(b)化合物領(lǐng)域的內(nèi)在限制，如一種活性化合物對每個個體治療的敏感性。例如，本發(fā)明抗體或抗體部分的治療或預(yù)防有效量的非限制性范圍是10 100毫克，較優(yōu)選的是20 80毫克，最優(yōu)選的約40毫克。應(yīng)當(dāng)注意劑量值可隨要緩解的病情類型以及嚴(yán)重程度變化而變化。對于確切的個體，在一段時間內(nèi)按照個體需要以及施用藥物的人或監(jiān)督用藥人的專業(yè)判斷，用藥方案應(yīng)當(dāng)調(diào)整，這都是應(yīng)當(dāng)能夠理解的，本文提供的劑量范圍僅是實例性的，并不是對所保護(hù)組合物的范圍或應(yīng)用的限制。V.本發(fā)明抗體的應(yīng)用本發(fā)明抗hTNFa抗體或其部分，具有結(jié)合hTNF α的活性，因此用常規(guī)的免疫學(xué)檢測方法可檢測hTNFa (如血清或血漿等生物樣本中的)，所述免疫學(xué)檢測方法如酶聯(lián)免疫吸附檢測法(ELISA)、放免檢測( RIA)或免疫組織化學(xué)檢測。本發(fā)明提供了檢測生物樣本中hTNFa的方法，這些方法包括檢測與抗體或抗體部分作用的生物樣本和檢測與hTNFa結(jié)合的或不結(jié)合的抗體或抗體部分，進(jìn)而檢測生物樣品中的hTNFa。抗體可以用可檢測的底物直接或間接標(biāo)記，利于檢測結(jié)合或未結(jié)合的抗體。可用的可檢測底物包括各種酶、互補(bǔ)基團(tuán)、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。適用的酶的實例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適用的互補(bǔ)基團(tuán)實例包括鏈親和素/生物素和親和素/生物素；適用的熒光物質(zhì)實例包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪氨熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的一個實例包括魯米諾；適用的放射性物質(zhì)包括1251、1311、35S 或 3Η。除標(biāo)記抗體外，生物體液中的hTNF α可以用競爭性免疫檢測法檢測，該方法使用標(biāo)記了可檢測物質(zhì)的重組人TNF α作為標(biāo)準(zhǔn)和未標(biāo)記的抗TNF α抗體。在該檢測中，生物樣品、標(biāo)記的rhTNFa標(biāo)準(zhǔn)品和抗TNFa抗體結(jié)合聯(lián)用，測定結(jié)合至未標(biāo)記抗體的、標(biāo)記的rhTNF α的量，生物樣品中的hTNF α的量與結(jié)合在抗TNF α抗體上的標(biāo)記的TNF α的量呈反比。本發(fā)明的D2E7抗體也可以用于檢測來源于非人的其它種的TNFa，尤其是來源于靈長類(如黑猩猩，狒狒，絨，獼猴和恒河猴)以及豬和鼠的TNFa，因為D2E7能夠與這些TNFa結(jié)合。本發(fā)明的抗體和抗體部分能夠在體內(nèi)外中和hTNFa的活性(參見美國專利N0.6090382)。而且至少本發(fā)明的某些抗體，如D2E7抗體，能夠中和其它物種的hTNF α。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分可用于抑制hTNFa活性，如在含hTNFa的細(xì)胞培養(yǎng)物、以及具有與本發(fā)明抗體交叉反應(yīng)的TNFa的人或其它哺乳動物(如黑猩猩，狒狒，絨，獼猴和恒河猴以及豬和鼠)中。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了抑制TNFa活性的方法，該方法包含施用本發(fā)明的抗體或抗體部分與TNFa作用，從而抑制TNFa活性。優(yōu)選的TNFa是人TNFa。例如，在含有或懷疑含有TNFa的細(xì)胞培養(yǎng)物中，可將本發(fā)明的抗體或抗體部分加入培養(yǎng)液中以抑制其中hTNFa活性。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了治療失調(diào)的方法，其中施用抗TNFa抗體是有益的，所述方法包括每兩周給受試者皮下施用一次本發(fā)明的抗體或抗體部分，來治療疾病。在特別優(yōu)選的實施方案中，抗體的施用是按每兩周皮下施用一次抗體。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，施用氨甲蝶呤前，施用過程中和施用后，皮下施用抗體。優(yōu)選的受試者是人。