一種GPx7重組蛋白的用途
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種重組GPx7的用途。本發(fā)明公開了一種GPx7重組蛋白在制備治療腫瘤藥物中的用途，其特征在于所述GPx7重組蛋白的序列如SEQ?ID?NO.1所示。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)GPx7重組蛋白具有抑瘤活性，克服了現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于GPx7為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，其抑制細胞增殖活性只能轉(zhuǎn)基因手段實現(xiàn)的技術(shù)誤解，為臨床治療腫瘤提供了新的選擇。
【專利說明】—種GPx7重組蛋白的用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種GPx7重組蛋白的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GPx)是機體內(nèi)廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GPx已經(jīng)包括8中不同的亞型，從GPxl亞型到目前發(fā)現(xiàn)的GPxS亞型，主要可以再細分成兩種，一種是含Sec稀有氨基酸的亞型，人源含硒的GPx (SecGPx)有5中，包括GPxl、GPx2、GPx3、GPx4以及GPx6 ;—種是不含有Sec稀有氨基酸的亞型，GPx7/8完全缺失了與GSH的結(jié)合位點。
[0003]2004年，首次報道了 GPx7具有緩解多不飽和脂肪酸介導(dǎo)細胞凋亡的功能，由于在結(jié)構(gòu)上GPx7與GPx4 (PHGPx)具有較高的相似性且都為單體，所以該研究小組又將GPx7稱為不含硒的磷酸脂質(zhì)羥基過氧化物酶(non-selenocysteine phospholipidhydroperoxide glutathione peroxidase, NPGPx)[Utomo, A., Jiang, X., Furuta, S.etal.Journal Of Biological Chemistry.2004,279(42):43522-43529.]。隨后，有報道關(guān)于GPx7能夠保護食管上皮細胞免受于胃酸和膽酸從胃部逆流造成細胞ROS累積所至使的DNA損傷，最終導(dǎo)致胃食管逆流癥(Gastro-oesophageal reflux disease, G0RD)發(fā)展為食管腺瘤(oesophageal adenocarcinoma, 0AC) [Peng, D., Belkhiri, A., Hu, T.etal.Gut.2012,61 (9):1250-1260]。GPx7也能夠緩解siRNA靶向干擾目標(biāo)mRNA時因脫靶效應(yīng)而對宿主細胞產(chǎn)生的應(yīng)激[Wei, P.C.,Lo,ff.T.,Su, Μ.1.et al.Nucleic Acids Res.2012，40 (I):323-332]。此外，GPx7也能夠調(diào)控葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白_78 (Glucose-regulatedprotein-78)的活性，在GPx7敲除小鼠當(dāng)中，GPx7的缺失最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激促成的嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病[Wei, P.C.，Hsieh, Y.H.，Su, Μ.1.et al.Molecular Cell.2012,48(5):747-759]。另一方面，有研究小組指出，作為CysGPx，GPx7與GPx8由于完全失去了谷胱甘肽(glutathione, GSH)結(jié)合位點，而幾乎不顯示任何的GPx活性，且GPx7與GPx8主要分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，其主要功能是參與到新合成蛋白質(zhì)的折疊過程中，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原蛋白 1-alpha (Endoplasmic reticulumn oxidoredoxinlalpha, Erol α )所產(chǎn)生的H2O2能夠有效利用到蛋白折疊中[Nguyen, V.D., Saaranen, M.J., Karala, A.R.etal.Journal Of Molecular Biology.2011,406 (3):503-515, Wang, L., Zhang, L., Niu, Y.etal.Antioxidants and Redox Signaling.2014, 20 (4):545-556]。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的旨在提供一種GPx7重組蛋白的用途。
