丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，所述復(fù)合多糖為丹參多糖和熟地黃多糖的組合，該復(fù)合多糖以丹參和/或熟地黃為原料，經(jīng)水提、濃縮和醇沉工藝獲得，制備方法簡單穩(wěn)定高效，適合工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明中的復(fù)合多糖經(jīng)秀麗線蟲模型實(shí)驗(yàn)證實(shí)，其能夠有效抑制β-淀粉樣蛋白和多聚谷氨酰胺的神經(jīng)毒性，作用方式與抑制毒性蛋白質(zhì)聚集和提高熱休克蛋白表達(dá)有關(guān)，表明其具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。
【專利說明】丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于健康食品/保健食品【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)退行性疾病是一類以特定神經(jīng)元和組織逐漸衰退乃至死亡為主要特征的進(jìn)行性疾病。隨著全球人口老齡化趨勢(shì)的加劇，神經(jīng)退行性疾病已經(jīng)成為嚴(yán)重危害人們生命健康和生活質(zhì)量的重大疾病，并引起了世界各國的高度重視，盡管已有減輕患者癥狀的藥物上市，但這些藥物缺乏對(duì)疾病前期發(fā)生和發(fā)展的關(guān)注。因此，積極開發(fā)針對(duì)神經(jīng)退行性疾病的健康食品/保健食品無疑具有重大的民生意義。目前已知的多種神經(jīng)退行性疾病都涉及到蛋白質(zhì)的異常聚集，例如，阿爾茨海默癥的主要病理特征表現(xiàn)為細(xì)胞外的淀粉樣蛋白(amyloid β protein ；Αβ )沉淀和神經(jīng)元內(nèi)過度磷酸化tau蛋白形成的聚集體，亨廷頓舞蹈病的主要病理特征表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)由多聚谷氨酰胺(polyglutamine ；polyQ)異常延伸引起的亨廷頓蛋白包涵體。這些蛋白質(zhì)異常聚集形成的產(chǎn)物將誘發(fā)氧化、炎癥等多種脅迫反應(yīng)，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷并產(chǎn)生神經(jīng)退行性病變。因此，通過抑制疾病蛋白質(zhì)異常聚集以及緩解由異聚蛋白引起的毒性脅迫損傷是防治神經(jīng)退行性病癥的重要策略。
[0003]秀麗線蟲是一種研宄神經(jīng)系統(tǒng)功能及相關(guān)疾病常用的模式動(dòng)物，具有生命周期短、實(shí)驗(yàn)操作簡單、遺傳資源豐富等突出優(yōu)點(diǎn)。秀麗線蟲的基因組含有2/3的人類疾病相關(guān)基因的同源基因，而且容易構(gòu)建轉(zhuǎn)基因疾病模型，比如利用GFP標(biāo)記技術(shù)，可以在個(gè)體水平上對(duì)退行性病變及潛在藥物進(jìn)行系統(tǒng)完整的終身跟蹤研宄，這對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研宄顯得尤為重要。因此，采用秀麗線蟲有利于促進(jìn)神經(jīng)保護(hù)活性化合物的篩選及其作用機(jī)制的研宄。
[0004]我國豐富的中草藥種類為防治神經(jīng)退行性疾病提供了龐大的資源庫，其中藥食同源品種無疑具有巨大的醫(yī)療藥用和營養(yǎng)保健價(jià)值。例如，丹參是我國傳統(tǒng)的活血類中藥，具有活血調(diào)經(jīng)、養(yǎng)血安神、涼血消癰和祛瘀止痛等功效；熟地黃作為著名的補(bǔ)血類中藥，具有補(bǔ)血滋潤和益精填髓等功效。現(xiàn)代研宄表明，這些中草藥來源的多糖也具有防治神經(jīng)退行性疾病的潛在生物活性。然而，由于神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生發(fā)展具有多因性和復(fù)雜性，單一多糖可能存在作用靶點(diǎn)有限、活性功能不足等問題，因此擴(kuò)大并增強(qiáng)多糖活性對(duì)于深入開發(fā)和改良多糖類產(chǎn)品是必不可少的。盡管目前關(guān)于復(fù)合多糖活性研宄的報(bào)道極少，但最近有研宄表明，黃芪多糖和硫酸化淫羊藿多糖聯(lián)用可以提高雞免疫系統(tǒng)功能，從而緩解環(huán)磷酰胺致免疫抑制；刺五加多糖可協(xié)同增強(qiáng)二甲雙胍對(duì)糖尿病小鼠的治療作用。這表明相比于單一多糖，中藥多糖聯(lián)用具有增強(qiáng)治療作用的潛力。因此，加強(qiáng)復(fù)合多糖在抗神經(jīng)退行性疾病方面的研宄不僅有利于推動(dòng)其在醫(yī)藥保健領(lǐng)域的深入應(yīng)用，拓寬多糖產(chǎn)品的應(yīng)用范圍，還能為疾病的防治提供新型活性物質(zhì)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用。