此外，受試者可以是表達(dá)與本發(fā)明的抗體交叉反應(yīng)的TNFa的哺乳動物。受試者也可以是引入hTNFa的哺乳動物(如施用hTNF α或表達(dá)hTNF α轉(zhuǎn)基因的動物)。本發(fā)明的抗體為治療目的而給人受試者施用(下面進(jìn)一步討論)。本發(fā)明的抗體也可為醫(yī)治動物目的而給表達(dá)TNFa的非人哺乳動物(如靈長類、豬或鼠)施用，該動物表達(dá)的TNFa與所用抗體有交叉反應(yīng)，或作為人類疾病的一種動物模型而施用。對于后者，這種動物模型對于評價本發(fā)明抗體的療效是有用的(如測試施用劑量和時間)。本文所用的術(shù)語“一種失調(diào)，其中施用抗TNFa抗體是有益的”包括下列疾病或其它失調(diào)，即該病患者體內(nèi)的TNFa的存在是或懷疑是該病病理學(xué)的發(fā)病原因或?qū)υ摬夯鹱饔?，或者已有證據(jù)表明另一種抗TNFa抗體或其抗體部分成功用于治療該疾病。因此，由于TNF α活性有害致病的一種疾病，是一種可通過抑制TNF α活性預(yù)期能夠緩解該病癥狀和/或進(jìn)程的疾病。這類疾病可被證明，如，患這種疾病的患者個體的生物體液中的TNF α濃度增高(如患者的血清、血漿、滑液等的TNF α濃度升高)，這一特點可以用如上所述的抗TNF α抗體檢測。不少疾病中TNFa活性有害。下面將進(jìn)一步討論治療特定疾病中的抗體或抗體部分的施用:A.敗血癥腫瘤壞死因子在敗血癥的病理學(xué)中的作用和生物學(xué)效應(yīng)已經(jīng)確定，這些生物學(xué)效應(yīng)包含血壓過低，心肌抑制，血管泄漏綜合癥，器官壞死，刺激有害的第二介質(zhì)的釋放和激活凝血過程(參見 Tracey 和 Cerami 等(1994)Annu Rev Med 45:491-503 ；Russell,D.和ThompsonR.C.等(1993) Curr.0pin.Biotech.4:714-721)。因此，本發(fā)明人抗體或抗體部分可用于治療任何臨床發(fā)病的敗血癥，包括感染性休克、內(nèi)毒素性休克、革蘭氏陰性膿毒癥和中毒性休克綜合征。此外，為了治療 敗血癥，本發(fā)明的抗TNFa抗體或抗體部分可以與一種或多種其它可進(jìn)一步緩解敗血癥的治療藥物聯(lián)用，這些藥物如白介素I抑制劑(如PCT出版物W092/16221和W092/17583)，細(xì)胞因子白介素6 (參見PCT出版物W093/11793)或血小板活化因子的拮抗劑(參見歐洲專利申請出版物EP374510)。另外，在優(yōu)選的實施方案中，給患敗血癥的個體施用本發(fā)明的抗TNF α抗體或抗體部分時，其血清或血漿IL6濃度達(dá)到500pg/ml以上，較優(yōu)選的為1000pg/ml。B.自身免疫性疾病腫瘤壞死因子在各種自身免疫性疾病的病理學(xué)中起一定的作用。比如，TNFa參與了組織炎癥的激活和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中關(guān)節(jié)的破壞(參見Tracey和Cerami,見上；ArendW.P.和Dayer J-M(1995)ArthRheum.38:151-160 ;Fava R.A.等(1993)Clin Exp Tmmunol ,94:261-266)。TNF α也參與了糖尿病患者體內(nèi)胰島細(xì)胞死亡的啟動以及調(diào)控胰島素抗性(參見上述Tracey和Cerami ;PCT出版物WO 94/08609)。TNFa也參與了多發(fā)性硬化癥患者體內(nèi)，對少突膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞毒性的介導(dǎo)和誘導(dǎo)炎癥斑塊(參見上述Tracey和Cerami)。嵌合抗體和人源化鼠抗hTNFa抗體已經(jīng)通過了臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的實驗(參見 Elliott M.J.等(1994)Lancet 344:1125-1127 ;Elliott M.J.等(1994)Lancet 344:1105-1110 ；Rankin E.C.等(1995)Br.J.Rheumatol.34:334-342)。本發(fā)明的人抗體或抗體部分可用于治療自身免疫性疾病，尤其是那些與炎癥有關(guān)的疾病，包括類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，類類風(fēng)濕性脊椎炎，骨關(guān)節(jié)炎，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化癥，自免性糖尿病，自免性色素層炎和腎病綜合征。