強(qiáng)心苷化合物在非小細(xì)胞肺癌治療中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及強(qiáng)心苷化合物在非小細(xì)胞肺癌治療中的應(yīng)用。具體地，本發(fā)明涉及強(qiáng)心苷化合物在在制備用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途，所述非小細(xì)胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細(xì)胞肺癌。
【專利說明】強(qiáng)心苷化合物在非小細(xì)胞肺癌治療中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及強(qiáng)心苷化合物在非小細(xì)胞肺癌治療中的應(yīng)用的【技術(shù)領(lǐng)域】。具體地，本發(fā)明涉及強(qiáng)心苷化合物在制備用于治療酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]肺癌是肺組織內(nèi)細(xì)胞生長失去控制而導(dǎo)致的一種疾病。在過去的半個多世紀(jì)中，肺癌的發(fā)病率和死亡率逐年增加，已經(jīng)從20世紀(jì)初的一種罕見疾病發(fā)展為當(dāng)今的全球頭號癌癥殺手。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)定期公布的資料，肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界各國尤其是發(fā)達(dá)國家呈明顯的上升趨勢，已經(jīng)成為許多發(fā)達(dá)國家最常見的腫瘤，位列男性常見惡性腫瘤第一位和女性常見惡性腫瘤第二位，并且成為惡性腫瘤中最常見的死亡原因。在我國，男性肺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為47.51/10萬，女性肺癌年齡標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率為22.69/10萬，并且呈逐年增加的趨勢，參見，She J, Yang P, Hong Q,等人Lung cancer inChina: challenges and interventions [J].Chest.2013，143 (4): 1117-1126。預(yù)計(jì)到 2025年，我國每年僅死于肺癌的人數(shù)就將接近100萬，成為世界第一肺癌大國。
[0003]根據(jù)肺癌細(xì)胞的分化程度和形態(tài)特征，臨床上將其分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non-small lung cancer, NSCLC)兩類，其中非小細(xì)胞肺癌占到85%左右。根據(jù)預(yù)后情況，幾種非小細(xì)胞肺癌又可以歸為三類:鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。盡管診斷方法和治療手段都有了很大的進(jìn)步，70%的NSCLC患者在初次確診時大多已處于III B/ IV期，其中約40%的患者失去手術(shù)治療的機(jī)會，5年生存率往往低于5%，參見MolinaJ R, Yang P,Cassivi S D,等人 Non-small cell lung cancer: epidemiology, riskfactors, treatment, and survivorship [J].Mayo Clin Proc.2008，83 (5): 584-594。因此，針對該疾病分子起源和疾病發(fā)生發(fā)展過程的研究，對其預(yù)防和治療具有重要意義。
[0004]與其他類型的癌癥相似，NSCLC的發(fā)病機(jī)制也是十分復(fù)雜的。盡管人們投入了大量的人力和財(cái)力嘗試從不同角度去解釋NSCLC的發(fā)生發(fā)展，但是到目前為止，NSCLC和其他腫瘤一樣被認(rèn)為沒有一個單一的致病機(jī)理，它往往是遺傳和環(huán)境等多個因素復(fù)雜作用的結(jié)果。目前對于NSCLC的研究以遺傳層面最為深入。人們對NSCLC的致病機(jī)理在分子和細(xì)胞層面上進(jìn)行了大量的研究，逐步闡明了該疾病的分子起源和發(fā)生發(fā)展過程?？偨Y(jié)起來，NSCLC的發(fā)生主要是由于一些細(xì)胞信號通路的改變，包括細(xì)胞生長促進(jìn)基因的過度激活和細(xì)胞生長抑制基因的失活。NSCLC的四種主要致病突變?yōu)?，EGFR突變、K-RAS突變、p53突變、MET突變。
[0005]在錯過手術(shù)治療的機(jī)會后,化療成為NSCLC治療的一種傳統(tǒng)方法。然而化療不僅給患者帶來很大的痛苦，更重要的是它并不能從實(shí)質(zhì)上改變大多數(shù)NSCLC患者的最終結(jié)局。近年來，隨著對NSCLC致病機(jī)理研究的深入，人們開始發(fā)展以細(xì)胞受體、關(guān)鍵基因和調(diào)控分子為靶點(diǎn)的分子靶向治療。目前，全球有80余種靶向治療的藥物正在研究中，其中以表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)和腫瘤血管內(nèi)皮生成因子受體(vascular endothelial growth factor, VEGFR)為作用革巴點(diǎn)的藥物占 60% 以上。
[0006]EGFR是I型跨膜酪氨酸激酶生長因子受體，定位于細(xì)胞膜，分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)3個部分。胞外區(qū)為配體結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)為一個單獨(dú)的螺旋，胞內(nèi)區(qū)包括一個酪氨酸激酶區(qū)及幾個酪氨酸磷酸化的羧基末端。EGFR與配體結(jié)合后，將它們的酪氨酸激酶區(qū)域緊密連接，介導(dǎo)羧基端磷酸化位點(diǎn)磷酸化，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞的增生、分化、粘附、血管生成和抑制細(xì)胞凋亡。目前以EGFR為靶點(diǎn)的藥物分為2類:一類為小分子的酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI),其通過競爭性結(jié)合酪氨酸激酶區(qū)的磷酸化位點(diǎn)來抑制該位點(diǎn)的磷酸化以實(shí)現(xiàn)阻斷EGFR信號傳導(dǎo)；另一類為單克隆抗體，通過阻斷胞膜外配體結(jié)合區(qū)而抑制EGFR活化。TKI類藥物主要有吉非替尼和厄羅替尼。吉非替尼是首個針對EGFR酪氨酸激酶的口服藥物，從2003年開始被FDA批準(zhǔn)用于I臨床治療肺癌。它能特異性作用于EGFR酪氨酸激酶，阻斷EGFR信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，切斷惡性腫瘤的形成過程中最重要的環(huán)節(jié)，從而起到抗腫瘤的作用，同時具有非細(xì)胞毒性和靶向性，對免疫系統(tǒng)無抑制作用，參見羅湘江，馬濤，尹清云.吉非替尼分子靶向治療晚期肺腺癌23例臨床觀察[J]中國腫瘤臨床.2009(12):672-674。