非常小的胚胎樣(vsel)干細(xì)胞及分離和利用其的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞及分離和利用其的方法。當(dāng)前披露的主題提供了從骨髓、外周血、和／或其它來(lái)源純化的干細(xì)胞群。還提供了將所述干細(xì)胞用于治療受試者中的組織和／或器官損傷的方法。
【專(zhuān)利說(shuō)明】非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞及分離和利用其的方法
[0001] 本申請(qǐng)是國(guó)際申請(qǐng)日為2006年11月2日的國(guó)際申請(qǐng)PCT / US2006 / 042780進(jìn)入中國(guó)、申請(qǐng)?zhí)枮?00680052508.X的題為“非常小的胚胎樣(VSE L)干細(xì)胞及分離和利用其的方法”的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0003]這個(gè)申請(qǐng)要求于2005年12月8日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)系列N0.60 / 748, 685的權(quán)益；其披露的全部?jī)?nèi)容以引用方式結(jié)合于此。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0004]當(dāng)前披露的主題總體上涉及從骨髓、臍帶血、和/或其它來(lái)源分離的干細(xì)胞群并且在本文中被稱(chēng)為非常小的胚胎樣(very small embryonic-like) (VSEL)干細(xì)胞的鑒定、分離及應(yīng)用。更具體地，當(dāng)前披露的主題涉及分離所述VSEL干細(xì)胞并且(可選地在體外處理后)將其用于治療需要其的受試者中的組織和/或器官損傷。
【背景技術(shù)】
[0005]干細(xì)胞和干細(xì)胞衍生物的應(yīng)用已經(jīng)在醫(yī)藥研究中，尤其在提供用于治療由于遺傳缺陷、創(chuàng)傷、和/或疾病過(guò)程的任何一個(gè)造成的組織損傷的試劑領(lǐng)域中獲得提高的興趣。理想地，能夠分化為受影響的細(xì)胞類(lèi)型的細(xì)胞可以被移植入需要其的受試者中，其中它們將與器官微環(huán)境相互作用并供應(yīng)必須的細(xì)胞類(lèi)型以修復(fù)損傷。
[0006]已經(jīng)付出了相當(dāng)多的努力以從大量不同的組織中分離干細(xì)胞用在再生醫(yī)藥中。例如，給予Tsukamoto et al.的美國(guó)專(zhuān)利N0.5, 750, 397披露了據(jù)報(bào)道能夠分化為淋巴系、紅(erythroid)系、和粒單(myelomonocytic)系的人類(lèi)造血干細(xì)胞的分離和生長(zhǎng)。給予Bruder et al.的美國(guó)專(zhuān)利N0.5，736，396披露了用于在合適的生長(zhǎng)和/或分化因子的影響下分離的人類(lèi)間充質(zhì)干細(xì)胞的譜系(lineage)-引導(dǎo)的分化的方法。隨后可以將所述得到的細(xì)胞引入宿主用于間充質(zhì)組織再生或修復(fù)。
[0007]強(qiáng)烈感興趣的一個(gè)領(lǐng)域涉及胚胎干(ES)細(xì)胞的應(yīng)用，其已經(jīng)在小鼠中顯示具有分化為動(dòng)物的所有不同的細(xì)胞類(lèi)型的潛能。小鼠ES細(xì)胞源自胚泡期的早期小鼠胚胎的內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞，并且其它多能和/或全能細(xì)胞已經(jīng)從胚(germinal)組織(如原始生殖細(xì)胞；PGC)分離。這些多能和/或全能干細(xì)胞以未分化狀態(tài)在體外增殖、保持正常核型、以及保持分化為全部的三個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層及外胚層)的衍生物的潛能的能力使得這些細(xì)胞作為細(xì)胞的潛在來(lái)源用在出生后受試者的再生治療中是有吸引力的。
[0008]人類(lèi)ES(hES)細(xì)胞的開(kāi)發(fā)還不及對(duì)小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行的進(jìn)展成功。Thomson etal.報(bào)道了來(lái)自低等靈長(zhǎng)類(lèi)(美國(guó)專(zhuān)利 N0.5，843，780 !Thomson et al.(1995)92Proc NatlAcad Sci USA7844-7848)、以及來(lái)自人類(lèi)(Thomson et al.(1998) 282Sciencell45_1147)的多能干細(xì)胞。Gearhart et al.產(chǎn)生了來(lái)自胎兒性腺組織的人類(lèi)胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott et al.(1998)95Proc Natl Acad Sci USA13726-13731 ;及美國(guó)專(zhuān)利N0.6，090, 622)。hES和hEG細(xì)胞均具有多能干細(xì)胞的理想特征，在于它們能夠在體外增殖而不分化，它們通常維持正常的核型，并且它們?nèi)匀荒軌蚍只癁槎喾N不同的細(xì)胞類(lèi)型。無(wú)性(clonally)來(lái)源的人類(lèi)胚胎干細(xì)胞系在培養(yǎng)中長(zhǎng)期維持多能性和增殖潛能(Amit etal.(2000)227Dev Biol271_278)。
[0009]ES細(xì)胞或其它多能細(xì)胞用于受試者中再生治療的一個(gè)重大挑戰(zhàn)是控制細(xì)胞生長(zhǎng)和分化為受試者治療所需的特定細(xì)胞類(lèi)型。已有許多生長(zhǎng)因子對(duì)ES細(xì)胞分化的影響的報(bào)道。例如，Schuldiner et al.報(bào)道了八種生長(zhǎng)因子對(duì)細(xì)胞從hES細(xì)胞分化為不同細(xì)胞類(lèi)型的影響(參見(jiàn) Schuldiner et al.(2000)97Proc Natl Acad Sci U SA11307-11312)。如其中所披露的，在開(kāi)始通過(guò)胚狀體樣(embryoid body-like)形成的分化后,在bFGF、TGFβ 1、Activin-A、BMP-4、HGF、EGF、β NGF、或視黃酸的存在下培養(yǎng)細(xì)胞。每種生長(zhǎng)因子對(duì)分化途徑具有獨(dú)特的影響，但是沒(méi)有生長(zhǎng)因子排他地指導(dǎo)分化為一種細(xì)胞類(lèi)型。
[0010]理想地，能夠從受試者分離和純化干細(xì)胞和/或前體細(xì)胞是有益的，所述細(xì)胞能夠在被再引入受試者用于治療目的之前被純化和/或體外處理。受試者的自身細(xì)胞的應(yīng)用將消除采用輔助免疫抑制治療的需要，由此維持受試者免疫系統(tǒng)的能力。然而，用于分離ES細(xì)胞系，尤其是hES細(xì)胞系的目前的策略排除了從受試者分離細(xì)胞并將它們?cè)僖胂嗤氖茉囌摺?br> [0011]因此，對(duì)于來(lái)自成年動(dòng)物的其它干細(xì)胞類(lèi)型的研究繼續(xù)。例如，間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一種這樣的細(xì)胞類(lèi)型。已經(jīng)顯示MSC具有分化為包括骨(Haynesworthet al.(1992) 13Bone81_88)、軟骨(Mackay et al.(1998) 4TissueEng415_28 ;Yoo etal.(1998) 80JBone Joint Surg Aml745_57)、脂肪組織(Pittenger etal.(2000) 25ICurrTop MicrobioIImmuno13-11) (Young et al.(1998) 16J Orthop Res406_13)、肌肉及間質(zhì)(Cap I an et al.(2001) 7Trends Mol Med259_64)的多個(gè)譜系的潛能。 [0012]另一細(xì)胞群，多能成年祖細(xì)胞(MAPC)也已經(jīng)從骨髓純化(BM ；Reyes etal.(2001)98Blood2615-2625 ；Reyes&Verfaillie(2001)938Ann NY Acad Sci231_235)。這些細(xì)胞已經(jīng)顯示能夠在體外擴(kuò)展為超過(guò)100群倍增(lOOpopulation doubling)而沒(méi)有端?？s短或核型異常的發(fā)展。已經(jīng)顯示MAPC在限定的培養(yǎng)條件下能夠分化為各種間充質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型(如成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及骨骼成肌細(xì)胞)、內(nèi)皮、神經(jīng)外胚層細(xì)胞、以及更最近的，分化為肝細(xì)胞(Schwartz et al.(2000) 109J Clin Investl291_1302)。