[0006]為達(dá)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提出丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖中丹參多糖與熟地黃多糖的質(zhì)量配比優(yōu)選為1:4 ?9:10
[0008]本發(fā)明所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖中丹參多糖與熟地黃多糖的質(zhì)量配比進(jìn)一步優(yōu)選為2:3?2:1。
[0009]作為本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式:所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得:以丹參和熟地黃為原料，經(jīng)含水提、濃縮和醇沉工序制備獲得復(fù)合多糖，所述的復(fù)合多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠用于制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品。
[0010]上述丹參和熟地黃復(fù)合多糖的制備方法中:
[0011]所述的丹參和熟地黃的質(zhì)量配比優(yōu)選為1:4?9:1。
[0012]所述的丹參和熟地黃的質(zhì)量配比進(jìn)一步優(yōu)選為2:3?2:1。
[0013]水提時(shí)，丹參和熟地黃藥材與水的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，提取溫度為50?100°c，提取時(shí)間為I?1h ;濃縮時(shí)，濃縮溫度為40?100°C;醇沉?xí)r，乙醇和濃縮液的體積比為2:1?9:1。
[0014]作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選的實(shí)施方式:所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得:以丹參或熟地黃為原料，經(jīng)含水提、濃縮和醇沉工序制備獲得丹參多糖或熟地黃多糖，再將二者按計(jì)量比混合，制備獲得丹參和熟地黃復(fù)合多糖，所述的復(fù)合多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠用于制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品。
[0015]上述丹參和熟地黃復(fù)合多糖的制備方法中:
[0016]水提時(shí)，丹參或熟地黃藥材與水的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，提取溫度為50?100°c，提取時(shí)間為I?1h ;濃縮時(shí)，濃縮溫度為40?100°C;醇沉?xí)r，乙醇和濃縮液的體積比為2:1?9:1。
[0017]所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖中丹參多糖與熟地黃多糖的質(zhì)量配比優(yōu)選為1:4?9:1。
[0018]所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖中丹參多糖與熟地黃多糖的質(zhì)量配比進(jìn)一步優(yōu)選為2:3 ?2:1。
[0019]本發(fā)明所述的神經(jīng)退行性疾病是指包括阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病等以毒性蛋白質(zhì)異常聚集為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
[0020]本發(fā)明提供的丹參和熟地黃復(fù)合多糖具有神經(jīng)保護(hù)功效具體可以體現(xiàn)在其能夠在整體動(dòng)物水平上抑制淀粉樣蛋白和多聚谷氨酰胺的聚集毒性，其作用方式與抑制多聚谷氨酰胺和淀粉樣蛋白聚集、提高熱休克蛋白表達(dá)密切相關(guān)，因此可用于防治以蛋白質(zhì)異常聚集為主要病理機(jī)制的神經(jīng)退行性疾病。