[0005]一種GPx7重組蛋白在制備治療腫瘤藥物中的用途，其特征在于所述GPx7重組蛋白的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]所述腫瘤為尤因肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠瘤或其他腦腫瘤、脊髓腫瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、胰癌、腦垂體癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、胸腺癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤、胃癌、食道癌、小腸癌、肝癌、肝外膽管癌、胃腸類癌性腫瘤、膽囊癌、睪丸癌、陰莖癌、前列腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、陰道癌、子宮/子宮內(nèi)膜癌、陰部癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、輸卵管癌、子宮肉瘤、口腔癌、唇癌、唾腺癌、喉頭癌、下咽癌、上咽癌、鼻癌、鼻竇癌、鼻咽癌、兒童白血病、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、發(fā)狀細胞性白血病、急性早幼粒細胞白血病、血漿細胞性白血病、骨髓分化不良癥候群、骨髓增生性病癥、再生障礙性貧血、范禾尼貧血、特發(fā)性巨球蛋白血癥、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚型T-細胞淋巴瘤、周圍T-細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)性淋巴瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、梅克爾細胞癌、兒童軟組織肉瘤、成人軟組織肉瘤、卡波希肉瘤、腎癌維爾姆斯腫瘤、膀胱癌、尿道癌或轉(zhuǎn)移性細胞癌中之一。
[0007] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)GPx7重組蛋白具有抑瘤活性，克服了現(xiàn)有技術(shù)關(guān)于GPx7為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白，其抑制細胞增殖活性只能轉(zhuǎn)基因手段實現(xiàn)的技術(shù)誤解，為臨床治療腫瘤提供了新的選擇。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖lpET24A_GPx7表達質(zhì)粒圖譜；
[0009]圖2GPx7在原核表達系統(tǒng)的表達情況；
[0010]圖3純化條件為pH6.10和不含有DTT的GPx7純化圖譜；
[0011]圖4Gpx7在分子排阻層析上的純化圖譜；
[0012]圖5SDS-PAGE鑒定分子排阻層析精制的GPx7 ；
[0013]圖6Western blotting 鑒定純化的 GPx7 ；
【具體實施方式】
[0014]本發(fā)明所使用的部分術(shù)語定義如下:
[0015]“腫瘤”一般是指廣泛的以細胞的失控性異常生長為特征的病癥。包括但不限于如骨癌類，包括:尤因肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤等；腦和CNS腫瘤，包括:聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠瘤和其他腦腫瘤，脊髓腫瘤；內(nèi)分泌癌類，包括:腎上腺皮質(zhì)癌、胰癌、腦垂體癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、胸腺癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤；胃腸癌類，包括:胃癌、食道癌、小腸癌、肝癌、肝外膽管癌、胃腸類癌性腫瘤、膽囊癌；泌尿生殖器癌類，包括:睪丸癌、陰莖癌、前列腺癌；婦科癌類，包括:子宮頸癌、卵巢癌、陰道癌、子宮/子宮內(nèi)膜癌、陰部癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、輸卵管癌、子宮肉瘤；頭和頸部腫瘤類，包括:口腔癌、唇癌、唾腺癌、喉頭癌、下咽癌、上咽癌、鼻癌、鼻竇癌、鼻咽癌；血癌類，包括:兒童白血病、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、發(fā)狀細胞性白血病、急性早幼粒細胞白血病、血漿細胞性白血??