一種金黃色葡萄球菌疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種金黃色葡萄球菌疫苗制劑及其制備方法。本發(fā)明的疫苗制劑免疫原性強(qiáng)，活性高，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的保護(hù)性免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用，從而抵御金黃色葡萄球菌感染。本發(fā)明的制備方法保證了疫苗抗原四種組分的吸附均一性和穩(wěn)定性，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。
【專利說明】一種金黃色葡萄球菌疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種金黃色葡萄球菌疫苗制劑及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA),以下簡(jiǎn)稱金葡菌,有“嗜肉菌”的別稱。作為革蘭氏陽性菌的代表，它是引起醫(yī)院感染和社區(qū)感染的一種重要致病菌。感染以急性、化膿性炎癥為特征，局部感染可引起皮膚和軟組織等的化膿性感染，經(jīng)久不愈；全身感染可導(dǎo)致骨髓炎、膿毒性關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎、膿毒血癥等嚴(yán)重感染及并發(fā)癥，死亡率高達(dá)20%。同時(shí)，金葡菌的外毒素還可引起食物中毒、燙傷樣皮膚綜合征和中毒性休克綜合征等全身致死性感染。
[0003]隨著抗生素長(zhǎng)期、廣泛地使用，細(xì)菌耐藥性問題日益突出，作為典型代表的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)自 1961 年首次被發(fā)現(xiàn)以來，已成為全球ICU病房、術(shù)后感染、燒傷、戰(zhàn)創(chuàng)傷等感染率最高的醫(yī)院內(nèi)感染病原菌之一。同時(shí)，因其致病性強(qiáng)、傳播途徑廣泛、易暴發(fā)流行且呈多重耐藥性發(fā)展而成為臨床上治療的難點(diǎn)，又被稱為“第一超級(jí)細(xì)菌”。
[0004]據(jù)美國(guó)⑶C報(bào)道，美國(guó)平均每年MRSA嚴(yán)重感染人數(shù)約為9萬人，致死病例約為2萬人。中國(guó)2011年全國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)報(bào)告顯示:臨床MRSA檢出率平均為60%，廣泛耐藥率超過40%。當(dāng)前MRSA已與乙型肝炎、AIDS被列為世界三大最難解決的感染性疾病，并位居首位。萬古霉素是目前治療MRSA感染的最后一道防線，但1997年以來耐萬古霉素的MRSA菌株相繼出現(xiàn)，并在全球呈蔓延趨勢(shì)，使MRSA感染面臨“無藥可治”的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。
[0005]針對(duì)耐藥金葡菌感染的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)，WHO于2011年提出“抵抗耐藥菌”的“六點(diǎn)政策一攬子計(jì)劃”，并強(qiáng)調(diào)未來重點(diǎn)支持創(chuàng)新性疫苗等免疫防控制品的研發(fā)。因此，加強(qiáng)對(duì)金葡菌感染的免疫防治研究，研制安全、有效的新型金葡菌基因工程疫苗將對(duì)有效控制金葡菌耐藥性蔓延和臨床金葡菌廣泛感`染具有重要的戰(zhàn)略及現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種新的金黃色葡萄球菌疫苗制劑，用于預(yù)防和治療金黃色葡萄球菌感染及因此引發(fā)的膿毒血癥等相關(guān)感染性疾病。
[0007]在第一個(gè)方面，本發(fā)明的疫苗制劑包括SpA5蛋白，所述SpA5蛋白的序列選自SEQID N0.1~4任一條序列ο
[0008]優(yōu)選地，所述疫苗制劑還包括MntC、mSEB和HI蛋白中的一種或多種。
[0009]在另一方面，本發(fā)明提供一種制備發(fā)明的疫苗制劑的方法，包括:將鋁佐劑與疫苗抗原蛋白分開稀釋后再混合和/或吸附。
[0010]本發(fā)明的疫苗制劑免疫原性強(qiáng)，活性高，能夠有效刺激機(jī)體產(chǎn)生高效的保護(hù)性免疫應(yīng)答和良好的免疫保護(hù)作用，從而抵御金黃色葡萄球菌感染。本發(fā)明的制備方法保證了疫苗抗原四種組分的吸附均一性和穩(wěn)定性，提高了生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0011]圖1、為實(shí)施例4中SDS-PAGE結(jié)果；Μ:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:為實(shí)施例4中所配制不含憐酸招佐劑的冋濃度蛋白原液樣品；2:為實(shí)施例1成品尚心沉淀解尚后取樣樣品；3:為實(shí)施例1成品離心后上清取樣樣品；4:為實(shí)施例2成品離心沉淀解離后取樣樣品；5:為實(shí)施例2成品離心后上清取樣樣品；6:為實(shí)施例3成品離心沉淀解離后取樣樣品；7:為實(shí)施例3成品離心后上清取樣樣品。