厄羅替尼屬于新型低相對分子質(zhì)量的李哪唑啉復(fù)合化物，可與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)位于酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)區(qū)的三磷腺苷特異性結(jié)合，有效抑制酪氨酸激酶活性及下游信號傳導(dǎo)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移，降低腫瘤細(xì)胞黏附能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，參見Bareschino M A, Schettino C，Troiani T,等人Erlotinib in cancertreatment [J].Ann Oncol.2007, 18Suppl6:135_i41。厄羅替尼還可誘導(dǎo)細(xì)胞周期抑制蛋白P27的表達(dá)，使癌細(xì)胞阻滯于Gl期，體外實(shí)驗(yàn)觀察到用藥后可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。除了 TKI類藥物，目前臨床上以EGFR為靶點(diǎn)的藥物還有西妥昔單抗，它是第I個獲準(zhǔn)上市的特異性針對EGFR的IgGl單克隆抗體，能與EGFR的胞外配體結(jié)合域結(jié)合，從而阻斷下游信號傳導(dǎo)通路。研究證實(shí)，將西妥昔單抗聯(lián)合含鉬化療方案作為表達(dá)EGFR的NSCLC患者的一線治療，有明顯療效。
[0007]此外，VEGFR也是NSCLC分子靶向治療的一個主要作用點(diǎn)。血管的生成在肺癌形成、生長和轉(zhuǎn)移過程 中發(fā)揮著重要作用，而在促進(jìn)血管生成的多種細(xì)胞因子和生長因子中血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其受體尤為重要。抑制血管生長因子可拮抗腫瘤血管生長，達(dá)到抑制腫瘤的目的。目前以VEGFR為靶點(diǎn)的藥物包括:貝伐單抗和重組人血管內(nèi)皮抑制素。貝伐單抗是一種重組人源化的抗VEGF抗體，是首個進(jìn)入臨床的抑制血管生長的藥物。它通過與VEGF結(jié)合，阻止和減弱VEGF與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新生血管生長，起到抗腫瘤作用。作為VEGFR，貝伐單抗的優(yōu)勢有:靶點(diǎn)直接暴于血液中，便于藥物直接作用；靶點(diǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定，不易產(chǎn)生抗藥性；
[0008]無需考慮腫瘤組織學(xué)特性；可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移；有下游放大效應(yīng)[38]。重組人血管內(nèi)皮抑制素(recombinant human endostatin, rh-ET)的作用機(jī)制是與VEGFR結(jié)合阻止VEGF引發(fā)的促血管生成活性，特異性地抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖，從而阻斷肺癌細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)。目前，臨床應(yīng)用較多的內(nèi)皮抑素抗腫瘤血管生長藥物是恩度。但其成本較高，臨床應(yīng)用受限。
[0009]如前文所述，EGFR-TKI是用于NSCLC分子靶向治療的一類重要藥物，其中以吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)為代表的EGFR-TKI目前被廣泛用于NSCLC的臨床治療，并且取得了非常好的療效。但是在臨床應(yīng)用中，大部分患者對EGFR-TKI的治療并不敏感，或開始對該類藥物高度敏感但經(jīng)過約10-14個月的中位無疾病進(jìn)展生存期(progression free survival, PFS)后最終產(chǎn)生耐藥參見 Paz-Ares L, MoecksJ, Klughammer B.Reply to Watkins and Rukazenkov(J Cell Mol Med2010)，re-Letter ofResponse to manuscript entitled’Clinical outcomes in NSCLC patients with EGFRmutations:pooled analysis’(Paz-Ares 等人.，J Cell Mol Med.2010; 14(1-2):51-69)[J].J Cell Mol Med.2011，15(5):1225.，使該類藥物的臨床應(yīng)用受到一定限制。因此，關(guān)于NSCLC EGFR-TKI耐藥機(jī)制的研究對于選擇性個體化治療、克服或逆轉(zhuǎn)耐藥具有重要意義。目前認(rèn)為NSCLC對EGFR-TKI的耐藥性可以分為原發(fā)性耐藥和獲得性耐藥。
[0010]原發(fā)性耐藥是指TKI在治療初期就對腫瘤細(xì)胞無明顯作用，應(yīng)用該藥物治療后病情未得到緩解，臨床治療未取得明顯療效。EGFR基因在不同種群中表現(xiàn)出不同的突變率，在亞洲NSCLC患者中其突變率為20%_30%，而在高加索NSCLC患者中為10%_15%參見SequistL V, Bell D W，Lynch T J, et al.Molecular predictors of response to epidermalgrowth factor receptor antagonists in non-small-cell lung cancer[J].J ClinOncol.2007, 25(5): 587-595。研究表明，吉非替尼或厄洛替尼對EGFR突變的NSCLC患者的治療有效率為70%-80%，而對野生型患者的有效率僅10%-20%參見Mitsudomi T, YatabeY.Mutations of the epidermal growth factor receptor gene and related genes asdeterminants of epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitorssensitivity in lung cancer [J].Cancer Sc1.2007，98 (12): 1817-1824。顯然，NSCLC 患者對EGFR-TKI具有原發(fā)性耐藥。研究顯示某些EGFR突變可以引起NSCLC對EGFR-TKI耐藥，如治療前存在EGFR20外顯子插入突變可導(dǎo)致原發(fā)性耐藥參見Greulich H, Chen T H, Fengff, et al.0ncogenic transformation by inhibitor-sensitive and—resistant EGFRmutants [J].PLoS Med.2005, 2(11): e313。其機(jī)制可能是由于突變形成了空間位阻，使吉非替尼及厄洛替尼無法與TKs區(qū)結(jié)合，大大地降低了藥物的敏感性。此外，K-Ras突變也可能與這種原發(fā)性耐藥有關(guān)。BR.21安慰劑對照試驗(yàn)對K-Ras與EGFR基因型厄洛替尼治療效果的影響進(jìn)行了評估。結(jié)果顯示，K-Ras野生型患者(HR=0.69，P=0.03)可從厄洛替尼治療中獲得統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的生 存益處，而KRAS突變型(HR=L 67，P=0.31)則沒有，參見Zhu C Q, DaCSG, Ding K, et al.Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinibin National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group Study BR.21[J].JClin Oncol.2008，26(26):4268-4275.。此外，有數(shù)據(jù)表明 Met 激活與 EGFR-TKI 原發(fā)性耐藥有關(guān)，與MET原癌基因擴(kuò)增是相互獨(dú)立的。