；骨髓癌血液病癥，包括:骨髓分化不良癥候群、骨髓增生性病癥、再生障礙性貧血、范禾尼貧血、特發(fā)性巨球蛋白血癥；肺癌類，包括:小細胞肺癌、非小細胞肺癌；淋巴癌類，包括:霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚型T-細胞淋巴瘤、周圍T-細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)性淋巴瘤；眼癌類，包括:視網(wǎng)膜母細胞瘤、葡萄膜黑色素瘤；皮膚癌類，包括:黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、梅克爾細胞癌、軟組織肉瘤類，例如:兒童軟組織肉瘤、成人軟組織肉瘤、卡波希肉瘤、泌尿系統(tǒng)癌癥，包括:腎癌維爾姆斯腫瘤、膀胱癌、尿道癌和轉(zhuǎn)移性細胞癌。其中優(yōu)選神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、腎癌、肝癌、肺癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、骨癌、皮膚癌、淋巴癌、白血病、宮頸癌、或卵巢癌。
[0016]藥物組合物
[0017]用于本發(fā)明或者含有本發(fā)明所述GPx7重組蛋白的藥物組合物。通常，當(dāng)本發(fā)明藥物組合物用于上述用途時，所述橄欖樹葉粗提物可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等。
[0018]“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的融合體蛋白傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。
[0019]本發(fā)明的GPx7重組蛋白可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
[0020]上述劑型中可經(jīng)口服給藥的劑型為:片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、醑劑。固態(tài)載體包括:淀粉、乳糖、磷酸氫鈣、微晶纖維素、蔗糖、白陶土、微粉硅膠、滑石粉、低取代羥丙基纖維素、羧甲基淀粉鈉、聚乙烯吡咯烷酮。而液態(tài)載體包括:無菌水、乙醇、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制備藥物組合物的過程中通常使用的佐劑包括:調(diào)味劑、著色劑、防腐劑(如羥苯烷基丁酯、苯甲酸鈉、山梨酸)和抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉和二丁基羥基甲苯)。
[0021]上述劑型中可用于注射途徑給藥的劑型包括:注射劑、注射用無菌粉末，它們是將藥物與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑混合制成以供注射給藥的形式。溶劑包括:無菌水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇。此外，還需加入抑菌劑(如苯甲醇、羥苯丁酯、硫柳汞)、等滲調(diào)節(jié)劑(如氯化鈉、葡萄糖)、助懸劑(如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素)、增溶劑(吐溫-80、卵磷酯)、抗氧化劑(如維生素E、維生素C、焦亞硫酸鈉)和填充劑(如乳糖、甘露醇)。
[0022]從易于制備和給藥的立場看，優(yōu)選的藥物組合物是液態(tài)組合物。
[0023]本發(fā)明的藥物組合物可根據(jù)熟知的及公認(rèn)的制藥生產(chǎn)要求的方法制備。藥物組合物適宜包含本發(fā)明的GPx7重組蛋白以及藥學(xué)上可接受的載體，并適宜為單位劑量形式。
[0024]用途
[0025]公開了所述GPx7重組蛋白可用于治療腫瘤。
[0026]所用的活性成分的有效劑量可隨給藥模式和待治療疾病的嚴(yán)重程度而變化。對大部分大型哺乳動物而言，每天施以有效成分的總劑量約為0.01-1OOOmgo通常，成人臨床給藥量的范圍為0.01-200mg/日，優(yōu)選為0.05-100mg/日。