雖然對某種疾病，在炎癥部位局部施用抗體或抗體部分(在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)部位局部用藥或給糖尿病性潰瘍局部涂藥，單獨(dú)或與環(huán)己烷亞基衍生物聯(lián)用，如PCT出版物W093/19751所述)是有效的，但通常為系統(tǒng)用藥。C.傳染病在多種傳染病觀察到:腫瘤壞死因子參與了介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)。比如，TNFa與瘧疾中腦部炎癥和毛細(xì)血管血栓以及梗塞有關(guān)(參見上述Tracey和Cerami) ；TNFa也與腦膜炎中腦部炎癥有關(guān)，包括血腦屏障障礙，觸發(fā)感染性休克以及激活靜脈栓塞(參見上述Tracey和Cerami) ；TNFa也與獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)中的惡疾、激活病毒復(fù)制以及介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷有關(guān)(參見上述Tracey和Cerami);因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分可用于治療的傳染病，包括細(xì)菌性腦膜炎(參見歐洲專利申請出版物EP585705)，腦型瘧，艾滋病和艾滋病相關(guān)復(fù)征(ARC)(參見歐洲專利申請出版物EP230574)，以及移植后的巨細(xì)胞病毒感染(參見Fietze E等(1994)Transplanation58:675-80)。本發(fā)明的抗體或抗體部分也可用于緩解與傳染病相關(guān)的癥狀，包括感染(如流感)所致的發(fā)熱和肌痛以及感染后的惡疾(AIDS或ARC后繼發(fā)的)D.移植腫瘤壞死因子是同種移植排斥和移植物抗宿主疾病(GVHD)的關(guān)鍵因素，并且介導(dǎo)一種有害反應(yīng)，這種反應(yīng)在施用直接與T細(xì)胞受體CD3結(jié)合的大鼠抗體0KT3可抑制腎移植排斥反應(yīng)中觀察到(參見上述Tracey和Cerami ；Eason, J.D.等(1995) Transplanation59:300-305 ；Suthanthiran Μ.和 Strom T.B.(1994) New Engl.J.Med.331:365-75)。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分可用 于抑制移植排斥，包括同種異體移植排斥和異種移植排斥以及抑制GVHD。雖然本發(fā)明的抗體或抗體部分可以單獨(dú)施用，但優(yōu)選與一種或多種能夠抑制同種異體移植排斥或抑制GVHD的藥物聯(lián)用。比如，在某一實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分可以與0KT3聯(lián)用，抑制0KT3誘導(dǎo)的反應(yīng)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種抗體聯(lián)用，其中聯(lián)用的抗體直接與其它調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的靶標(biāo)結(jié)合，t匕如細(xì)胞表面分子 CD25 (白介素 2 受體-α )，CDlla (LFA-1)，CD54 (ICAM-1)，CD4，CD45, CD28/CTLA4，⑶80(Β7-1)和/或⑶86 (Β7-2)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體或抗體部分與一種或多種通用的免疫抑制劑如環(huán)磷酰胺A或FK506聯(lián)用。Ε.惡性腫瘤腫瘤壞死因子與惡性腫瘤所致的惡疾、刺激腫瘤生長、增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移可能性以及介導(dǎo)的惡性腫瘤細(xì)胞毒性有關(guān)(參見上述Tracey和Cerami)。因此，本發(fā)明的抗體或抗體部分可用于惡性腫瘤治療，抑制腫瘤生長或轉(zhuǎn)移和/或緩解腫瘤后的惡疾。本發(fā)明的抗體或抗體部分可以系統(tǒng)施用或在腫瘤部位局部用藥。F.肺病腫瘤壞死因子與成人呼吸窘迫綜合征的病理學(xué)有關(guān)，包括白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞活化，導(dǎo)致對肺細(xì)胞的細(xì)胞毒性以及誘導(dǎo)血管泄漏綜合癥(參見上述Tracey和Cerami)。