[0012]圖2、為實(shí)施例6中SDS-PAGE結(jié)果；Μ:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；I:80 μ gHI蛋白樣品；2:120 μ g HI蛋白樣品；3:160 μ g HI蛋白樣品；4:SpA5 (KKAA)不含佐劑樣品；5:80 μ gSpA5 (KKAA)樣品；6:120 μ g SpA5 (KKAA)樣品；7:160 μ g SpA5 (KKAA)樣品。
[0013]圖3、為實(shí)施例6中SDS-PAGE結(jié)果；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:mSEB蛋白不含佐劑樣品；2:80yg mSEB蛋白樣品；3:80μ g mSEB蛋白樣品；4:160μ g mSEB蛋白樣品；5 =MntC蛋白不含佐劑樣品；6:80μ g MntC蛋白樣品；7:120 μ g MntC蛋白樣品；8:160 μ gMntC蛋白樣品。
[0014]圖4、為實(shí)施例7中SDS-PAGE結(jié)果；M:為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:隨機(jī)取樣1_離心上清取樣樣品；2:隨機(jī)取樣1-離心沉淀解離后取樣樣品；3:隨機(jī)取樣2-離心上清取樣樣品；4:隨機(jī)取樣2-離心沉淀解離后取樣樣品；5:隨機(jī)取樣3-離心上清取樣樣品；6:隨機(jī)取樣3-離心沉淀解離后取樣樣品。
[0015]圖5、為實(shí)施例7中SDS-PAGE結(jié)果；M:為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:隨機(jī)取樣4_離心上清取樣樣品；2:隨機(jī)取樣4-離心沉淀解離后取樣樣品；3:隨機(jī)取樣5-離心上清取樣樣品；4:隨機(jī)取樣5-離心沉淀解離后取樣樣品；5:隨機(jī)取樣6-離心上清取樣樣品；6:隨機(jī)取樣6-離心沉淀解離后取樣樣品。
[0016]圖6、為實(shí)施例9中·SDS-PAGE結(jié)果；1:HI蛋白吸附0.5小時(shí)后離心上清取樣；2:HI蛋白吸附I小時(shí)后離心上清取樣；3:HI蛋白吸附2小時(shí)后離心上清取樣；4:HI蛋白吸附4小時(shí)后離心上清取樣品；5:HI蛋白吸附8小時(shí)后離心上清取樣；6:SpA5 (KKAA)吸附0.5小時(shí)后離心上清取樣；7:SpA5 (KKAA)吸附I小時(shí)后離心上清取樣；8:SpA5 (KKAA)吸附2小時(shí)后離心上清取樣；9:SpA5 (KKAA)吸附4小時(shí)后離心上清取樣品；10:SpA5 (KKAA)吸附8小時(shí)后離心上清取樣。
[0017]圖7、為實(shí)施例9中SDS-PAGE結(jié)果；1:MntC蛋白吸附I小時(shí)后離心上清取樣；2:MntC蛋白吸附2小時(shí)后離心上清取樣；3:MntC蛋白吸附4小時(shí)后離心上清取樣品；4 =MntC蛋白吸附8小時(shí)后離心上清取樣；5:mSEB蛋白吸附I小時(shí)后離心上清取樣；6:mSEB蛋白吸附2小時(shí)后離心上清取樣；7:mSEB蛋白吸附4小時(shí)后離心上清取樣品；8:mSEB蛋白吸附8小時(shí)后離心上清取樣。
[0018]圖8、為實(shí)施例10中保存4周后SDS-PAGE結(jié)果；M:蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1隨機(jī)取樣1-離心上清取樣樣品；2:隨機(jī)取樣1-離心沉淀解離后取樣樣品；3:隨機(jī)取樣2-離心上清取樣樣品；4:隨機(jī)取樣2-離心沉淀解離后取樣樣品；5:隨機(jī)取樣3-離心上清取樣樣品；6:隨機(jī)取樣3-離心沉淀解離后取樣樣品。
[0019]圖9、為實(shí)施例10中保存8周后SDS-PAGE結(jié)果；M:為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:隨機(jī)取樣1-離心上清取樣樣品；2:隨機(jī)取樣1-離心沉淀解離后取樣樣品；3:隨機(jī)取樣2-離心上清取樣樣品；4:隨機(jī)取樣2-離心沉淀解離后取樣樣品；5:隨機(jī)取樣3-離心上清取樣樣品；6:隨機(jī)取樣3-離心沉淀解離后取樣樣品。
[0020]圖10、為實(shí)施例10中保存12周后SDS-PAGE結(jié)果；M:為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1:隨機(jī)取樣1-離心上清取樣樣品；2:隨機(jī)取樣1-離心沉淀解離后取樣樣品；3:隨機(jī)取樣2-離心上清取樣樣品；4:隨機(jī)取樣2-離心沉淀解離后取樣樣品；5:隨機(jī)取樣3-離心上清取樣樣品；6:隨機(jī)取樣3-離心沉淀解離后取樣樣品。
[0021]圖11、實(shí)施例13的不同時(shí)間點(diǎn)各組雄性動(dòng)物體重變化趨勢(shì)。
[0022]圖12、實(shí)施例13的不同時(shí)間點(diǎn)各組雌性動(dòng)物體重變化趨勢(shì)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]在第一個(gè)方面,本發(fā)明提供一種疫苗制劑。
[0024]在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗制劑包括SpA5蛋白；在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗制劑包括SpA5蛋白以及MntC、mSEB和HI蛋白中的一種或多種。
