一種ApoB100酵母重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種ApoB100酵母重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用，該酵母重組疫苗以酵母作為宿主細胞，轉(zhuǎn)染包含ApoB100基因片段的真核表達載體；所述的ApoB100基因片段的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的真核表達載體為JMB88-HA-OVA-hApoB100。該酵母重組疫苗通過口服的方式飼喂，能夠在酵母中被硫酸銅誘導(dǎo)下表達OVA-hApoB融合蛋白，并在體內(nèi)被裂解釋放，經(jīng)過抗原呈遞引起集體的體液和細胞免疫反應(yīng)，達到緩解和治療動脈粥樣硬化的目的，可應(yīng)用于動脈粥樣硬化的藥物的制備。
【專利說明】—種ApoBIOO酵母重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種Ap0BlOO酵母重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]在21世紀，心腦血管疾病已經(jīng)成為人類健康的第一殺手，動脈粥樣硬化(atheroma)是一組稱為動脈硬化的血管病中常見的最重要的一種，多由脂肪代謝紊亂、神經(jīng)血管功能失調(diào)引起，是由遺傳、環(huán)境等多因素導(dǎo)致的老年多發(fā)性疾病，常導(dǎo)致血栓形成、供血障礙等，近年來有逐漸年輕化和上升趨勢。在眾多的發(fā)病因素中，脂質(zhì)代謝紊亂，尤其是聞膽固醇血癥與其關(guān)系最為密切。
[0003]脂蛋白在人類動脈粥樣硬化(As)形成及進展過程中起主要作用，它是由脂質(zhì)及載脂蛋白(Apo)構(gòu)成。載脂蛋白在脂蛋白的代謝過程中起關(guān)鍵作用，主要分為A、B、C、D、E五類。載脂蛋白E是血漿脂蛋白的重要成分，它的主要機能是作為乳糜微粒(CM)殘粒受體和低密度脂蛋白(LDL)受體的配體，在脂質(zhì)殘粒的代謝中起重要作用，對脂質(zhì)的運輸和代謝發(fā)揮主要作用。有研究表明，載脂蛋白E (ApoE)基因缺陷小鼠無論正?；蛘吒咧嬍尘尚纬蓢乐氐母哐Y及AS，其病變的發(fā)展同人類極其相似，故常被用于研究AS發(fā)病機制以及抗AS病理學(xué)研究。載脂蛋白B (ApoB)為人體主要的載脂蛋白，為乳糜微粒(CM)、及低密度脂蛋白(VLDL)、中間密度脂蛋白、低密度脂蛋白(LDL)的構(gòu)成成分，在脂類轉(zhuǎn)運和代謝過程中起著極其重要的作用。人體含有兩型ApoB分子，ApoBIOO參與VLDL的裝配與分泌。在血液中，VLDL可代謝轉(zhuǎn)化為富含膽固醇的LDL。每個LDL顆粒上僅含一分子ApoBIOO，是唯一的蛋白成分，同時也介導(dǎo)80%的LDL與受體結(jié)合使之被清除體外。ApoB48為CM合成和分泌所必需，參與外源性脂質(zhì)的消化、吸收和運輸。目前ApoB已被鎖定為促使動脈粥樣硬化(AS)與冠心病(CAD)的危險因子。
[0004]已研究發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)與動脈粥樣硬化的發(fā)病相關(guān)，因此使用免疫抑制以及接種疫苗成為治療動脈粥樣硬化的新方法。許多研究證實，大部分免疫抑制藥物對心血管的危險因素(包括血脂異常、高血壓病、糖尿病)均有負面作用。因此，限制了該類藥物在抗動脈粥樣硬化上的應(yīng)用。免疫接種常用的方法就是通過接種疫苗，暴露抗原誘導(dǎo)機體免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抗體。最近，臨床上正在嘗試使用免疫接種疫苗的方法治療非感染性疾病，包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、I型糖尿病和Alzheimer’ s病等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明解決的問題在于提供一種ApoBIOO酵母重組疫苗及其制備方法和應(yīng)用，通過基因工程發(fā)酵酵母疫苗遞呈抗原ApoBIOO，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體，有助于動脈粥樣等慢性炎癥性疾病的防治。