[0011]EGFR-TKI獲得性耐藥產(chǎn)生的機(jī)制主要包括EGFR基因的二次突變和MET基因的擴(kuò)增。2005年Kobayashi等提出EGFR 二次突變可能是引起EGFR-TKI獲得性耐藥的主要原因，參見 Kobayashi S，Boggon T J, Dayaram T, et al.EGFR mutation and resistance ofnon-small-cell lung cancer to gefitinib[J].N Engl J Med.2005，352(8):786-792。這一理論目前在國際上已經(jīng)被廣泛認(rèn)可。該研究發(fā)現(xiàn)，EGFR基因的第二次突變發(fā)生在20號外顯子，為T790M突變，即酪氨酸激酶活性結(jié)構(gòu)域上790位的蘇氨酸殘基被甲硫氨酸取代，從而形成空間位阻，增加了 EGFR與ATP之間的親和力，同時減弱了與EGFR-TKI的親和力，致使吉非替尼和厄洛替尼不能有效抑制EGFR。原癌基因MET擴(kuò)增也是導(dǎo)致EGFR-TKI獲得性耐藥性的一個重要原因。MET是肝細(xì)胞生長因子(HGF)/分散因子的一種高親和力的酪氨酸激酶受體，被激活后發(fā)生自身磷酸化，引起多種底物蛋白磷化和細(xì)胞內(nèi)一系列信號傳導(dǎo)，激活MAPK-ERKI /2及P13K_Akt等信號通路，促進(jìn)多種瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。2007年Engelman等發(fā)現(xiàn)MET擴(kuò)增可以通過ErbB3使PI3K通路持續(xù)激活，從而繞過受抑制的EGFR祀點(diǎn)而產(chǎn)生耐藥性，參見Engelman J A, Zejnullahu K, MitsudomiT, et al.MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer byactivating ERBB3signaling[J].Science.2007，316 (5827): 1039-104.。TKI 獲得性耐藥的NSCLC患者中，約30%-40%既無繼發(fā)突變，也無MET擴(kuò)增，這部分患者的耐藥機(jī)制正在進(jìn)一步研究。可能的機(jī)制包括=EGFR-TKI誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞膜表面EGFR/IGF1R異源二聚體化進(jìn)而激活膜島素樣生長因子I受體(insulin-like growth factorlreceptor, IGF-1R)及其下游信號通路MAPK和P13K/AKT的轉(zhuǎn)導(dǎo)，并能刺激mTOR介導(dǎo)的survivin蛋白合成引發(fā)抗凋亡效應(yīng)，從而引起肺癌患者對TKI耐藥，參見Morgillo F，Kim W Y，Kim E S，等人.Implication of the insulin-like growth factor-1R pathway in the resistanceof non-small cell lung cancer cells to treatment with gefitinib[J].Clin CancerRes.2007, 13(9):2795-2803 ;PTEN基因表達(dá)喪失可活化PI3K/Akt/mT0R信號通路，導(dǎo)致凋亡抵抗，促進(jìn)癌癥的發(fā)生，進(jìn)而對EGFR-TKI產(chǎn)生耐藥，參見Sos M L, Koker M, Weir B A，等A.PTEN loss contributes to erlotinib resistance in EGFR-mutant lung cancer byactivation of Akt and EGFR[J].Cancer Res.2009，69(8):3256-3261。
[0012]NSCLC治療過程中EGFR-TKI的原發(fā)與獲得性耐藥問題已經(jīng)極大地限制了其在該疾病治療中的應(yīng)用。因此對其耐藥機(jī)制的深入研究，尋找克服耐藥的治療方法，已經(jīng)成為NSCLC研究領(lǐng)域的迫切任務(wù)。隨著基礎(chǔ)研究和臨床實(shí)驗(yàn)的不斷深入，EGFR-TKI藥物耐藥機(jī)制逐漸清晰，越來越多的針對腫瘤耐藥機(jī)制或作用于其它相關(guān)信號通路的靶向藥物逐漸進(jìn)入臨床，并取得一定療效。
[0013]目前，用于克服EGFR-TKI耐藥的策略主要有2種:一是研發(fā)第二代TKI，如不可逆的EGFR抑制劑；二是聯(lián)合應(yīng)用或者單用多靶點(diǎn)藥物，同時阻斷多種信號通路。
[0014]EGFR-TKI耐 藥性NSCLC患者的臨床治療應(yīng)該采取多種治療方案相結(jié)合，以求達(dá)到最優(yōu)的治療效果。例如，隨著對EGFR-TKI原發(fā)性和獲得性耐藥機(jī)制的不斷深入探討，與EGFR-TKI療效有關(guān)的分子生物標(biāo)記及其之間的相互關(guān)系已經(jīng)越來越明了，臨床上可以根據(jù)這些分子標(biāo)記物選擇適合的患者接受TKI治療，進(jìn)一步提高NSCLC的療效和生存，最大限度地避免無效的治療。
[0015]強(qiáng)心苷是一類從被子植物中提取的有機(jī)化合物。早在1500多年前，富含該類化合物的植物就被人們用于墮胎、催吐、利尿、心臟滋補(bǔ)等醫(yī)療目的。1775年，英國生理學(xué)家William Withering發(fā)現(xiàn)毛地黃的提取物可以顯著改善充血性心力衰竭病人的癥狀,并證明該提取物中所含的強(qiáng)心苷如歐夾竹桃苷和地高辛可以提高心臟收縮并控制心房顫抖。從此，強(qiáng)心苷作為一種藥物正式用于現(xiàn)代醫(yī)療。
[0016]實(shí)際上，強(qiáng)心苷的抗腫瘤作用在體內(nèi)也得到證實(shí)。早在十幾年前，Inada就首先在DMBA與TPA誘導(dǎo)的小鼠皮膚瘤和4NQ0與甘油誘導(dǎo)的小鼠肺癌中證明，洋地黃毒苷可以抑制月中瘤的形成，參見 Inada A, Nakanishi T, Konoshima T, et al.Ant1-tumor promotingactivities of natural products.11.1nhibitory effects of digitoxin on two-stagecarcinogenesis of mouse skin tumors and mouse pulmonary tumors[J].Biol PharmBull.1993，16(9):930_931。與此同時，在Afaq等人關(guān)于夾竹桃苷對皮膚瘤抑制作用的研究中，夾竹桃苷在TPA誘導(dǎo)前半小時使用可以時間依賴型地抑制腫瘤的生成，參見Prassas
I,Diamandis E P.Novel therapeutic applications of cardiac glycosides[J].Nat RevDrug Discov.2008，7(11):926_935。Svensson 證明地高辛是 SH-SY5Y 和 Neuro_2a 細(xì)胞系小鼠移植瘤的特異抑制劑。Han等人研究了蟾毒靈在人肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤上的作用，發(fā)現(xiàn)無毒性濃度的蟾毒靈可以誘導(dǎo)移植腫瘤細(xì)胞的凋亡。這些體內(nèi)研究不斷增強(qiáng)著我們將強(qiáng)心苷用于癌癥治療的信心。令人鼓舞的是，基于強(qiáng)心苷的抗癌藥物也已經(jīng)開始臨床試驗(yàn)。