[0025]優(yōu)選地,所述SpA5蛋白序列選自SEQ ID N0.1~4任一條序列，即，SpA5蛋白可以是 SpA5 (KKAA)、SpA5 (RRAA)、SpA5 (KKVV)或 SpA5 (RRVV) ；MntC 蛋白序列如 SEQ ID N0.5所示；mSEB蛋白序列如SEQ ID N0.6所示；HI蛋白序列如SEQ ID N0.7所示。進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明的疫苗制劑中，SpA5蛋白是SpA5 (KKAA)或SpA5 (RRVV)。
[0026]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的疫苗制劑中抗原由SpA5、MntC、mSEB和HI蛋白組成。各抗原的濃度范圍是10-100 μ g/ml。優(yōu)選地，各抗原的濃度是50μ g/ml。
[0027]優(yōu)選地，所述疫苗制劑中還包括佐劑，如鋁佐劑(磷酸鋁或氫氧化鋁)。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易判斷需要哪些試劑來制備疫苗制劑。
`[0028]上述疫苗制劑為本發(fā)明人通過反向疫苗學(xué)技術(shù)、高通量免疫優(yōu)勢(shì)抗原組學(xué)技術(shù)、高效可溶蛋白表達(dá)及純化技術(shù)及大量的動(dòng)物免疫保護(hù)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)，從金黃色葡萄球菌全基因組2742個(gè)開放閱讀框(ORFs)中篩選并鑒定出抗原性強(qiáng)、特異性保守性好、且具有良好保護(hù)作用的多個(gè)抗原分子。它們包括:α -溶血素(Hla)、鐵離子表面決定蛋白B(IsdB)、金葡菌蛋白A (SpA)、腸毒素B (SEB)、錳離子結(jié)合蛋白C (MntC)0這些抗原在金黃色葡萄球菌感染致病、免疫逃逸的關(guān)鍵環(huán)節(jié)均發(fā)揮著重要作用。本發(fā)明人在對(duì)上述抗原的結(jié)構(gòu)分析、分子融合設(shè)計(jì)、多組分選擇、制劑配伍優(yōu)化基礎(chǔ)上，成功制備了含有上述抗原的重組金黃色葡萄球菌疫苗及其組合物。該疫苗在阻斷金黃色葡萄球菌生存代謝途徑、抑制粘附定植、控制毒素?cái)U(kuò)散、打破免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用，從而有效的抵御了金黃色葡萄球菌的感染侵襲。
[0029]本發(fā)明的疫苗抗原組分復(fù)雜，抗原蛋白性質(zhì)各異，直接使用單一抗原蛋白進(jìn)行單組分疫苗制劑制備的難度較大，方法繁瑣，免疫效果不佳，不利于疫苗的產(chǎn)業(yè)化制備。同時(shí)鋁佐劑對(duì)不同抗原蛋白的吸附率良莠不齊，吸附均一性存在差異，從而導(dǎo)致疫苗接種劑量偏高，而免疫保護(hù)效果不好的現(xiàn)象；并且鋁佐劑在制備過程中易發(fā)生理化性質(zhì)的改變，從而導(dǎo)致疫苗制劑的免疫無效。
[0030]主要問題包含如下幾個(gè)方面:①現(xiàn)有技術(shù)對(duì)于抗原與鋁元素配比選擇評(píng)價(jià)指標(biāo)不統(tǒng)一，為追求達(dá)到較高的吸附率使用很高的鋁元素量，這不利于受用者健康，并與WHO及《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求不符，更不符合制藥領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)；②現(xiàn)有的制劑成分添加順序?yàn)閷⒖乖鞍缀妥魟┓珠_稀釋后吸附，再混合分裝，對(duì)于單一抗原尚可，但制劑難度和成本會(huì)隨著抗原組分?jǐn)?shù)量的增加而上升；③為解決前述問題，有的方法提出將佐劑稀釋后直接加入抗原，但是卻無法保證多種抗原情況下的吸附均一性制劑領(lǐng)域缺乏科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹苿┰u(píng)價(jià)體系，現(xiàn)有的技術(shù)只針對(duì)佐劑的制備方法，而輕視制劑工藝，對(duì)于制劑工藝的評(píng)估指標(biāo)僅關(guān)注吸附率，更對(duì)吸附的方式、吸附效率、吸附均一性及其檢測(cè)方法、制劑工藝各種參數(shù)穩(wěn)定性等方面完全忽視；⑤現(xiàn)有的組氨酸溶液，雖然對(duì)于組氨酸的濃度、PH等參數(shù)進(jìn)行了研究，但是對(duì)于不同特性蛋白適用范圍存在局限性，有的疫苗制劑工藝雖然加入了吐溫等增溶劑，但是由于存在安全隱患等問題，美國(guó)FDA批準(zhǔn)藥物中，吐溫的使用已不如以前普遍，而對(duì)于新增溶劑的選擇卻遲遲未見報(bào)道；⑥傳統(tǒng)制劑工藝采用水平吸附混合的方式，缺乏對(duì)疫苗吸附新技術(shù)和新設(shè)備的創(chuàng)新和開發(fā)。
[0031]因此，當(dāng)前有必要對(duì)現(xiàn)有的制備疫苗制劑的相關(guān)工藝進(jìn)行改進(jìn)和創(chuàng)新，能夠有效解決上述抗原蛋白吸附率、多組分抗原吸附均一性、穩(wěn)定性、吸附方式合理有效性等疫苗制備中的關(guān)鍵工藝瓶頸，使得疫苗制劑(尤其是多組分疫苗制劑)的制備工藝更加簡(jiǎn)便、穩(wěn)定及高效，并有利于降低生產(chǎn)成本。
[0032]因此，在另一方面，本發(fā)明提供一種制備多組分疫苗的方法，所述方法將鋁佐劑與疫苗抗原蛋白分開稀釋后再混合和/或吸附，具體為: [0033]方法1:將單一疫苗抗原蛋白組分分別用疫苗稀釋液稀釋，分別與等體積的用疫苗稀釋液稀釋后的鋁佐劑溶液混合，分別吸附后再將多種蛋白溶液混合均勻后分裝；
[0034]①根據(jù)鋁佐劑溶液鋁元素濃度(5.3mg/ml)以及疫苗成品中鋁元素終濃度(0.71mg/ml)，計(jì)算所需鋁佐劑溶液量并準(zhǔn)確量取，將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液，定容至疫苗制劑終體積的50%，充分混勻；