[0006]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn):
[0007]一種ApoBIOO酵母重組疫苗，該酵母重組疫苗以酵母作為宿主細胞，轉(zhuǎn)染包含Ap0BlOO基因片段的真核表達載體。
[0008]所述的ΑροΒΙΟΟ基因片段的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
[0009]所述的真核表達載體為JMB88-HA-0VA-hApoB100，是將ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS載體中的OVA的下游而得到的；
[0010]所述的酵母為酵母JMY1。
[0011]該酵母重組疫苗能夠表達OVA-ApoBlOO融合蛋白，并將表達的ΑροΒΙΟΟ肽遞呈給抗原遞呈細胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對ΑροΒΙΟΟ的抗體。
[0012]該酵母重組疫苗能夠表達ΑροΒΙΟΟ肽，并將表達的ΑροΒΙΟΟ肽遞呈給抗原遞呈細胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對ΑροΒΙΟΟ的抗體。
[0013]一種真核表達載體，該真核表達載體為JMB88-HA-0VA-hApoB100，是將ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS載體中而得到的。
[0014]一種ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗的制備方法，包括以下操作:
[0015]I)以人基因組為模板克隆ΑροΒΙΟΟ基因片段，并將ΑροΒΙΟΟ基因克隆到真核表達載體JMB88-HA-0VA-MCS當中，構(gòu)建真核表達載體JMB88-0VA_hApoB100 ；
[0016]2)將真核表達載體JMB88-0VA_hApoB100轉(zhuǎn)染到酵母菌株當中，并篩選陽性克隆；
[0017]3)將陽性克隆接種到液體SD培養(yǎng)基中，當細胞最佳密度達到OD6tltl=0.5時加入
0.5mM的硫酸銅溶液進行誘導(dǎo)表達；
`[0018]4)誘導(dǎo)表達后離心收集酵母細胞并進行洗滌，然后將酵母細胞在56°C滅活lh，得到ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗。
[0019]所述的真核表達載體JMB88-0VA_hApoB100的構(gòu)建包括:
[0020]以人基因組DNA為模板，以上游引物hApoB-F、下游引物hApoB-R為引物對擴增ΑροΒΙΟΟ基因片段，Bgl II /Xho I雙酶切得到的ΑροΒΙΟΟ基因片段，并與經(jīng)同樣雙酶切后的酵母真核表達載體JMB88-HA-0VA-MCS連接，16°C連接過夜，構(gòu)建質(zhì)粒JMB88-HA-0VA-hApoB100o
[0021]所述的真核表達載體JMB88-0VA-hApoB100是通過LiAc/ssDNA的方法轉(zhuǎn)染到酵母菌株JMYl當中，然后將轉(zhuǎn)染后的菌體均勻涂布并在基本SD固體培養(yǎng)基上進行篩選。
[0022]所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗在制備防治冠心病、動脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
[0023]所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗在制備降低低密度脂蛋白膽固醇、提高高密度脂蛋白膽固醇藥物中的應(yīng)用。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0025]1、本所述基因工程發(fā)酵酵母含有真核基因表達盒(如CUPl-ApoBlOO):真核基因表達盒可以整合在酵母基因組或者作為酵母質(zhì)粒隨酵母細胞進行復(fù)制。應(yīng)用該基因工程酵母飼喂買7周齡雄性ApoE基因缺陷型(ApoE-/-)小鼠，免疫12周后能夠在小鼠血清中檢測到特異性抗體的產(chǎn)生。本發(fā)明應(yīng)用基因工程酵母作為表達和運輸外援蛋白的載體，靶向調(diào)控機體體液和細胞免疫反應(yīng)，能夠應(yīng)用于治療自身免疫疾病和新型口服疫苗開發(fā)和生產(chǎn)，并且能夠終生保護機體對抗特的定病理反應(yīng)。
