一種藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬藍(lán)耳病(繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合癥，PRRSV)蛋白工程疫苗的制備與應(yīng)用。所述疫苗以PRRSV主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5和次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4的體液和細(xì)胞免疫表位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，通過柔性linker連接后再與Thelper表位串聯(lián)，克隆入pRSETB載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗。本發(fā)明還涉本發(fā)明還涉及該疫苗的使用方法。動物實(shí)驗(yàn)表明，藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的攻毒保護(hù)力與弱毒苗相當(dāng)，高于滅活苗，可以產(chǎn)生快速有效的免疫反應(yīng)，預(yù)防豬藍(lán)耳病病毒的感染。
【專利說明】一種藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的制備
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域，主要涉及一種豬藍(lán)耳病蛋白工程疫苗制備與應(yīng)用。具體地，利用基因重組技術(shù)，將主要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4、GP5抗原表位串聯(lián)并在框架結(jié)構(gòu)中加入Thelper表位,克隆入大腸桿菌載體,轉(zhuǎn)化宿主菌,經(jīng)過發(fā)酵,純化、乳化工藝制備，得到重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗以及該疫苗在預(yù)防重大動物疾病豬藍(lán)耳病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]豬生殖和呼吸綜合征(PorcineReporductive and Respiratory Syndrome, PRRS),又稱藍(lán)耳病(Blue ear diesase)是由動脈炎病毒科的豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRVS)引起的一種新的病毒性傳染病，是一種以導(dǎo)致母豬發(fā)熱、厭食、早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎等繁殖障礙及仔豬高死亡率和育成豬呼吸困難、發(fā)育遲緩為特征的新病。1987年該病首次報(bào)道于美國，隨后在北美、歐洲及亞洲各國和地區(qū)迅速蔓延，目前已成為一種地方性流行病(DeaSetal，1991 ;殷震等，1985 ；LoulaT, 1991 ；ShimizuM etal.，1994 ；Lindhausff etal.，1991.)。1996年，我國郭寶清首次分離到病毒(北美型經(jīng)典毒株)，證實(shí)我國也存在此病(郭寶清等，1996)，之后我國相繼有20多個(gè)省份報(bào)道發(fā)生了該病的流行(Tian K G et al.，2007 ;田克恭等2008 ;金寧一，2008)，尤其是2006年下半年來，我國有25個(gè)省份發(fā)生了以高致病性豬藍(lán)耳病病毒(HP-PRRSV)為主要病原的“豬高熱病”。各地高致病性PRRSV變異株有以下特點(diǎn):傳播迅速，毒力增強(qiáng)，致病力相似；對中小養(yǎng)殖場和農(nóng)戶危害嚴(yán)重；分子特征一致，起源于同一祖先。對全國各地分離的高致病性豬藍(lán)耳病病毒毒株，通過完整的ORFS和部分Nsp2基因序列比較分析發(fā)現(xiàn)來自不同豬場的HPPRRSV高度同源，而且在Nsp2基因上都有兩個(gè)相同位點(diǎn)的缺失:Nsp2基因的第483位和535-563位氨基酸發(fā)生缺失(童光志等，2007 ;郝曉芳等，2007)。而與2005 年以前的PRRSV的Nsp2同源性僅為69.886.2%。新分離毒株的GP5基因相互之間也是高度同源(98.5% -100.0% )，與以前的PRRSV毒株相比變異也比較大，尤其是兩個(gè)潛在的認(rèn)為與病毒毒力相關(guān)的氨基酸(R13 — Q13and R151 — G151) (Madsenet al.,1998 ；Yang et al.，1998 ；Allende et al.，2000)。目前，對該病尚無有效的治療方法，疫苗免疫雖然能在一定程度上減輕疫情的嚴(yán)重情況，仍在疫苗的選用上存在不少問題；藍(lán)耳病在我國廣泛的流行給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失，因此研制有效控制該病的疫苗是當(dāng)務(wù)之急。
