索拉膠作為制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種索拉膠作為制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物的應(yīng)用。本發(fā)明所采用的動(dòng)物模型為小鼠全皮層傷口模型，使用3％的索拉膠溶液涂抹傷口，可以減輕傷口處的炎癥反應(yīng)，降低感染的風(fēng)險(xiǎn)，加速傷口愈合過(guò)程。本發(fā)明采用的索拉膠還可以促進(jìn)NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)皮膚中主要膠原蛋白Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的主要合成基因Col1α1和Col3α1的表達(dá)。
【專利說(shuō)明】索拉膠作為制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明應(yīng)用于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，本發(fā)明涉及一種索拉膠作為制備促進(jìn)皮膚傷口愈合 藥物的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 皮膚是身體最大的器官，覆蓋著皮膚下的肌肉組織。皮膚參與人體的代謝過(guò)程，保 持著人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。因受傷或疾病而導(dǎo)致大面積的皮膚完整性的破壞可能會(huì)導(dǎo)致較大 的傷殘甚至死亡，是臨床治療中的棘手問(wèn)題。在美國(guó)每年有超過(guò)125萬(wàn)人燒傷，650萬(wàn)人因 壓力、靜脈淤滯或糖尿病而患有慢性皮膚潰瘍。
[0003] 傷口愈合是機(jī)體對(duì)組織出現(xiàn)損傷后的一個(gè)復(fù)雜有序的、動(dòng)態(tài)的、旨在恢復(fù)組織完 整性的生物學(xué)反應(yīng)，涉及到各種細(xì)胞（角質(zhì)細(xì)胞、纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等）、細(xì)胞外基質(zhì)、可 溶性介質(zhì)和細(xì)胞分子間的相互作用。
[0004] Portera 等人（Browder W，Williams D，Pretus H，et al. 1990. Benefical effect of enhanced macrophage function in trauma patients. Ann Surg211:605 - 613)的石開 究表明，使用β -葡聚糖作為治療傷口愈合的藥物，可以降低死亡率，減輕感染，還可以使 受損皮膚恢復(fù)更好的彈性。Berdal 等人（Berdal M，Hege I，Appelborn BS，et al.2007. Aminated b_l, 3-glucan improves wound healing in diabetic db/db mice. Wound Rep egl5:825 - 832)的研究表明β-葡聚糖和巨噬細(xì)胞刺激劑的混合使用，可以加速糖尿病小 鼠的傷口愈合。研究表明，局部或全身性的葡聚糖治療可以加速傷口周圍巨噬細(xì)胞的滲透、 肉芽組織的形成、膠原蛋白的合成和提高新生皮膚的拉伸強(qiáng)度，從而促進(jìn)傷口的愈合。
[0005] 索拉膠（Salecan)是一種由土壤桿菌Agrobacterium sp. ZX09分泌產(chǎn)生的胞外 多糖，是一種新型的β_葡聚糖并具有降血糖的作用。目前已發(fā)現(xiàn)索拉膠具有降低肝脂、 血脂、體脂、體重和膽固醇（中國(guó)專利，201010198223. 5)，預(yù)防和治療便秘（中國(guó)專利， 201110028483. 2)以及抑制紫外線對(duì)皮膚損傷（中國(guó)專利，201310730754. 8)的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種索拉膠在促進(jìn)皮膚傷口愈合方面的的應(yīng)用，該索拉膠 具有使用方便，可以加快皮膚的傷口愈合的功能。