[0035]②重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的終濃度為0.2mg/ml，單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白終濃度為0.05mg/ml，根據(jù)所需體積計(jì)算所需蛋白量，準(zhǔn)確量取所需單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液，定容至疫苗制劑終體積的12.5%，充分混勻；
[0036]③將稀釋后單一組分蛋白溶液與等體積的稀釋后佐劑溶液加入至分裝瓶中，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C _37°C范圍內(nèi)。
[0037]④吸附后再將四種組分蛋白溶液混合均勻即得。
[0038]方法2:將單一疫苗抗原蛋白組分分別用疫苗稀釋液稀釋，分別與等體積的稀釋后鋁佐劑溶液混合，再將多種蛋白溶液混合后共同吸附后分裝；
[0039]①根據(jù)鋁佐劑溶液鋁元素濃度(5.3mg/ml)以及疫苗成品中鋁元素終濃度(0.71mg/ml)，計(jì)算所需鋁佐劑溶液量并準(zhǔn)確量取，將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液，定容至疫苗制劑終體積的50%，充分混勻；
[0040]②重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的終濃度為0.2mg/ml，單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白終濃度為0.05mg/ml，根據(jù)所需體積計(jì)算所需蛋白量，準(zhǔn)確量取所需單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液，定容至疫苗制劑終體積的12.5%，充分混勻；
[0041]③將稀釋后單一組分蛋白溶液與等體積的稀釋后佐劑溶液加入至分裝瓶中，再將四種組分蛋白溶液混合，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C _37°C范圍內(nèi)。
[0042]方法3:將多種疫苗抗原蛋白組分混合后使用疫苗稀釋液稀釋，混勻后與等體積的稀釋后鋁佐劑溶液混合，吸附后分裝；
[0043]①根據(jù)鋁佐劑溶液鋁元素濃度(5.3mg/ml)以及疫苗成品中鋁元素終濃度(0.71mg/ml)，計(jì)算所需鋁佐劑溶液量并準(zhǔn)確量取，將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液，定容至疫苗制劑終體積的50%，充分混勻；
[0044]②重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的終濃度為0.2mg/ml，單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白終濃度為0.05mg/ml，根據(jù)所需體積計(jì)算所需蛋白量，量取所需四種重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白原液，將其加入到配制瓶中；疫苗稀釋液，定容至疫苗制劑終體積的50%，充分混勻；
[0045]③將等體積的稀釋后蛋白溶液與稀釋后的佐劑溶液加入至分裝瓶中，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C -37°C范圍內(nèi)。
[0046]優(yōu)選地，所述垂直混懸方式可以用水平混懸方式替代。
[0047]優(yōu)選地，稀釋后鋁佐劑溶液與稀釋后疫苗抗原蛋白溶液的添加比例為1:1。
[0048]優(yōu)選地，所述鋁佐劑是磷酸鋁或氫氧化鋁佐劑。
[0049]優(yōu)選地,所述抗原蛋白與招元素質(zhì)量比為1: 1.98,吸附率即可達(dá)到90%~100%。
[0050]優(yōu)選地，使用的疫苗稀釋液為組氨酸緩沖液，包括組氨酸(優(yōu)選濃度10mmol/L)、泊洛沙姆188 (優(yōu)選0.02%)、氯化鈉(優(yōu)選濃度0.9%)，pH值優(yōu)選為6.0。
[0051 ] 本發(fā)明方法制備的·疫苗制劑在4°C至37°C范圍內(nèi)，穩(wěn)定性在8周以上。
[0052]本發(fā)明提供的方法的功效包括:
[0053]①針對(duì)現(xiàn)有制劑評(píng)價(jià)體系的缺乏和不完善，本發(fā)明對(duì)已有驗(yàn)證指標(biāo)進(jìn)行了科學(xué)的優(yōu)化，除傳統(tǒng)的吸附率外，還提出了質(zhì)量配伍比、吸附效率、穩(wěn)定性、均一性及其檢測(cè)方式等指標(biāo)，以及前述各項(xiàng)參數(shù)的穩(wěn)定性，創(chuàng)新性的確立了以吸附率、吸附效率、質(zhì)量配伍比、均一性、穩(wěn)定性為主要指標(biāo)的一整套制劑工藝評(píng)價(jià)體系，能夠科學(xué)、準(zhǔn)確、快速的評(píng)估制劑工藝的效果(注:吸附效率指達(dá)到目的吸附率、均一性等指標(biāo)所用的最短時(shí)間);
[0054]②本發(fā)明采用質(zhì)量配伍比，可準(zhǔn)確科學(xué)的描述吸附效率和鋁元素用量，本發(fā)明在吸附率達(dá)到90%~100%情況下，抗原與鋁元素質(zhì)量比為1:1.98，遠(yuǎn)低于現(xiàn)有報(bào)道的1:45，這意味著吸附相同量的蛋白，使用鋁元素量越低，有效的減少了鋁元素的使用量，有利受用者健康，更符合WHO及《預(yù)防用疫苗臨床前研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的相關(guān)要求；