因而，本發(fā)明的抗體或抗體部分可用于治療不同的肺病，包括成人呼吸窘迫綜合征(參見PCT出版物W091/04054)，肺休克，慢性肺炎，肺部肉狀瘤病，肺纖維化和硅肺病。抗體或抗體部分可以系統(tǒng)施用和在肺部表面局部施用，如作為氣溶劑施用。G.腸道疾病腫瘤壞死因子與炎性腸道疾病的病理學(xué)有關(guān)(參見Tracy，K.J.等(1986)SCienCe234:470-474 ；Sun X-M 等(1998)J.Clin.1nvest.81:1328-1331 ;MacDonald T.T.等(1990) Clin.Exp.1mmunol.81:301-305)。嵌合的鼠抗TNF α抗體已經(jīng)通過治療局限性腸炎臨床實驗(vanDullemen H.Μ.等(1995)Gastroenterology 109:129-135)。本發(fā)明的人抗TNF α抗體或抗體部分也可用于治療腸道疾病，如特發(fā)性腸道炎癥，包括局限性腸炎和潰瘍性結(jié)腸炎。H.心臟疾病本發(fā)明的抗體或抗體部分也可以用于治療各種心臟病，包括心臟缺血(參見歐洲專利申請出版物ΕΡ453898)和心衰(心肌衰弱)(參見PCT出版物W094/20139)。1.其它疾病

本發(fā)明的抗體或抗體部分也可用于治療其它的疾病，這些疾病中TNFa的活性有害。這些疾病和失調(diào)的與TNFa參與了疾病的病理學(xué)有關(guān)，因此可以應(yīng)用本發(fā)明的抗體或抗體部分治療，其實例包括炎性骨失調(diào)和骨吸收障礙(參見Bertolini D.R.等(1986)Nature 319:516-518 ；Konig A.等(1998)J.Bone Miner.Res.3:621-627 ；Lerner,U.H.和Ohlin A(1993) J.Bone Miner.Res.8:147-155 ;和 Shanker G.和 Stern，P.H.(1993)Bone14:871-876)，肝炎，包括酒精性肝炎(參見McClain C.J.和Cohen D.A.(1989)Hepatology9:349-351 ；Felver Μ.E.等(1990)Alcohol.Clin.Exp.Res.14:255-259 ;和 HansenJ.等，Hepatology20:461-474)和病毒性肝炎(參見 Sheron, N.等(1991) J.Hepatol.12:241-245 ;和 Hussain M.J.等(1994) J.Clin.Pathol.47:1112-1115)，凝血障礙(參見 vander Poll, T.等(1990)N.Engl.J.Med.322:1622-1627 ;和 van der Poll, T.等(1991)Prog.Clin.Biol.Res.367:55-60)，燒傷(參見 Giroir，B.P.等(1994) Am.J.Physiol.267:H118-124 ;和 Liu X.S.等(1994)Burns 20:40-44)，再輸注損傷(參見 Scales，W.E.等(1994) Am.J.Physiol.267:G1122-1127 ；Serrick, C.等(1994) Transplanation 58:1158-1162 ;和 Yao Y.M.等(1995) Resuscitation 29:157-168)，瘢痕瘤形成(參見McCauley R.L.等(1992) J Clin Immunoll2:300-308),癒痕組織形成和發(fā)熱。本發(fā)明將通過下面的實施例進(jìn)一步闡明，但這些實施例不應(yīng)當(dāng)解釋為一種限制。本發(fā)明中所引用的參考文獻(xiàn)、專利以及公開的專利申請的內(nèi)容，在本文中引入作為參考。實施例1用抗TNF α抗體治療皮下施用D2E7后的效力本研究中，24例患活動類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎每周施用一次施用D2E7抗體(η = 18)或安慰劑(η = 6)，劑量為0.5毫克/公斤，途徑為皮下注射，時間達(dá)3個月。參與本研究的患者平均患病10.1年，在治療前疾病活動分值(DAS)為4.87和平均3.4DMARDs (diseasemodifying ant1-rheumatic drugs);這又相當(dāng)大的程度上反映了疾病的活動度。用D2E7抗體治療有反應(yīng)的患者，繼續(xù)公開標(biāo)記(open-label)的治療；而對0.5毫克/公斤劑量沒有反應(yīng)或失去了 DAS反應(yīng)患者，在本研究進(jìn)行12周后提高至I毫克/公斤，途徑仍是皮下注射。