[0007] 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案為：索拉膠作為一種具有促進(jìn)皮膚傷口愈合的作用的 藥物，可配制成溶液直接涂抹于傷口表面來(lái)促進(jìn)傷口愈合，或用于制備具有促進(jìn)傷口愈合 的外用藥物的功能性產(chǎn)品。
[0008] 本發(fā)明所述的應(yīng)用包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
[0009] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)是：
[0010] 1.本發(fā)明方法中的索拉膠生產(chǎn)、提取方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)量大，可直接溶于冷水，而且安 全無(wú)毒，功效全面。
[0011] 2.索拉膠溶液可以促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞的增殖，提高了皮膚中主要膠原蛋白I型 膠原和III型膠原的主要合成基因 Coll α 1和C〇13a 1的表達(dá)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，與正常小鼠比， 涂抹索拉膠溶液的小鼠皮膚傷口愈合速度明顯加快，皮膚組織中的炎癥細(xì)胞因子明顯降 低。
[0012] 3.索拉膠配成溶液后可直接涂抹于哺乳動(dòng)物皮膚，也可用于制備具有促進(jìn)傷口愈 合的外用藥物的功能性產(chǎn)品。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0013] 圖1是小鼠傷口的形態(tài)變化。
[0014] 圖2是小鼠傷口愈合面積的變化。
[0015] 圖3是小鼠傷口皮膚IL-1 β基因的表達(dá)。
[0016] 圖4是小鼠傷口皮膚TNF- a基因的表達(dá)。
[0017] 圖5是索拉膠對(duì)NIH3T3成纖維細(xì)胞增殖的影響。
[0018] 圖6是索拉膠處理后NIH3T3成纖維細(xì)胞Coll a 1基因的mRNA表達(dá)。
[0019] 圖7是索拉膠處理后NIH3T3成纖維細(xì)胞Col3 a 1基因的mRNA表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0021] 實(shí)施例1 :索拉膠粗品的制備
[0022] 配置培養(yǎng)液，稱取 lgNaH2P04, 3gKN03, 0· 07gCaCl2, 0· 3gMgS04 · 7H20， 0· 0125gFeS04 · 7Η20,0· 003gMnS04, 0· 0075gZnCl2, 20g 蔗糖，加入 H20 至體積為 lOOOmL，調(diào) 節(jié)pH至7。將培養(yǎng)液加熱121°C滅菌20分鐘，冷卻至室溫后接入平皿菌落液200 μ L，28°C 培養(yǎng)12h，為種子液。向滅過(guò)菌（121°C滅菌20分鐘）的培養(yǎng)液中加入5%的種子培養(yǎng)液， 28°C發(fā)酵48h。在該發(fā)酵液中加入兩倍體積的95%乙醇，沉淀多糖，將沉淀物于50°C抽真空 干燥，即得到索拉膠粗品。
[0023] 實(shí)施例2 :索拉膠粗品的純化
[0024] 索拉膠粗品的純度達(dá)不到實(shí)驗(yàn)要求，對(duì)其采用改進(jìn)后的Sevag法純化。純化步驟 為
[0025] (1)配制0. 5 %的索拉膠溶液，加熱（105 °C，15min)，待冷卻至室溫時(shí)， 7000r/10min，取上清，除去殘余菌體和部分蛋白。
[0026] (2)按1:30的比例加入pH4. 0的乙酸一乙酸鈉溶液，以除去DNA。
[0027] (3)按1:1的比例將上清與苯酚氯仿溶液（按1:1的比例配制成混合溶液）混合， 劇烈振蕩約15min，7000r/10min，取上清。重復(fù)此步驟2?3次，以徹底除去蛋白。
[0028] (4)向上清液中加入2倍體積的工業(yè)酒精，重力離心沉淀。
[0029] (5)用75%的酒精洗滌沉淀2?3次，再用95%的酒精洗滌沉淀1?2次。
[0030] (6)真空冷凍干燥，得到索拉膠純品。
[0031] 實(shí)施例3 :小鼠全皮層傷口模型的研究