[0017]本實(shí)驗(yàn)室采取藥物篩選的策略，對一個所含藥物大部分已獲FDA批準(zhǔn)的藥物文庫進(jìn)行篩選，希望得到可以提高NSCLC吉非替尼敏感性的藥物。這不僅避免了現(xiàn)有聯(lián)合應(yīng)用多靶點(diǎn)藥物的偏向性，更重要的是，由于篩選出的藥物在安全性、毒理和作用機(jī)制方面都比較清楚，將可以大大減少研發(fā)投入和研發(fā)時間。經(jīng)過前期篩選，初步確定強(qiáng)心苷藥物吉妥辛可以提高NSCLC耐藥性細(xì)胞系H1975的吉非替尼敏感性。
[0018]本研究首先對前期的篩選結(jié)果在多個耐藥性NSCLC細(xì)胞系中進(jìn)行了驗(yàn)證。同時，考慮到強(qiáng)心苷藥物在腫瘤抑制方面的作用，本研究還評價了強(qiáng)心苷中的其他化合物對NSCLC細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響。結(jié)果顯示，強(qiáng)心苷中的吉妥辛(Gitoxin)和洋地黃毒苷(Digitoxin)可以顯著提高NSCLC的吉非替尼敏感性。同時，我們對吉妥辛/洋地黃毒苷與吉非替尼在H1975和H1650中的藥物相互作用進(jìn)行了評價，發(fā)現(xiàn)這兩種藥物都可以和吉非替尼協(xié)同性地抑制耐藥性NSCLC細(xì)胞的生長，并促進(jìn)其凋亡。此外，我們對其分子機(jī)制進(jìn)行了初步研究，發(fā)現(xiàn)吉妥辛/洋地黃毒苷與吉非替尼對NSCLC的協(xié)同性抑制可能是通過協(xié)同性抑制Erk信號通路實(shí)現(xiàn)的。
[0019]最后，在研究中，我們發(fā)現(xiàn)相同濃度強(qiáng)心苷藥物吉妥辛可以比吉非替尼更有效地抑制NSCLC耐藥細(xì)胞的生長并促進(jìn)其凋亡。而且，小鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)顯示，吉妥辛可以有效抑制小鼠移植瘤的生長。由于強(qiáng)心苷是目前臨床上用于治療心臟病的藥物，而且其抑癌作用的濃度在治療心臟病生 理濃度范圍內(nèi)，因此，該藥物很有可能作為治療耐藥性NSCLC的替代藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0020]本發(fā)明提供了一種強(qiáng)心苷化合物在制備用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
[0021]具體地，根據(jù)本發(fā)明的非小細(xì)胞肺癌選自鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。進(jìn)一
[0022]步地，本發(fā)明提供了強(qiáng)心苷化合物在制備用于治療酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小
[0023]細(xì)胞肺癌。
[0024]具體地，根據(jù)本發(fā)明的酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
[0025]更具體地，根據(jù)本發(fā)明的用途中所述的強(qiáng)心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
[0026]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了強(qiáng)心苷化合物聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑在制備用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
[0027]具體地，根據(jù)本發(fā)明的用途，其中所述非小細(xì)胞肺癌選自鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。[0028]具體地，根據(jù)本發(fā)明的用途，其中所述非小細(xì)胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細(xì)胞肺癌。
[0029]更具體地，根據(jù)本發(fā)明的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
[0030]更具體地，根據(jù)本發(fā)明的用途，其中所述的強(qiáng)心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
[0031]進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了治療酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細(xì)胞肺癌的治療方法，其中包括向有需要的受試者施用治療有效量的強(qiáng)心苷化合物和酪氨酸激酶抑制劑。
[0032]具體地，根據(jù)本發(fā)明的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼；所述強(qiáng)心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1 A至圖1D:吉妥辛對H1975、H1650、PC9/G和A549細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響。圖1A、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的H1975生存曲線；圖1Β、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1650生存曲線；圖1C、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的PC9/G生存曲線；圖1D、用吉非替尼、吉妥辛和吉妥辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的Α549生存曲線。
[0034]圖2Α至圖2D:其他幾種強(qiáng)心苷藥物對Η1975細(xì)胞吉非替尼敏感性的影響。圖2Α、用吉非替尼、洋地黃毒苷和洋地黃毒苷+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1975的生存曲線；圖2Β、用吉非替尼、地高辛和地高辛+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1975的生存曲線；圖2C、用吉非替尼、哇巴因和哇巴因+1 μ M吉非替尼處理48小時的Η1975的生存曲線；圖2D、用吉非替尼，前海蔥苷原A和前海蔥苷原A處理48小時的Η1975的生存曲線。
[0035]圖3Α至圖3D:吉妥辛和吉非替尼在Η1975和Η1650細(xì)胞中的相互作用方式。圖3Α、用吉非替尼、吉妥辛和吉非替尼+吉妥辛以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖3Β、基于A的Cl值；圖3C、用吉非替尼、吉妥辛和吉非替尼+吉妥辛以如所示濃度處理48小時的Η1650的生存曲線；圖3D、基于C的Cl值。
[0036]圖4Α至圖4D:、洋地黃毒苷和吉非替尼在Η1975和Η1650細(xì)胞中的相互作用方式。圖4Α、用吉非替尼、洋地黃毒苷和吉非替尼+洋地黃毒苷以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖4Β、基于A的Cl值；圖4C、用吉非替尼，洋地黃毒苷和吉非替尼+洋地黃毒苷以如所示濃度處理48小時的Η1650的生存曲線；圖4D、基于C的Cl值。
