一種可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體及其合成方法
【專利摘要】一種可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體及其合成方法，先對(duì)端甲氧基聚乙二醇進(jìn)行胱胺化改性，得到胱胺化mPEG；接著利用碳二亞胺法將RAFT聚合鏈轉(zhuǎn)移劑鍵接于胱胺化聚乙二醇鏈端，獲得大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑；隨后實(shí)施RAFT聚合，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)-聚(N-叔丁氧羰基丙烯酰肼)三嵌段共聚物；最后去除保護(hù)基(叔丁氧羰基)，得到端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)-聚丙烯酰肼三嵌段共聚物。該合成方法原料易得，且反應(yīng)條件溫和，得到的載體中各段聚合物分子量和鏈長(zhǎng)度易控制，載阿霉素后能夠自組裝成納米粒、藥效高，實(shí)現(xiàn)了化療藥物和基因藥物的共同裝載。
【專利說明】一種可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體及其合成方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及一種可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體及其合成方法。
【背景技術(shù)】
[0002]化療是臨床腫瘤治療的主要策略之一，它主要是利用循環(huán)系統(tǒng)將細(xì)胞毒性的化學(xué)藥物遞送至病變部位，同時(shí)不可避免地給身體中正常細(xì)胞帶來毒副作用?；熕幬锏寞熜Ш投靖弊饔镁c施用劑量密切相關(guān)。因此，如何提高化療藥物療效并避免其毒副作用是始終是腫瘤化療最關(guān)心的問題。目前，開發(fā)分子靶向藥物和藥物遞送體系就成為研究熱點(diǎn)。其中，分子靶向藥物因開發(fā)困難和臨床療效遠(yuǎn)遜于預(yù)期等問題，進(jìn)展相對(duì)緩慢；而基于生物材料的藥物遞送體系因載藥量大、適用藥物種類多、生物相容性好、可生物降解等優(yōu)點(diǎn)，成為研究重點(diǎn)，已開發(fā)出納米粒、納米凝膠、聚合物-藥物偶聯(lián)物、納米膠束等載體形式。在藥物遞送體系開發(fā)中，普遍通過聚乙二醇修飾載體，以避免載體在血液中循環(huán)時(shí)被免疫系統(tǒng)快速清除掉，利于載體在腫瘤區(qū)的富集。然而，聚乙二醇修飾也降低了載體與細(xì)胞相互作用，使載體經(jīng)胞吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)或從內(nèi)涵體內(nèi)逃逸進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)變得困難。可見，適時(shí)將載體上修飾的聚乙二醇去掉，將利于提高藥物療效。 [0003]阿霉素是臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，對(duì)肺癌、乳腺癌、膀胱癌等均有很好的療效。與大多數(shù)藥物一樣，阿霉素水溶性和選擇性均差，臨床上多以其鹽酸鹽形式，存在生物利用度低、半衰期短、毒副作用明顯等缺點(diǎn)，嚴(yán)重制約其臨床療效。因此，將其裝載于各種形式的藥物載體中，將可有效緩解/克服這些缺點(diǎn)。然而，這仍無法解決阿霉素的耐藥性問題。耐藥性的產(chǎn)生通常是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞表達(dá)某種蛋白如P-gp蛋白時(shí)將藥物泵出細(xì)胞外以避免其毒性作用。近年來，基因治療被視為提高化療療效和從根本上消除耐藥性的有前景的方法，如siRNA法。它可以通過沉默腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的耐藥性蛋白，實(shí)現(xiàn)化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的聚集，發(fā)揮治療作用。然而，基因藥物的遞送更是一個(gè)挑戰(zhàn)性難題，因?yàn)樗ǔ：韶?fù)電，極易被免疫系統(tǒng)清除而無法發(fā)揮治療作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和SiRNA載體及其合成方法，該合成方法原料易得，且反應(yīng)條件溫和，得到的載體中各段聚合物分子量和鏈長(zhǎng)度易控制，載阿霉素后能夠自組裝成納米粒、藥效高，實(shí)現(xiàn)了化療藥物和基因藥物的共同裝載。
[0005]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，包括如下步驟:
[0006]I) mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑的合成:
[0007]將胱胺化端甲氧基聚乙二醇溶于無水有機(jī)溶劑中，然后在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下向其中加入帶一個(gè)羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、4- 二甲氨基吡啶以及二環(huán)己基碳二亞胺，再在室溫反應(yīng)24小時(shí)~72小時(shí)，得到反應(yīng)液；向反應(yīng)液中加入冷乙醚使反應(yīng)液中析出固體，將反應(yīng)液中的固體分離后收集，即得mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇、帶一個(gè)羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、4-二甲氨基吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1:(2~20):1:(4 ~40)；
[0008]2) mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA 的合成:
[0009]將mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、N_(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺和引發(fā)劑溶于無水無氧有機(jī)溶劑中，然后于60°C~65°C反應(yīng)24小時(shí)~48小時(shí)，得到反應(yīng)液；反應(yīng)液經(jīng)濃縮后用冷乙醚沉淀，再將沉淀分離并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA ;其中，mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑和N-(3- 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺的摩爾比為10: (100~600)；
[0010]3) N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的合成:
[0011]將叔丁氧羰基肼溶于O~4°C的水中，然后在攪拌下滴加丙烯酰氯有機(jī)溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)PH值至8~9，并在室溫反應(yīng)4~10小時(shí)，最后將得到的產(chǎn)物用二氯甲烷萃取、重結(jié)晶并真空干燥，得到N-叔 丁氧羰基丙烯酰肼；其中，叔丁氧羰基肼與丙烯酰氯有機(jī)溶液中的丙烯酰氯的摩爾比為1:1.1;
[0012]4) mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA 的合成:
[0013]將mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA、N-叔丁氧羰基丙烯酰肼和引發(fā)劑溶于無水無氧有機(jī)溶劑中，然后于60°C~65°C反應(yīng)24小時(shí)~48小時(shí)，得到反應(yīng)液；反應(yīng)液經(jīng)濃縮后用冷乙醚沉淀，再將沉淀分離并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA ;其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA與N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的摩爾比為5: (100~500)；
[0014]5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護(hù)基脫除，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體。
[0015]所述的胱胺化端甲氧基聚乙二醇采用如下步驟合成:
[0016]a)將分子量為800~4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2，2’-二硫代二乙基異氰酸酯溶于無水甲苯中，在氮?dú)夥障掠?5°C反應(yīng)48小時(shí)，然后用無水正己烷沉淀出固體，收集固體真空干燥，得到2，2’ - 二硫代二乙基異氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫以及2，2’-二硫代二乙基異氰酸酯的摩爾比為1:(0.02 ~0.08): (3 ~8)；
[0017]b)將2，2’ - 二硫代二乙基異氰酸酯改性mPEG溶于蒸餾水中，然后在60°C反應(yīng)6小時(shí)，最后將得到的反應(yīng)液經(jīng)透析和凍干，得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
[0018]所述的步驟I)中帶一個(gè)羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑為S-1-十二烷基-S’_(α，α’-二甲基-α "-乙酸)三硫代碳酸酯、4-氰基_4-[(十二烷基硫烷基硫羰基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
[0019]所述的步驟I)中每升無水有機(jī)溶劑中溶解5g~40g胱胺化端甲氧基聚乙二醇，步驟2)中每升無水無氧有機(jī)溶劑中溶解50g~150g的mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑，步驟
4)中每升無水無氧有機(jī)溶劑溶解50g~200g的mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA。
[0020]所述的步驟2)中N-(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺與引發(fā)劑的摩爾比為(100~600):1，步驟4)中N-叔丁氧羰基丙烯酰肼與引發(fā)劑的摩爾比為(100~500):1。
[0021]所述的步驟2)和步驟4)中無水無氧有機(jī)溶劑為無水無氧二氧六環(huán)、無水無氧四氫呋喃或無水無氧二甲基甲酰胺。
[0022]所述的步驟2)和步驟4)中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或4，4’-偶氮雙(氰基戊酸)。
[0023]所述的步驟5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護(hù)基脫除的方法為:
[0024]將mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA溶于無水有機(jī)溶劑中，于(TC滴加到體積比為1:1的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶劑中，然后升至室溫反應(yīng)5小時(shí)；減壓蒸餾去除溶劑，再向得到的固體中加入碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行中和處理，接著裝入截留分子量為3500Da的透析袋中對(duì)質(zhì)量濃度為0.25%的氨水透析48小時(shí)，最后凍干，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體；其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA和三氟乙酸的摩爾比為1: (15~40)。
[0025]所述的步驟I)以及步驟5)中的無水有機(jī)溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿、無水二氧六環(huán)或無水四氫呋喃。
[0026]一種所述的方法合成的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體，化學(xué)名稱為端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)_聚丙烯酰肼三嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為:
[0027]
【權(quán)利要求】
1.一種可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和SiRNA載體的合成方法，其特征在于，包括如下步驟: DmPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑的合成: 將胱胺化端甲氧基聚乙二醇溶于無水有機(jī)溶劑中，然后在氮?dú)夥毡Ｗo(hù)下向其中加入帶一個(gè)羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、4- 二甲氨基吡啶以及二環(huán)己基碳二亞胺，再在室溫反應(yīng)24小時(shí)~72小時(shí)，得到反應(yīng)液；向反應(yīng)液中加入冷乙醚使反應(yīng)液中析出固體，將反應(yīng)液中的固體分離后收集，即得mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑；其中，胱胺化端甲氧基聚乙二醇、帶一個(gè)羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、4- 二甲氨基吡啶和二環(huán)己基碳二亞胺的摩爾比為1: (2~20):1:(4 ~40)； 2)mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA 的合成: 將mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑、N_(3_ 