[0055]③本發(fā)明采用的獨(dú)特制劑工藝步驟，可有效降低實(shí)施多種抗原組分疫苗制劑制備的難度和成本；
[0056]④本發(fā)明采用的特有制劑工藝，可保證制劑的均一性及穩(wěn)定性；
[0057]⑤對(duì)于疫苗稀釋液，本發(fā)明優(yōu)化了組氨酸緩沖體系及各種參數(shù)，并優(yōu)選的加入了泊洛沙姆188作為助溶劑，增加了疫苗稀釋液的適用范圍的同時(shí)降低了副作用風(fēng)險(xiǎn)；
[0058]⑥對(duì)于現(xiàn)有的制劑方式和設(shè)備，本發(fā)明獨(dú)創(chuàng)性的提出了垂直混懸的吸附方式和相應(yīng)的垂直混懸設(shè)備，該設(shè)備已成功申請(qǐng)國(guó)家實(shí)用新型發(fā)明(授權(quán)專利號(hào)201220314436.4)。
[0059]綜上所述，本發(fā)明通過各種改進(jìn)和創(chuàng)新，將現(xiàn)有的制劑工藝進(jìn)行優(yōu)化及改進(jìn)，減少了工藝流程，降低了工藝成本，提高了生產(chǎn)效率。通過研究制劑成分的工藝步驟、創(chuàng)新吸附工藝方式、以及調(diào)整疫苗稀釋液組成配方等方式，提高了抗原蛋白吸附率和配伍比，有效保證了疫苗抗原蛋白各組分的吸附均一性，并防止鋁佐劑在制劑過程中發(fā)生理化性質(zhì)改變，降低鋁元素使用量，提高生產(chǎn)效率，降低了生產(chǎn)成本。完善了現(xiàn)有工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用了新的評(píng)價(jià)指標(biāo)和相應(yīng)檢測(cè)方法，創(chuàng)新性的提出了一整套科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹苿┰u(píng)價(jià)體系，填補(bǔ)了制劑領(lǐng)域的一項(xiàng)重大空缺。
[0060]以下實(shí)施例中所使用的抗原蛋白與各種試劑如下:
[0061]1.抗原蛋白
[0062]重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白由重慶原倫生物科技有限公司、中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)提供；抗原蛋白包括本發(fā)明的SpA5 (KKAA)、H1、mSEB和MntC四種。
[0063]2.試劑
[0064]SDS-PAGE, HPLC等所需試劑和儀器由重慶原倫生物科技有限公司提供；
[0065]疫苗蛋白稀釋液:組氨酸(美國(guó)Merck公司，藥用級(jí))IOmM, NaCl0.9% (四川科倫，注射用生理鹽水)、泊洛沙姆188 (美國(guó)Merck公司，藥用級(jí))0.01%、pH6.0，無熱原；
[0066]PBS:磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.2g (國(guó)產(chǎn)分析純)，磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)2.9g(國(guó)產(chǎn)分析純)，氯化鈉(NaCl) 8.0g(國(guó)產(chǎn)分析純)，氯化鉀(KCl)0.2g，加水至1000mL，pH7.4 ；
[0067]磷酸鋁佐劑(鋁元素濃度5.3mg/ml)為美國(guó)GENERAL CHEMICAL公司原裝進(jìn)口產(chǎn)品O
[0068]3.儀器
[0069]疫苗制劑使用的大型垂直混懸儀為自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)，委托上海格氏公司生產(chǎn)。
[0070]4.菌株`
[0071]金黃色葡萄球菌MRSA-252國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)株由美國(guó)ATCC提供；
[0072]實(shí)施例1:配制重組金黃色葡萄球菌四組分疫苗(1920ml)
[0073]①量取磷酸招佐劑256ml,將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液704ml,加入配制瓶中，總體積為960ml,充分混勻；
[0074]②重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的終濃度為0.2mg/ml，單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白終濃度為0.05mg/ml，因此，根據(jù)各抗原蛋白的初始濃度量取各蛋白:HI蛋白96ml，加入疫苗稀釋液144ml ；SpA5 (KKAA)蛋白48ml，加入疫苗稀釋液192ml ；mSEB蛋白60ml，加入疫苗稀釋液180ml ；MntC蛋白60ml，加入疫苗稀釋液180ml ;分別將各蛋白及其對(duì)應(yīng)的疫苗稀釋液加入到各自的配制瓶中，充分混勻；
[0075]③將稀釋后單一組分蛋白溶液與等體積的稀釋后佐劑溶液加入至分裝瓶中，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C _37°C范圍內(nèi)；
[0076]④吸附后再將四種蛋白溶液混合均勻后作為疫苗制劑。
[0077]實(shí)施例2:配制重組金黃色葡萄球菌四組分疫苗(1200ml)