[0013]此外，已報(bào)道造血干細(xì)胞(HSC)能夠分化為多種細(xì)胞類(lèi)型。已報(bào)道BM造血干細(xì)胞能夠“轉(zhuǎn)分化(transdifferentiate) ”為表達(dá)早期心(Orlic etal.(2003)7Pediatr Transplant86-88 ；Makino et al.(1999)103J Clin Invest697_705)、骨骼肌(Labarge&Blau(2002)lllCell589-601 ;Corti et al.(2002)277Exp CellRes74_85)、神經(jīng)(Sanchez-Ramos(2002)69Neurosci Res880_893)、肝(Petersenet al.(1999)284Sciencell68-1170)、或胰腺細(xì)胞(lanus et al.(2003)IllJClinInvest843-850 ；Lee&Stoffel (2003) IllJ Clin Invest799_801)標(biāo)記物的細(xì)胞。在人類(lèi)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中還表明CD34+外周血(PB)干細(xì)胞的移植導(dǎo)致供體-來(lái)源的肝細(xì)胞(Korblinget al.(2002) 346N Engl J Med738_746)、上皮細(xì)胞(Korbling et al.(2002) 346N EnglJ Med738-746)、和神經(jīng)元(Hao et al.(2003) 12J Hematother Stem Cell Res23_32)的出現(xiàn)。此外，已顯示人類(lèi)BM-來(lái)源的細(xì)胞有助于梗塞的心肌的再生(Stamm etal.(2003)361Lancet45_46)。[0014]這些報(bào)道已經(jīng)被解釋為成年干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化或可塑性現(xiàn)象存在的證據(jù)。然而，成年組織特異性干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化的概念目前在科學(xué)和醫(yī)藥界內(nèi)是廣泛爭(zhēng)議的主題(參見(jiàn)，如，Lemischka (2002)30Exp Hematol848-852 ；Holden&Vogel(2002)296Science2126-2129)。試圖再生的研究結(jié)果表明借助神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是不成功的(Castroet al.(2002)297Sciencel299) ?還顯示肌肉組織中發(fā)現(xiàn)的造血干/祖細(xì)胞(HSPC)起源于 BM(Mckinney-Freeman et al.(2002)99Proc Natl Acad Sci USA1341-1346 ;Geigeret al.100Blood721-723 ;Kawada&0gawa(2001)98Blood2008-2013)。此外，借助涉及單獨(dú)的HPC移植入致命照射的小鼠的嵌合動(dòng)物的研究表明循環(huán)HPSC和/或它們的子代的轉(zhuǎn)分化和/或可塑性，如果它完全存在，是極稀有的事件(Wagers etal.(2002)297Science2256-2259)。
[0015] 因此，持續(xù)存在產(chǎn)生適于多種應(yīng)用(包括但不限于治療多個(gè)器官和/或組織的損傷和/或疾病)的可移植細(xì)胞群的新方法的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016]這個(gè)總結(jié)列出了當(dāng)前披露的主題的幾個(gè)實(shí)施方式，并且在許多情況下列出了這些實(shí)施方式的變體和改變。這個(gè)總結(jié)僅是許多和改變的實(shí)施方式的示例。提及的給定實(shí)施方式的一個(gè)或更多個(gè)代表性特征同樣是示例性的。這樣的實(shí)施方式通常可以伴隨或不伴隨提及的特征而存在；同樣地，那些特征可以應(yīng)用到當(dāng)前披露的主題的其它實(shí)施方式，不管在這個(gè)，總結(jié)中是否列出。為了避免過(guò)多重復(fù)，這個(gè)總結(jié)沒(méi)有列出或建議這樣的特征的所有可能組合。
[0017]當(dāng)前披露的主題提供了用于從非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞或其衍生物的群體形成胚狀體樣球體(embryoid body-like sphere)的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的⑶45_細(xì)胞群；以及(b)在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞或其衍生物達(dá)足以使胚狀體樣球體形成的時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，VSEL干細(xì)胞或其衍生物包含CD34+ / IirT / CD45-或Sca-1* / IirT / CD45—非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，VSEL干細(xì)胞的直徑約為3-4 μ m，表達(dá)SSEA-1、Oct-4, Rev_l、和Nanog的至少一種，具有由細(xì)胞質(zhì)的窄緣圍繞的大細(xì)胞核，并且具有開(kāi)放型染色質(zhì)(常染色質(zhì))。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的⑶45_細(xì)胞群從人或從小鼠分離。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45-細(xì)胞群從人或小鼠中選自由骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的組的來(lái)源分離。在一些實(shí)施方式中，誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2及其組合。在一些實(shí)施方式中，通過(guò)將VSEL干細(xì)胞或其衍生物與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)將一個(gè)或更多個(gè)因子提供給VSEL干細(xì)胞或其衍生物。
[0018]在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括通過(guò)下述方法分離包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群，所述方法包括下述步驟:(a)提供懷疑包含CD45_干細(xì)胞的初始細(xì)胞群；(b)在足以允許每個(gè)抗體與在初始細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合的條件下將所述細(xì)胞群與對(duì)于CD45特異的第一抗體和對(duì)于CD34或Sca-1特異的第二抗體接觸；(c)選擇為⑶34+或Sca-1*、并且⑶45_的細(xì)胞的第一亞群；⑷在足以允許每個(gè)抗體與在細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合的條件下將所述細(xì)胞的第一亞群與對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個(gè)或更多個(gè)抗體接觸，所述標(biāo)記物選自由 CD45R / B220、Gr-UTCRa β , TCR y δ、CDllb 及 Ter-119 組成的組；(e)從所述細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個(gè)的那些細(xì)胞；以及(f)收集為CD34+ /IirT / CD45—或Sca-y / IirT / CD45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細(xì)胞的亞群。在一些實(shí)施方式中，每個(gè)抗體包括可檢測(cè)的標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，所述可檢測(cè)的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記或者可以通過(guò)包含熒光標(biāo)記的試劑被檢測(cè)的部分。在一些實(shí)施方式中，所述分離包括FACS分類(lèi)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離為c-met+、c-kit+、和/或LIF-R+的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離表達(dá)選自由SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog組成的組的一個(gè)或更多個(gè)基因的那些細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，細(xì)胞群包括骨髓樣品、臍帶血樣品、或外周血樣品。
[0019]在當(dāng)前披露的主題的一些實(shí)施方式中，在用足以將包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞從骨髓移動(dòng)到受試者的外周血的量的移動(dòng)劑處理受試者后，所述細(xì)胞群從受試者的外周血分離。在一些實(shí)施方式中，所述移動(dòng)劑包括粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗劑的至少一種。在一些實(shí)施方式中，CXCR4拮抗劑是T140肽。在一些實(shí)施方式中，所述受試者是小鼠。
[0020]在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括將干細(xì)胞的亞群與結(jié)合到CXCR4的抗體接觸以及從干細(xì)胞的亞群分離為CXCR4+的那些細(xì)胞。
[0021]在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離為CXCR4+和/或AC133+的那些細(xì)胞。
[0022]在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括選擇為HLA_DR_、MHCI類(lèi)_、⑶90_、⑶29'⑶105-、或其組合 的那些細(xì)胞。
[0023]當(dāng)前披露的主題還提供了包含多個(gè)非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的胚狀體樣球體。
[0024]當(dāng)前披露的主題還提供了包含本文披露的胚狀體樣球體的細(xì)胞培養(yǎng)物。在一些實(shí)施方式中，本文披露的胚狀體樣球體在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中提供。