[0021]本發(fā)明所述保健食品的劑型可以為膠囊、粉劑、顆粒劑、片劑或口服液等。例如將上述復(fù)合多糖添加其它原料如乳清蛋白、輔料如麥芽糊精，可制備成為抗神經(jīng)退行性疾病健康食品或保健食品。
[0022]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0023](I)本發(fā)明中的丹參和熟地黃復(fù)合多糖，其制備工藝簡單高效，適合大規(guī)模生產(chǎn)；
[0024](2)本發(fā)明制備的丹參和熟地黃復(fù)合多糖經(jīng)證明其能夠在秀麗線蟲整體動(dòng)物水平上抑制蛋白質(zhì)聚集相關(guān)的神經(jīng)退行性病癥，表明其可應(yīng)用于抗神經(jīng)退行性疾病的固液制劑健康食品或保健食品中，為相關(guān)疾病的防治和健康老齡化提供了新型方案，并能促進(jìn)多糖產(chǎn)品的深入應(yīng)用和中藥現(xiàn)代化發(fā)展。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]下面通過【具體實(shí)施方式】及藥效學(xué)研宄結(jié)果對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0026]圖1為實(shí)施例6中采用實(shí)施例1中丹參和熟地黃復(fù)合多糖和單一多糖抑制秀麗線蟲CL2355體內(nèi)β-淀粉樣蛋白毒性的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖1A表征2mg/mL復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲CL2355趨化行為影響的示意圖，圖1B表征2mg/mL復(fù)合多糖、丹參多糖和熟地黃多糖改善秀麗線蟲CL2355的趨化能力，其中*代表ρ〈0.05 ；
[0027]圖2為實(shí)施例7中采用實(shí)施例2和3中丹參和熟地黃復(fù)合多糖和單一多糖抑制秀麗線蟲ΗΑ759體內(nèi)多聚谷氨酰胺毒性的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖2Α表征未經(jīng)處理和經(jīng)2mg/mL復(fù)合多糖處理的HA759秀麗線蟲ASH神經(jīng)元示意圖，圖2B表征2mg/mL復(fù)合多糖、丹參多糖和熟地黃多糖抑制HA759秀麗線蟲體內(nèi)多聚谷氨酰胺聚集毒性，圖2C表征2mg/mL復(fù)合多糖、丹參多糖和熟地黃多糖改善多聚谷氨酰胺聚集毒性導(dǎo)致的行為學(xué)缺陷，其中*代表p〈0.05 ;
[0028]圖3為實(shí)施例8中采用實(shí)施例4中丹參和熟地黃復(fù)合多糖抑制神經(jīng)退行性疾病相關(guān)蛋白質(zhì)體外聚集的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖3A表征2mg/mL復(fù)合多糖抑制A β 42的體外聚集，圖3Β表征2mg/mL復(fù)合多糖抑制polyQ40的體外聚集；
[0029]圖4為實(shí)施例9中采用實(shí)施例5中丹參和熟地黃復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲CL2070體內(nèi)熱休克蛋白調(diào)控作用的數(shù)據(jù)表征圖，其中圖4A表征2mg/mL復(fù)合多糖對(duì)秀麗線蟲CL2070體內(nèi)HSP16.2表達(dá)影響的示意圖，圖4B表征lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL復(fù)合多糖促進(jìn)秀麗線蟲CL2070體內(nèi)HSP16.2的表達(dá)，其中*代表ρ〈0.05。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面列舉一部分具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說明，有必要在此指出的是以下具體實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，不代表對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。其他人根據(jù)本發(fā)明做出的一些非本質(zhì)的修改和調(diào)整仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]實(shí)施例1