[0037]圖5Α至圖5F:其他幾種強(qiáng)心苷與吉非替尼在Η1975細(xì)胞中的相互作用方式。圖5Α、用吉非替尼，地高辛和吉非替尼+地高辛以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖5Β、基于A的Cl值；圖5C、用吉非替尼，哇巴因和吉非替尼+哇巴因以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖5D、基于C的Cl值；Ε、用吉非替尼、前海蔥苷原A和吉非替尼+前海蔥苷原A以如所示濃度處理48小時的Η1975的生存曲線；圖5F、基于E的Cl值。
[0038]圖6Α至圖6D:吉妥辛和吉非替尼聯(lián)合使用對Η1975和Η1650細(xì)胞凋亡的影響。圖6Α、用DMS0，9 μ M吉非替尼，300ηΜ吉妥辛和9 μ M吉非替尼+300ηΜ吉妥辛處理后由流式細(xì)胞儀分析Η1975的凋亡；圖6Β、基于A計(jì)算的凋亡比率；圖6C、用DMS0，4 μ M吉非替尼，I μ M吉妥辛和4μ M吉非替尼+1 μ M吉妥辛處理后由流式細(xì)胞儀分析Η1650的凋亡；圖6D、基于C計(jì)算的凋亡比率。*P〈0.01，與吉非替尼或吉妥辛組比較。
[0039]圖7A至圖7D:洋地黃毒苷和吉非替尼聯(lián)合使用對H1975和H1650細(xì)胞凋亡的影響。圖7A、用DMS0，9 μ M吉非替尼，40ηΜ洋地黃毒苷和9 μ M吉非替尼+40ηΜ洋地黃毒苷處理后由流式細(xì)胞儀分析Η1975的凋亡；圖7Β、基于A計(jì)算的凋亡比率；圖7C、用DMS0，4 μ M吉非替尼，30ηΜ洋地黃毒苷和4μΜ吉非替尼+30ηΜ洋地黃毒苷處理后由流式細(xì)胞儀分析Η1650的凋亡；圖7D、基于C計(jì)算的凋亡比率。*Ρ〈0.01，與吉非替尼或洋地黃毒苷組比較，**Ρ<0.05,與吉非替尼或洋地黃毒苷組比較。
[0040]圖8Α至圖8D:吉妥辛、洋地黃毒苷和吉非替尼聯(lián)合使用對Η1975和Η1650細(xì)胞中PARP表達(dá)量的影響。圖8Α、在用DMS0，9 μ M吉非替尼，300ηΜ吉妥辛和9 μ M吉非替尼+300ηΜ吉妥辛處理后使用蛋白印記雜交測量Η1975中的PARP ;圖8Β、在用DMS0，4 μ M吉非替尼，I μ M吉妥辛和4 μ M吉非替尼+1 μ M吉妥辛處理后使用蛋白印記雜交測量Η1650中的PARP ；圖8C、在用DMS0，9 μ M吉非替尼，40ηΜ洋地黃毒苷和9 μ M吉非替尼+40ηΜ洋地黃毒苷處理后使用蛋白印記雜交測量Η1975中的PARP ；圖8D、在用DMS0，4μΜ吉非替尼，30ηΜ洋地黃毒苷和4μ M吉非替尼+30ηΜ洋地黃毒苷處理后使用蛋白印記雜交測量Η1650中的PARP。
[0041]圖9Α至圖9C:吉非替尼和吉妥辛/洋地黃毒苷/地高辛聯(lián)合用藥對Η1975和Η1650細(xì)胞信號通路的影響。圖9Α、用如所示的2.25 μ M吉非替尼和75ηΜ吉妥辛處理Η1975細(xì)胞12小時；圖9Β、用如所示的I μΜ吉非替尼和250ηΜ吉妥辛處理Η1650細(xì)胞12小時；圖9C.用如所示的2.25 μ M吉非替尼，IOnM洋地黃毒苷和IOnM地高辛處理Η1975細(xì)胞12小時。通過蛋白印記雜交檢測信號分子。
[0042]圖1OA至圖1OF:Erk信號通路與耐藥性。用如所示濃度的吉非替尼處理。圖10A、HCC827;圖10B、PC9;圖10C、H1975;圖10D、H1650細(xì)胞后，通過蛋白印記雜交檢測Erk。如所示處理圖10E、H1975;圖10F、H1650細(xì)胞并通過MST分析測量生存率。
[0043]圖1lA至圖1lB:聯(lián)合用藥對腫瘤干細(xì)胞和非腫瘤干細(xì)胞的影響。圖11A、用所示濃度DMS0、吉非替尼、地高辛和吉非替尼+地高辛處理48小時的癌干細(xì)胞和非癌干細(xì)胞的生存率。圖11B、側(cè)群細(xì)胞的百分比。
[0044]圖12A至圖12B、洋地黃毒苷與吉非替尼聯(lián)合用藥對小鼠移植瘤生長的影響。圖12A、記錄4周的腫瘤體積。n=7, *P〈0.05,與吉非替尼或洋地黃毒苷組比較。圖12B、如所示各組中腫瘤的照片。
[0045]圖13A至圖13 C:H1975對吉非替尼和吉妥辛的敏感性。圖13A、用吉非替尼和吉妥辛處理48小時的H1975的生存曲線；圖138、用相同濃度的DMSO，300nM吉非替尼和300nM吉妥辛處理后通過流式細(xì)胞儀分析H1975的凋亡；圖13C:計(jì)算凋亡，*P〈0.01，與吉非替尼組比較。
[0046]圖14 A至圖14 B:吉妥辛對腫瘤生長的影響。圖14A、PBS或吉妥辛處理的腫瘤生長曲線；圖14B、在終止點(diǎn)的小鼠圖片，*P〈0.05，與對照比較。
[0047]圖15 A至圖15B:吉妥辛對H1975細(xì)胞中Erkl/2磷酸化的影響。圖15A、用不同濃度的吉妥辛處理的H1975的Erkl/2磷酸化模式；圖15B、在用吉妥辛處理的不同時間點(diǎn)的H1975的Erkl/2磷酸化模式。【具體實(shí)施方式】
[0048]材料與方法
[0049]一、實(shí)驗(yàn)材料
[0050]1.細(xì)胞
[0051]NC1-H1975 (人非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞，EGFR exon20T790M-L858R),NC1-H1650 (人肺支氣管癌細(xì)胞，EGFR exonl9Del E746-A750)、HCC827(人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，EGFRexonl9DelE746-A750);購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。
[0052]PC9 (人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞)，由上海市瑞金醫(yī)院贈送。
[0053]2.實(shí)驗(yàn)動物
[0054]BALB/c Nude型免疫缺陷小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，合格證號為:SCXK (京)2012-0001。
[0055]3.主要試劑
[0056](I)細(xì)胞培養(yǎng)用試劑
[0057]改良型RPM1-1MO 培養(yǎng)基(SH3O8O9.18, Hyclone)；
[0058]DMEM-高糖培養(yǎng)基(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；
[0059]胰酶消化液(0.05%和0.25%，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；
[0060]磷酸緩沖液PBS (SH30256.01，Hyclone)；
[0061]胎牛血清FBS (10099-141，gibico)
[0062]青-鏈霉素(SH40003_12，Hyclone)
[0063]動物細(xì)胞冷凍保存液(CSM-100，大連普肽生物科技有限公司)
[0064](2)試劑盒
[0065]Alexa Fluor488Annexin V/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Vl3245, Invitrogen)；
[0066]BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒(PAl 15-01，TianGen)
[0067](3)抗體
[0068]本研究所用抗體均來自Cell Signaling Tech公司。
[0069]4.軟件及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
[0070]細(xì)胞凋亡分析軟件CFlow Plus ；圖標(biāo)制作軟件Excel ;用SPSS16.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多個獨(dú)立樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析。