[0078]①量取磷酸招佐劑160ml,將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液440ml,加入至配制瓶中，總體積為600ml，充分混勻；
[0079]②重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的終濃度為0.2mg/ml，單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白終濃度為0.05mg/ml ;根據(jù)該要求計(jì)算所需蛋白質(zhì)體積并量取對(duì)應(yīng)的蛋白溶液:HI蛋白60ml，加入疫苗稀釋液90ml ；SpA5 (KKAA)蛋白30ml，加入疫苗稀釋液120ml ；mSEB蛋白37.5ml，加入疫苗稀釋液112.5ml ；MntC蛋白37.5ml，加入疫苗稀釋液112.5ml ;將各蛋白及對(duì)應(yīng)體積的稀釋液分別加入到各自的配制瓶中，充分混勻；[0080]③將稀釋后單一組分蛋白溶液與等體積的稀釋后佐劑溶液加入至分裝瓶中，再將四種蛋白溶液混合，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C _37°C范圍內(nèi)。
[0081]實(shí)施例3:配制重組金黃色葡萄球菌四組分疫苗(600ml)
[0082]①量取磷酸招佐劑80ml,將其加入到配制瓶中；量取疫苗稀釋液220ml,加入至配制瓶中，總體積300ml，充分混勻；
[0083]②重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白的終濃度為0.2mg/ml，單一組分重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白終濃度為0.05mg/ml，根據(jù)各蛋白的初始濃度計(jì)算所需各蛋白量:HI蛋白所用體積為30ml，SpA5(KKAA)蛋白所用體積為15ml，mSEB蛋白所用體積為18.75ml,MntC蛋白所用體積為18.75ml ;量取對(duì)應(yīng)體積的四種蛋白加入到配制瓶中，再量取疫苗稀釋液217.5ml加入至配制瓶中，總體積300ml,充分混勻；
[0084]③將等體積的稀釋后蛋白溶液與稀釋后的佐劑溶液加入至分裝瓶中，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C -37°C范圍內(nèi)。
[0085]實(shí)施例4 =SDS-PAGE鑒定重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白磷酸鋁佐劑吸附均一性與完全性
[0086]①分別從實(shí)施例1-3的疫苗制劑中取樣lml，4°C，6000rpm離心5分鐘，小心吸取上清,并從上清取樣40 μ I ;
[0087]②補(bǔ)入與上清 等體積的解離液(1Μ Na2CO3)至離心沉淀物中，重懸后于室溫條件下，垂直混懸I小時(shí)，取樣40 μ I ;
[0088]③按照實(shí)施例3中配制方法配制不含磷酸鋁佐劑的蛋白溶液，磷酸鋁所占體積以疫苗稀釋液補(bǔ)足，充分混勻后取樣40 μ I ;
[0089]④向所取樣品加入10 μ 15Χ蛋白上樣緩沖液，100°C加熱5分鐘，冷卻并瞬時(shí)離心后，取10 μ I上樣；
[0090]⑤進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，先在電壓80v下電泳20分鐘，再調(diào)至180v電泳40分鐘，然后將膠取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫色后，在呈像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，結(jié)果示于圖1，結(jié)果顯示:三種方法磷酸鋁佐劑均能充分吸附蛋白，且吸附效果無顯著差異，但是方法二、三制劑工藝步驟均較方法一簡(jiǎn)化，而如果多種抗原成分按照方法一進(jìn)行制劑，每個(gè)抗原成分均需要吸附、混合儀器各一套，且不能共用，所需要的儀器設(shè)備是方法二、三的數(shù)倍。
[0091]實(shí)施例5:重組金黃色葡萄球菌疫苗質(zhì)量配伍比的研究
[0092]①量取磷酸鋁佐劑溶液720 μ I (鋁元素濃度為5.3mg/ml)，將其加入到配制瓶中，再加入疫苗稀釋液6.48ml，充分混勻，等體積均分為12等分，每份600 μ 1，含磷酸鋁60 μ 1，招元素318μ g ；
[0093]②依據(jù)每個(gè)抗原蛋白使用劑量遞增原則，分為80 μ g、120 μ g、160 μ g三組，4個(gè)抗原蛋白共計(jì)12組，根據(jù)每個(gè)蛋白濃度計(jì)算所需體積，以此加入對(duì)應(yīng)容器中，再以疫苗稀釋液定容至600 μ I ；
[0094]③將稀釋后單一組分蛋白溶液與等體積的稀釋后佐劑溶液加入至分裝瓶中，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附I小時(shí)，環(huán)境溫度控制在4°C _37°C范圍內(nèi)。
[0095]實(shí)施例6 =SDS-PAGE鑒定重組金黃色葡萄球菌疫苗質(zhì)量配伍比[0096]①將實(shí)施例5中12個(gè)樣品，4°C，6000rpm離心5分鐘，小心吸取上清，并從各上清取樣40 μ I ;[0097]②按照實(shí)施例20中配制方法配制不含磷酸鋁佐劑的蛋白溶液，磷酸鋁所占體積以疫苗稀釋液補(bǔ)足，充分混勻后取樣40 μ I ;
[0098]③將所取樣品加入10 μ 15Χ蛋白上樣緩沖液，100°C加熱5分鐘，冷卻并瞬時(shí)離心后，取10 μ I上樣；