[0026]2、本發(fā)明構(gòu)建含有真核啟動子的酵母表達載體的JMB88-HA-0VA-hApoB100，并將該載體轉(zhuǎn)化到釀酒酵母中。通過口服的方式飼喂小鼠，由于載體具有真核表達系統(tǒng)，能夠在酵母中被硫酸銅誘導(dǎo)下表達OVA-hApoBlOO融合蛋白(其中OVA為雞卵清蛋白，表達后能提高抗原的免疫原性，用于增加抗原蛋白的刺激機體產(chǎn)生抗體的能力)，并在體內(nèi)被裂解釋放，經(jīng)過抗原呈遞引起集體的體液和細胞免疫反應(yīng)，達到緩解和治療動脈粥樣硬化的目的，可應(yīng)用于動脈粥樣硬化的藥物的制備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為人ΑροΒΙΟΟ基因片段的PCR擴增電泳圖；
[0028]圖2為JMB88-HA-0VA-MCS載體的質(zhì)粒圖譜；
[0029]圖3為JMB88-0VA_hApoB酵母表達載體的質(zhì)粒圖譜；
[0030]圖4為真核表達載體JMB88-HA-0VA-hApoB100的雙酶切鑒定圖；
[0031]圖5 酵母菌株 JMYl 中 HA-0VA-hApoB100、HA-OVA 融合蛋白表達的 Western blot檢測結(jié)果圖；
[0032]圖6為Western blot檢測各組小鼠血清中的ΑροΒΙΟΟ抗體的結(jié)果圖；
[0033]圖7為Western blot檢測hApoBlOO特異性抗體與apoE基因缺陷小鼠、昆白小鼠自身ΑροΒΙΟΟ之間的特異性免疫反應(yīng)；
[0034]圖8為ELISA檢測各組小鼠血清ΑροΒΙΟΟ特異性抗體的滴度；
[0035]圖9為測定各組小鼠 血清中TC、TG、HDL-C和LDL-C的濃度結(jié)果圖；
[0036]圖10為分離成功的心臟樣本示意圖；
[0037]圖11為小鼠動脈瓣膜冰凍切片油紅O染色結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0038]免疫反應(yīng)與動脈粥樣硬化的發(fā)病相關(guān)，因此使用免疫抑制以及接種疫苗成為治療動脈粥樣硬化的新方法。然而許多研究證實，大部分免疫抑制藥物對心血管的危險因素(包括血脂異常、高血壓病、糖尿病)均有負面作用。因此，限制了該類藥物在抗動脈粥樣硬化上的應(yīng)用。
[0039]鑒于ApoB已被鎖定為促使動脈粥樣硬化(AS)與冠心病(CAD)的危險因子，且根據(jù)文獻報道用ΑροΒΙΟΟ的ρ143和ρ210肽段免疫高脂飼喂的ApoE基因缺陷型小鼠，它們能夠抑制降主動脈上動脈粥樣硬化病變。故本發(fā)明了一種針對ΑροΒ100ρ210肽段的新型重組酵母疫苗，驗證重組酵母ΑροΒ100ρ210作為降低主動脈粥樣硬化病變的可能性。利用酵母本身具有佐劑的作用和易于表達抗原蛋白并遞呈抗原的特性，將表達的外源ΑροΒ100ρ210肽段遞呈給機體的抗原遞呈細胞(APC)--樹突狀細胞(DCs)，從而誘導(dǎo)機體有效的保護性免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對ΑροΒΙΟΟ的抗體。結(jié)果表明將本發(fā)明所制備的酵母疫苗口服免疫的方法讓小鼠產(chǎn)生針對外源蛋白ΑροΒΙΟΟ的特異性抗體，從而調(diào)節(jié)小鼠本身的ΑροΒΙΟΟ水平，以達到治療或者預(yù)防動脈粥樣樣硬化的疾病的目的。
[0040]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合人基因組ΑροΒΙΟΟ基因的具體試驗例對本發(fā)明由口服基因工程發(fā)酵酵母表達外源基因的方法(即通過口服基因工程發(fā)酵酵母向小鼠體內(nèi)靶向運送功能基因片段的方法)作進一步的說明。下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0041]1、酵母真核表達載體JMB88-HA-0VA-hApoB100的構(gòu)建[0042]首先利用PCR體外擴增人基因組外顯子上的一個859bp的片段，包含CVX_210_H肽段。