[0071]二、實(shí)驗(yàn)方法
[0072]1.細(xì)胞培養(yǎng)
[0073]遵循本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、復(fù)蘇、傳代、凍存以及計(jì)數(shù)。
[0074]2.MTS法檢測細(xì)胞生存率
[0075]原理:MTS/PMS法是一種用比色法來檢測細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中的活細(xì)胞數(shù)量的檢測試劑。MTS是一種新型四唑化合物，PMS是一種電子偶聯(lián)劑。PMS具有增強(qiáng)的化學(xué)穩(wěn)定性，這使它可與MTS混合形成穩(wěn)定的溶液。MTS (Owen’ s reagent)被細(xì)胞生物還原成為一種有色的甲臜產(chǎn)物，可直接溶解于培養(yǎng)基中。這種轉(zhuǎn)化很可能是在代謝活躍的細(xì)胞中的脫氫酶產(chǎn)生的NADPH或NADH的作用下完成的。在490nm處檢測到的甲臜產(chǎn)物的量與培養(yǎng)中的活細(xì)胞數(shù)成正比。MTS與MTT法相比，操作步驟更少，無需揮發(fā)性溶劑來溶解結(jié)晶沉淀甲臜產(chǎn)物。[0076]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0077](I)接種細(xì)胞:用含10%胎牛血清得培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔5000-7000個細(xì)胞接種到96孔板，每孔體積150ul ；
[0078](2)培養(yǎng)細(xì)胞:培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁后更換為含1%胎牛血清的培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)，24h后換為含不同濃度的藥物的RPM1-1640培養(yǎng)基進(jìn)行處理，每孔100 μ 1，每個濃度4個重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)48h;
[0079](3)MTS/PMS溶液的配制:分別融化MTS和PMS，37°C水浴10分鐘。按7ml培養(yǎng)基:1336.4 μ I MTS:63.6 μ I PMS 比例配制；
[0080](4)呈色:棄去培養(yǎng)基，每孔加MTS/PMS溶液120ul，繼續(xù)孵育1.5_2h。
[0081](5)用酶標(biāo)儀檢測490nm波長下的吸光度A，并根據(jù)吸光度A計(jì)算細(xì)胞的生存率。計(jì)算公式如下:細(xì)胞生存率=(實(shí)驗(yàn)組A/對照組A) X 100%。
[0082]3.Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測法
[0083]原理:在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞發(fā)生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此，Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。在細(xì)胞發(fā)生凋亡時，膜磷脂酰絲氨酸外翻的發(fā)生早于細(xì)胞核的變化。因?yàn)榧?xì)胞壞死時也會發(fā)生磷脂酰絲氨酸外翻，所以Annexin V常與鑒定細(xì)胞死活的核酸染料(如PI)合并使用，來區(qū)分凋亡細(xì)胞與死亡細(xì)胞。
[0084]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0085](I)細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求接種于12孔板，每孔約1X105個細(xì)胞。24h后換為含1%胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基對細(xì)胞進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24h。
[0086](2)設(shè)置相應(yīng)對照:正常對照，什么染料也不加；凋亡細(xì)胞(處理組)，只染AnnexinV ;死亡細(xì)胞，可用高濃度的吉非替尼處理正常細(xì)胞，只用PI染色；另外有處理對照和各處理組，用Annexin V和PI同時染色。細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)要求，用不同藥物處理。對不同時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)，在不同時間加藥，同時收集細(xì)胞。
[0087](3)吸出培養(yǎng)液，由于有死亡的細(xì)胞已經(jīng)懸起，培養(yǎng)液不能扔掉，一并轉(zhuǎn)入離心管中(如吸出培養(yǎng)液體積較大，可用離心管保存。離心后同胰酶消化的細(xì)胞合并)。
[0088](4)每孔加入200 μ L0.05%胰酶消化，鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起開始收縮、細(xì)胞開始變圓時，吸出胰酶。
[0089](5)加新完全培養(yǎng)液終止消化，吹打下細(xì)胞，轉(zhuǎn)入離心管，200g離心5min收集細(xì)胞，PBS洗兩次，重懸細(xì)胞于IOOul的結(jié)合緩沖液中。
[0090](6)加入5μ I的Annexin V和I μ I的PI輕輕混勻，避光染色15min。用400目細(xì)胞篩過濾后上機(jī)檢測。使用Accurie軟件對結(jié)果進(jìn)行分析，得到細(xì)胞的凋亡率。
[0091]4.細(xì)胞總蛋白提取
[0092](I)用PBS將要收集的細(xì)胞洗一遍，加入含有cocktail的RIPA蛋白裂解液，放在冰上，用細(xì)胞刮將培養(yǎng)板上的細(xì)胞迅速刮下，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。
[0093](2)在混勻器上于4°C旋轉(zhuǎn)混勻45min,4°C, 12000rpm離心IOmin,將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管保存于_80°C冰箱。[0094](3)蛋白總濃度測定(BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒法):
[0095]I)配制BCA工作液:依據(jù)樣品數(shù)量，將試劑A和試劑B按體積比50:1配制BCA工作液，并充分混勻。
[0096]2)分別取25μ1表格中新鮮配置的BSA標(biāo)準(zhǔn)液和待測樣品，加入到96孔板中；每孔中加入200 μ I BCA工作液，并充分混勻；加蓋，37°C孵育30min后冷卻至室溫或室溫放置2h ;用酶標(biāo)儀于562nm波長處檢測其吸光度；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白含量。
[0097]5.蛋白印記雜交(Western blot)
[0098](I) SDS-PAGE:
[0099]I)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備分離凝膠；
[0100]2)灌濃縮膠前要將分離膠上的ddH20倒掉，濃縮膠凝膠速度更快，加入TEMED后要快速混勻后灌膠，再插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，一般?.75mm厚度。