[0099]④進(jìn)行12%SDS_PAGE電泳，先在電壓80v下電泳20分鐘，再調(diào)至180v電泳40分鐘，然后將膠取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫色后，在呈像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，結(jié)果示于圖2、3，結(jié)果顯示:對(duì)于蛋白H1、SpA5 (KKAA)和MntC，318y g鋁元素即可100%吸附160 μ g蛋白，而100%吸附率蛋白鋁元素質(zhì)量配伍比為1:1.9875 ;對(duì)于mSEB蛋白，318 μ g鋁元可100%吸附80 μ g蛋白，90%吸附160 μ g, 100%吸附率蛋白鋁元素質(zhì)量配伍比為1:3.975,90%吸附率蛋白鋁元素質(zhì)量配伍比為1:1.9875。故而可以認(rèn)為對(duì)于重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白，90~100%吸附率蛋白鋁元素質(zhì)量配伍比為1:
1.9875。
[0100]同時(shí)需要指出的是，如果對(duì)配伍比不加限定，僅僅描述體積，而忽略質(zhì)量的話，蛋白鋁元素配伍比將會(huì)更低，甚至達(dá)到1:1以下。
[0101]實(shí)施例7 =SDS-PAGE鑒定重組金黃色葡萄球菌疫苗均一性
[0102]①將實(shí)施例3中吸附混勻完畢后的溶液中隨機(jī)取樣6個(gè)，取樣位置和時(shí)間完全隨機(jī)，每個(gè)樣品取樣Iml ；
[0103]②4°C，6000rpm離心5分鐘，小心吸取上清，并從上清取樣40 μ I ;
[0104]③補(bǔ)入與上清等體積的解離液至離心沉淀物中，重懸后室溫條件下，垂直混懸I小時(shí)，取樣40μ I ；
[0105]④將所取樣品加入10μ 15Χ蛋白上樣緩沖液，100°C加熱5分鐘，冷卻并瞬時(shí)離心后，取10 μ I上樣；
[0106]⑤進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，先在電壓80v下電泳20分鐘，再調(diào)至180v電泳40分鐘，然后將膠取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫色后，在呈像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，結(jié)果示于圖4、5，結(jié)果顯示:所取樣品的離心上清中均未見條帶，離心沉淀解離后，條帶位置、灰度、面積均相同，說明每個(gè)隨機(jī)取樣點(diǎn)佐劑所吸附的抗原蛋白量和種類完全相同，即為制劑工藝吸附均一性完全一致。
[0107]實(shí)施例8:重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白制劑吸附率與吸附效率
[0108]①量取磷酸鋁佐劑溶液1.2ml (鋁元素濃度為5.3mg/ml )，將其加入到配制瓶中，再加入疫苗稀釋液10.8ml，充分混勻，等體積均分為20等份，每份600 μ 1，含磷酸鋁60 μ 1，招元素318μ g ；
[0109]②依據(jù)每個(gè)抗原蛋白吸附時(shí)間倍增的原則，分為0.5小時(shí)、I小時(shí)、2小時(shí)、4小時(shí)、8小時(shí)，共20組，根據(jù)每個(gè)蛋白濃度計(jì)算所需體積，以此加入對(duì)應(yīng)容器中，再以疫苗稀釋液定容至600 μ I ；
[0110]③將稀釋后單一組分蛋白溶液與等體積的稀釋后佐劑溶液加入至分裝瓶中，以14rpm轉(zhuǎn)速，垂直混懸吸附至設(shè)定時(shí)間后停止吸附并處理樣品，環(huán)境溫度控制在4°C -37°C范圍內(nèi)。[0111]實(shí)施例9 =SDS-PAGE鑒定重組金黃色葡萄球菌疫苗制劑吸附率與吸附效率
[0112]①將實(shí)施例8中20個(gè)樣品，4°C，6000rpm離心5分鐘，小心吸取上清，并從各上清取樣40 μ I ;
[0113]②將所取樣品加入10 μ 15Χ蛋白上樣緩沖液，100°C加熱5分鐘，冷卻并瞬時(shí)離心后，取10 μ I上樣；
[0114]③進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，先在電壓80v下電泳20分鐘，再調(diào)至180v電泳40分鐘，然后將膠取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫色后，在呈像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，結(jié)果示于圖6、7，結(jié)果顯示:對(duì)于重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白，吸附2小時(shí)即可達(dá)到100%吸附率,吸附I小時(shí)可達(dá)到90%以上的吸附率,故而重組金黃色葡萄球菌疫苗抗原蛋白90~100%吸附率的吸附效率為I小時(shí)。
[0115]實(shí)施例10 =SDS-PAGE鑒定重組金黃色葡萄球菌疫苗穩(wěn)定性
[0116]①將實(shí)施例3中吸附混勻完畢后的溶液按Iml每只進(jìn)行分裝，灌裝至無菌2ml西林瓶中壓蓋密封后37°C保存；
[0117]②每4周隨機(jī)取樣3只，樣品4°C，6000rpm離心5分鐘，小心吸取上清，并從上清取樣40 μ I ;
[0118]③補(bǔ)入與上清等體積的疫苗解離液至離心沉淀物中，重懸后室溫條件下，垂直混懸I小時(shí)，取樣40 μ I ；
[0119]④將所取樣品加入10 μ 15Χ蛋白上樣緩沖液，100°C加熱5分鐘，冷卻并瞬時(shí)離心后，取10 μ I上樣；
