用于將gdnf和bdnf遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于將GDNF和BDNF遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白，其包括充當(dāng)穿過血腦屏障的載體的肽載體如angiopep-2，連接于膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）、或相關(guān)分子，如它們的類似物或片段。本發(fā)明的化合物可以用來治療其中期望增加神經(jīng)元存活或生長的任何疾病，例如神經(jīng)變性疾病如帕金森病或肌萎縮側(cè)索硬化。能夠利用所述化合物進(jìn)行治療的其他疾病包括精神分裂癥和抑郁癥。
【專利說明】用于將GDNF和BDNF遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白
[0001]本申請是申請日為2010年6月11日的題為“用于將⑶NF和BDNF遞送至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的融合蛋白”的中國專利申請?zhí)?01080031759.6的分案申請。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及一種包括肽載體和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)或腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)的軛合物(結(jié)合物或共軛物，conjugate)，及其用途。
【背景技術(shù)】
[0003]與神經(jīng)元損失或損傷相關(guān)的疾病是嚴(yán)重病癥并且在世界范圍內(nèi)影響數(shù)百萬人。盡管療法如GDNF在治療神經(jīng)變性病如帕金森病中具有前景，但是在本發(fā)明之前，這樣的療法至腦的遞送由于活性劑不能穿過(跨越或越過，cross)血腦屏障而是復(fù)雜的。事實(shí)上，涉及用于帕金森病的GDNF療法的先前臨床試驗(yàn)要求使用將藥劑直接注入腦中，并且用于治療肌萎縮側(cè)索硬化的BDNF試驗(yàn)涉及藥劑的胸內(nèi)注射。這些方法是繁瑣且困難的。
[0004]由于對于其中增加神經(jīng)元存活或生長是有益的各種各樣的疾病的治療性治療存在需要，所以期望具有穿過血腦屏障的能力的基于⑶NF和BDNF的治療劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]現(xiàn)在本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了這樣的化合物，其包括軛合至⑶NF、BDNF、或相關(guān)分子的肽載體(peptide vector)。這些化合物可以例舉包括⑶NF或BDNF序列和Angiopep-2序列的融合蛋白。在某些實(shí)施方式中，這些化合物能夠穿過血腦屏障，并因此可以用作治療具有神經(jīng)變性疾病或神經(jīng)元受損的對象(個(gè)體，subject)的治療劑。
[0006]因此，在第一方面 ，本發(fā)明的特征在于一種包括下式的化合物
[0007]A-X-B
[0008]其中A是肽載體；B是與以下基本上相同(具有統(tǒng)一性的，identical)的多肽:(i)GDNF、其具有至少一種GDNF活性的片段、或GDNF類似物(例如本文中描述的任一種)；或
(ii)BDNF、其具有至少一種BDNF活性的片段、或BDNF類似物(例如本文中描述的任一種)；以及X是結(jié)合A與B的連接物(接頭，linker)(例如本文中描述的任一種)。該化合物可以能夠(例如有效地)穿過血腦屏障。該化合物可以包括⑶NF的成熟形式(例如亞型I的氨基酸118-211)或BDNF的成熟形式(例如亞型A的氨基酸129-247)。⑶NF片段可以包括或可以是亞型I的氨基酸78-211。該化合物可以進(jìn)一步包括標(biāo)簽(tag)如His標(biāo)簽，或切割位點(diǎn)如凝血酶切割位點(diǎn)。在某些是實(shí)施方式中，該化合物具有圖2或圖14所示的結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方式中，X是肽鍵或X是至少一個(gè)氨基酸，其中A和B各自通過肽鍵共價(jià)地鍵接于X。在某些實(shí)施方式中，連接物是柔性連接物(例如(GGGGS)n，其中η為1、2或3)、剛性連接物(例如PAPAP和(PT)nP，其中η為2、3、4、5、6或7)，或者α -螺旋連接物(例如A(EAAAK)ηΑ，其中η為1、2、3、4或5)。肽載體可以存在于⑶NF、BDNF或相關(guān)分子的N-或C-端。本發(fā)明的特征還在于一種編碼該化合物的核酸分子，其中X是肽鍵、氨基酸或肽連接物。該核酸可以是載體的一部分，并且該核酸可以可操作地(operably)連接于啟動子。本發(fā)明的特征還在于一種通過在細(xì)胞中表達(dá)由所述載體編碼的多肽，并純化該多肽而制備一種化合物的方法。本發(fā)明的特征還在于一種通過在固體支撐物(固體載體，solid support)上合成所述化合物而制備該化合物的方法。
[0009]在另一方面，本發(fā)明的特征在于一種治療(例如預(yù)防地)具有神經(jīng)變性病或神經(jīng)元受損或損傷的對象(例如人)的方法，通過給予該對象有效量的本發(fā)明的化合物。神經(jīng)變性病可以選自由多聚谷氨酰胺序列延長病(多聚谷氨酰胺擴(kuò)張紊亂，polyglutamineexpansion disorder)、脆性X染色體綜合征、脆性XE精神發(fā)育遲緩、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥(Friedreich’ sataxia)、營養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直(myotonic dystrophy)、8型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia type8)和12型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、亞歷山大病(Alexander disease)、阿耳拍病(Alper，s disease)、阿爾茨海默病(Alzheimer’ sdisease)、肌萎縮側(cè)索硬化癥(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)、運(yùn)動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telangiectasia)、Batten 病(Batten disease, SVSB 四氏病(SpieImeyer-Vogt-Sjogren-Batten disease))、卡納萬病(Canavan