[0003]更加有效的PRRSV疫苗的開發(fā)存在三個(gè)主要問題:⑴對于免疫系統(tǒng)PRRSV可能誘導(dǎo)反相調(diào)節(jié)信號，在結(jié)構(gòu)蛋白中存在極大的抗原變異性，因此，免疫保護(hù)并未完全搞清楚。⑵正如(I)所示，PRRSV異源二聚體GP5-M肯定是體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的主要誘導(dǎo)蛋白；(3)然而，次要結(jié)構(gòu)蛋白對于PRRSV病毒粒子的感染性也是必要的(Wissink etal.，2005)，也可以起到保護(hù)作用，而且誘導(dǎo)T細(xì)胞保護(hù)反應(yīng)表明其也具有有限的T細(xì)胞表位(Mateuand Diaz, 2008)。
[0004]PRRSV包括3個(gè)主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5 (E)、GP6 (M)和GP7 (N)以及次要結(jié)構(gòu)蛋白GP2、GP3、GP4。研究結(jié)果表明，GP2在病毒中含量少，免疫原性差并且在實(shí)際操作中難以分離提純；GP3主要誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫；GP4、GP5 (E)和GP6 (M)均可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，其中GP5有6個(gè)抗原決定簇，是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價(jià)呈顯著相關(guān)性((Lopez and Osorio, 2004 ；Tong et al., 2009)，GP5還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。核衣殼蛋白(N)免疫原性強(qiáng)，但產(chǎn)生的抗體無中和活性，主要用于免疫診斷，是檢測病毒抗體的良好抗原。Yoon等的研究發(fā)現(xiàn)，向豬體內(nèi)被動輸入高滴度中和抗體可以預(yù)防本病(Yoon KJ et al., 1996),而且母豬在輸入高滴度中和抗體后可免于出現(xiàn)繁殖障礙(OsorioFAet al.，2002)。這說明，單體液免疫即可有效預(yù)防PRRSV。豬感染PRRSV后，最7d即可檢測到特異性抗體。在整個(gè)感染期問，均能檢測出結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白(尤其是Nsp2)抗體(Meulenberg JJ et al., 1995 ；Nelson EA et al., 1994 ；01eksiewica MB et al., 2002 ；ffuWH et al.，2001)，有關(guān)PRRSV的免疫保護(hù)機(jī)制還沒有完全闡明，體液免疫和細(xì)胞免疫均可發(fā)揮作用。
[0005]GP3蛋白由0RF3編碼的一種高度糖基化蛋白。GP3蛋白共有7個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，且這些糖基化位點(diǎn)在不同分離株間非常保守(Gonin et al.，1998 ；Katz et al.，1995)。GP3在動脈炎病毒糖蛋白中的位置比較特殊，它的膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)還在推測中，而且它在病毒粒子中的結(jié)構(gòu)特征還存在爭議(Hedges et al.，1999 ；ffieringa et al.，2002) XP3 是PRRSV各毒株間保守性最差的蛋白之一，GP3可能與誘導(dǎo)細(xì)胞免疫有關(guān)，對豬產(chǎn)生保護(hù)作用(Plana-Duranet al.，1997)。GP3在歐美型毒株間推導(dǎo)氨基酸的同源率為54%~60%而且多數(shù)變異發(fā)生在其N末端，但GP3的N端潛在的糖基化位點(diǎn)及疏水性仍是保守的。另外，與LV相比，北美型毒株的GP3中C端的推導(dǎo)氨基酸有12個(gè)殘基的缺失。0RF3和0RF4的重疊區(qū)有一疏水的高變區(qū)，即GP4的N端存在這樣一個(gè)高變區(qū)。據(jù)報(bào)道，LV的這個(gè)高變區(qū)含有一個(gè)推測的中和位點(diǎn)，其中由9個(gè)氨基酸構(gòu)成的基元(59-67)構(gòu)成了此中和位點(diǎn)的核心，此處的突變可造成GP4蛋白的抗原性發(fā)生改變(Meulenberg JJ et al.，1997)。
