水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途，特征是將菌種保藏編號為CCTCC?No:M2011054的粒毛盤菌所產(chǎn)胞內(nèi)黑色素，經(jīng)組氨酸分子修飾后，得到水溶性粒毛盤菌黑色素；藥效學實驗證明該水溶性粒毛盤菌黑色素不僅具有顯著的抑制肝癌功能，且無毒副作用，其制備方法簡單經(jīng)濟，故可將菌種保藏編號為CCTCC?No:M2011054的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素及其水溶性黑色素，按藥劑學的常規(guī)制備方法，將有效量的水溶性粒毛盤菌黑色素與適量的藥用輔料混合加工制備成口服片劑或膠囊劑型的抑制肝癌藥物。
【專利說明】水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于粒毛盤菌黑色素在醫(yī)藥領域中的應用【技術領域】，具體涉及菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌的水溶性黑色素作為制備抑制肝癌藥物的用途。
【背景技術】[0002]惡性腫瘤是臨床上常見的疾病之一，亦是導致人類死亡的主要病因之一。目前，惡性腫瘤的治療主要采用放、化療等方法，通常使用的化療藥物多為化學合成物質(zhì)而非天然產(chǎn)物，因此在殺死腫瘤細胞的同時，對正常細胞也有一定程度的殺傷作用；且單純化療會使患者食欲不振，體重降低，導致機體衰弱，并引起一定程度的免疫抑制，毒副作用較大。因此，挖掘與開發(fā)天然、無毒副作用的抗腫瘤藥物對維護人類健康具有重要的意義。
[0003]黑色素是通過多羥基酚氧化而成的構(gòu)造不規(guī)則的類多酚聚合體，來源于動物、植物及微生物，一般只溶于堿液，不溶(或微溶)于水。據(jù)英國《細胞微生物學》(CellularMirobiology, 2003, 5，167-223)介紹，黑色素常與蛋白質(zhì)牢固結(jié)合，且不溶于水。
[0004]粒毛盤菌屬是一類腐生性真菌，近幾年來本發(fā)明人課題組研究發(fā)現(xiàn)粒毛盤菌具有重要的經(jīng)濟價值。如中國《食品科學》(2009，30:185-189)及荷蘭《國際生物大分子雜志》(International Journal of Biological Macromolecules, 2014，63:170-176)介紹了粒毛盤菌一些菌株深層發(fā)酵后可產(chǎn)生大量黑色素，具有較強的抗氧化、抗輻射等活性。中國專利號ZL201110072469.2公開了一株保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌YM_292(本發(fā)明人課題組自定的編號代碼)液態(tài)發(fā)酵制備胞內(nèi)黑色素的方法。所制備的胞內(nèi)黑色素具有較強的光保護作用，且經(jīng)過毒理性試驗證實其安全無毒，同時該粒毛盤菌黑色素在pH ^ 7時穩(wěn)定，pH ( 6時沉淀，室溫下其在水中溶解度僅為0.llg/100g。由于該粒毛盤菌黑色素在水中的難溶性使其在醫(yī)療、食品等領域的應用受到限制。若能將堿溶性黑色素改性成水溶性黑色素，以便于人體吸收，可充分發(fā)揮其保健功能，具有重大意義。目前，國內(nèi)外對黑色素進行改性的研究很少。中國專利號ZL201210218401.5公開了一種將粒毛盤菌胞外黑色素改性為水溶性黑色素的方法，即將黑色素與精氨酸或組氨酸或賴氨酸，和水，按質(zhì)量比為1:0.5~1.5:4.5~50混合，震蕩至黑色素固體溶解后，將溶液干燥得到水溶性粒毛盤菌黑色素。目前國內(nèi)外未見有公開文獻提及以粒毛盤菌黑色素作為制備抗腫瘤藥物的應用方面的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌水溶性黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途，確立菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌水溶性黑色素抑制肝癌的藥理作用。
[0006]本發(fā)明水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途，將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌發(fā)酵后提取純化制備得到的胞內(nèi)黑色素，采用組氨酸(His)對該胞內(nèi)黑色素(LIM)進行修飾，改性后得到水溶性粒毛盤菌黑色素(HLIM);其特征在于:通過其對小鼠抑制肝癌的作用藥理實驗，確立水溶性粒毛盤菌黑色素(HUM)的抑制肝癌作用；該水溶性粒毛盤菌黑色素(HLIM)在制備抑制肝癌藥物中的用途:按藥劑學的常規(guī)制備方法，將有效量的水溶性粒毛盤菌黑色素(HUM)與藥用輔料混合加工制備成口服片劑或膠囊。