[0101]3)樣品加入適量的4X loading buffer,沸水浴10分鐘,短暫離心上樣。
[0102]4) 70-90V電泳，大約需要2.5小時。
[0103](2 )蛋白印記雜交檢測:
[0104]I)將合適大小的PVDF膜首先置于甲醇中浸潤5min,然后在IXTransfer Buffer中平衡(即用鑷子夾住膜在Transfer Buffer中反復(fù)涮洗30s)后方可應(yīng)用，如果使用尼龍膜，貝1J直接在I XTransfer Buffer中平衡后即可使用。取下電泳后的膠置于I X TransferBuffer中平衡。
[0105]2)安裝轉(zhuǎn)膜設(shè)備:將轉(zhuǎn)膜用的塑料夾子的黑色面向下打開后平放于桌上，首先放置一片在I X Transfer Buffer中浸潤過的海面墊,然后放置2層浸潤過的3M濾紙,之后將平衡過的PAGE膠平鋪于濾紙上，再在其上放置平衡過的PVDF膜并用一玻璃試管趕壓所有氣泡，接著再向其上放置2層浸潤過的3M濾紙和另一片在IXTransfer Buffer中浸潤過的海面墊，最后合上塑料夾子并放置于裝滿轉(zhuǎn)膜液的轉(zhuǎn)膜槽中(注意電極方向)。
[0106]3)電轉(zhuǎn)移:對于轉(zhuǎn)印120KD以下的蛋白質(zhì)，通常按如下參數(shù)設(shè)置，I安培恒定電流需要 Ih ；500mA2h ；250mA4h ;或 150mA 過夜。
[0107]4)抗原抗體反應(yīng):
[0108]Blocking (封閉):將轉(zhuǎn)印好的膜卸下(觀察有色Marker是否完全從膠上轉(zhuǎn)移到膜上)，標(biāo)記好正面(即蛋白面)，置于Blocking Buffer中室溫?fù)u晃孵育Ih,或37°C 30min,或4°C過夜。
[0109]一抗孵育:將特定的抗體稀釋于Primary Antibody Dillution Buffer中，通常的稀釋比例為1:1000。將膜從Blocking Buffer中取出，稍稍空干一下液體后直接放于稀釋的一抗溶液中，室溫?fù)u晃孵育lh，或37°C 30min，或4°C過夜(對于一些信號較弱的抗體采用4°C過夜效果較好)。
[0110]二抗孵育:將膜取出浙干液體后放于IXTBS中搖晃孵育30min(每隔約5min更換一次液體)。將洗過的膜置于稀釋后的二抗中(通常1:1000倍稀釋)室溫?fù)u晃孵育lh。
[0111]洗膜:將膜從二抗稀釋液中取出，浙干液體后放于IXTBS中搖晃孵育30min(每隔約5min更換一次液體)。
[0112]5)顯色反應(yīng)(辣根過氧化物酶化學(xué)發(fā)光法):各取等體積ECL試劑A液、B液混合(按每平方厘米轉(zhuǎn)印膜0.125mL ECL混合液計(jì)算)。將轉(zhuǎn)印膜輕輕接觸3MM濾紙吸干液體。將膜放入事先混勻的ECL混合液中反應(yīng)lmin，提起轉(zhuǎn)印膜，輕輕在3MM濾紙上吸干液體。在Image Quant LAS4000mini突光成像儀上成像。
[0113]6.測定細(xì)胞內(nèi)pH值
[0114]原理:BCECF AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。BCECF AM沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成BCECF，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。BCECF在適當(dāng)?shù)膒H值情況下可以被激發(fā)形成綠色熒光。最大激發(fā)波長和發(fā)射波長因PH的不同而有所不同，最大激發(fā)波長大致在503nm左右，最大發(fā)射波長大致在520nm左右,實(shí)際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為535nm。
[0115]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0116](I)接種細(xì)胞到12孔板并按實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行相應(yīng)處理，收集細(xì)胞時，每孔加入200 μ L0.05%胰酶消化，鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起開始收縮、細(xì)胞開始變圓時，吸出胰酶，完全培養(yǎng)基終止消化并制成細(xì)胞懸液。
[0117](2)用HBSS稀釋BCECF AM至5μΜ，取100μ重懸細(xì)胞，在室溫避光孵育60min。
[0118](3)用PBS洗細(xì)胞兩次，在C6流式細(xì)胞儀上檢測熒光強(qiáng)度。
[0119]7.腫瘤干細(xì)胞分選
[0120]原理:H0eChst33342是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料。當(dāng)用這種染料給細(xì)胞染色時，正常細(xì)胞會大量攝取。但是在腫瘤干細(xì)胞中存在一種ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體，它可以將腫瘤干細(xì)胞攝取的染料重新排出細(xì)胞外。因此，一個細(xì)胞系中的腫瘤干細(xì)胞在染色后往往呈現(xiàn)較低的熒光信號。根據(jù)這個原理，我們可以用流式細(xì)胞儀將腫瘤干細(xì)胞分選出來。同時，在染色時，還需要加入 PI以排除凋亡的細(xì)胞。維拉帕米可以特異性地抑制ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)體，通常用做對照。
[0121]實(shí)驗(yàn)步驟:
[0122](I) Hoechst33342 的配制
[0123]儲存液:將25mg Hoechst33342粉末，加入25ml蒸餾水，制成lmg/ml的儲存液，零下20度保存。工作液:取Iml儲存液加入9ml蒸餾水，配制成0.lmg/ml的工作液，過濾除菌，4度避光保存.[0124](2) PI 的配制
[0125]儲存液:將IOmgPI粉末加入IOml蒸餾水，制成lmg/ml儲存液，零下20度避光保存。工作液:取Iml儲存液，加入49mlPBS，制成20 μ g/ml工作液，過濾除菌，4度避光
保存，最多可使用8周
[0126](3)分選分成三組，分別為藥物組、對照組和維拉帕米組，三組細(xì)胞用PBS洗2次，胰酶消化細(xì)胞，加入完全培養(yǎng)基，1000r/分鐘離心10分鐘。然后將其重懸于含2%的胎牛血清1640中，調(diào)整細(xì)胞濃度成IX 106個/ml，對照組和藥物組加入Hoechst33342，調(diào)整濃度至5 μ g/mL,維拉帕米組同時加入維拉帕米100 μ g/mL,避光37度水浴內(nèi)孵育70分鐘，在期間每15到20分鐘震蕩一次，最后加入2mL冰磷酸緩沖液(PBS)終止反應(yīng)，1500r/min離心IOmin后棄上清，再用含2%的胎牛血清的PBS洗I次，用2%的胎牛血清的PBS重懸，PI加入至終濃度I μ g/mL的，在進(jìn)行流式細(xì)胞分選、鑒定前細(xì)胞4度避光保存。
[0127](4)流式細(xì)胞儀檢測分選，350nm(375)波長紫外光激發(fā)Hoechst染色，于450/20nm帶通下收集測定藍(lán)光，675nm帶通下收集測定紅光。選取線性信號，做Hoechst Red(X軸)和Hoechst Blue (Y軸)二維散點(diǎn)圖,將Hoechst Red及Hoechst Blue弱信號且維拉帕米對照組缺失的區(qū)域設(shè)定為SP細(xì)胞的門，計(jì)算百分比。檢測分選參數(shù)如下:1)激光器:大功率、488nm紫外激光；2)光電倍增管(PMT)光譜檢測范圍:300——llOOnm、電壓:150 —990V ；3)檢測靈敏度:小于200MESF、CV小于1.5% (2 μ m Beads) CV小于3% ；4)樣本獲取速度:25000個/秒(細(xì)胞)；5)分選速度:5000個/秒或以上；6)分選純度:99%7)分選模式:二路米集