[0032]本實(shí)施例提供的一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖，其通過如下方法制備獲得:將丹參和熟地黃藥材按照重量比1:1進(jìn)行混合，其中丹參是指丹參的藥用部位根部，熟地黃是指熟地黃的藥用部位塊根，下同，粉碎后按照料液比l:10(g/mL)加水，在90°C下加熱攪拌提取4h。過濾獲得的藥渣按照料液比為1:5 (g/mL)加水，在90°C下繼續(xù)提取4h。合并兩次提取液，經(jīng)過減壓濃縮和離心獲得澄清濃縮液，按照1:4體積比將4倍體積95 % (體積百分含量，下同)乙醇加入濃縮液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得復(fù)合多糖。
[0033]或?qū)⒌⒎鬯楹蟀凑樟弦罕?:10 (g/mL)加水，在90°C下加熱攪拌提取4h。過濾獲得的藥渣按照料液比為1:5 (g/mL)加水，在90°C下繼續(xù)提取4h。合并兩次提取液，經(jīng)過減壓濃縮和離心獲得澄清濃縮液，按照I: 4體積比將4倍體積95 %乙醇加入濃縮液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得丹參多糖，熟地黃多糖的制備方法同丹參多糖，將熟地黃多糖與丹參多糖按1:1的質(zhì)量配比混勻，制備獲得丹參和熟地黃復(fù)合多糖。
[0034]采用第一種方法和第二種方法制備的丹參和熟地黃復(fù)合多糖，二者性能等基本相同，無論采用哪一種方法制備丹參和熟地黃復(fù)合多糖均可。
[0035]實(shí)施例2
[0036]本實(shí)施例提供的一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖，其通過如下方法制備獲得:將丹參和熟地黃藥材按照重量比2:3進(jìn)行混合，粉碎后按照料液比1:15 (g/mL)加水，在90°C下加熱攪拌提取6h。減壓濃縮后離心獲得澄清濃縮液，按照1:3體積比將3倍體積95%乙醇加入濃縮液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得復(fù)合多糖。
[0037]本實(shí)施例也可以同實(shí)施例1中一樣分別采用丹參或熟地黃為原料，制備丹參和熟地黃復(fù)合多糖。
[0038]實(shí)施例3
[0039]本實(shí)施例提供的一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖，其通過如下方法制備獲得:將丹參和熟地黃藥材按照重量比3:2進(jìn)行混合，粉碎后按照料液比1:10 (g/mL)加水，在95°C下加熱攪拌提取3h。過濾獲得的藥渣按照上述料液比、溫度和時(shí)間繼續(xù)提取一次。合并兩次提取液，經(jīng)過減壓濃縮和離心獲得澄清濃縮液，按照I: 2體積比將2倍體積95 %乙醇加入濃縮液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得復(fù)合多糖。
[0040]本實(shí)施例也可以同實(shí)施例1中一樣分別采用丹參或熟地黃為原料，制備丹參和熟地黃復(fù)合多糖。
[0041]實(shí)施例4
[0042]本實(shí)施例提供的一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖，其通過如下方法制備獲得:將丹參和熟地黃藥材按照重量比2:1進(jìn)行混合，粉碎后按照料液比1:5 (g/mL)加水，在75°C下加熱攪拌提取3h。過濾獲得的藥渣按照上述料液比、溫度和時(shí)間繼續(xù)提取兩次。合并三次提取液，經(jīng)過減壓濃縮和離心獲得澄清濃縮液，按照I: 9體積比將9倍體積95 %乙醇加入濃縮液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得復(fù)合多糖。
[0043]本實(shí)施例也可以同實(shí)施例1中一樣分別采用丹參或熟地黃為原料，制備丹參和熟地黃復(fù)合多糖。
[0044]實(shí)施例5
[0045]本實(shí)施例提供的一種丹參和熟地黃復(fù)合多糖，其通過如下方法制備獲得:將丹參和熟地黃藥材按照重量比9:1進(jìn)行混合，粉碎后按照料液比1:15 (g/mL)加水，在50°C下加熱攪拌提取lh，提取3次，合并濾液，減壓濃縮后離心獲得澄清濃縮液，按照2:1體積比將0.5倍體積95%乙醇加入濃縮液中，混勻后于4°C下過夜靜置沉淀，離心收集沉淀，經(jīng)過真空冷凍干燥即獲得復(fù)合多糖。
[0046]本實(shí)施例也可以同實(shí)施例1中一樣分別采用丹參或熟地黃為原料，制備丹參和熟地黃復(fù)合多糖。
[0047]實(shí)施例6