[0007]本發(fā)明中參考專利號ZL201210218401.5中公開的改性方法，并可以略作改進，即:將原公開專利改性方法中的黑色素、組氨酸和水的混合方式由按質(zhì)量比改為按摩爾比，具體修改方法如下:將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌的胞內(nèi)黑色素與組氨酸，和水，按摩爾比為1:2~5:50~100混合,震蕩至黑色素固體溶解后,將溶液干燥亦獲得水溶性粒毛盤菌黑色素。采用本發(fā)明上述方法得到的改性粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素，室溫下在水中的溶解度由原來改性前的0.llg/100g提高到了改性后的4.77g/100g，優(yōu)于采取原來專利號ZL201210218401.5中已公開的現(xiàn)有改性方法中的條件進行改性后得到的改性粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素的溶解度(4.69g/100g)。采用本發(fā)明方法可以克服原保藏號為CCTCCNo:M2011054的粒毛盤菌(Lachnum singerianum)胞內(nèi)黑色素由于難溶于水而不適合用于制成口服制劑或食品添加劑用于醫(yī)療、食品等領域的問題，對于擴展黑色素的應用領域和適用范圍具有積極意義。經(jīng)藥效學實驗表明，該水溶性粒毛盤菌黑色素具有顯著的抑制肝癌功能，且無毒副作用，克服了現(xiàn)有化療藥物在殺死腫瘤細胞的同時，對正常細胞也有一定程度殺傷作用，且單純化療會使患者食欲不振，體重降低，導致機體衰弱，并引起一定程度的免疫抑制，毒副作用較大等缺點。本發(fā)明方法簡單經(jīng)濟，可將水溶性粒毛盤菌黑色素應用于制備片劑或膠囊劑型的抑制肝癌藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為改性前的原粒毛盤菌(Lachnum) CCTCC No:M2011054胞內(nèi)黑色素的紅外光譜圖；
[0009]圖2為采用本發(fā)明中所述的方法對粒毛盤菌(Lachnum) CCTCC No:M2011054胞內(nèi)黑色素采用組氨酸進行改性修飾后的水溶性黑色素的紅外光譜圖。
【具體實施方式】
[0010]實施例1:
[0011]一、粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(UM)的制備:
[0012]將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌接種于5L發(fā)酵罐，培養(yǎng)基配方為按質(zhì)量百分比由馬鈴薯汁20%，葡萄糖2%，蛋白胨1%，酪氨酸0.03%, K2HPO40.05%,MgSO4.7H200.05%組成；裝料系數(shù)體積比為0.7，接種量為8% (體積比)，培養(yǎng)溫度為27°C，通氣量為1.0L/min，攪拌轉(zhuǎn)速為180r/min，發(fā)酵時間為8天；將發(fā)酵液抽濾，收集菌絲體，60°C烘干，按菌絲體的質(zhì)量(g)與濃度為0.4mol/L的氫氧化鈉(mL)比為1:200 (g/mL)混勻，80°C水浴浸提2h，抽濾得浸提液；用lmol/LHCl調(diào)節(jié)上述浸提液pH值為2，靜置12h，得到黑色素懸浮液；然后將上述黑色素懸浮液離心，棄上清，所得到的沉淀經(jīng)去離子水洗滌至PH值為7后真空冷凍干燥，即得黑色素粗品；將該黑色素粗品經(jīng)7mol/L HCl于100°C酸解2h,以除去與黑色素結(jié)合的蛋白質(zhì)及碳水化合物。然后將酸解后得到的沉淀經(jīng)雙蒸水洗滌至上清液PH值為7時重新溶于lmol/L NH3.Η20溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸去NH3至溶液pH為7.5后，依次經(jīng)乙酸乙酯、氯仿、無水乙醇萃取，以除去脂類物質(zhì)，萃取后除去有機相，水相調(diào)pH值為2，5000r/min離心lOmin，沉淀經(jīng)去離子水反復洗滌至上清液Cl -定性檢測為陰性后，真空冷凍干燥，即得菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(UM)。