[0128]8.動物實(shí)驗(yàn)
[0129](I)動物飼養(yǎng)條件
[0130]所有實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF級動物房飼養(yǎng)，每5只一籠。室內(nèi)溫度控制在19_24°C，濕度50%-60%，12小時明暗交替。小鼠飼料、墊料均經(jīng)高溫消毒處理，飲水經(jīng)高溫高壓滅菌處理。飼養(yǎng)過程中，密切觀察小鼠生長情況，墊料每周換一次，飼料和飲水每日補(bǔ)充。
[0131](2)小鼠灌胃
[0132]準(zhǔn)備灌胃針頭，本研究采用特制8號小鼠灌胃針頭；抓住小鼠，使其頭、頸和身體呈一直線。左手的小指和無名指抓住小鼠的尾巴，另外三個手指抓住小鼠的頸部即可。若小鼠始終在活動中，可放開重新抓，避免強(qiáng)行操作損害小鼠；用Iml的注射器配灌胃針頭。灌胃針頭從小鼠的嘴角進(jìn)入，壓住舌頭，抵住上顎，輕輕向內(nèi)推進(jìn)，進(jìn)入食管后會有一個刺空感，待針頭全部沒入后，輕推注射器給藥液；灌胃容積一般是0.1~0.2ml/10g，最大0.35ml/10g,每只小鼠的灌胃最大容積不超過0.8ml。
[0133](3)小鼠移植瘤模型的建立
[0134]SPF級4周BALB/c裸鼠購自維通利華公司，合格證號:SCXK (京)2012_0001，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究實(shí)驗(yàn)動物中心。I周后，待小鼠適應(yīng)環(huán)境后開始相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先，對每只小鼠右側(cè)皮 f 下注射0.2ml含有8X IO6個H1975細(xì)胞的RPM1-1640懸液。10天后，當(dāng)移植的腫瘤長到50~70mm3時，將小鼠隨機(jī)分為四組，每組5只。腫瘤體積V的計(jì)算公式為V=0.52XLXW2 (長和寬)。將藥物溶于含有0.05%羧甲基纖維素鈉的PBS中，以相應(yīng)劑量對實(shí)驗(yàn)組小鼠口服灌胃給藥，對照組小鼠口服溶劑，腫瘤體積每四天測量I次。服藥三周后，根據(jù)記錄的測量數(shù)據(jù)制作腫瘤生長曲線。
[0135]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0136]一、強(qiáng)心苷與吉非替尼聯(lián)合用藥對耐藥性NSCLC細(xì)胞的抑制應(yīng)用
[0137]1、吉妥辛及其他強(qiáng)心苷對耐藥性NSCLC細(xì)胞系吉非替尼敏感性的影響
[0138]首先，對本實(shí)驗(yàn)室前期的藥物篩選結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。選取與藥物篩選相一致的細(xì)胞系H1975，分別以不同濃度吉非替尼、不同濃度吉妥辛和不同濃度吉妥辛+IyM吉非替尼處理48h，用MTS法檢測細(xì)胞的生存率，并做出細(xì)胞生存曲線。結(jié)果顯示，吉妥辛可以在多個濃度點(diǎn)提高H1975細(xì)胞對IyM吉非替尼的敏感性(圖1-Α)。同時，我們在其他幾種耐藥性NSCLC細(xì)胞系H1650、PC9/G和A549中對這一結(jié)論進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，吉妥辛可以在多個濃度點(diǎn)提高H1650細(xì)胞對I μ M吉非替尼的敏感性(圖1Β)，但是不能改變PC9/G和Α549細(xì)胞對I μΜ吉非替尼的敏感性(圖1C-1D)。
[0139]強(qiáng)心苷藥物包括一大類結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)相似的化合物，其中多種已是目前的臨床用藥?？紤]到近年來越來越多的關(guān)于強(qiáng)心苷抗癌作用的報(bào)道，我們也評價了該類藥物中其他幾種化合物對Η1975吉非替尼敏感性的影響。結(jié)果顯示洋地黃毒苷可以在多個濃度點(diǎn)提高H1975細(xì)胞對I μ M吉非替尼的敏感性(圖2Α)。而該類藥物中的其他幾種如地高辛、哇巴因和前海蔥苷原A并不改變Η1975細(xì)胞對I μ M吉非替尼的敏感性(圖2B-2D)。
[0140]2、強(qiáng)心苷藥物與吉非替尼在耐藥性NSCLC細(xì)胞中的相互作用
[0141]上結(jié)果表明吉妥辛和洋地黃毒苷可以提高耐藥性細(xì)胞系Η1975和Η1650的吉非替尼敏感性。為了了解這兩種強(qiáng)心苷與吉非替尼的相互作用，我們采用了目前藥物研究領(lǐng)域廣泛用于評價藥物相互作用的Chou-Talalay模型。根據(jù)該模型，我們首先確定了各種藥物在Η1975和Η1650中的半數(shù)抑制濃度IC5tl (表1)。其次，根據(jù)固定的IC5tl比設(shè)計(jì)下列三組濃度，吉妥辛組:1C50/16、IC50/8、IC50/4、IC50/2、IC50,2X IC50,4X IC50,8X IC50,16X IC50 ;吉非替尼組:1C50/16、IC50/8、IC50/4、IC50/2、IC5(1、2X IC5(1、4X IC5(1、8X IC5(1、16X IC50 ;聯(lián)合用藥組:各個濃度兩種藥物對應(yīng)聯(lián)合。
[0142]表1各藥物在H1975和H1650中的IC5tl
【權(quán)利要求】
1.強(qiáng)心苷化合物在制備用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述非小細(xì)胞肺癌選自鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中所述非小細(xì)胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細(xì)胞肺癌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的強(qiáng)心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
6.強(qiáng)心苷化合物聯(lián)合酪氨酸激酶抑制劑在制備用于治療非小細(xì)胞肺癌的藥物中的用途。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述非小細(xì)胞肺癌選自鱗狀細(xì)胞癌、肺腺癌和大細(xì)胞肺癌。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其中所述非小細(xì)胞肺癌是酪氨酸激酶抑制劑耐藥性的非小細(xì)胞肺癌。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其中酪氨酸激酶抑制劑選自吉非替尼或厄洛替尼。
10.根據(jù)權(quán)利要求6至9任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的強(qiáng)心苷化合物選自吉妥辛、洋地黃毒苷、地高辛、哇巴因或前海蔥苷原A。
【文檔編號】A61K31/7048GK103536925SQ201310516219
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月28日
【發(fā)明者】鄭直, 王超, 薛毅博 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所