[0043]I)引物設(shè)計與合成
[0044]以人基因組DNA為模板，利用Clone ManagerV7軟件進行引物設(shè)計，設(shè)計能夠特異擴增p210肽段的引物hApoB-F和hApoB-R，并在上游引物hApoB_F中引入Bgl II酶切位點，下游引物hApoB-R中引入Xho I酶切位點。序列設(shè)計如下:
[0045]hApoB-F:GGGAGATCTATAGACTTCCTGAATAACTATGCA ；
[0046]hApoB-R:GGGCTCGAGTTGGTATTCAGTGTGATGACACTTG ；
[0047]其中:hApoB-F引物序列中下劃線部分為Bgl II酶切位點；hApoB-R引物序列中下劃線部分為Xho I酶切位點。
[0048]2、PCR擴增人基因ΑροΒΙΟΟ目的片段
[0049]以人基因組DNA為模板，hApoB-F和hApoB-R為引物，PCR擴增人ΑροΒΙΟΟ基因片段，PCR反應(yīng)體系為如表2所述，反應(yīng)條件為:95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，56°C退火30s, 72°C延伸50s, 30個循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
[0050]表2ApoB 100PCR 體系
[0051]

Componentvolume
人基因組dmTTl
hApoB-FIuL
hApoB-RIuL

IOTaq Buffer5 μ L

2.5mmol/L dNTPs4 μ L

Taq:pfu=4:10.5 μ L
Εβ37.5uL
[0052]PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小正確結(jié)果如圖1所示，其中。泳道I為Trans2K Plus DNA Marker;泳道2，3為人ΑροΒΙΟΟ基因片段的PCR擴增產(chǎn)物。
[0053]3、構(gòu)建酵母表達載體 JMB88-0VA_hApoB100
[0054]Bgl II /Xho I雙酶切膠回收得到的目的片段(酶切體系如表3所示)與經(jīng)同樣雙酶切后的酵母真核表達載體JMB88-HA-0VA-MCS連接，酶切體系如表4)，連接體系如表5，16°C連接過夜，構(gòu)建質(zhì)粒JMB88-HA-0VA-hApoB100，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，涂LB/Amp平板，挑取單克隆并在LB/Amp液體培養(yǎng) 基中37°C培養(yǎng)8h。
[0055]JMB88-HA-0VA-MCS載體的質(zhì)粒圖譜如圖2所示，包括amp、TRP 1、CUP1-P及0VA，其中OVA為雞卵清蛋白的CDS序列，表達后能提高抗原的免疫原性，用于增加抗原蛋白的刺激機體產(chǎn)生抗體的能力；其核苷酸的序列如SEQ.1D.N0.2所示。[0056]所構(gòu)建的JMB88-0VA_hApoB酵母表達載體的質(zhì)粒圖譜如圖3所示，可以看到該酵母表達載體是CUPl啟動子，ΑροΒΙΟΟ插入到OVA的下游，含有真核基因表達盒CUPl-ΑροΒΙΟΟ，能夠表達OVA-hApoB融合蛋白，真核基因表達盒可以整合在酵母基因組或者作為酵母質(zhì)粒隨酵母細胞進行復(fù)制。
[0057]所構(gòu)建的JMB88-0VA_hApoB酵母表達載體能夠在酵母中被硫酸銅誘導(dǎo)下表達OVA-hApoB融合蛋白，并在體內(nèi)被裂解釋放，經(jīng)過抗原呈遞引起集體的體液和細胞免疫反應(yīng)。
[0058]提取質(zhì)粒JMB88-HA-0VA-hApoB100，并經(jīng)Bgl II /Xho I雙酶切鑒定，結(jié)果如圖4所示，其中泳道 I 為 DNA Marker;泳道為 2，3，4.JMB88-HA-0VA-hApoB100 經(jīng) Bglll/Xho I雙酶切的產(chǎn)物。送陽性質(zhì)粒到Invitrogen公司進行測序分析,其中hApoBlOO的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示，保存測序正確的質(zhì)粒備用。