[0025]當(dāng)前披露的主題還提供了用于將非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞分化為感興趣的細(xì)胞類(lèi)型的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體；以及(b)在包含分化誘導(dǎo)量的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體直到培養(yǎng)基中出現(xiàn)感興趣的細(xì)胞類(lèi)型，所述因子誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物分化為感興趣的細(xì)胞類(lèi)型。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型是神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物選自由少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自由GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、01 igl及01 ig2組成的組的標(biāo)記物。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)持續(xù)至少約10天。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包括約IOng / ml rhEGF、約20ng /ml FGF-2及約20ng / ml NGF。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)包括在包含Activin A的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體；以及其后在包含N2補(bǔ)充物-A (N2supplement-A)、B27補(bǔ)充物(B27supplement)及約IOmM煙酰胺(nicotinamide)的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚狀體樣球體。在一些實(shí)施方式中，在第一培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)約48小時(shí)。在一些實(shí)施方式中，在第二培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)至少約12天。在一些實(shí)施方式中，內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自由Nkx6.1、Pdxl及C-肽組成的組的標(biāo)記物。在一些實(shí)施方式中，感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為心肌細(xì)胞或其衍生物。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)持續(xù)至少約15天。在一些實(shí)施方式中，所述培養(yǎng)基包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β I的組合，數(shù)量足以造成胚狀體樣球體細(xì)胞的亞組分化為心肌細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，所述心肌細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自由Nsx2.5 / Csx和GATA-4組成的組的標(biāo)記物。
[0026]在當(dāng)前披露的方法的一些實(shí)施方式中，所述胚狀體樣球體通過(guò)下述制備:(a)提供包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_細(xì)胞群；以及(b)在包含一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)VSEL細(xì)胞的胚狀體樣球體形成的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞達(dá)到足以使胚狀體樣球體出現(xiàn)的時(shí)間。
[0027]當(dāng)前披露的主題還提供了包含在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中的本文披露的分化的非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的制劑。在一些實(shí)施方式中，所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑用于人類(lèi)中是可接受的。
[0028]當(dāng)前披露的主題還提供了用于治療受試者中組織損傷的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括給予受試者包括在藥學(xué)上可接受的載體中包含VSEL干細(xì)胞的多個(gè)分離的⑶45_干細(xì)胞的組合物，數(shù)量和經(jīng)由的途徑足以允許⑶45_干細(xì)胞群的至少一部分結(jié)合(engraft)所述組織并且在其中分化，由此治療損傷。在一些實(shí)施方式中，所述損傷選自由缺血性損傷、心肌梗塞及中風(fēng)組成的組。在一些實(shí)施方式中，受試者為哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，所述哺乳動(dòng)物選自由人類(lèi)和小鼠組成的組。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞的分離的CD45_干細(xì)胞從選自由骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合組成的組的來(lái)源分離。
[0029]在一些實(shí)施方式 中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分化分離的⑶45-干細(xì)胞以在給予受試者所述組合物之前產(chǎn)生預(yù)定的細(xì)胞類(lèi)型。在一些實(shí)施方式中，所述預(yù)定細(xì)胞類(lèi)型選自由神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、心肌細(xì)胞及其衍生物組成的組。
[0030]當(dāng)前披露的主題還提供了用于產(chǎn)生嵌合動(dòng)物的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括將一個(gè)或更多個(gè)包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群添加到胚胎，以便一個(gè)或更多個(gè)CD45—干細(xì)胞發(fā)育為胚胎的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型。在一些實(shí)施方式中，所述添加包括將一個(gè)或更多個(gè)CD45—干細(xì)胞注射入胚泡期胚胎的囊胚腔。在一些實(shí)施方式中，所述添加包括聚集包含VSEL干細(xì)胞的一個(gè)或更多個(gè)⑶45_干細(xì)胞與桑葚胚期胚胎。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括在加入一個(gè)或更多個(gè)包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞后孕育胚胎至少直到出生，以提供嵌合動(dòng)物。
[0031]當(dāng)前披露的主題還提供了用于從⑶45_干細(xì)胞群純化非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞用于感興趣的細(xì)胞類(lèi)型的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)提供包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群；(b)鑒定表達(dá)VSEL干細(xì)胞的標(biāo)記物的0045_干細(xì)胞的亞群；以及(c)純化所述亞群。在一些實(shí)施方式中，所述群和所述亞群除了為⑶45_，均為⑶34+ /CXCR4+ / IirT或Sca-1 / lin—。在一些實(shí)施方式中，包含VSEL干細(xì)胞的⑶45—干細(xì)胞群從選自由骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合組成的組的來(lái)源分離。在一些實(shí)施方式中，感興趣的細(xì)胞類(lèi)型選自由骨骼肌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞及內(nèi)胚層細(xì)胞組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物選自由GFAP、巢蛋白、β III 微管蛋白、Oligl、01ig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白(myogenin)、Nsx2.5 / Csx> GATA-4>甲胎蛋白(a-fetoprotein)、CK19、Nkx2_3、Tcf4、Nkx6.1、Pdxl、VE-鈣粘蛋白、Krt2_5、Krt2-6a、BNC, DCT、TYR及TRP組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為心肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由Nkx2.5 / Csx, GATA-4、MEF2C組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為內(nèi)皮細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由VEGFR2、VE-鈣粘蛋白、血管性血友病因子(yon Willebrand factor)及TIE2組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為骨骼肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由Myf5、MyoD及成肌蛋白組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為肝細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由甲胎蛋白和CK19組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為神經(jīng)細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由β III微管蛋白、01igl、01ig2、GFAP及巢蛋白組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為胰腺細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由Nkx6.1和Pdxl組成的組。在一些實(shí)施方式中，所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為黑色素細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由DCT、TYR及TRP組成的組。