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺和引發(fā)劑溶于無水無氧有機(jī)溶劑中，然后于60°C~65°C反應(yīng)24小時(shí)~48小時(shí)，得到反應(yīng)液；反應(yīng)液經(jīng)濃縮后用冷乙醚沉淀，再將沉淀分離并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA ;其中，mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑和N-(3- 二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺的摩爾比為10: (100~600)； 3)N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的合成: 將叔丁氧羰基肼溶于0°C~4°C的水中，然后在攪拌下滴加丙烯酰氯有機(jī)溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)pH值至8~9，并在室溫反應(yīng)4小時(shí)~10小時(shí)，最后將得到的產(chǎn)物用二氯甲烷萃取、重結(jié)晶并真空干燥，得到N-叔丁氧羰基丙烯酰肼；其中，叔丁氧羰基肼與丙烯酰氯有機(jī)溶液中的丙烯酰氯的摩爾比為1:1.1 ;
4)mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA 的合成: 將mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA、N-叔丁氧羰基丙烯酰肼和引發(fā)劑溶于無水無氧有機(jī)溶劑中，然后于60°C~65°C反應(yīng)24小時(shí)~48小時(shí)，得到反應(yīng)液；反應(yīng)液經(jīng)濃縮后用冷乙醚沉淀，再將沉淀分離并真空干燥，得到mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA ;其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA與N-叔丁氧羰基丙烯酰肼的摩爾比為5: (100~500)； 5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護(hù)基脫除，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于，所述的胱胺化端甲氧基聚乙二醇采用如下步驟合成: a)將分子量為800~4000Da的端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫和2，2’- 二硫代二乙基異氰酸酯溶于無水甲苯中，在氮?dú)夥障掠?5°C反應(yīng)48小時(shí)，然后用無水正己烷沉淀出固體，收集固體真空干燥，得到2，2’ - 二硫代二乙基異氰酸酯改性的mPEG ;其中，端甲氧基聚乙二醇、二月桂酸二丁基錫以及2，2’-二硫代二乙基異氰酸酯的摩爾比為1:(0.02~0.08): (3 ~8)； b)將2，2’- 二硫代二乙基異氰酸酯改性mPEG溶于蒸餾水中，然后在60°C反應(yīng)6小時(shí)，最后將得到的反應(yīng)液經(jīng)透析和凍干，得到胱胺化端甲氧基聚乙二醇。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于:所述的步驟I)中帶一個(gè)羧基的RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑為S-1-十二烷基-S’_(a, a’-二甲基-a"-乙酸)二硫代碳酸酯、4_氰基_4_[(十二烷基硫烷基硫擬基)硫烷基]戊酸、4-氰基-4-(硫代苯甲酰)戊酸或4-氰基戊酸二硫代苯甲酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于:所述的步驟I)中每升無水有機(jī)溶劑中溶解5g~40g胱胺化端甲氧基聚乙二醇，步驟2)中每升無水無氧有機(jī)溶劑中溶解50g~150g的mPEG大分子RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑，步驟4)中每升無水無氧有機(jī)溶劑溶解50g~200g的mPEG-S-S-PDMAPMA-CTA。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于:所述的步驟2)中N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺與引發(fā)劑的摩爾比為(100~600):1，步驟4)中N-叔丁氧羰基丙烯酰肼與引發(fā)劑的摩爾比為(100~500):1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于:所述的步驟2)和步驟4)中無水無氧有機(jī)溶劑為無水無氧二氧六環(huán)、無水無氧四氫呋喃或無水無氧二甲基甲酰胺。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于:所述的步驟2)和步驟4)中引發(fā)劑為偶氮二異丁腈或4，4’ -偶氮雙(氰基戊酸)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于，所述的步驟5)將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA上的叔丁氧羰基保護(hù)基脫除的方法為: 將mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA溶于無水有機(jī)溶劑中，于(TC滴加到體積比為1:1的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶劑中，然后升至室溫反應(yīng)5小時(shí)；減壓蒸餾去除溶劑，再向得到的固體中加入碳酸氫鈉水溶液進(jìn)行中和處理，接著裝入截留分子量為3500Da的透析袋中對(duì)質(zhì)量濃度為0.25%的氨水透析48小時(shí)，最后凍干，即得到可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體；其中，mPEG-S-S-PDMAPMA-PBocAAH-CTA和三氟乙酸的摩爾比為1:(15 ~40)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體的合成方法，其特征在于:所述的步驟I)以及步驟5)中的無水有機(jī)溶劑為無水二氯甲烷、無水氯仿、無水二氧六環(huán)或無水四氫呋喃。
10.一種如權(quán)利要求1~9中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的方法合成的可去聚乙二醇化的共裝載阿霉素和siRNA載體，其特征在于，化學(xué)名稱為端甲氧基聚乙二醇-聚(N-(3-二甲胺丙基)甲基丙烯酰胺)_聚丙烯酰肼三嵌段共聚物，結(jié)構(gòu)式為:
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK104027816SQ201410268060
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】姚煜, 錢軍民, 徐明輝, 胥偉軍 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)