[0027]通常，當(dāng)本發(fā)明組合物用于上述用途時，它們可與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥途徑的藥物劑型，如片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末、栓劑等。
[0028]“藥學(xué)上可接受的”成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))即有合理的效益/風(fēng)險比的物質(zhì)?！八帉W(xué)上可接受的載體”是用于將本發(fā)明的GPx7重組蛋白傳送給動物或人的藥學(xué)上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以是液體或固體。[0029]本發(fā)明的化合物可經(jīng)過口服、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
[0030]以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)均按重量計。
[0031]除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0032]實施例1:構(gòu)建重組人GPx7蛋白的原核表達質(zhì)粒
[0033] 1、構(gòu)建人源GPx7原核表達質(zhì)粒和菌株
[0034]根據(jù)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站http://www.uniprot.0rg/uniprot/Q96SL4 關(guān)于 GPx7 的氨基酸序列分析結(jié)果，在構(gòu)建原核表達質(zhì)粒時去除GPx7N-端推測可能為信號肽相應(yīng)的19個氨基酸。首先，從實驗室原本已經(jīng)構(gòu)建好的真核表達質(zhì)粒P⑶NA3.l_GPx7(毛文偉，王曉，何慧娟，etal.體內(nèi)表達谷胱甘肽過氧化物酶-7型基因?qū)撬枰种频姆雷o作用研究.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，3 (4) =250-257,2008.)中擴增目的基因同時引入目的基因插入到原核表達載體pET24A中所需要的Ndel和BamHl酶切位點。采用正義引物5?-GCGCATATGCAGCAGGAGCAGGACTTC-3’ 和反義引物 5’ -GCGGGATCCTTATAAGTCTTCTCGCTTCA-3’ 進行對 GPx7 基因的擴增。按照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)體系,加入適當(dāng)體積的ddH20、10XPCR buffer、25mMgS04、10mMdNTP、10mM 相關(guān)引物、模板 DNA、KOD 聚合酶共 50 μ I 進行GPx7基因的擴增。反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性2min，(94°C變性40sec，65°C退火40sec，72°C延伸30sec) X36循環(huán)，72°C延伸10min,4°C結(jié)束。依照限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)商(Fermentas)所推薦方法進行PET24A原核表達載體和GPx7的PCR產(chǎn)物進行限制性Ndel和BamHl酶酶切反應(yīng)，并且依照DNA回收試劑盒生產(chǎn)商(Toyobo)的推薦的方法回收線性質(zhì)粒片段，然后線性化原核表達載體PET24A與含有酶切位點的目的基因片段的連接反應(yīng)依照T4連接酶生產(chǎn)商(Fermentas)推薦的方法進行，最后全部DNA連接反應(yīng)體系進行熱激轉(zhuǎn)化目的感受態(tài)菌株DH5 α與BL21 (DE3);篩選陽性轉(zhuǎn)化子，并進行PCR反應(yīng)鑒定；隨后，送往測序公司(InvitiOgen)進行基因測序并將測序結(jié)果與NCBI上的核酸數(shù)據(jù)庫進行比對(Genbankn0.BC032788.1)，確定原核表達載體pET24A_GPx7是正確的。見圖1
[0035]實施例2重組人源GPx7的表達、純化與鑒定
[0036]1、乳糖誘導(dǎo)表達GPx7
[0037]將實施例1所制備的含pET24A_GPx7表達質(zhì)粒的BL21 (DE3)菌株加入含相應(yīng)抗性抗生素終濃度為IOOy g/ul的3ml LB培養(yǎng)基進行37°C振蕩培養(yǎng)IOh以進行復(fù)蘇。取Iml復(fù)蘇菌液加入255ml LB培養(yǎng)基中，同時加入乳糖誘導(dǎo)所需成分10X乳糖誘導(dǎo)緩沖液、25 X乳糖誘導(dǎo)液、100 XMgSO4和終濃度為100μ g/ul的相應(yīng)抗生素，37°C振蕩培養(yǎng)和誘導(dǎo)7h。