[0006]基質(zhì)蛋白(M)和GP5糖蛋白是囊膜的主要成分，M和GP5構(gòu)成異二聚體。從歐洲LV株上還分離出囊膜糖蛋白GP3，但是在北美IAF-Klop株的GP3是一種可溶性蛋白且與囊膜結(jié)合能力較弱(Dea, Set al., 2000) 0 GP4蛋白的分子量為31~35KD，有4個(gè)糖基化位點(diǎn)，為N-糖基化蛋白，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一。GP4蛋白有一個(gè)可以被單抗中和的抗原決定簇，它位于該蛋白胞外區(qū)第40~79位氨基酸之間。該區(qū)域在不同的PRRSV中高度可變，它可能和免疫選擇相關(guān)。已證實(shí)LV病毒的GP4蛋白誘導(dǎo)的抗體具有中和作用(Meulenberget al.，1997)，說明這個(gè)蛋白質(zhì)至少有部分暴露在病毒粒了的表面。雖然GP4蛋白具有中和表位，但GP4抗體的出現(xiàn)與血清的中和抗體效價(jià)似乎無相關(guān)性(Zhang etal.,1998)。Yoo等(2005)認(rèn)為GP4在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和介導(dǎo)脂質(zhì)雙層漂移中發(fā)揮作用。Meulenberg等在LV株的0RF4編碼蛋白GP4中鑒定了一個(gè)中和區(qū)，表明該蛋白誘導(dǎo)的抗體具有中和作用，但是該表位在北美株和歐洲株之間并不保守。而且，針對GP4的單克隆抗體的中和活性不如GP5的單克隆抗體有效。LV株GP4蛋白的中和域?yàn)橐挥H水域，靠近N末端(AA40-79)，在歐美毒株之間是高度變異的。Kwang等同大腸桿菌表達(dá)PRRSV北美參考株的0RF4，免疫印跡試驗(yàn)表明，在美國和加拿大豬場中只有65%的PRRSV陽性血清與該重組GP4發(fā)生反應(yīng)(GoninPetal, 1999 ；Kwang J etal.，1994)。然而，康復(fù)豬血清的病毒中和滴度與抗GP4的抗體無相關(guān)性。Zhang等用昆蟲細(xì)胞表達(dá)北美毒株VR-2385的GP4蛋白，制備的4株單克隆抗體沒有中和活性，它們都是針對構(gòu)象依賴性表位(Zhang Y etal.，1998)。用抗GP4的中和性單克隆抗體研究表明，GP4蛋白暴露于病毒粒子的表面，可能與病毒、細(xì)胞之間的相互作用有關(guān)。
[0007]GP5的生物學(xué)功能非常重要，主要在病毒感染、細(xì)胞結(jié)合及病毒吸附中起作用，也是淋巴細(xì)胞增生性應(yīng)答的靶點(diǎn)。GP5蛋白含有多個(gè)中和表位(Pirzadeh B etal.，1997 ；PirzadehB etal.,1998 ；WeilandE et al.，1999 ；ZhangYetal.，1998)，用重組GP5蛋白制備的單克隆抗體具有中和活性，病毒中和作用與抗GP5抗體效價(jià)呈顯著相關(guān)性。針對GP5的單克隆抗體的中和活性比針對其它蛋白如GP4蛋白的單克隆抗體更強(qiáng)(Weiland E et al, 1999)。研究表明，GP5蛋白至少包含兩種類型的中和抗原決定簇，一些為線性決定簇(Pirzadeh B etal.1998)，還有一些為構(gòu)象依賴性決定簇(Weiland E et al.，1999 ；Zhang Y etal.，1998)。人報(bào)道稱，無論是自然感染還是實(shí)驗(yàn)感染，M蛋白的抗體卻早于其他蛋白的抗體。由于該蛋白的保守性較好，所以其診斷學(xué)上具有重要意義(MengelingWLet al.,1995)。
[0008]PRRS自發(fā)生以來給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的危害。盡管弱毒疫苗和滅活苗被應(yīng)用于控制病毒感染，但由于其本身內(nèi)在的缺陷使得免疫效果都不十分理想?；钜呙缰荒鼙Ｗo(hù)同源病毒的攻擊，而對異源毒株的保護(hù)效果較差(Mengeling W Let al., 2003 ；Meng X J,2000)。活疫苗只能改善部分的臨床癥狀，而不能預(yù)防感染。另外，活疫苗還可能出現(xiàn)毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)(Opriessnig T et al.,2002)。另一方面,滅活苗預(yù)防和控制疾病的效果更差。