[0048]轉(zhuǎn)基因秀麗線蟲CL2355是在體內(nèi)神經(jīng)元中表達(dá)A β 42蛋白，其聚集能夠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)毒性，從而導(dǎo)致秀麗線蟲的趨化行為能力下降，因此可以利用該模型研宄復(fù)合多糖對(duì)毒性蛋白脅迫的緩解作用。將實(shí)施例1制得的復(fù)合多糖和單一多糖，以2mg/mL濃度分別加入LI期CL2355幼蟲中，對(duì)照組加入等體積的S Medium。在16°C下培養(yǎng)36h后，轉(zhuǎn)移至23°C中再次培養(yǎng)36h。取9cm培養(yǎng)皿，用lmol/L甘油在中間劃條直線，在左半圓形區(qū)域加Λ 1.5 μ L0.5%苯甲醛的乙醇溶液和1.5 μ Llmol/L疊氮化鈉溶液，標(biāo)記為A區(qū)。在右半圓區(qū)域的相同位置加入1.5 yL乙醇和1.5 yL lmol/L疊氮化鈉溶液，標(biāo)記為B區(qū)。將CL2355秀麗線蟲轉(zhuǎn)到培養(yǎng)皿中央后于23°C下孵育lh，然后分別統(tǒng)計(jì)A區(qū)和B區(qū)的線蟲數(shù)量，趨化率=(A區(qū)數(shù)目-B區(qū)數(shù)目)/線蟲總數(shù)。數(shù)據(jù)以mean土SD表示，采用T檢驗(yàn)比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0049]結(jié)果如圖1A所示，與對(duì)照相比，采用復(fù)合多糖處理的CL2355線蟲在苯甲醛區(qū)域的數(shù)目更多。圖1B統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，未處理CL2355線蟲的趨化率僅為26.7%，而復(fù)合多糖、丹參多糖和熟地黃多糖在2mg/mL濃度時(shí)能夠?qū)②吇史謩e顯著提高至38.5%、34.1%和34.9%
[0050](P ( 0.05)。相比于單一多糖，復(fù)合多糖改善毒性蛋白Αβ誘導(dǎo)的行為缺陷的活性較好，表明其具有緩解神經(jīng)退行性病癥的作用。
[0051]實(shí)施例7
[0052]秀麗線蟲轉(zhuǎn)基因模型ΗΑ759是利用滲透壓相關(guān)基因osm_10促使polyQ40片段在其頭部ASH神經(jīng)元中表達(dá)，由于polyQ40的聚集能產(chǎn)生顯著毒性，ASH神經(jīng)元將發(fā)生進(jìn)行性衰亡(表現(xiàn)為熒光消失)。因此可以通過觀察ASH神經(jīng)元存活率研宄復(fù)合多糖對(duì)毒性蛋白脅迫的緩解作用。將實(shí)施例2制得的復(fù)合多糖和單一多糖，以2mg/mL濃度分別加入LI期的HA759幼蟲中，對(duì)照組加入等體積的S Medium。在15°C下培養(yǎng)3天后收集線蟲，加入疊氮化鈉溶液使線蟲麻痹，混勻后滴加在瓊脂糖墊上，在熒光顯微鏡下觀察每條秀麗線蟲ASH神經(jīng)元的GFP熒光點(diǎn)。每個(gè)處理組隨機(jī)統(tǒng)計(jì)?50條線蟲，ASH神經(jīng)元存活百分率=ASH神經(jīng)元存活的線蟲數(shù)目/ (ASH神經(jīng)元存活的線蟲數(shù)目+ASH神經(jīng)元死亡的線蟲數(shù)目)X 100%。存活率以mean土 SEM表不，使用one-way ANOVA分析和Tukey post-hoc test比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0053]結(jié)果如圖2A所示，未經(jīng)多糖處理的HA759秀麗線蟲的ASH神經(jīng)元因polyQ聚集而衰亡(熒光消失)，加入復(fù)合多糖后ASH神經(jīng)元依然存活(熒光存在)。圖2B顯示，未處理HA759秀麗線蟲的ASH神經(jīng)元在3天后的存活率為38.4%，采用2mg/mL復(fù)合多糖和丹參多糖處理后，ASH神經(jīng)元存活率分別顯著提高至52.7%和46.8% (p ^ 0.05)，熟地黃多糖(42.5% )在2mg/mL濃度下不能顯著提高ASH神經(jīng)元存活率。該結(jié)果表明復(fù)合多糖能夠抑制易聚蛋白PolyQ的毒性脅迫反應(yīng)，具有緩解神經(jīng)退行性病癥的作用。