disease)、Cockayne綜合征(Cockayne syndrome)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(Corticobasal degeneration)、克雅二氏病(Ceutzfeldt-Jakob disease)、缺血性中風(fēng)(ischemia stroke)> 克拉伯病(Krabbedisease)、Lewy體癡呆(Lewy body dementia)、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮(multiple systematrophy)> 帕金森病、佩-梅二氏病(Pelizaeus-Merzbacher disease)、匹克病(Pick，sdisease)、原發(fā)性側(cè)索硬化(primary lateral sclerosis)、植燒酸忙積癥(Refsum，sdisease)、Sandhoff 病(Sandhoff disease)、謝耳德病(Schilder，s disease)、脊髓損傷(spinal cord injury)、脊髓性肌萎縮(spinal muscular atrophy)、SRO 三氏病(Steele-Richardson-Olszewski disease)、以及脊髓瘦(Tabes dorsalis)組成的組。多聚谷氨酰胺復(fù)發(fā)病(polyglutamine repeat disease)可以是亨廷頓氏病(HD)、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮(dentatorubropallidoluysian atrophy)、肯尼迪病(Kennedy，sdisease)(也稱為脊髓延髓肌萎縮(spinobulbar muscular atrophy)),或選自由I型、2型、3型(馬-約病(Machado-Josep`h disease))、6型、7型、和17型組成的組中的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxia)。神經(jīng)元損傷可以由缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)(hemorrhagic stroke)、或脊髓受損引起。能夠利用本發(fā)明的化合物治療的其他疾病包括抑郁癥和精神分裂癥(schizophrenia)。
[0010]在以上這些方面的特定實(shí)施方式中，A是Angiop印-2 (SEQ ID N0:97)，X是肽鍵，而B是h⑶NF78_211，其中A通過X結(jié)合于B的N-端；A是Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X是肽鍵，而B是h⑶NF78_211,其中A通過X連接于B的C-端；A是反向Angiopep-2 (reversedAngiopep-2)(SEQ ID NO: 117)，X是肽鍵，而B是h⑶NF78_211，其中A通過X連接于B的N-端；A 是 Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X 是(GGGGS)2，而 B 是 h⑶NF78_211，其中 A 通過 X 連接于 B的N-端汸是么叩化口印-2 (SEQID N0:97)，X是PAPAP，而B是h⑶NF78_211，其中A通過X連接于 B 的 N-端；或 A 是 Angiop印-2 (SEQ ID NO:97)，X 是 A(EAAAK)2A，而 B 是 h⑶NF78-211，其中A通過X連接于B的N-端。
[0011]在以上方面的任一個(gè)中，肽載體可以是與表1列出的序列中的任一個(gè)基本相同的多肽、或其片段。在某些實(shí)施方式中，肽載體具有Angiop印-1 (SEQ ID N0:67)、Angiopep-2 (SEQ ID N0:97)、Angiopep-3 (SEQ ID NO: 107)、Angiopep_4a (SEQ IDNO: 108)、Angiopep_4b (SEQ ID NO: 109)、Angiopep-5 (SEQ ID NO: 110)、Angiopep-6(SEQ ID NO: 111)、Angiop印-7 (SEQ ID NO: 112)、或反向 Angiop印-2 (SEQ ID NO: 117)的序列。本發(fā)明的肽載體或化合物可以被有效地輸送到特定細(xì)胞型(例如，肝、肺、腎、脾和肌肉中的任一種、兩種、二種、四種或五種)，或可以有效地穿過哺乳動物BBB (例如Angiopep-1、-2、-3、-4a> -4b> -5、以及-6)。在另一實(shí)施方式中,肽載體或化合物能夠進(jìn)入特定細(xì)胞型(例如，肝、肺、腎、脾和肌肉中的任一種、兩種、三種、四種或五種)，但不會有效地穿過BBB (例如包括Angiop印-7的軛合物)。肽載體可以為任意長度，例如至少6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、或 500 個(gè)氨基酸，或者是這些數(shù)值之間的任意范圍。在某些實(shí)施方式中，肽載體的長度為10~50個(gè)氨基酸。多肽可以通過重組遺傳技術(shù)或化學(xué)合成生產(chǎn)。
[0012]表1:示例性肽載體
【權(quán)利要求】
1.一種包含下式的化合物:
A-X-B 其中，A包括與選自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向Angiop印_2(SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQ ID NO:67)、cys_Angiopep-2 (SEQ ID NO: 113)和 Angiopep-2-cys (SEQID NO: 114)組成的組中的序列至少70%相同的氨基酸序列；B是與以下基本相同的多肽: ⑶NF、其具有至少一種⑶NF活性的片段、或⑶NF類似物； 以及 X是將A結(jié)合于B的連接物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述化合物能夠穿過血腦屏障。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述B包括GDNF的成熟形式。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，所述序列同一性為至少90%。