[0009]發(fā)明概述
[0010]本發(fā)明根據(jù)不同結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染中的作用，選擇主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5和次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4的表位作為疫苗框架結(jié)構(gòu)，通過柔性linker連接后再與Thelper表位串聯(lián)，克隆入PRSETB載 體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)過發(fā)酵、純化、乳化等工藝，獲得具有理想免疫原性的重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗。利用本發(fā)明制備的疫苗可以有效預(yù)防豬藍(lán)耳病的感染。
[0011]本發(fā)明的目的之一在于提供了一種新的能用于預(yù)防藍(lán)耳病的蛋白工程疫苗多肽及其疫苗組合物；本發(fā)明的目的之二在于提供了所述蛋白工程疫苗的構(gòu)建及獲得方法；本發(fā)明的目的之三在于提供了能夠表達(dá)所述藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的基因工程菌株；本發(fā)明的目的之四在于提供了所述藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的制備方法；本發(fā)明的目的之五在于提供了所述蛋白工程疫苗在預(yù)防藍(lán)耳病中的用途。
[0012]在第一方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防藍(lán)耳病的蛋白工程疫苗多肽及其組合物。其含有對主要的結(jié)構(gòu)蛋白GP5以及次要結(jié)構(gòu)蛋白GP3、GP4篩選得到的抗原表位以及Thelper表位。所述的蛋白工程疫苗蛋白或多肽或藥學(xué)上可接受的鹽以及表達(dá)抗原表位所需要的載體。載體也可以包括單獨(dú)編碼各抗原表位的序列，串聯(lián)可以通過遺傳工程方法進(jìn)行。所述疫苗也包括非免疫活性物質(zhì)，即為各多肽的連接部分，不具有抗原表位的免疫原性，也不具有任何佐劑活性，主要有純化標(biāo)簽、接頭肽、化學(xué)修飾部分、N端信號肽和C端多聚腺苷酸等。所述藥學(xué)上可接受的鹽是指無毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng)，適用于人或動物組織的鹽。非活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的鹽為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0013]在第二方面，本發(fā)明提供了一種核苷酸分子，其編碼本發(fā)明第一方面所述的藍(lán)耳病蛋白工程疫苗多肽。本發(fā)明中核苷酸可以是RNA形式，DNA形式，通過人工合成方式合成多抗原表位串聯(lián)序列，然后經(jīng)過基因工程操作連接后克隆入載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，篩選、發(fā)酵、純化后獲得藍(lán)耳病蛋白工程疫苗多肽。在本發(fā)明中可以對該核酸進(jìn)行常規(guī)的分子生物學(xué)操作，如:PCR、限制性內(nèi)切酶酶切、連接等，核酸設(shè)計(jì)5’端和3’端均加入酶切位點(diǎn)。