[0120]⑤進(jìn)行12%SDS-PAGE電泳，先在電壓80V下電泳20分鐘，再調(diào)至180V電泳40分鐘，然后將膠取出，置于考馬斯亮藍(lán)染色液中振蕩染色，再置于脫色液中振蕩脫色后，在呈像系統(tǒng)下觀察結(jié)果，結(jié)果示于圖8、9、10，結(jié)果顯示:所取樣品的離心上清中均未見條帶，離心沉淀解離后，條帶位置、灰度、面積均相同，說明每個(gè)隨機(jī)取樣點(diǎn)佐劑所吸附的抗原蛋白量和種類完全相同，除了再次證明了制劑的均一性外，還揭示了制劑的穩(wěn)定性，包括吸附率的穩(wěn)定性、均一性的穩(wěn)定性、抗原蛋白的穩(wěn)定性。
[0121]經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證，37°C的加速溫度條件下，本發(fā)明的制劑穩(wěn)定性至少可維持12周不變，再次證明了本制劑工藝的有效性和穩(wěn)定性。
[0122]實(shí)施例11:不同組分疫苗的免疫效價(jià)和攻毒保護(hù)
[0123]選擇SpA5 (KKAA)作為候選抗原，與H1、MntC、mSEB進(jìn)行單價(jià)、雙價(jià)、三價(jià)及四價(jià)組合，制備成多組分疫苗，對(duì)小鼠進(jìn)行進(jìn)一步的動(dòng)物免疫后抗體效價(jià)評(píng)估。取血清作ELISA檢測(cè)，結(jié)果見表1。
[0124]然后進(jìn)行攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)(免疫及攻毒保護(hù)同實(shí)施例12)，從V34到V39進(jìn)行六輪實(shí)驗(yàn)，每組6周齡Balb/C小鼠(北京華阜康)20只。肌注免疫，蛋白量為每種組分30 μ g。攻毒試驗(yàn)的過程為:將各疫苗分別三次股四頭肌肌注(0、14、21天)免疫；末次免疫后，在第14天采用致死劑量，尾靜脈注射金黃色葡萄球菌MRSA-252活菌進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，每只BALB/C小鼠注射菌液量為1.25X IO9CFU,觀察10天，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的存活率。結(jié)果見表2。
[0125]表1:ELISA檢測(cè)不同組分中各種蛋白免疫小鼠后抗體滴度
[0126]
【權(quán)利要求】
1.一種金黃色葡萄球菌疫苗制劑，包括SpA5蛋白，所述SpA5蛋白序列選自SEQ IDN0.1~4中任一條。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的疫苗制劑，其中還包括MntC、mSEB和HI蛋白中的一種或多種，所述MntC蛋白序列如SEQ ID N0.5所示，mSEB蛋白序列如SEQ ID N0.6所示，HI蛋白序列如SEQ ID N0.7所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的疫苗制劑，其中，疫苗制劑的抗原成分由SpA5、MntC、mSEB和HI蛋白組成；各抗原的濃度范圍是10-100 μ g/ml ;優(yōu)選地，各抗原的濃度是50μ g/ml。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的疫苗制劑，還包括鋁佐劑；優(yōu)選地，所述鋁佐劑是磷酸招佐劑或氫氧化招佐劑。
5.一種制備如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的疫苗制劑的方法，所述方法將鋁佐劑與疫苗抗原蛋白分開稀釋后再混合和/或吸附，具體為: (1)將單一疫苗抗原蛋白組分分別用疫苗稀釋液稀釋，分別與等體積的用疫苗稀釋液稀釋后的鋁佐劑溶液混合，分別吸附后再將多種蛋白溶液混合均勻后分裝； (2)將單一疫苗抗原蛋白組分分別用疫苗稀釋液稀釋，分別與等體積的稀釋后鋁佐劑溶液混合，再將多種蛋白溶液混合后共同吸附后分裝；或者 (3)將多種疫苗抗原蛋白組分混合后使用疫苗稀釋液稀釋，混勻后與等體積的稀釋后鋁佐劑溶液混合，吸附后分裝。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述鋁佐劑是磷酸鋁或氫氧化鋁佐劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，抗原蛋白與鋁元素質(zhì)量比為1:1.98。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述吸附方式為垂直混懸吸附或水平混懸吸附；混懸時(shí)間為I小時(shí)，溫度為4°C -37°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述疫苗稀釋液為組氨酸緩沖液，包括組氨酸、泊洛沙姆188、氯化鈉，pH值為6.0。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，所述疫苗稀釋液為:10mmol/L組氨酸、0.02%泊洛沙姆188、0.9%氯化鈉，pH值為6.0。
【文檔編號(hào)】A61K39/39GK103705914SQ201310665062
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月9日
【發(fā)明者】鄒全明, 曾浩, 樊紹文, 盧陸, 董衍東, 敬海明, 馮強(qiáng), 章金勇 申請(qǐng)人:重慶原倫生物科技有限公司, 中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)