[0032]當(dāng)前披露的主題還提供了用于鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)從已知包含誘導(dǎo)劑的細(xì)胞制備包含多個(gè)cDNA克隆的cDNA文庫(kù)；(b)用cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化不包含誘導(dǎo)劑的多個(gè)細(xì)胞；(c)在足以造成VSEL干細(xì)胞或其衍生物形成胚狀體樣球體的條件下，在轉(zhuǎn)化的多個(gè)細(xì)胞存在下，培養(yǎng)多個(gè)VSEL干細(xì)胞或其衍生物；(d)分離包含誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)化 的細(xì)胞；(e)從轉(zhuǎn)化的細(xì)胞回收cDNA克??；以及(f)鑒定由回收的cDNA克隆編碼的多肽，由此鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑。在一些實(shí)施方式中，已知包括誘導(dǎo)劑的細(xì)胞為C2C12細(xì)胞。在一些實(shí)施方式中，多個(gè)cDNA克隆包括位于克隆載體(cDNA克隆被插入其中)中cDNA克隆位點(diǎn)的至少一側(cè)的側(cè)翼的至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括利用雜交到位于cDNA克隆位點(diǎn)的兩側(cè)的側(cè)翼的引物位點(diǎn)的引物擴(kuò)增轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的cDNA克隆。在一些實(shí)施方式中，所述鑒定是通過(guò)對(duì)cDNA克隆測(cè)序。
[0033]當(dāng)前披露的主題還提供了用于從臍帶血或其部分分離包含VSEL干細(xì)胞的〇045_干細(xì)胞的亞群的方法。在一些實(shí)施方式中，所述方法包括(a)在足以允許每個(gè)抗體與細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合的條件下，將臍帶血或其部分與對(duì)于⑶45特異的第一抗體和對(duì)于⑶34或Sca-1特異的第二抗體接觸；(b)選擇為⑶34+或Sca-I~、并且為CD45_的細(xì)胞的第一亞群；(c)在足以允許每個(gè)抗體與細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)(如果存在)結(jié)合的條件下，將細(xì)胞的第一亞群與對(duì)于選自由CD45R/B220、Gr-1、TCRa β、TCR Y δ、⑶IIb及Ter-119組成的組的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個(gè)或更多個(gè)抗體接觸；(d)從細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的抗體的至少一個(gè)的那些細(xì)胞；以及(e)收集為CD34+ / lin_ / CD45_或Sca- / lin_/CD45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞的亞群。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括在低張溶液中孵育臍帶血或其部分或任何亞群達(dá)到足以基本上裂解可能存在的所有紅細(xì)胞(erythocyte)的時(shí)間。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)前披露的方法進(jìn)一步包括分離對(duì)于CXCR4、c-met、c_kit、或LIF-R的至少一個(gè)為陽(yáng)性的那些細(xì)胞。
[0034]因此，當(dāng)前披露的主題的一個(gè)目的是提供新的干細(xì)胞群，以及制備和應(yīng)用其的方法。這個(gè)目的和其它目的全部或部分通過(guò)當(dāng)前披露的主題實(shí)現(xiàn)。[0035]當(dāng)前披露的主題的一個(gè)目的已經(jīng)在上面陳述，其他目的將隨著結(jié)合下述實(shí)施例和附圖的說(shuō)明的繼續(xù)而變得顯而易見(jiàn)。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1A 和 IB 描繪了 Sca-1+ / IirT / CD45-和 Sca-1+ / IirT / CD45+細(xì)胞的透射電子顯微鏡(TEM)圖像。
[0037]圖1A顯示Sca-1‘ / lin_ / CD45_細(xì)胞較小并且測(cè)量的直徑為3_4 μ m。它們具有由細(xì)胞質(zhì)的窄緣圍繞的較大細(xì)胞核。在超微水平上，細(xì)胞質(zhì)的窄緣具有一些線粒體、分散的核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的小輪廓、以及一些囊泡。細(xì)胞核被包含在具有核孔的核膜內(nèi)。染色質(zhì)松散的包裝(packed)并由常染色質(zhì)構(gòu)成。圖1B顯示與之相反，Sca-1’ / IirT /⑶45+細(xì)胞表現(xiàn)為異源形態(tài)并且較大。它們的平均測(cè)量直徑為8-10 μ m,并具有分散的染色質(zhì)和突出的核仁。
[0038]圖2描繪了熒光顯微圖像，描繪了對(duì)Sca-1’ / IirT /⑶45_細(xì)胞的表達(dá)研究的結(jié)果并表明Sca-1‘ / IirT / CD45_細(xì)胞是SSEA-1‘并表達(dá)0ct_4和Nanog。如左側(cè)所示，通過(guò)FACS分離的Sca-1’ / lin_ / 0)45_細(xì)胞被評(píng)估SSEA-1、0ct_4及Nanog的表達(dá)。所有的圖像在Plan Apo60XA / 1.40油性物鏡(Nikon，Japan)下采集。右側(cè)示出了在 ADOBE?PHOTOSHOP?1 CS 軟件(Adobe System Incorporated, San Jose,California, United States of America)中進(jìn)行的代表性細(xì)胞(箭頭)的IOx放大的圖像。陰性染色對(duì)照未示出。對(duì)從四個(gè)獨(dú)立類(lèi)別分離的細(xì)胞進(jìn)行染色。示出了代表性數(shù)據(jù)。
[0039]圖3A-3C 描繪了對(duì) Sca-1+ / lin_ / CD45-的 CXCR4、c_met 和 LIF-R 的表達(dá)研究的結(jié)果。
[0040]圖3A描繪了RT-PCR產(chǎn)物在其上分離并用溴化乙錠染色的凝膠的圖像，并描繪了Sca-1+ / lin_ / CD45-中對(duì)于 CXCR4 (泳道(lane) I)、c_Met (泳道 3)和 LIF-R (泳道 5)的mRNA的表達(dá)結(jié)果。RT-PCR進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。陰性RT-PCR反應(yīng)(DNA代替cDNA:泳道2、4和6)。示出了來(lái)自三個(gè)獨(dú)立的類(lèi)別的代表性結(jié)果。圖3B描繪了通過(guò)FACS分離并通過(guò)免疫組織化學(xué)染色評(píng)估CXCR4、c-Met和LIF-R的表達(dá)的Sca-1’ / IirT / CD45—細(xì)胞的熒光顯微圖像(在Plan Apo60XA / 1.40油性物鏡(Nikon，Japan)下采集圖像)。未示出陰性染色對(duì)照。示出了來(lái)自四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)的代表性結(jié)果。圖3C是描繪了通過(guò)包含SDF-1或不包含SDF-1 (陰性對(duì)照)的MATRIGEL?滴狀物的Sca-r/lin— / CD45—細(xì)胞的化學(xué)引誘研究結(jié)果。示出了每IOOym的MATRIGEL?滴狀物周長(zhǎng)的化學(xué)引誘的Sca-1‘ / lin_ /⑶45_細(xì)胞的數(shù)量。從三個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)收集數(shù)據(jù)。*與對(duì)照MATRIGEL?相比ρ〈0.00001。
[0041]圖4Α和4Β描繪了 FACS分類(lèi)從不同年齡的動(dòng)物分離的Sca-1’ / IirT / CD45—細(xì)胞的結(jié)果。