第一位參加的患者接受60次注射,并持續(xù)60周的研究。皮下注射劑量效率與靜脈注射相似。在治療的第一周內(nèi)，高達(dá)78%的患者達(dá)到DAS和ACR20反應(yīng)。以0.5毫克/毫升劑量皮下施用D2E712周，與基線相比，有54%的關(guān)節(jié)腫脹(SWJ)減輕，關(guān)節(jié)壓痛(CRP)61%減輕，CRP減輕39%，而所有的指標(biāo)與安慰劑組相比都升高。完成本研究的安慰劑對照期后，患者持續(xù)用維持效力的抗體治療長達(dá)14個月。因此這些結(jié)果表明:皮下施用D2E7，劑量為0.5毫克/公斤/周，可以安全地自己施用，而且局部耐受性不錯。施用D2E7和氨甲蝶呤本研究中，患者除施用正在施用的(氨甲蝶呤)MTX外，接受皮下或靜脈注射安慰劑或D2E7，劑量為I毫克/公斤。54位患者參加本研究，18位接受D2E7和安慰劑靜脈注射，18位接受靜脈注射安慰劑和皮下注射D2E7，18位患者接受靜脈或皮下注射安慰劑?；颊邇H在他們無可見反應(yīng)狀態(tài)時，接受第二劑量藥物，但第一劑量后不得早于4周。此后，所有患者都接受公開標(biāo)記的每兩周一次皮下注射D2E7抗體。本研究的研究總體統(tǒng)計學(xué)特征包括:平均患類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎11.1年，用藥前平均3.6DMARDS (不是氨甲蝶呤)和本研究開始時DAS平均為4.81。到29天時，72%靜脈注射D2E7治療患者和44%皮下注射D2E7治療患者獲得了 DAS標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，相比較而言，安慰劑治療的患者只有28%患者達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)(見圖5)、本研究有反應(yīng)的患者中，至29天時28%安慰劑治療患者維持ACR20反應(yīng)，而對應(yīng)的有72%靜脈注射D2E7治療患者和67%皮下注射D2E7治療患者，他們的ACR20反應(yīng)持續(xù)一至三個月。實施例2皮下施用抗TNF α抗體的全身劑量每周皮下施用一次D2E7本研究有284名類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者參加，設(shè)計目的為確定皮下施用D2E7的、優(yōu)化全身劑量?；颊呙恐茈S機(jī)接受20，40或80毫克的D2E7或安慰劑，施用12周。安慰劑治療后的患者轉(zhuǎn)用D2E7，劑量為40毫克/周。接近49%的患者在施用20毫克時達(dá)到ACR20，55 %的患者在施用40毫克時達(dá)到ACR20，54%的患者在施用80毫克時達(dá)到ACR20(見圖1A)。接近23%的患者在施用20毫克時達(dá)到ACR50，27%的患者在施用40毫克時達(dá)到ACR50，20%的患者在施用80毫克時達(dá)到ACR50，而接受安慰劑的患者僅有2%達(dá)到ACR50。這些資料表明說明，皮下施用D2E7，尤其在劑量為40毫克/周時，獲得良好的反應(yīng)。實施例3:每兩周皮下施用一次抗TNF α抗體每兩周皮下施用一次D2E7以不同的劑量在隔周皮下(s.c.)施用安慰劑或D2E7并持續(xù)與MTX聯(lián)用24周后，研究對氨甲蝶呤部分反應(yīng)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的臨床效果、安全性、免疫原性和耐受性。研究設(shè)計對氨甲蝶呤效果不明顯或?qū)ζ淠褪艿念愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者，進(jìn)行有安慰劑對照、雙盲、隨機(jī)、多中心的研究。在試驗期間，患者持續(xù)施用恒定劑量的氨甲蝶呤，以及按照下面所述的特定的內(nèi)在標(biāo)準(zhǔn)的劑量范圍。本研究由兩部分組成:1)在施用第一劑量的藥物前四周為一段“藥力消散期”，在此期間DNARDs (氨甲蝶呤除外)消退；(二)“安慰劑控制期”，在此期間67位患者隨機(jī)分配成四組接受安慰劑，20毫克、40毫克、80毫克的D2E7 (作為全身總劑量)的治療，隔周皮下給藥，用藥長達(dá)24周。每個劑量的研究藥物分兩次皮下注射，注射劑量位1.6ml/次?；颊叩谝淮斡盟幱舍t(yī)務(wù)人員給藥，并作為培訓(xùn)患者的一個環(huán)節(jié)。隨后在醫(yī)務(wù)人員的直接觀察下由患者自己用藥四周。