優(yōu)選本發(fā)明中的核苷酸序列如下:[0014]GCAAAGTTCGTTGCAGCATGGACCCTGAAAGCAGCAGCAATCTCCGAGATCAAGGGTGTCATCGTCCACAAGATCGAGGGGATCGGTTCTGGTATAGGGCATGACCGATGTAGTGAGAACGATCATGACGAACTAGTTCACGACGGGGATAACGCCACCTTGCCTCGCCATGACAATATTGTCTTTCGGACATCAAAACCAACACCACCGCAGCATCAGGGTTCTGGTCCATGTTTCAGTTCGAGCCTTTCGGACATCAAAACCAACACCTCCGCAGCATCAGACTTCGTTGTCCTCCAGGACATCAGCTGCCTTAGGCATGGCGACTCGTCCCCTCCGACGGTTCGCAAAATCCCTCAGTGCCGCTCTGAGATGAGTGAAAAGGGATTCAAAGTGGTGTTCGGCAATGTGTCAGGCATCGTGGCTGTGTGCGTCAACTTTACCAGCTACGTCCAACACGTCAAGGAGTTTACCCAACGCTCCTTAGGTGGTGCCAACCCAAACAACAGCTCTTATTCACAGTTGATTTATAACCTGACACTATGTGAGCTGAATGGCACAGATTGGTTGGTGAAGAATTGCATGTCTTGGCGCTACTCATGTACCAGGTATACTAATTTTCTTTTAGACACCAAAGGCAAAATTTATCGTTGGCGATCACCCGTCATCATAGAGAAAGGGGGAAAAGTTGAGGTCGAGGGCCACCTCATCGACCTCAAGAGAGTTGTGCTTGATGGTTCCGCGGCTATCCCTGTAACCAAAATTTCAGCTGAGCGATGGGGTCATCCC
[0015]在第三方面，本發(fā)明提供了一種載體，其除了含有本發(fā)明第二方面所述的編碼藍(lán)耳病蛋白工程疫苗核苷酸分子，還含有與該核苷酸序列可操作的連接，在原核細(xì)胞表達(dá)(轉(zhuǎn)錄和翻譯)所需的表達(dá)控制元件。最基本的表達(dá)控制元件包括啟動子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)子，選擇性標(biāo)記等，這些調(diào)控元件為本領(lǐng)域所熟知。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為大腸桿菌表達(dá)載體。
[0016]在第四方面，本發(fā)明提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第三方面所述的載體。宿主細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染含有本發(fā)明所述編碼蛋白的基因序列，而后經(jīng)檢測具有良好的的遺傳和表達(dá)穩(wěn)定性后，可用于發(fā)酵 表達(dá)生產(chǎn)所需的藍(lán)耳病蛋白工程疫苗多肽。
[0017]在第五方面，本發(fā)明提供了一種藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的制備方法，其包括以下步驟:工程菌發(fā)酵表達(dá)蛋白工程疫苗多肽，經(jīng)過粗純化與精細(xì)純化工藝以及后續(xù)乳化工藝，獲得所需要的重組疫苗。其中涉及的方法包括但不限制于菌體破碎、包涵體洗滌、離心、變性、親和層析、疏水層析、陰離子交換色譜、反相色譜、復(fù)性、乳化等。本發(fā)明中涉及的制備方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
[0018]在第六方面，本發(fā)明提供了一種用于預(yù)防豬藍(lán)耳病的重組蛋白工程疫苗，其包括本發(fā)明第一方面所述的多肽以及藥學(xué)上可接受的載體。所述蛋白工程疫苗能夠預(yù)防豬藍(lán)耳病的爆發(fā)。本發(fā)明所述的藥學(xué)上可接受的載體為免疫增強(qiáng)劑或免疫佐劑，優(yōu)選免疫佐劑為進(jìn)口白油佐劑。
[0019]在第七方面，本發(fā)明提供了第六方面所述的重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗的應(yīng)用。疫苗可以一定有效劑量肌肉注射，皮內(nèi)或皮下注射或鼻內(nèi)接種注射動物，能夠誘導(dǎo)足夠量的體液及細(xì)胞免疫提供抗病毒活性，保護(hù)動物免于藍(lán)耳病流行毒株的攻擊。此外，在本發(fā)明的實(shí)施方案中，通過對疫苗進(jìn)行靶動物攻毒對比試驗(yàn)、實(shí)驗(yàn)室安全性試驗(yàn)等，表明本發(fā)明所述的重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗是安全的(見實(shí)施例四)，能夠保護(hù)動物免受藍(lán)耳病病毒感染(見實(shí)施例五、六、七、八、九、十)。
[0020]另外，需要指出的是，在本申請的上下文的公開內(nèi)容的基礎(chǔ)上，本發(fā)明的其他具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)的方面對本領(lǐng)域的普通技術(shù)人來說是顯而易見的。此外，本發(fā)明亦使用了公開文獻(xiàn)，他們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行參考。