[0042]圖4Α是從源自3周大(上側(cè))和I歲大的小鼠(下側(cè))的BMMNC分類(lèi)的細(xì)胞的FACS點(diǎn)圖。左側(cè)描繪了鼠BMMNC的點(diǎn)圖。作為Sca-1‘ / I in_ (中側(cè))的來(lái)自淋巴門(mén)(lymphoid gate)的細(xì)胞通過(guò)對(duì)于⑶45表達(dá)的FACS進(jìn)行分類(lèi)(右側(cè))。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的分類(lèi)實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類(lèi)8只小鼠的BM被收集)。示出了代表性類(lèi)別。圖4B是條形圖，描繪了在通過(guò)FACS分離來(lái)自3周大和I歲大的小鼠的Sca-1‘ / lin_ / CD45_細(xì)胞中PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)，并通過(guò)相同數(shù)量的分類(lèi)細(xì)胞之間的RQ-PCR進(jìn)行比較。進(jìn)行四個(gè)獨(dú)立的分類(lèi)實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類(lèi)收集8只小鼠的BM)。數(shù)據(jù)是平均數(shù)土SD。*p〈0.01vS.來(lái)自年老動(dòng)物的細(xì)胞。
[0043]圖5是條形圖，描繪了來(lái)自具有相對(duì)長(zhǎng)的生命期的小鼠品系(C57BL / 6)的細(xì)胞數(shù)量與具有相對(duì)短的生命期的小鼠品系(DBA / 2J)的細(xì)胞數(shù)量的比較結(jié)果。所述圖示出了與C57BL / 6小鼠相比，DBA/2J小鼠中Sca-1+ / IirT / CD45_細(xì)胞的數(shù)量減少。通過(guò)相同數(shù)量的分類(lèi)細(xì)胞之間的RQ-PCR比較通過(guò)FACS從三周大DBA/2J和C57BL / 6小鼠分離的Sca-1+ / IirT /⑶45-細(xì)胞中PSC和VSEL干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的分類(lèi)實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類(lèi)6只小鼠的BM被收集)。數(shù)據(jù)是平均數(shù)土SD。*p〈0.01vS.來(lái)自年老DBA / 2J小鼠的細(xì)胞。
[0044]圖6A和6B描繪了骨髓單核細(xì)胞(BMMNC)的側(cè)群(SP)的分類(lèi)。
[0045]圖6A是描繪BMMNC的SP的FACS分類(lèi)的點(diǎn)圖。圖6B是條形圖，描繪了通過(guò)FACS從 3 周大的小鼠分離的 BMMNC、SP、SP Sca-1+ / IirT / CD45'SP Sca-1+ / IirT / CD45+、Sca-1+ / IirT / CD45-和 Sca-1+ / IirT / CD45+細(xì)胞中的 PSC 和 VSEL 干細(xì)胞標(biāo)記物的mRNA的表達(dá)，并通過(guò)相同數(shù)量的分類(lèi)細(xì)胞之間的RQ-PCR進(jìn)行比較。進(jìn)行三個(gè)獨(dú)立的分類(lèi)實(shí)驗(yàn)(對(duì)于每類(lèi)，8只小鼠的BM被收集)。數(shù)據(jù)以平均數(shù)土SD表示。*p〈0.01vS.來(lái)自年老動(dòng)物的細(xì)胞。[0046]圖7是四個(gè)點(diǎn)圖，描繪了細(xì)胞的多個(gè)亞群的移植結(jié)果和這些細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)期血細(xì)胞生成的貢獻(xiàn)。Sca-1+ / IirT /⑶45_細(xì)胞不會(huì)有助于長(zhǎng)期血細(xì)胞生成。Ly5.2小鼠被移植以來(lái)自 Ly5.1 小鼠的 IO4 個(gè) Sca-1+ / lin_ / CD45+或 2 X IO4 個(gè) Sca-1+ / lin_ / CD45-細(xì)胞，并且與IO6個(gè)BMMNC Ly5.2細(xì)胞一起移植入Ly5.2受體小鼠，在移植后8個(gè)月通過(guò)FACS評(píng)估Ly5.1細(xì)胞的存在。上側(cè)描繪了來(lái)自外周血的MNC的分析。下側(cè)描繪了來(lái)自骨髓的MNC的分析。示出了代表性結(jié)果。
[0047]圖8A和8B描繪了熒光顯微圖像，描繪了具有對(duì)于SSEA-1 (圖8A;4個(gè)圖板)或0ct-4(圖8B)特異的抗體的Sca-1+ / lin_ / CD45_BM細(xì)胞的ES樣球體的染色。
[0048]圖9A和9B描繪了在C2C12細(xì)胞上的GFP+Sca-1+ / IirT / αΜδ?Μ細(xì)胞的胚狀體樣球體的形成。
[0049]圖9Α描繪了在實(shí)施例20所述的條件下，共培養(yǎng)Sca-1+ / IirT /⑶45—ΒΜ細(xì)胞與C2C12細(xì)胞后胚狀體(EB)-樣球體的顯微圖像。圖9Β是描繪Sca-1+ / IirT /⑶45—細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)表達(dá)的熒光顯微圖像，表明這些胚狀體源自從綠色免疫熒光陽(yáng)性(GFP+)小鼠(購(gòu)自 The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, United States ofAmeric 的 C57BL/6-Tg(ACTB-EGFP) IOsb / J 小鼠)分離的純化 Sca-1+ / IirT / CD45—BM細(xì)胞，并且不是C2C12細(xì)胞。
[0050]圖10是從鼠淋巴結(jié)分離的碘化丙唳(propidium iodide)染色的細(xì)胞、HSC(造血干細(xì)胞；Sca-l+/lin7CD45+)或 VSEL 干細(xì)胞(Sca-l./lirT / CD450 的一系列點(diǎn)圖。
[0051]圖1IA-1IG是鼠骨髓細(xì)胞的FACS分析的系列點(diǎn)圖。
[0052]圖1lA是低張裂解后鼠骨髓MNC的點(diǎn)圖。圖1lB是示出了來(lái)自Rl門(mén)(Rlgate)用于譜系標(biāo)記物表達(dá)和CD45抗原的細(xì)胞的染色的點(diǎn)圖。在這個(gè)圖中，R2示出了譜系-和CD45陰性BM MNC。分析來(lái)自Rl和R2的細(xì)胞的Sca-1的表達(dá)和HLA_DR(參見(jiàn)圖11C)、MHC I類(lèi)(參見(jiàn)圖11D)、CD29(參見(jiàn)圖11E)、CD90(參見(jiàn)圖11F)及⑶105 (參見(jiàn)圖11G)抗原的共表達(dá)。
[0053]圖12是來(lái)自VSEL干細(xì)胞衍生的球體(VSEL-DS)的碘化丙啶染色的細(xì)胞的系列點(diǎn)圖。示出了三個(gè)獨(dú)立的代表性實(shí)施例。
[0054]圖13描繪了對(duì)從D3胚胎干細(xì)胞(ED-D3 ;頂側(cè))形成的胚狀體和從VSEL干細(xì)胞(底側(cè))形成的胚狀體樣球體進(jìn)行堿性(alpkaline)磷酸酶(AP)染色的圖。
[0055]圖14描繪了熒光顯微圖像，表明VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體表達(dá)早期胚胎發(fā)育標(biāo)記物如 SSEA-1、GATA-6、GATA-4、FOXDl 及 Nanog。
[0056]圖15描繪了在VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體中存在的細(xì)胞的透射電子顯微鏡圖，表明這些細(xì)胞在尺寸上大于它們來(lái)源的初始VSEL干細(xì)胞(圖15，上側(cè))，但仍具有非常原始的包含常染色質(zhì)的細(xì)胞核。圖15的中側(cè)描繪了在用SDF-1、HGF / SF及LIF刺激從VSEL干細(xì)胞-衍生的胚狀體樣球體分離的細(xì)胞后MAPKp42 / 44的磷酸化研究結(jié)果，表明相應(yīng)的受體(分別為SDF-1、HGF / SF及LIF)在這些細(xì)胞的表面表達(dá)。并且最后，圖15的下側(cè)描繪了從來(lái)自VSEL干細(xì)胞衍生的胚狀體樣球體的細(xì)胞的連續(xù)傳代分離的細(xì)胞的RT-PCR分析結(jié)果，其揭示了調(diào)節(jié)胚狀體的原腸胚形成的基因(如GATA-6、Cdx2、Sox2、HNF3及AFP)的mRNA的表達(dá)增加。
[0057]圖16A-16C和圖17A-17D描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞(圖16A-16C)或神經(jīng)元(圖17A-17D)。細(xì)胞用針對(duì)巢蛋白的抗體染色，其利用Alexa Fluor594_標(biāo)記的山羊抗-小鼠IgG第二抗體檢測(cè),其給予紅色突光。用抗-綠色突光蛋白Alexa Fluor488結(jié)合物檢測(cè)細(xì)胞中存在的GFP (綠色熒光)，并且細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色熒光)。
[0058]圖18A-18C描繪了熒光顯微鏡圖像，描繪了 ES樣球體分化為表達(dá)胰腺細(xì)胞的標(biāo)記物(C-肽)的內(nèi)胚層細(xì)胞。
[0059]圖19A-19C和20A-20D描繪了熒光顯微圖像，描繪了 ES樣球體分化為心肌細(xì)胞。這些細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)，表明心肌細(xì)胞源于由GFP+Sca-1+ / IirT /⑶45—BM細(xì)胞形成的胚狀體。細(xì)胞用針對(duì)肌鈣蛋白I或α橫紋肌輔肌動(dòng)蛋白的抗體染色(分別為圖19和20)，其利用Alexa Fluor594-結(jié)合的第二抗體檢測(cè)，其給予紅色熒光。用抗-綠色熒光蛋白Alexa Fluor488結(jié)合物檢測(cè)細(xì)胞中存在的GFP (綠色熒光)，細(xì)胞核用DAPI染色(藍(lán)色熒光)。