此后，在研究地點外由患者自己、或由患者指定的受訓(xùn)人員或醫(yī)務(wù)人員用藥。每次臨床評估后分發(fā)給患者4或5周的藥量?；颊哌B續(xù)在第一、二、三、四、六、八、十二、十六、二十和二十四周進(jìn)行關(guān)節(jié)檢查，檢查由不知情的、與治療醫(yī)生無關(guān)的輔助人員進(jìn)行。本研究有271名類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者參加。本研究的總體適度的代表了北美嚴(yán)重類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的情況:70%女性，大部分年齡超過40歲。該總體有本領(lǐng)域中技術(shù)人員根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)選擇出來，如患者必須接受類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的診斷，按照1987年修訂的美國風(fēng)濕學(xué)會(ACR)標(biāo)準(zhǔn)定義來診斷(參見附錄A)結(jié)果圖1B和2-4表明每兩周皮下施用一次D2E7，且與氨甲蝶呤聯(lián)用，在24周內(nèi)減輕類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎征兆和癥狀方面明顯好于安慰劑。統(tǒng)計分析表明，所有D2E7三種劑量與每周施用安慰劑相比明顯有效，而且40和80毫克劑量的D2E7比20毫克劑量效率更高。等價方案本領(lǐng)域內(nèi)的那些技術(shù)人員，將認(rèn)識到或僅通過常規(guī)的試驗就能夠確定有許多和本發(fā)明所述特定方法等價的方案。這類等價方案包括在下面的權(quán)利要求中。附錄A類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的ACR定義

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)的1987年分類標(biāo)準(zhǔn)和功能
權(quán)利要求
1.一種試劑盒,它包含: a)—種預(yù)裝注射器，其包含作為每兩周一次劑量的40mg的人抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分，和藥學(xué)上可接受的載體，并且是適合皮下給藥的形式，其中所述人抗TNF a抗體包含輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)，該輕鏈可變區(qū)具有包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的⑶Rl結(jié)構(gòu)域，且該重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的⑶R3結(jié)構(gòu)域，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的⑶R2結(jié)構(gòu)域和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的CDRl結(jié)構(gòu)域；和 b)每兩周皮下施用一次所述人抗TNFa抗體或其抗原結(jié)合部分以治療可用抗TNF a抗體治療的自身免疫性疾病或腸道失調(diào)的說明。
2.權(quán)利要求1中的試劑盒，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分為具有輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR)的人抗TNF a抗體或其抗原結(jié)合部分，該輕鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:I的氨基酸序列，該重鏈可變區(qū)包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求1中的試劑盒，其中所述抗體或其抗原結(jié)合部分是抗體D2E7。
4.權(quán)利要求1-3之任一項中的試劑盒，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分具有IgGl或和IgG4重鏈恒定區(qū)。
5.權(quán)利要求1-3之任一項中的試劑盒，其中所述人抗體或其抗原結(jié)合部分是Fab片段或單鏈Fv片段。