[0032] 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為6周齡的C57BL/6J雄鼠，購(gòu)于揚(yáng)州，飼養(yǎng)于22± 1°C，12小時(shí)光照一 12 小時(shí)黑暗循環(huán)的動(dòng)物房，自由攝取食物和水。小鼠通過(guò)腹腔注射10%水合氯醛（4mL/kg) 麻醉，待麻醉充分時(shí)，固定小鼠使其背部朝上。以背部脊椎為中間線，用剪刀將背部鼠毛剪 去，大小約2cmX 2cm。兩至三天后，將小鼠隨機(jī)分為兩組，一組為對(duì)照組（即CK組），一組 為索拉膠實(shí)驗(yàn)組。用70%的乙醇對(duì)背部皮膚進(jìn)行清潔消毒，全皮層切除傷口分布在以背部 脊椎為中間線的兩旁，用無(wú)菌的鑷子挑起皮膚，用無(wú)菌的剪刀剪去直徑大小約為6mm的皮 膚，深達(dá)肌肉層筋膜。以此，在小鼠背部共造成4個(gè)直徑為6mm的圓形傷口，左右兩側(cè)各兩 個(gè)傷口。對(duì)每個(gè)傷口利用帶方格的紙進(jìn)行傷口面積測(cè)量并拍照，拍照結(jié)束后，使用傷口愈 合快示格膠貼（安舒妥一OPSITE FLEXIGRID，Smith&N印hew Medical Limited)將傷口覆 蓋，以保證傷口處于濕性愈合的狀態(tài)。手術(shù)當(dāng)天計(jì)為dayO,正常組小鼠的傷口涂抹200μ L 的生理鹽水，索拉膠組的小鼠的傷口涂抹200μ L的3% (w/v)的索拉膠溶液，每三天涂抹 一次。實(shí)驗(yàn)一共分為兩批，一批用來(lái)統(tǒng)計(jì)傷口愈合率，即在小鼠傷口愈合的過(guò)程中，分別于 dayO、day3、day6、day7、day9、daylO、dayll、dayl2 統(tǒng)計(jì)傷口面積，計(jì)算傷口愈合率；另一 批分別于dayl、day3、day6處死，收集傷口處皮膚，作皮膚RNA的抽提。CK組和Salecan組 的小鼠背部傷口的面積變化通過(guò)計(jì)算得到傷口愈合率，如圖2所示，在傷口愈合過(guò)程中的 前期，CK組小鼠和Salecan組小鼠的傷口面積沒有太大的變化，傷口愈合率基本相同，而隨 著愈合時(shí)間的延續(xù)，Salecan組的小鼠傷口的愈合速率明顯變快，傷口迅速收縮變小，第12 天其傷口愈合率為5. 38%，傷口已基本愈合，而對(duì)照組的傷口愈合率仍為24. 76%;外觀上， Salecan組的小鼠傷口無(wú)明顯的紅腫、化膿等感染現(xiàn)象，部分CK組的小鼠則出現(xiàn)了感染現(xiàn) 象，表明索拉膠可以在一定程度上防止傷口感染。
[0033] 1)皮膚組織RNA的提取
[0034] 取小鼠背部傷口處直徑約10mm皮膚組織，按照Invitrogen RNA提取試劑盒和 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的說(shuō)明，提取RNA和逆轉(zhuǎn)錄cDNA。cDNA原液稀釋20倍后用于RT-PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μ L :
[0035] ddwalcr 4 μ?^ 2><SYBR Green PCR master mix 10 ^lL Forward primer 0.5 μ? Reverse primer 0_5 pL cDNA. 5 pL
[0036] PCR 擴(kuò)增條件為：50°C，2min ;95°C，lOmin ;95°C，15s，60°C，30s (收集熒光信號(hào)）， 40 個(gè)循環(huán)；95°C，15s，60°C，30s，95°C，15s (溶解曲線）。
[0037] 基因表達(dá)相對(duì)量用2〃C11法分析，以GAPDH為內(nèi)參。
[0038] 基因引物序列如表1所不：
[0039] 表 1
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種索拉膠作為制備促進(jìn)皮膚傷口愈合藥物的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的索拉膠可直接配制成溶液使用，或 用于制備具有促進(jìn)傷口愈合的外用藥物的功能性產(chǎn)品。
【文檔編號(hào)】A61K31/716GK104116756SQ201410385771
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】張建法, 寧益春 申請(qǐng)人:南京理工大學(xué)