[0054]由于ASH神經(jīng)元具有高滲回避功能，因此在同時(shí)受到引誘和高滲溶液阻攔時(shí)，ASH神經(jīng)元未衰亡的秀麗線蟲能夠保留回避高滲溶液的行為特征，而ASH神經(jīng)元死亡的秀麗線蟲將喪失對(duì)高滲溶液的回避能力。因此利用HA759秀麗線蟲模型可以檢測(cè)復(fù)合多糖對(duì)毒性蛋白誘導(dǎo)行為缺陷的緩解作用。將實(shí)施例3制得的復(fù)合多糖和單一多糖，以2mg/mL濃度分別加入LI期的HA759幼蟲中，對(duì)照組加入等體積的S Medium。在15°C下培養(yǎng)3天后收集線蟲。以SM甘油(高滲試劑)、雙乙酰(引誘試劑)、疊氮化鈉(麻醉劑)制備趨化回避平板，將處理后的秀麗線蟲置于平板上，在20°C中培養(yǎng)1.5h后取出統(tǒng)計(jì)秀麗線蟲的分布數(shù)目?；乇苈视?jì)算公式如下:回避率=(回避區(qū)內(nèi)線蟲數(shù)目/線蟲總數(shù))X100%，回避率以mean土SD表示，使用one-way ANOVA分析和Tukey post-hoc test比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0055]結(jié)果如圖2C所示，對(duì)照組有45.5%的秀麗線蟲在高滲溶液甘油附近表現(xiàn)出回避行為，采用2mg/mL復(fù)合多糖和丹參多糖處理后，HA759秀麗線蟲的回避率分別顯著提高至59.7%和52% (P彡0.05)，而熟地黃多糖(51.2%)在2mg/mL濃度下不能顯著提高HA759秀麗線蟲的回避率，表明相比于單一多糖，復(fù)合多糖能夠改善毒性蛋白PolyQ誘導(dǎo)的行為缺陷，與圖2A和圖2B結(jié)果相一致。
[0056]以上結(jié)果顯示，復(fù)合多糖能夠在神經(jīng)元細(xì)胞和動(dòng)物行為學(xué)水平上抑制Αβ和PolyQ毒性蛋白的脅迫損傷，表明其具有良好的防治神經(jīng)退行性疾病的作用。
[0057]實(shí)施例8
[0058]由于Αβ 42和polyQ40分別是阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病中的關(guān)鍵致病蛋白，其聚集能夠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)毒性，抑制其聚集無疑能夠有效緩解其神經(jīng)毒性。將實(shí)施例4制得的復(fù)合多糖，以lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL濃度分別加入50 μ M Αβ 42和polyQ40單體溶液中，混勻后置于37°C下孵育。對(duì)照組同上處理，但用等體積的水代替多糖溶液。每隔一定時(shí)間取出混合液，加入硫磺素T溶液和Glycine-NaOH溶液，振蕩均勻后利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為450nm和485nm。相對(duì)熒光強(qiáng)度以mean土SD表示，采用T檢驗(yàn)比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0059]如圖3所示，A β 42和polyQ40隨著時(shí)間的延長均能逐漸發(fā)生聚集，加入丹參和熟地黃復(fù)合多糖后能夠有效抑制蛋白聚集速度，表明該復(fù)合多糖具有抑制毒性蛋白聚集的作用。
[0060]實(shí)施例9
[0061]熱休克蛋白(Heat Shock Proteins，HSPs)是一大類廣泛存在和高度保守的分子伴侶家族，主要在蛋白質(zhì)的折疊、裝配、運(yùn)輸、定位以及降解過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)還參與了細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。研宄表明，在蛋白質(zhì)聚集相關(guān)神經(jīng)退行性疾病中，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)平衡呈現(xiàn)失衡狀態(tài)，一些熱休克蛋白的活性也有所下降，而通過提高熱休克蛋白表達(dá)可以達(dá)到減少蛋白質(zhì)異常聚集從而緩解神經(jīng)退行性病癥的作用。將實(shí)施例5制得的復(fù)合多糖，按照lmg/mL、2mg/mL和4mg/mL濃度分別與0P50混勾后涂布于NGM培養(yǎng)皿上，然后加入LI期CL2070線蟲(體內(nèi)表達(dá)hsp-16.2::GFP融合蛋白)。在20°C下培養(yǎng)至L4期后，收集線蟲并用疊氮化鈉麻痹固定，置于2%瓊脂糖墊上。在熒光顯微鏡拍攝線蟲咽部照片，使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)咽部熒光密度。每個(gè)處理組隨機(jī)統(tǒng)計(jì)?10條線蟲，數(shù)據(jù)以mean土SD表示，采用T檢驗(yàn)比較多糖組和對(duì)照組的差異性。