6.權(quán)利要求1-5之任一項中的試劑盒，還包含至少一種另外的治療劑。
7.權(quán)利要求6中的試劑盒 ，其中所述另外的治療劑選自非類固醇抗炎性藥物(NSAID)、細(xì)胞因子抑制性抗炎性藥物和抗炎細(xì)胞因子。
8.權(quán)利要求7中的試劑盒,其中所述NSAID選自tenidap、naproxen、美洛昔康、布洛芬、卩比羅昔康和indomethacin。
9.權(quán)利要求6中的試劑盒，其中所述另外的治療劑是氨甲蝶呤。
10.權(quán)利要求6中的試劑盒，其中所述另外的治療劑選自白介素-1抑制劑、0KT3、抗⑶25抗體、抗⑶11 a抗體、抗⑶54抗體、抗⑶54抗體、抗⑶45抗體、抗⑶28抗體、抗⑶80抗體、抗 CD86 抗體、CDP-571/BAY-10-3356、cA2、75kdTNFR-1gG、55kdTNFR_IgG、IDEC-CE9.1/SB210396、DAB486-1L-2、DAB389-1L-2、抗-Tac、IL4、IL-10、IL-4 激動劑、IL-10 激動劑、IL-1RA、TNF-bp/s-TNFR、R974301、MK-966、Iloprost、酞胺哌啶酮、酞胺哌啶酮相關(guān)藥物、leflunomide、氨甲環(huán)酸、T-614、前列腺素El、tenidap、naproxen、美洛昔康、布洛芬、卩比羅昔康、二氯芬酸、indomethacin、水楊酸偶氮磺胺批唳、硫唑嘌呤、ICE抑制劑、zap-7抑制齊U、Ick抑制劑、VEGF抑制劑、VEGF-R抑制劑、皮質(zhì)類固醇、TNF蛋白轉(zhuǎn)化酶抑制劑、抗白介素-12抗體、白介素11、白介素13、白介素17抑制劑、gold、青霉胺、氯奎、輕氯喹、苯丁酸氮芥、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、全身淋巴放射治療藥物、抗胸腺細(xì)胞球蛋白、抗CD4抗體、CD5-毒素、口服肽、膠原蛋白、氯苯扎利二鈉、細(xì)胞因子調(diào)控藥物HP228、細(xì)胞因子調(diào)控藥物HP466、ICAM-1 二硫代磷酸酯的反義寡聚脫氧核酸、可溶性補(bǔ)體受體1、潑尼松、奧古蛋白、硫酸葡糖胺聚糖、美滿霉素、抗白介素2受體抗體、海產(chǎn)品脂類、植物脂類、金諾芬、保泰松、甲氯芬那酸、氟奮那酸、靜脈用免疫球蛋白、齊留通、麥考酚酸、taCTolimus、西羅莫司、氨普立糖、克拉屈濱、阿扎立平、budenoside、表皮生長因子、氨基水楊酸鹽、6-巰基嘌呤、metronidazole、脂加氧酶抑制劑、氨基水楊酸、奧沙拉秦、巴柳氮、抗氧化劑、血栓素抑制劑、白介素I受體拮抗劑、抗白介素IP單抗、抗白介素6單抗、生長因子、彈性蛋白酶抑制劑、吡啶-咪唑化合物、葡糖苷酸或葡聚糖連接的潑尼松龍、地塞米松、葡聚糖連接的潑尼松龍前藥、緩釋氨基水楊酸、血小板活化因子(PAF)拮抗劑、環(huán)丙沙星、利諾卡因、脫氫皮質(zhì)醇、甲基脫氫皮質(zhì)醇、環(huán)磷酰胺、4-氨基吡啶、替托尼定、干擾素Pla、干擾素Plb、共聚物1、高壓氧法、靜脈用免疫球蛋白、clabribine、高滲鹽溶液、抗生素、靜脈用、免疫球蛋白、連續(xù)血液濾過、K青霉烯、如TNFa、IL-1 P、IL6和/或IL8細(xì)胞因子的拮抗劑、SK&F107647、四價丙咪腙CN1-1493、組織因子途徑抑制劑、PHP、鐵鰲合劑和鰲合物、二乙撐三胺五乙酸-鐵(III)復(fù)合物、 利索茶堿、PGG-葡聚糖、載脂的載脂蛋白A-1、手性異羥肟酸、抗內(nèi)毒素抗體、E5531、rBPI21、SyNSAIDtic抗內(nèi)毒素肽、表面活性劑替代療法和抗IL-8抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了治療其中TNFα活性是有害的失調(diào)的方法，所述方法是通過每兩周皮下施用人抗體，優(yōu)選重組人抗體而進(jìn)行的，所述抗體特異性地結(jié)合人腫瘤壞死因子α(hTNFα)?？贵w可以與氨甲蝶呤一起施用或不一起施用。這些抗體對hTNFα有高的親和力(例如Kd＝10-8M或更低)，低的解離速率(例如Koff＝10-3/秒或更低)和體外、體內(nèi)中和hTNFα活性。本發(fā)明的抗體可以是全長抗體或其抗原結(jié)合部分。本發(fā)明也包括含有藥物組合物的和施用說明的試劑盒，和含有藥物組合物的預(yù)裝的注射器。
文檔編號A61P1/16GK103110944SQ201210574409
公開日2013年5月22日 申請日期2002年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者J·肯佩尼, R·維斯, S·A·菲斯科夫 申請人:艾博特生物技術(shù)有限公司