[0038]取Iml菌體在SDS-PAGE中作全菌蛋白(Total cell protein, TCP)鑒定。經(jīng)離心收集、緩沖液吹打懸浮、超聲破碎和離心分離后，取上清作SDS-PAGE鑒定，從圖2 (泳道I為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道2為未誘導(dǎo)菌體的全菌總蛋白，泳道3為誘導(dǎo)菌體的全菌總蛋，泳道4為超聲破碎菌體的上清)中可見含乳糖誘導(dǎo)成分的實驗組與不含乳糖誘導(dǎo)成分的對照組相比在蛋白分子量ISkDa到25kDA處有一明顯的誘導(dǎo)表達條帶。參考移除了 19個信號肽氨基酸的GPx7理論分子量約為19kDa，SDS-PAGE的結(jié)果也顯示了其與理論值相符合，同時發(fā)現(xiàn)超聲上清液組份中含有大量的GPx7。
[0039]2、GPx7重組蛋白的抽提
[0040]乳糖誘導(dǎo)表達后的菌液以6000rpm，4min，4°C離心棄上清收集菌體。使用超聲破菌緩沖液懸浮洗滌菌體以6000rpm，4min，4°C離心棄上清收集菌體。稱取濕菌體重量并且以Ig濕菌體:10ml超聲破菌緩沖液的比例懸浮菌體在冰水浴中以細胞超聲破碎儀進行超聲破碎。破碎條件為使用直徑為6mm的變幅桿、功率控制為20%，設(shè)置溫度保護為10°C，超聲開1.5s，超聲停4.5s,總共進行35min，超聲破碎結(jié)束后破碎溶液應(yīng)為清亮。破碎溶液以15000rpm,30min,4°C離心保留上清,此時上清即為蛋白抽提液。使用0.45μηι濾膜進行過濾，過濾液加入終濃度為ImM的EDTA和IOmM DTT并置于4°C冰箱以備GPx7的純化。
[0041 ] 3、GPx7重組蛋白的純化
[0042]3.1陽離子交換層析
[0043]在弱酸性緩沖液的條件中，GPx7在其理論等電點pI8.48之下，目的蛋白質(zhì)帶正電荷，因此GPx7的純化方式可以首先采用陽離子交換層析介質(zhì)進行捕獲?；潜栯x子交換層析介質(zhì)(sulfopropyl medium, SP)為強陽離子交換層析介質(zhì),介質(zhì)的解離特性不會受到緩沖溶液PH值的影響。
[0044]在運行陽離子交換層析時，2中所制備的過濾液調(diào)整pH值為6.66且加入終濃度為IOmM DTT 和 2mM ETDA。
[0045]SP純化柱經(jīng)緩沖溶液B沖洗一個柱體積，再使用緩沖液A平衡3個柱體積。含有GPx7蛋白的上述過濾液采用流穿方式進行上樣，上樣流速為2.5ml/min。樣品流穿結(jié)束后，繼續(xù)使用緩沖液A沖洗柱子至0D280為5mAu左右，然后進行洗脫，洗脫條件為流速2.61ml/min、從O %緩沖液B~11 %緩沖液B進行復(fù)合梯度洗脫3.3個柱體積，然后11 %緩沖液B~50%緩沖液B進行復(fù)合梯度洗脫3.9個柱體積梯度，收集第2個洗脫峰，見圖3。更進一步，發(fā)現(xiàn)SP介質(zhì)與樣品體積比為1: 2以達到最佳的動態(tài)結(jié)合載量。
[0046]3.2分子排阻層析
[0047]經(jīng)SP層析介質(zhì)所捕獲含GPx7的組分直接進入分子排阻層析進行精制。分子排阻層析采用填充了 144ml葡聚糖凝膠(superdex75prep grade)介質(zhì)的XK16/20柱子進行。相應(yīng)緩沖液(25mM histidine, 150mM NaCl,pH6.7)以流速0.8ml/min平衡柱子一個柱體積后，上樣體積以柱體積的4%進行，等度洗脫并且收集目標(biāo)組份，第2峰，圖4 ;考馬斯亮藍染色的SDS-PAGE鑒定結(jié)果也顯示出峰組份為GPx7且純度極高，圖5 (泳道I為蛋白分子量、泳道2未誘導(dǎo)全菌總蛋白、泳道3誘導(dǎo)全菌總蛋白、泳道4為破菌上清、泳道5為SP介質(zhì)捕獲的GPx7組份以及泳道6為葡聚糖凝膠(superdex75pg)精制的GPx7組份)。
[0048]收集的GPx7組份加入終濃度為0.3M的海藻糖后經(jīng)脫鹽濃縮管濃縮至所需要濃度，濃縮液用0.22 μ m濾膜過濾除菌，最后保存于-20°C冰箱中備用。
[0049]3.3ffestern blotting 鑒定純化的 GPx7
[0050]通過兩步層析獲得的GPx7采用western blot方法進行鑒定。GPx7抗體是采用IMAC放法純化帶組氨酸標(biāo)簽的GPx7，然后再將其用于免疫小鼠獲得GPx7的多克隆抗體。圖6，泳道1，蛋白marker、泳道2，陽離子層析捕獲的GPx7、泳道3，分子排阻層析精制的GPx7(GPx7目的條帶以4標(biāo)出)，結(jié)果說明經(jīng)過陽離子層析捕獲和分子排阻層析精制的目的蛋白確實為GPx7組份，電泳遷移率與理論值約19.5KDa相符合。[0051 ] 實施例3GPx7抑瘤活性檢測