【專利附圖】

【附圖說明】[0021]下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗表達(dá)載體pRSETB-PRRSV(GP3/4/5)構(gòu)建圖；圖2pRSETB-PRRSV(GP3/4/5)載體質(zhì)粒酶切圖，其中泳道I為DNAmarker，從上至下分子量依次為2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp，泳道2為質(zhì)粒酶切圖，泳道3為未酶切對照，泳道4為陰性對照；圖3SDS-PAGE檢測圖，其中泳道I為蛋白Marker，從上至下依次為97.2KD、66.4KD、44.3KD、29.0KD、20.1KD、14.3KD，泳道2為未誘導(dǎo)的陰性對照樣品，泳道3為陽性對照，泳道4為誘導(dǎo)的樣品，箭頭所指為表達(dá)的目的蛋白檢測圖，其中泳道I為預(yù)染marker，從上至下依次為97KD、66KD、43KD、3IKD、20KD、14KD，泳道2為陽性對照，泳道3為陰性對照，泳道4為目的蛋白。圖5為小鼠血清GP5特異性抗體檢測結(jié)果；圖6為針對PRRSV刺激鼠腎細(xì)胞T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；圖7針對PRRSV刺激仔豬PBMC T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；圖8為PRRSV中和抗體水平檢測結(jié)果；圖9為病毒特異性(記憶抗原刺激)產(chǎn)生頻率和自發(fā)(背景)IFN Y-SC的平均值；圖10為PBMC自發(fā)產(chǎn)生IL-10的檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]實(shí)施例中所述的具體試驗(yàn)方法描述僅是示例性描述，用于詳細(xì)闡述本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制，依據(jù)本發(fā)明的許多變化為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知。
[0023]實(shí)施例一大腸桿菌表達(dá)載體與表達(dá)菌株的構(gòu)建
[0024]將設(shè)計(jì)好的多肽編碼核苷酸送上海英俊生物技術(shù)公司合成，核苷酸片段兩端分別設(shè)計(jì)了 EcoRI (5’端)和HindIII (3’端)限制性酶切位點(diǎn)，把這片段合成后分別克隆到PMD18T載體上，序列測定證實(shí)插入基因片段與設(shè)計(jì)序列一致(見序列表)。將重組質(zhì)粒分別命名為pMD18T-PRRSV(GP3 /4/5)。用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶將兩種質(zhì)粒進(jìn)行酶切處理，大腸桿菌表達(dá)載體選用Invitrogen公司的pRSETB質(zhì)粒,也使用相同的限制性內(nèi)切酶處理,酶切條件:10μ I反應(yīng) 體系，體系內(nèi)加入2 μ I質(zhì)粒，限制性內(nèi)切酶為5個(gè)活性單位(NewEngland biolabs)，加入IOX緩沖液I μ 1，去離子水補(bǔ)齊，37°C酶切90min。酶切結(jié)束后加入I μ 1200mM EDTA終止反應(yīng)。在I %瓊脂糖凝膠電泳中，電泳30分鐘。紫外燈下將2.88kbpRSETB質(zhì)粒和796bp PRRSV (GP3 /4/5)片段切下，按照Qiagen公司凝膠回收試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。按照載體:片段=1: 2-3的比例將多表位核苷酸片段單獨(dú)和表達(dá)載體混合，反應(yīng)體系15 μ 1，由T4DNA連接酶進(jìn)行連接，16°C連接過夜，獲得重組質(zhì)粒分別命名為pRSETB-PRRSV(GP3 /4/5)，(見圖1)，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 BL21 (DE3)pLysS。