[0060]圖21A-21C描繪了對(duì)來(lái)自單VSEL干細(xì)胞衍生的球體的細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR的結(jié)果，其表明這些細(xì)胞可以分化為心肌細(xì)胞(中胚層；參見(jiàn)圖21A)、神經(jīng)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞(外胚層；參見(jiàn)圖21B)及胰腺或肝細(xì)胞(內(nèi)胚層；參見(jiàn)圖21C)。
[0061]圖22A-22I描繪了表明培養(yǎng)的細(xì)胞中心臟-特異性抗原的表達(dá)的免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡照片。
[0062]圖22A-22C 和 22D-22F 描繪了其中 Sca-1+ / IirT / CD45-BMMNC 被培養(yǎng)的培養(yǎng)板的圖像。具有Sca-1+ / IirT /⑶45_細(xì)胞的板中的許多細(xì)胞對(duì)于心臟-特異的肌球蛋白重鏈?zhǔn)顷?yáng)性的(圖22B、22C、22E及22F;綠色熒光)。這些心臟-特異性肌球蛋白重鏈-陽(yáng)性的細(xì)胞中的許多對(duì)于心臟肌鈣蛋白I也是陽(yáng)性的(圖22D和22F[箭頭];紅色熒光)。圖22G-22I是其中Sca-1+ / IirT /⑶45+細(xì)胞被培養(yǎng)的培養(yǎng)板的圖像。這些細(xì)胞對(duì)于前述心臟-特異性抗原的表達(dá)基本上是陰性的(參見(jiàn)圖22H)。通過(guò)DAPI染色鑒定圖22A-22I中的每個(gè)的細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)。比例尺(Scale bar) =20 μ m。
[0063]圖23描繪了 Sca- / lin_ /⑶45_細(xì)胞的FACS分類(lèi)結(jié)果，表明能夠被分類(lèi)的這些細(xì)胞的產(chǎn)量隨著供體動(dòng)物的年齡而降低。
[0064]圖24是描繪作為年齡的函數(shù)的小鼠骨髓中存在的VSEL干細(xì)胞(左側(cè))和HSC (右偵D的百分?jǐn)?shù)的兩幅圖。
[0065]圖25是兩幅圖，描繪了從較老的小鼠分離的VSEL干細(xì)胞形成胚狀體樣球體的能力下降(左側(cè))以及根據(jù)小鼠(細(xì)胞從其分離)的年齡的VSEL干細(xì)胞的培養(yǎng)物中CD45+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)增加(右側(cè))。
[0066]圖26為從5周大的小鼠(左側(cè))與2.5歲大的小鼠(右側(cè))分離的VSEL干細(xì)胞的不同表達(dá)模式。在左側(cè)中，示出了免疫熒光和透射共聚焦顯微鏡圖像，表明來(lái)自5周大的小鼠的培養(yǎng)的細(xì)胞中不同造血抗原的表達(dá)。在右側(cè)中，示出了在從2.5歲大的小鼠分離的VSEL干細(xì)胞中，CD45被表達(dá)并且所述細(xì)胞能夠在甲基纖維素培養(yǎng)基中的第二培養(yǎng)基中生長(zhǎng)造血集落。
[0067]圖27A-27B描繪了 人類(lèi)臍帶血的FACS分類(lèi)結(jié)果。
[0068]圖27A 示出了人類(lèi) CB 包含表達(dá) CXCR4 (0.037+0.02%, n=9)、CD34 (0.118+0.028%,n=5)及 CD133(0.018+0.008%，n=5)的 IirT / CD45TMNC 群。圖 27B 表明這些 CXCR4+ /CD133./ CD34./ IirT / CD45_細(xì)胞非常小(約3-5 μ m ;圖27B，上側(cè))，而CB-來(lái)源的IirT / CD45+造血細(xì)胞較大(>6口111;圖278，下側(cè))。
[0069]圖28A-28C描繪了對(duì)來(lái)自人類(lèi)臍帶血的分類(lèi)的細(xì)胞的基因表達(dá)研究結(jié)果。
[0070]圖28A和28B是條形圖，顯示通過(guò)FACS分類(lèi)的CB-來(lái)源的CXCR4+ / CD133+ /CD34./ IirT / CD45-細(xì)胞、以及 CXCR4+/lirT / CD45'CD34+ / IirT / CD45'以及 CD133+/lin_ /⑶45_ /細(xì)胞高度富集由多能胚胎細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子如Oct-4和Nanog的mRNA。圖28C示出了確認(rèn)FACS分析的RT-PCR結(jié)果。
[0071]圖29描繪了 CB-VSEL干細(xì)胞的免疫熒光染色結(jié)果，表明高度純化的CB-來(lái)源的CXCR47lirT / CD45-細(xì)胞在它們的表面上表達(dá)SSEA-4并且在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)Oct-4和Nanog轉(zhuǎn)錄因子。
[0072]圖30描繪了三種不同的CB-VSEL干細(xì)胞的光學(xué)顯微(photomicroscopic)圖片，表明這些細(xì)胞非常小~3-5 μ m，并包含相對(duì)大的細(xì)胞核和具有許多線粒體的細(xì)胞質(zhì)的窄緣。這些細(xì)胞的細(xì)胞核中的DNA包含作為多能胚胎干細(xì)胞的特征的開(kāi)放型常染色質(zhì)。
[0073]圖31A-31C描繪了光學(xué)顯微圖片，表明來(lái)源于GFP+小鼠的VSEL干細(xì)胞-DS如果被平鋪在補(bǔ)充有IL-3+GM-CSF的甲基纖維素培養(yǎng)基中可以形成小的第二球體(圖31A和31B)。通過(guò)從初始甲基纖維素培養(yǎng)基的甲基纖維素溶解回收的這些第二球體制備的單細(xì)胞懸浮液，如果再次平鋪在甲基纖維素培養(yǎng)基(圖31B)或血漿凝塊(圖31C)中并由IL-3和GM-CSF刺激，形成造血集落。這些為造血集落的證據(jù)通過(guò)FACS分析來(lái)自甲基纖維素中生長(zhǎng)的溶解集落的細(xì)胞的CD45表達(dá)或通過(guò)免疫熒光染色來(lái)自血漿凝塊培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的集落的細(xì)胞的⑶45而獲得。
[0074]圖32是用于從人類(lèi)臍帶血分離VSEL干細(xì)胞的基于FACS的策略的略圖。
[0075]序列表的簡(jiǎn)單描沭
[0076]SEQ ID Nos:1_64是可以用于擴(kuò)增多個(gè)鼠核酸序列的32個(gè)引物對(duì)的核苷酸序列，總結(jié)于表1中。
【權(quán)利要求】
1.一種用于從非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞或其衍生物的群體形成胚狀體樣球體的方法，所述方法包括: (a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的⑶45_細(xì)胞群；以及 (b)在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)VSEL干細(xì)胞或其衍生物達(dá)足以使胚狀體樣球體形成的時(shí)間。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述VSEL干細(xì)胞或其衍生物包含⑶34+/ IirT /CD45—或Sca-I^ / IirT / CD45—非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述VSEL干細(xì)胞的直徑約為3-4μ m，表達(dá)SSEA-1、Oct-4、Rev-1、和Nanog的至少一種，具有由細(xì)胞質(zhì)的窄緣圍繞的大細(xì)胞核，并且具有開(kāi)放型染色質(zhì)(常染色質(zhì))。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群從人或從小鼠分離。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的CD45_細(xì)胞群從人或小鼠中選自由骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合的組的來(lái)源分離。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)生長(zhǎng)因子包括表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2及其組合。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)將所述VSEL干細(xì)胞或其衍生物與C2C12細(xì)胞共培養(yǎng)將所述一個(gè)或更多個(gè)因子提供給所述VSEL干細(xì)胞或其衍生物。
8.權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括通過(guò)包含下列步驟的方法分離包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的⑶45_細(xì)胞群: (a)提供懷疑包含CD45_干細(xì)胞的初始細(xì)胞群； (b)在足以允許每個(gè)抗體與，如果存在時(shí)，在初始細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)結(jié)合的條件下將所述初始細(xì)胞群與對(duì)于CD45特異的第一抗體和對(duì)于CD34或Sca-1特異的第二抗體接觸； (c)選擇為⑶34+或Sca-I^、并且還是⑶45_的細(xì)胞的第一亞群； (d)在足以允許每個(gè)抗體與，如果存在時(shí)，在所述細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)結(jié)合的條件下將所述細(xì)胞的第一亞群與對(duì)于一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個(gè)或更多個(gè)抗體接觸，所述標(biāo)記物選自由CD45R / B220、Gr-UTCRa β、TCR Y δ、CDllb及Ter-119組成的組； (e)從所述細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的所述抗體的至少一個(gè)的那些細(xì)胞；以及 (f)收集為CD34+/ lin_ / CD45_或Sca-I^ / lin_ / CD45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離⑶45_干細(xì)胞的亞群。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中每個(gè)抗體包括可檢測(cè)的標(biāo)記。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記包括熒光標(biāo)記或者可以通過(guò)包含突光標(biāo)記的試劑被檢測(cè)的部分。