[0052]將S180肉瘤細胞懸浮培養(yǎng)于細胞培養(yǎng)皿內(nèi)至旺盛生長期，當(dāng)細胞數(shù)約為IXlO7個時，1500rpm、離心3min收集,用PBS緩沖液懸浮洗漆一次,再次離心1500rpm、3min,然后用約500 μ I PBS緩沖液懸浮細胞沉淀形成細胞混懸液。隨后，用Iml注射器吸取細胞混懸液，注射至小鼠的腹膜腔或腹腔內(nèi)。在小鼠腹腔內(nèi)生長7至8d的S180細胞形成腹水后，將該只小鼠斷頸處死，剖腹收集S180腹水細胞，1500rpm、離心3min收集腹水細胞。若腹水細胞出現(xiàn)血性腹水，則使用氯化銨紅細胞裂解液裂解血性腹水內(nèi)的紅細胞，1500rpm、離心3min，重復(fù)兩次把紅細胞去除。隨后，用一定體積PBS緩沖液懸浮S180腹水細胞，稀釋計數(shù)。最后以IX IO7個細胞數(shù)接種小鼠的右前肢腋窩皮下。被接種S180腹水細胞的小鼠被隨機分成兩組，分別為實驗組以及對照組，每組6只重復(fù)。
[0053]小鼠經(jīng)S180接種后，當(dāng)天即接受GPx7蛋白的皮下注射或經(jīng)尾靜脈注射。GPx7最佳的蛋白注射濃度通過3個不同濃度梯度進行摸索，分別為1.3mg/kg體重、4mg/kg體重以及12mg/kg體重，最終確定GPx7的注射濃度只有在盡可能高的情況下才會顯示對腫瘤細胞的生長抑制作用，所以后續(xù)皆采用注射濃度為12mg/kg或以上的GPx7蛋白進行實驗。荷瘤實驗組給予GPx7蛋白而荷瘤對照組則給予GPx7蛋白緩沖液。連續(xù)皮下注射GPx7蛋白9至14d。末次給藥12小時后，對小鼠眼眶后靜脈叢進行采血，檢測小鼠白細胞數(shù)的變化。隨后，對小鼠進行斷頸處死，剝離右前肢腋窩下瘤塊并進行稱重以及計算抑瘤率。
[0054]結(jié)果:給予GPx7蛋白的實驗組與對照組相比起肉瘤的生長具有抑制作用，在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性的差異(P = 0.022)。注射GPx7蛋白的荷瘤小鼠其腫瘤細胞與對照組相比，抑制率為29.26%，表1。
[0055]表1 GPx7組小鼠肉瘤細胞抑瘤率
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種GPx7重組蛋白在制備治療腫瘤藥物中的用途，其特征在于所述GPx7重組蛋白的序列如SEQ ID N0.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述腫瘤為尤因肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、聽神經(jīng)瘤、神經(jīng)母細胞瘤、神經(jīng)膠瘤或其他腦腫瘤、脊髓腫瘤、腎上腺皮質(zhì)癌、胰癌、腦垂體癌、甲狀腺癌、副甲狀腺癌、胸腺癌、多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤、胃癌、食道癌、小腸癌、肝癌、肝外膽管癌、胃腸類癌性腫瘤、膽囊癌、睪丸癌、陰莖癌、前列腺癌、子宮頸癌、卵巢癌、陰道癌、子宮/子宮內(nèi)膜癌、陰部癌、妊娠滋養(yǎng)細胞腫瘤、輸卵管癌、子宮肉瘤、口腔癌、唇癌、唾腺癌、喉頭癌、下咽癌、上咽癌、鼻癌、鼻竇癌、鼻咽癌、兒童白血病、急性淋巴性白血病、急性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、發(fā)狀細胞性白血病、急性早幼粒細胞白血病、血漿細胞性白血病、骨髓分化不良癥候群、骨髓增生性病癥、再生障礙性貧血、范禾尼貧血、特發(fā)性巨球蛋白血癥、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、霍奇金病、非霍奇金氏淋巴瘤、皮膚型T-細胞淋巴瘤、周圍T-細胞淋巴瘤、AIDS相關(guān)性淋巴瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、葡萄膜黑色素瘤、黑色素瘤、非黑色素瘤皮膚癌、梅克爾細胞癌、兒童軟組織肉瘤、成人軟組織肉瘤、卡波希肉瘤、腎癌維爾姆斯腫瘤、膀胱癌、尿道癌或轉(zhuǎn)移性細胞癌中之 一。
【文檔編號】A61P35/00GK103990113SQ201410238296
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月29日
【發(fā)明者】孫永憲, 陳欣麟, 毛文偉, 杜偉業(yè), 孫文立 申請人:上海御先醫(yī)藥科技有限公司