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的化合物，其中，A包括選自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向 Angiopep-2 (SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQ ID NO:67)、cys-Angiopep-2 (SEQID NO: 113)和 Angiopep-2-cys (SEQ ID NO: 114)組成的組中的氨基酸序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物，其中，A由選自由Angiop印-2(SEQ ID N0:97)、反向 Angiopep-2 (SEQ ID NO: 117)、Angiopep-1 (SEQID NO:67)、cys-Angiopep-2 (SEQ IDNO: 113)和Angiopep·-2-cys (SEQ ID NO: 114)組成的組中的氨基酸序列構(gòu)成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X是肽鍵。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，X是至少一個(gè)氨基酸；并且A和B各自通過肽鍵共價(jià)鍵接于X。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的化合物，其中，X選自由以下構(gòu)成的組:(GGGGS)n，其中η為1、2 或 3 ;PAPAP ; (PT)pP，其中 ρ 為 2、3、4、5、6 或 7 ;以及 A (EAAAK) qA，其中 q 為 1、2、3、4 或 5。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ ID N0:97);X是肽鍵;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiopep-2(SEQ ID N0:97);X是肽鍵;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的C-端。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是反向Angiop印-2(SEQ ID N0:117);X是肽鍵；以及B是h⑶NF78_211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ ID N0:97);X是(GGGGS) 2 ;以及B是h⑶NF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQID NO:97);X是PAPAP ;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化合物，其中，A是Angiop印-2(SEQ IDN0:97);X是A (EAAAK) 2A ;以及B是hGDNF78-211 ;其中A通過X結(jié)合于B的N-端。
16.一種編碼根據(jù)權(quán)利要求7-15中任一項(xiàng)所述的化合物的核酸分子。
17.一種載體，包括根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸分子，其中，所述核酸可操作地連接于啟動子。
18.一種制備根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的化合物的方法，所述方法包括在細(xì)胞中表達(dá)由根據(jù)權(quán)利要求17所述的載體編碼的多肽，以及純化所述多肽。
19.一種制備根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的化合物的方法，所述方法包括在固體載體上合成所述化合物。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有神經(jīng)變性疾病的對象的藥物中的用途。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中，所述神經(jīng)變性疾病選自由以下組成的組:多聚谷氨酰胺序列延長病、脆性X染色體綜合征、脆性XE精神發(fā)育遲緩、弗里德賴希共濟(jì)失調(diào)癥、營養(yǎng)不良性肌強(qiáng)直、8型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、和12型脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)、亞歷山大病、阿耳珀病、阿爾茨海默病、肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)、運(yùn)動失調(diào)性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥、Batten病(SVSB四氏病)、卡納萬病、Cockayne綜合征、皮質(zhì)基底節(jié)變性、克雅二氏病、缺血性中風(fēng)、克拉伯病、Lewy體癡呆、多發(fā)性硬化、多系統(tǒng)萎縮、帕金森病、佩-梅二氏病、匹克病、原發(fā)性側(cè)索硬化、植烷酸貯積癥、SandhofT病、謝耳德病、脊髓損傷、脊髓性肌萎縮、SRO三氏病以及脊髓癆。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的用途，其中，所述多聚谷氨酰胺復(fù)發(fā)病是亨廷頓氏病(HD)、齒狀核紅核蒼白球丘腦下核萎縮、肯尼迪病(也稱為脊髓延髓肌萎縮)，或選自由I型、2型、3型(馬-約病)、6型、7型和17型組成的組中的脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)。
23.根據(jù)權(quán)利要求20所述的用途，其中，所述對象是人。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有神經(jīng)元損傷的對象的藥物中的用途。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的用途，其中，所述神經(jīng)元損傷是由缺血性中風(fēng)、出血性中風(fēng)或脊髓受損引起的。
26.根據(jù)權(quán)利要求24 所述的用途，其中，所述對象是人。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有抑郁癥的對象的藥物中的用途。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的用途，其中，所述對象是人。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的化合物在制備用于治療具有精神分裂癥的對象的藥物中的用途。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的用途，其中，所述對象是人。
【文檔編號】A61P25/18GK103819564SQ201410030902
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2010年6月11日 優(yōu)先權(quán)日:2009年6月11日
【發(fā)明者】米歇爾·德默勒, 多米尼克·波依溫, 讓-保羅·卡斯泰恩 申請人:安吉奧開米公司