[0013]二、水溶性粒毛盤菌黑色素(HUM)的制備:
[0014]按黑色素與組氨酸摩爾比分別為1:0.5, 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, I:4,1:4.5,1:5,分別取一定量的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(Ig)和組氨酸，溶于IOOmL蒸餾水中，室溫下振蕩溶解，離心、稀釋后測定溶液的吸光度值，以溶液的最大吸光度值確定組氨酸的添加量。結(jié)果表明黑色素與組氨酸摩爾比在1:0.5~1:5時，溶液的吸光度值隨組氨酸量的增大而增大，其中當黑色素與組氨酸摩爾比為1:2時，溶液的吸光度值達到最大(0.394±0.005)，黑色素與組氨酸摩爾比小于0.5時，溶液的吸光度值基本保持在 0.394-0.395范圍內(nèi)?？纱丝芍?:2為組氨酸與黑色素的最佳摩爾比。然后將溶液于截留分子量為200Da的透析袋透析36h，冷凍干燥后獲得水溶性粒毛盤菌黑色素(HLIM)。對其進行復溶實驗，結(jié)果表明該組氨酸-黑色素復溶效果較好，室溫下在蒸餾水中的溶解度為4.77g/100g。
[0015]三、水溶性粒毛盤菌黑色素(HUM)的結(jié)構(gòu)驗證:
[0016]分別取前面制備的粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(UM)及上述制備的水溶性粒毛盤菌黑色素(HUM)各2mg，分別與400mg干燥的KBr研磨后壓片，采用傅里葉變換紅外光譜儀(Nexus670)進行IR光譜分析，掃描范圍是4000-400(^'圖1為改性前的原粒毛盤菌(Lachnum) CCTCC No:M2011054胞內(nèi)黑色素的紅外光譜圖；圖2為采用上述方法對粒毛盤菌(Lachnum) CCTCC No:M2011054胞內(nèi)黑色素采用組氨酸進行改性修飾后的水溶性黑色素的紅外光譜圖。對比分析這兩個紅外光譜圖的結(jié)果表明，改性前后的粒毛盤菌CCTCCNo:M209193胞外黑色素均具有真菌黑色素的特征吸收峰，即3388CHT1和1629CHT1處的C=O和-O (N) H基團特征吸收峰，此外水溶性黑色素在1659.67CHT1和1636.0lcnT1處具有黑色素的羰基與組氨酸的氨基結(jié)合形成的特征吸收峰，在3000(^^-3200(?^處具有組氨酸咪唑環(huán)上C-H的伸縮振動吸收峰；在1463.3301^-1576.63cm—1處具有組氨酸咪唑環(huán)上C=N伸縮振動吸收峰，在1171.0ecnT1處具有組氨酸咪唑環(huán)上C-H面內(nèi)彎曲振動吸收峰。該結(jié)果表明組氨酸對粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素改性成功。
[0017]四、粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素(LIM)及水溶性粒毛盤菌黑色素(HLIM)的抑制肝癌作用藥理實驗:
[0018](I)粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素及其水溶性黑色素生理鹽水溶液的制備:將上述粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素及其通過組氨酸對粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素改性后的水溶性黑色素粉末用質(zhì)量百分濃度為0.9%的生理鹽水分別配置成50mg/mL、100mg/mL和200mg/mL的水溶液,采取的給藥體積為0.25mL/每只小鼠。
[0019](2)動物:昆明小鼠100只，雌雄各半，體重22±2g，隨機分組。
[0020](3)試劑盒:采用的超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、過氧化氫酶(CAT)測試盒、丙二醛(MDA)試劑盒、小鼠白細胞介素-2 (IL-2) ELISA試劑盒和腫瘤壞死因子-α (TNF-α )ELISA試劑盒，為南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的產(chǎn)品；陽性藥物:環(huán)磷酰胺，為上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)的產(chǎn)品。