[0025]轉(zhuǎn)化:將pRSETB-PRRSV (GP3 /4/5)置冰上融化，加入2 μ I鏈接反應(yīng)液，再次混勻，冰水浴30分鐘，42°C 30秒，然后迅速放回冰浴1.5分鐘，加入1ml LB培養(yǎng)液，37°C，靜置培養(yǎng)I小時(shí)，4000g低溫離心10秒鐘棄上清，用200 μ ILB培養(yǎng)基重懸菌體；將菌液均勻涂布于含有100 μ g / mL氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)板上，倒置于37°C恒溫箱中培養(yǎng)12-16小時(shí)，直至克隆形成。
[0026]鑒定:挑取平板上的單克隆至LB培養(yǎng)基中，37°C，180rpm震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，提取質(zhì)粒，分別使用內(nèi)切酶EcoRI和Hindi 11進(jìn)行雙酶切，可以切出相應(yīng)藍(lán)耳病疫苗基因大小片段的克隆為SOObp左右，可初步確定為陽性克隆(見圖2);陽性克隆進(jìn)行DNA序列測定進(jìn)一步驗(yàn)證其正確性(見序列表)。
[0027]誘導(dǎo)表達(dá)。即將陽性克隆過夜培養(yǎng)，次日早上按1: 100轉(zhuǎn)接，培養(yǎng)3小時(shí)后，加入0.5mM IPTG，繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)，制備樣品；常規(guī)SDS-PAGE檢測目的蛋白表達(dá)情況——在33.8KD(見圖3)，見到特異性條帶為正確克??；取正確克隆，放大培養(yǎng)，SDS-PAGE證實(shí)表達(dá)正確后，使用常規(guī)Western-blot進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)準(zhǔn)確性(見圖4);經(jīng)過上述構(gòu)建及鑒定程序后，可將挑選的陽性克隆作為工程菌進(jìn)行原始種子庫的建立，菌種命名pRSETB-PRRSV(GP3 / 4 / 5) / BL21(DE3，Plys)。
[0028]實(shí)施例二工程菌的發(fā)酵、純化與乳化
[0029]發(fā)酵取生產(chǎn)菌種，接種于2ml LB液體培養(yǎng)基中(含100 μ g/ml氨芐青霉素)，37°C，180rpm振蕩培養(yǎng)12小時(shí)活化菌種。再以1: 100的接種量接入搖瓶，37 °C振蕩培養(yǎng)至0D600=3，可按10%比例接種入發(fā)酵罐。發(fā)酵用培養(yǎng)基為半合成培養(yǎng)基，用蒸餾水配制，其中不含有任何抗生素。校正溶氧和PH值電極，開啟罐體攪拌，轉(zhuǎn)數(shù)為300rpm，罐體在線滅菌，待罐內(nèi)培養(yǎng)液溫度降至37.(TC時(shí)，標(biāo)定pH及溶氧(OD)零點(diǎn)。發(fā)酵溫度為37.0 ± 0.1°C，溶氧控制在20%左右，pH控制在7.0，接種后培養(yǎng)菌體0D600=1.0~1.2時(shí)流加補(bǔ)料500ml，補(bǔ)料后I小時(shí)加入IPTG (終濃度為0.5mM)誘導(dǎo)表達(dá)，連續(xù)誘導(dǎo)6個(gè)小時(shí)后發(fā)酵結(jié)束，取樣做SDS-PAGE檢定表達(dá)情況。
[0030]純化將收集到的菌體，用包含體洗液(1% Triton X-100，20mMTris_cl PH8.0)混懸后進(jìn)行超聲，2000W超聲裂解I小時(shí)，4°C，12000rpm離心收集包含體，用4M鹽酸胍，0.2%β -ME, 20mM Tris-cl (pH=8.00)混勻，室溫?cái)嚢?小時(shí),8000rpm低溫離心30min,棄去沉淀。變性蛋白1: 100稀釋，復(fù)性液用Tris (PH8.0)緩沖體系，加入0.3M精氨酸，4°C攪拌復(fù)性24小時(shí)。復(fù)性液用pH=8.0的20mM磷酸緩沖液，0.5M氯化鈉，20mM咪唑，平衡上親和層析柱，用pH=8.0的20mM磷酸緩沖液，0.5M氯化鈉，0.5M咪唑洗脫；即得重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗半成品原液。做SDS-PAGE以及Western blot印記檢定純化產(chǎn)物是否為目標(biāo)蛋白。
[0031]乳化將純化的半成品用滅菌的PBS稀釋至200μ8 / ml。取進(jìn)口白礦物油佐劑DU0PRME(醫(yī)藥級)經(jīng)121 °C，滅菌15分鐘，備用。按油相:水相=50: 50的比例配制，先將油相加入乳化缸內(nèi)，開動攪拌機(jī)以80-100r / min的速度緩慢攪拌，緩緩加入水相，加完后再攪拌2min,然后以5500r / min高速循環(huán)乳化9min,制成油包水單相疫苗。