[0059]表3hApoB100Bgl II和Xho I雙酶切反應(yīng)體系
[0060]
【權(quán)利要求】
1.一種Ap0BlOO酵母重組疫苗，其特征在于，該酵母重組疫苗以酵母作為宿主細胞，轉(zhuǎn)染包含Ap0BlOO基因片段的真核表達載體。
2.如權(quán)利要求1所述的Ap0BlOO酵母重組疫苗，其特征在于，所述的Ap0BlOO基因片段的核苷酸序列如SEQ.1D.N0.1所示。
3.如權(quán)利要求1或2所述的Ap0BlOO酵母重組疫苗，其特征在于，所述的真核表達載體為JMB88-HA-0VA-hApoB100，是將ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS載體中的OVA的下游而得到的； 所述的酵母為酵母JMYl。
4.如權(quán)利要求3所述的Ap0BlOO酵母重組疫苗，其特征在于，該酵母重組疫苗能夠表達OVA-ApoBlOO融合蛋白，并將表達的Ap0BlOO肽遞呈給抗原遞呈細胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生針對ΑροΒΙΟΟ的抗體。
5.一種真核表達載體，其特征在于，該真核表達載體為JMB88-HA-0VA-hApoB100，是將ΑροΒΙΟΟ基因片段克隆到JMB88-HA-0VA-MCS載體中而得到的。
6.一種ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗的制備方法，其特征在于，包括以下操作: O以人基因組為模板克隆ΑροΒΙΟΟ基因片段，并將ΑροΒΙΟΟ基因克隆到真核表達載體JMB88-HA-0VA-MCS 當中，構(gòu)建真核表達載體 JMB88-0VA_hApoB ； 2)將真核表達載體JMB88-0VA-hApoB100轉(zhuǎn)染到酵母菌株當中，并篩選陽性克隆； 3)將陽性克隆接種到液體SD培養(yǎng)基中，當細胞最佳密度達到0.5時加入0.5mM的硫酸銅溶液進行誘導(dǎo)表達； 4)誘導(dǎo)表達后離心收集酵母細胞并進行洗滌，然后將酵母細胞在56°C滅活lh，得到ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗。
7.如權(quán)利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗的制備方法，其特征在于，所述的真核表達載體JMB88-0VA-hApoB100的構(gòu)建包括: 以人基因組DNA為模板，以上游引物hApoB-F、下游引物hApoB-R為引物對擴增ΑροΒΙΟΟ基因片段，Bgl II /Xho I雙酶切得到的ΑροΒΙΟΟ基因片段，并與經(jīng)同樣雙酶切后的酵母真核表達載體JMB88-HA-0VA-MCS連接，16°C連接過夜，構(gòu)建質(zhì)粒JMB88-HA-0VA-hApoB100o
8.如權(quán)利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗的制備方法，其特征在于，所述的真核表達載體JMB88-0VA-hApoB100是通過LiAc的方法轉(zhuǎn)染到酵母菌株JMYl當中，然后將轉(zhuǎn)染后的菌體均勻涂布并在基本SD固體培養(yǎng)基上進行篩選。
9.權(quán)利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗在制備防治冠心病、動脈粥樣硬化的藥物中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1所述的ΑροΒΙΟΟ酵母重組疫苗在制備降低低密度脂蛋白膽固醇、提高高密度脂蛋白膽固醇藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P3/06GK103520713SQ201310485936
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月16日
【發(fā)明者】張智英, 麻麗霞, 李欣憶, 張婷婷, 張優(yōu)優(yōu), 劉中天 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)