[0021](4)方法:將小鼠H22肝癌細胞常規(guī)培養(yǎng)后，調(diào)整濃度為2X IO6個/ml。取昆明小鼠10只，每只腹腔注射0.5ml細胞懸液進行瘤細胞體內(nèi)增值。常規(guī)飼養(yǎng)7d后，選擇生長狀態(tài)良好的小鼠取腹水瘤細胞，離心后棄上清，用無菌生理鹽水稀釋至細胞濃度為IO7個/ml。另取健康小鼠80只(雌雄各半)，每只小鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2ml上述細胞懸液，常規(guī)飼養(yǎng)4d后，得到腫瘤直徑達到0.5cm左右的H22荷瘤模型小鼠，表明建模成功。
[0022]將上述建模成功的H22荷瘤模型小鼠隨機分為8組(每組10只)，分別為模型對照組(0.9%的生理鹽水)、陽性對照組(環(huán)磷酰胺，25mg.kg—1)、黑色素低劑量組(50mg.kg—1)、黑色素中劑量組(IOOmg.kg—1)、黑色素高劑量組(200mg.kg—1)、水溶性黑色素低劑量組(50mg.kg—1)、水溶性黑色素中劑量組(IOOmg.kg—1)、水溶性黑色素高劑量組(200mg.kg—1)，取10只健康小鼠作為空白對照組，分別稱體重并記錄。灌胃給藥0.2ml/只，I次/d，連續(xù)給藥12d。期間，每日觀察小鼠的一般活動、皮毛、反應能力等情況，測定攝食量，計算平均值。末次給藥后第2d，小鼠稱體重，脫頸椎處死。
[0023](5)相關指標測定:
[0024]抑瘤率及免疫器官指數(shù)測定:分離瘤塊,稱瘤質(zhì)量,計算抑瘤率:
[0025]抑瘤率=(模型組瘤質(zhì)量-給藥組瘤質(zhì)量)/模型組瘤質(zhì)量X 100% ；
[0026]取脾臟和胸腺，稱質(zhì)量，計算臟器指數(shù):
[0027]臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量X 100% ；
[0028]SOD酶活力、C AT酶活、MDA酶活、IL-2和TNF- α水平的測定:
[0029]從小鼠眼球取血，以5000r/min離心3min,取血清放于_20°C備用；臨用前恢復至室溫，按照試劑盒說明書步驟進行操作，測定SOD酶活力、C AT酶活力、MDA酶活力、IL-2和TNF-α的水平。
[0030](6)藥理實驗結(jié)果:
[0031]表1給出了上述粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素及其水溶性黑色素對H22荷瘤小鼠攝食量、體重增長率、抑瘤率及臟器指數(shù)的影響。
[0032]表1粒毛盤菌胞內(nèi)黑色素及其水溶性黑色素對H22荷瘤
[0033]小鼠攝食量、體重增長率、抑瘤率及臟器指數(shù)的影響
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途，將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌發(fā)酵后提取純化制備得到的胞內(nèi)黑色素，采用組氨酸對該胞內(nèi)黑色素進行修飾，改性后得到水溶性粒毛盤菌黑色素；其特征在于:將該水溶性粒毛盤菌黑色素應用在制備抑制肝癌藥物中的用途。
2.如權(quán)利要求1所述水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途，特征在于所述水溶性粒毛盤菌黑色素為，將菌種保藏編號為CCTCC No:M2011054的粒毛盤菌發(fā)酵后提取純化制備得到的胞內(nèi)黑色素按如下條件采用組氨酸對該胞內(nèi)黑色素進行修飾:將胞內(nèi)黑色素與組氨酸，和水，按摩爾比為1:2~5:50~100混合，震蕩至黑色素固體溶解，離心后將該溶液于截留分子量為200Da的透析袋透析24~48h，冷凍干燥，所得到的水溶性粒毛盤菌黑色素。
3.如權(quán)利要求1所述水溶性粒毛盤菌黑色素在制備抑制肝癌藥物中的用途，特征在于按藥劑學的常規(guī)制備方法將有效量的水溶性粒毛盤菌黑色素與藥用輔料混合加工制備成片劑或膠囊。
【文檔編號】A61K9/48GK103720722SQ201410022755
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2014年1月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月16日
【發(fā)明者】葉明 , 盧瑩, 宋升
申請人:合肥工業(yè)大學