[0032]實(shí)施例三重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗安全性試驗(yàn)
[0033]I 材料
[0034]1.1疫苗:由寶麥德生物研發(fā)中心提供，批號為20120611、20120612、20120613。
[0035]1.2試驗(yàn)動物:18_22gBalb / C小白鼠購自北京華阜康。30日齡健康三元雜交仔豬由廣東永順制藥提供。
[0036]2 方法
[0037]2.1疫苗對小白鼠的安全性
[0038]皮下注射18_22gBalb / C小白鼠，每只注射0.5ml，每批疫苗注射5只，共三個(gè)批次，注射15只小白鼠，同時(shí)設(shè)定2只陰性對照，連續(xù)觀察10天，觀測小白鼠的健康狀況。
[0039]2.2疫苗對仔豬的安全性
[0040]選擇30日齡健康三元雜交仔豬，每頭耳后肌肉注射重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗，每批次5頭，共三個(gè)批次，注射15頭仔豬，同時(shí)設(shè)立陰性對照2頭，每頭注射生理鹽水乳化液2ml,臨床觀察1 4天。
[0041]3 結(jié)果[0042]3.1疫苗對小白鼠的安全性試驗(yàn)
[0043]結(jié)果如表1，免疫后，所有小鼠的食欲、精神和健康狀況無異常，與對照組一致，無死亡發(fā)生，可見重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗對小白鼠是安全的，見表1。
[0044]表1疫苗對小白鼠的安全性試驗(yàn)結(jié)果
[0045]
【權(quán)利要求】
1.一種藍(lán)耳病蛋白工程疫苗融合蛋白，其氨基酸序列為SEQ IDN0.2。
2.—種核酸分子，其編碼權(quán)利要求1項(xiàng)所述融合蛋白。
3.—種載體,其含有權(quán)利要求2所述的核酸分子。
4.一種宿主細(xì)胞,其含有權(quán)利要求3所述的載體。
5.權(quán)利要求2所述的核酸分子，其具體序列如下:
gcaaagttcgttgcagcatggaccctgaaagcagcagcaatctccgagatcaagggtgtcarcgtccacaagatcgaggggatcggttctggtatagggcatgaccgatgtagtgagaacgatcatgacgaactagttcacgacggggataacgccaccttgcctcgccatgacaatattgtctttcggacatcaaaaccaacaccaccgcagcatcagggttctggtccatgtttcagttcgagcctttcggacatcaaaaccaacacctccgcagcatcagacttcgttgtcctccaggacatcagctgccttaggcatggcgactcgtcccctccgacggttcgcaaaatccctcagtgccgctctgagatgagtgaaaagggattcaaagtggtgttcggcaatgtgtcaggcatcgtggctgtgtgcgtcaactttaccagctacgtccaacacgtcaaggagtttacccaacgctccttaggtggtgccaacccaaacaacagctcttattcacagttgatttataacctgacactatgtgagctgaatggcacagattggttggtgaagaattgcatgtcttggcgctactcatgtaccaggtatactaattttcttttagacaccaaaggcaaaatttatcgttggcgatcacccgtcatcatagagaaagggggaaaagttgaggtcgagggccacctcatcgacctcaagagagttgtgcttgatggttccgcggctatccctgtaaccaaaatttcagctgagcgatggggtcatccc
6.一種用于預(yù)防高致病性藍(lán)耳病的疫苗，其包含權(quán)利要求1所述的融合蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體。
7.權(quán)利要求1所述的 融合蛋白在制備重組藍(lán)耳病蛋白工程疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/14GK103992408SQ201410118926
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】李殿明, 蒲勤, 李毅, 齊春梅, 田春輝, 任百亮, 張導(dǎo)春, 劉甜甜, 顧富香 申請人:青島寶麥德生物醫(yī)藥科技有限公司