[0062]結(jié)果如圖4A所示，相比于對(duì)照組，采用2mg/mL復(fù)合多糖處理之后，CL2070線蟲咽部焚光水平明顯提高。圖4B統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，采用2mg/mL和4mg/mL復(fù)合多糖處理后的相對(duì)熒光密度由1.39分別顯著上升至1.63和1.67 (P ( 0.05)。該結(jié)果表明，復(fù)合多糖具有促進(jìn)熱休克蛋白家族重要成員HSP16.2表達(dá)的作用。
[0063]經(jīng)上述秀麗線蟲模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所制備的復(fù)合多糖能夠有效夠多聚谷氨酰胺和β -淀粉樣蛋白聚集誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性(實(shí)施例6和實(shí)施例7)，其活性作用方式涉及到抑制毒性蛋白聚集(實(shí)施例8)和提高熱休克蛋白表達(dá)(實(shí)施例9)。這些結(jié)果充分證明由丹參和熟地黃制備的復(fù)合多糖具有良好的防治神經(jīng)退行性疾病的作用。
[0064]實(shí)施例10
[0065]將實(shí)施例1制得的復(fù)合多糖，根據(jù)需要添加適量乳清蛋白、麥芽糊精制備成為具有神經(jīng)保護(hù)功效的粉末狀態(tài)健康食品或保健食品，還可以添加其它常規(guī)輔料制成常規(guī)劑型。
[0066]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖中丹參多糖與熟地黃多糖的質(zhì)量配比為1:4 ?9:10
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖中丹參多糖與熟地黃多糖的質(zhì)量配比為2:3 ?2:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得:以丹參或熟地黃為原料，經(jīng)含水提、濃縮和醇沉工序制備獲得丹參多糖或熟地黃多糖，再將二者按計(jì)量比混合，制備獲得丹參和熟地黃復(fù)合多糖，或所述丹參和熟地黃復(fù)合多糖通過以下方法制備獲得:以丹參和熟地黃為原料，經(jīng)含水提、濃縮和醇沉工序制備獲得丹參和熟地黃復(fù)合多糖；所述復(fù)合多糖具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠應(yīng)用于抗神經(jīng)退行性疾病相關(guān)保健食品領(lǐng)域中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:以丹參或熟地黃為原料時(shí)，所述丹參多糖和熟地黃多糖的質(zhì)量配比為1:4?9:1，以丹參和熟地黃為原料時(shí)，所述丹參和熟地黃的質(zhì)量配比為1:4?9:1。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:以丹參或熟地黃為原料時(shí)，所述丹參多糖和熟地黃多糖的質(zhì)量配比為2:3?2:1，以丹參和熟地黃為原料時(shí)，所述丹參和熟地黃的質(zhì)量配比為2:3?2:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:水提時(shí)，丹參和/或熟地黃藥材與水的質(zhì)量體積比為1:2?1:20，提取溫度為50?100°C，提取時(shí)間為I?1h ;濃縮時(shí)，濃縮溫度為40?100°C;醇沉?xí)r，乙醇和濃縮液的體積比為2:1?9:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述的神經(jīng)退行性疾病是指包括阿爾茨海默癥和亨廷頓舞蹈病等以毒性蛋白質(zhì)異常聚集為主要病理特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的丹參和熟地黃復(fù)合多糖在制備抗神經(jīng)退行性疾病保健食品中的應(yīng)用，其特征是:所述保健食品的劑型為膠囊、粉劑、顆粒劑、片劑或口服液。
【文檔編號(hào)】A61K31/715GK104491137SQ201410682635
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年11月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月24日
【發(fā)明者】馬方勵(lì), 胡明華, 梁明 申請(qǐng)人:無限極（中國）有限公司