11.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述分離包括FACS分類(lèi)。
12.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括分離為c-met+、c_kit+、和/或LIF-R+的那些細(xì)胞。
13.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括分離表達(dá)選自由SSEA-1、Oct-4、Rex-1及Nanog組成的組的一個(gè)或更多個(gè)基因的那些細(xì)胞。
14.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述細(xì)胞群包括骨髓樣品、臍帶血樣品、或外周血樣品。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中在用足以將包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞從骨髓移動(dòng)到受試者的外周血的量的移動(dòng)劑處理所述受試者后，所述細(xì)胞群從所述受試者的外周血分離。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述移動(dòng)劑包括粒細(xì)胞-集落刺激因子(G-CSF)和CXCR4拮抗劑的至少一種。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中所述CXCR4拮抗劑是T140肽。
18.權(quán)利要求15所述的方法，其中所述受試者是小鼠。
19.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括將所述干細(xì)胞的亞群與結(jié)合到CXCR4的抗體接觸以及從所述干細(xì)胞的亞群分離為CXCR4+的那些細(xì)胞。
20.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括分離為CXCR4+和/或AC133+的那些細(xì)胞。
21.權(quán)利要求8所述的方法，進(jìn)一步包括選擇為HLA-DR'MHCI類(lèi)-、⑶90'⑶29'⑶105'或其組合的那些細(xì)胞。
22.一種包含多個(gè)非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的胚狀體樣球體。
23.—種包含權(quán)利要求22所述的胚狀體樣球體的細(xì)胞培養(yǎng)物，所述胚狀體樣球體在包含誘導(dǎo)VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體形成的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中。
24.一種將非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞分化為感興趣的細(xì)胞類(lèi)型的方法，所述方法包括: (a)提供包含VSEL干細(xì)胞或其衍生物的胚狀體樣球體；以及 (b)在包含分化誘導(dǎo)量的一個(gè)或更多個(gè)因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述胚狀體樣球體直到所述培養(yǎng)物中出現(xiàn)所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型，所述因子誘導(dǎo)所述VSEL干細(xì)胞或其衍生物分化為所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型。
25.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型選自由神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞及心肌細(xì)胞及其衍生物組成的組。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型是神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物。
27.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物選自由少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元組成的組。
28.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述神經(jīng)元細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自由GFAP、巢蛋白、β III微管蛋白、Oligl及01ig2組成的組的標(biāo)記物。
29.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述培養(yǎng)持續(xù)至少約10天。
30.權(quán)利要求26所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包括約IOng/ mlrhEGF、約20ng / mlFGF-2 及約 20ng / ml NGF。
31.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物。
32.權(quán)利要求31所述的方法，其中所述培養(yǎng)包括在包含ActivinA的第一培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述胚狀體樣球體；以及其后在包含N2補(bǔ)充物-A、B27補(bǔ)充物及約IOmM煙酰胺的第二培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述胚狀體樣球體。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中在所述第一培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)約48小時(shí)。
34.權(quán)利要求32所述的方法，其中在所述第二培養(yǎng)基中的培養(yǎng)持續(xù)至少約12天。
35.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述內(nèi)胚層細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自由Nkx6.1、Pdxl及C-肽組成的組的標(biāo)記物。
36.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為心肌細(xì)胞或其衍生物。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述培養(yǎng)持續(xù)至少約15天。
38.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述培養(yǎng)基包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子βI的組合，數(shù)量足以造成所述胚狀體樣球體細(xì)胞的亞組分化為心肌細(xì)胞。
39.權(quán)利要求36所述的方法，其中所述心肌細(xì)胞或其衍生物表達(dá)選自由Nsx2.5 / Csx和GATA-4組成的組的標(biāo)記物。
40.權(quán)利要求24所述的方法，其中所述胚狀體樣球體通過(guò)下述制備: (a)提供包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_細(xì)胞群；以及 (b)在包含一個(gè)或更多個(gè)誘導(dǎo)所述VSEL細(xì)胞 的胚狀體樣球體形成的因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述VSEL干細(xì)胞達(dá)到足以使胚狀體樣球體出現(xiàn)的時(shí)間。
41.一種包含在藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑中的權(quán)利要求24所述的分化的非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞的制劑。
42.權(quán)利要求41所述的制劑，其中所述藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑用于人類(lèi)中是可接受的。
43.一種用于治療受試者中組織損傷的方法，所述方法包括給予所述受試者包括在藥學(xué)上可接受的載體中的包含VSEL干細(xì)胞的多個(gè)分離的0045_干細(xì)胞的組合物，數(shù)量和經(jīng)由的途徑足以允許CD45_干細(xì)胞群的至少一部分結(jié)合所述組織并且在其中分化，由此治療所述損傷。
44.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述損傷選自由缺血性損傷、心肌梗塞及中風(fēng)組成的組。
45.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述受試者為哺乳動(dòng)物。
46.權(quán)利要求45所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物選自由人類(lèi)和小鼠組成的組。
47.權(quán)利要求43所述的方法，其中所述包含VSEL干細(xì)胞的分離的CD45_干細(xì)胞從選自由骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合組成的組的來(lái)源分離。
48.權(quán)利要求43所述的方法，進(jìn)一步包括分化所述分離的CD45_干細(xì)胞以在給予所述受試者所述組合物之前產(chǎn)生預(yù)定的細(xì)胞類(lèi)型。
49.權(quán)利要求48所述的方法，其中所述預(yù)定細(xì)胞類(lèi)型選自由神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)胚層細(xì)胞、心肌細(xì)胞及其衍生物組成的組。
50.一種產(chǎn)生嵌合動(dòng)物的方法，所述方法包括將一個(gè)或更多個(gè)包含VSEL干細(xì)胞的CD45_干細(xì)胞群添加到胚胎，以便所述一個(gè)或更多個(gè)CD45_干細(xì)胞發(fā)育為所述胚胎的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型。
51.權(quán)利要求50所述的方法，其中所述添加包括將所述一個(gè)或更多個(gè)CD45_干細(xì)胞注射入胚泡期胚胎的所述囊胚腔。
52.權(quán)利要求50所述的方法,其中所述添加包括聚集包含所述VSEL干細(xì)胞的所述一個(gè)或更多個(gè)CD45—干細(xì)胞與桑葚胚期胚胎。
53.權(quán)利要求50所述的方法，進(jìn)一步包括在加入一個(gè)或更多個(gè)包含所述VSEL干細(xì)胞的所述CD45_干細(xì)胞后孕育所述胚胎至少直到出生，以提供嵌合動(dòng)物。
54.一種從0045_干細(xì)胞群純化非常小的胚胎樣(VSEL)干細(xì)胞用于感興趣的細(xì)胞類(lèi)型的方法，所述方法包括 (a)提供包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞群； (b)鑒定表達(dá)VSEL干細(xì)胞的標(biāo)記物的所述CD45_干細(xì)胞的亞群；以及 (c)純化所述亞群。
55.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述群和所述亞群除了為⑶45_，均為⑶34+/CXCR4+ / Iirf 或 Sca-1+ / lirf。
56.權(quán)利要求55所述的方法，其中包含VSEL干細(xì)胞的所述CD45_干細(xì)胞群從選自由骨髓、外周血、脾、臍帶血及其組合組成的組的來(lái)源分離。
57.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型選自由骨骼肌細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、表皮細(xì)胞、黑色素細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、心肌細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素細(xì)胞及內(nèi)胚層細(xì)胞組成的組。
58.權(quán)利要求58所述的方法，其中所述標(biāo)記物選自由GFAP、巢蛋白、βIII微管蛋白、01igl、01ig2、Myf5、MyoD、成肌蛋白、Nsx2.5 / Csx、GATA_4、甲胎蛋白、CK19、Nkx2_3、Tcf4、Nkx6.1、Pdxl、VE-鈣粘蛋白、Krt2_5、Krt2_6a、BNC, DCT, TYR 及 TRP 組成的組。
59.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為心肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由 Nkx2.5 / Csx、GATA-4、MEF2C 組成的組。
60.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為內(nèi)皮細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由VEGFR2、VE-鈣粘蛋白、血管性血友病因子及TIE2組成的組。
61.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為骨骼肌細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由Myf5、MyoD及成肌蛋白組成的組。
62.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為肝細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由甲胎蛋白和CK19組成的組。
63.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為神經(jīng)細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由β III微管蛋白、01igl、01ig2、GFAP及巢蛋白組成的組。
64.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為胰腺細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由Nkx6.1和Pdxl組成的組。
65.權(quán)利要求55所述的方法，其中所述感興趣的細(xì)胞類(lèi)型為黑色素細(xì)胞，所述標(biāo)記物選自由DCT、TYR及TRP組成的組。
66.一種鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑的方法，所述方法包括: (a)從已知包含所述誘導(dǎo)劑的細(xì)胞制備包含多個(gè)cDNA克隆的cDNA文庫(kù)； (b)用所述cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化不包含所述誘導(dǎo)劑的多個(gè)細(xì)胞； (c)在所述轉(zhuǎn)化的多個(gè)細(xì)胞存在下，培養(yǎng)多個(gè)VSEL干細(xì)胞或其衍生物，其培養(yǎng)條件足以造成所述VSEL干細(xì)胞或其衍生物形成胚狀體樣球體； (d)分離包含所述誘導(dǎo)劑的所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞； (e)從所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞回收cDNA克?。灰约?f)鑒定由回收的所述cDNA克隆編碼的多肽，由此鑒定胚狀體樣球體形成的誘導(dǎo)劑。
67.權(quán)利要求66所述的方法，其中已知包括所述誘導(dǎo)劑的所述細(xì)胞為C2C12細(xì)胞。
68.權(quán)利要求66所述的方法，其中所述多個(gè)cDNA克隆包括位于所述cDNA克隆被插入其中的克隆載體中cDNA克隆位點(diǎn)的至少一側(cè)的側(cè)翼的至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。
69.權(quán)利要求68所述的方法，進(jìn)一步包括利用雜交到位于所述cDNA克隆位點(diǎn)的兩側(cè)的側(cè)翼的引物位點(diǎn)的引物擴(kuò)增所述轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中存在的所述cDNA克隆。
70.權(quán)利要求66所述的方法，其中所述鑒定是通過(guò)對(duì)所述cDNA克隆測(cè)序進(jìn)行的。
71.一種從臍帶血或其部分分離包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞的亞群的方法，所述方法包括: (a)在足以允許每個(gè)抗體與，如果存在時(shí)，在所述細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)結(jié)合的條件下，將所述臍帶血或其部分與對(duì)于CD45特異的第一抗體和對(duì)于CD34或Sca-1特異的第二抗體接觸； (b)選擇為⑶34+或Sca-、并且為⑶45_的細(xì)胞的第一亞群； (c)在足以允許每個(gè)抗體與，如果存在時(shí)，在所述細(xì)胞群的每個(gè)細(xì)胞上的它的靶標(biāo)結(jié)合的條件下，將所述細(xì)胞的第 一亞群與對(duì)于選自由⑶45R / B220、Gr-1、TCRa β、TCR Y δ、⑶Ilb及Ter-119組成的組的一個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞表面標(biāo)記物特異的一個(gè)或更多個(gè)抗體接觸； (d)從所述細(xì)胞的第一亞群去除結(jié)合到步驟(d)的所述抗體的至少一個(gè)的那些細(xì)胞；以及 (e)收集為CD34+/ IirT / CD45—或Sca- / IirT / CD45_的細(xì)胞的第二亞群，由此分離包含VSEL干細(xì)胞的⑶45_干細(xì)胞的亞群。
72.權(quán)利要求71所述的方法，進(jìn)一步包括在低張溶液中孵育所述臍帶血或其部分或所述亞群的任何一個(gè)達(dá)到足以基本上裂解可能存在的所有紅細(xì)胞的時(shí)間。
73.權(quán)利要求71所述的方法，進(jìn)一步包括分離對(duì)于CXCR4、c-met、c-kit、或LIF-R的至少一個(gè)為陽(yáng)性的那些細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61K35/14GK103952373SQ201310618525
【公開(kāi)日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2006年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2005年12月8日
【發(fā)明者】M·拉塔查克, M·庫(kù)恰, J·拉塔查克 申請(qǐng)人:路易斯維爾大學(xué)研究基金會(huì)有限公司