本發(fā)明屬于生物材料應(yīng)用領(lǐng)域。涉及一種茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片的制備方法及其醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

1、與心肌梗塞(mi)相關(guān)的心血管疾病是全世界死亡的主要原因之一，部分原因是心肌組織的再生能力有限。心肌梗死后，心臟會(huì)出現(xiàn)缺血、炎癥、纖維化和左心室功能障礙等病理狀況。目前的手術(shù)方法足以增強(qiáng)心肌灌注，但無(wú)法逆轉(zhuǎn)纖維化等病理變化。脫細(xì)胞生物材料被廣泛應(yīng)用于心梗治療的研究。然而，目前被報(bào)道的生物材料如小腸黏膜下層、腹膜和心包膜等，厚度較薄，機(jī)械性能和抗酶解性能十分有限，運(yùn)用時(shí)須多層疊加以制作適當(dāng)厚度的支架，但疊加后容易在體內(nèi)分層，支架的強(qiáng)度會(huì)降低，這將限制生物材料的修復(fù)作用。豬橫膈膜肌腱是一種主要由膠原纖維組成的肌腱，機(jī)械性能優(yōu)越，厚度在0.4～1mm之間，這對(duì)心梗區(qū)植入來(lái)說(shuō)這是合適的厚度，并且同樣具有促血管化的潛力，這有望使其成為更理想的修復(fù)材料。動(dòng)物生物材料需要經(jīng)過(guò)脫細(xì)胞處理以去除刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的成分。然而，脫細(xì)胞后會(huì)材料機(jī)械強(qiáng)度大幅下降，在體內(nèi)降解速率顯著加快，且材料中的α-半乳糖基(α-gal)抗原仍能造成機(jī)體很強(qiáng)生物免疫反應(yīng)，這些缺陷都將嚴(yán)重影響修復(fù)效率。臨床上廣泛應(yīng)用戊二醛將脫細(xì)胞外基質(zhì)材料進(jìn)行交聯(lián)以改善上述缺陷，交聯(lián)還可以一定程度屏蔽抗原減輕免疫排斥反應(yīng)，但戊二醛有高毒性和導(dǎo)致生物材料鈣化等缺點(diǎn)。茶多酚是一種天然的多酚類(lèi)物質(zhì)，其酚羥基可以與細(xì)胞外基質(zhì)(ecm)形成大量氫鍵而增強(qiáng)機(jī)械性能和抗酶解性能，同時(shí)賦予材料強(qiáng)大的抗氧化、抑菌和抑制鈣化能力等，更重要的是茶多酚交聯(lián)也可以屏蔽表面抗原并降低植入后的炎癥反應(yīng)，是優(yōu)于戊二醛的天然高效交聯(lián)劑。

2、因此開(kāi)發(fā)出一種由天然交聯(lián)劑-茶多酚交聯(lián)的脫細(xì)胞豬橫膈膜肌腱對(duì)心梗治療具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片的制備方法，由1％tnbp(磷酸三丁酯)將豬橫膈膜肌腱脫細(xì)胞后與茶多酚交聯(lián)后形成，具體采用如下方案：

2、(1)將屠宰場(chǎng)獲得的新鮮豬橫膈肌腱使用在冰箱預(yù)冷的pbs(磷酸緩沖鹽溶液)處理，在無(wú)菌環(huán)境下使用8mm鉆頭將膈膜肌腱制備成8mm的近圓形薄片，使用pbs配置1％tnbp(磷酸三丁酯)，在無(wú)菌50ml試劑管中加入處理后的橫膈肌腱薄片，加入1％tnbp，置于搖床中，條件設(shè)置為勻速80rpm/min，溫度設(shè)置為20℃，處理72h。處理完成后使用無(wú)菌pbs在搖床中處理24h。將獲得的樣片進(jìn)行促血管活性因子等相關(guān)成分測(cè)試；

3、(2)分別使用pbs配置5mg/ml和1mg/ml的茶多酚溶液，配置0.625％戊二醛溶液，將步驟(1)獲得的樣片加入以上三種試劑足量，在搖床中處理48h(條件與步驟1同)，之后使用無(wú)菌pbs處理24h，獲得最終的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱樣片，將最終獲得的產(chǎn)品進(jìn)行體外機(jī)械性能、抗酶解性能等特性測(cè)試，并且通過(guò)小鼠皮下植入模型探究交聯(lián)后的免疫原性與對(duì)機(jī)體的毒性，最后通過(guò)大鼠心梗模型驗(yàn)證了茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片對(duì)心梗的綜合治療作用。

4、發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱樣片在制備治療心梗補(bǔ)片中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱可下調(diào)凋亡基因與炎癥基因并上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，通過(guò)抑制心室擴(kuò)張、改善纖維化與促進(jìn)血管生成的作用，綜合治療心梗。研究表明本發(fā)明制備的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片具有良好的抗氧化、低免疫原性與機(jī)械性能，治療心梗時(shí)在短期(7天內(nèi))可以提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力，在長(zhǎng)期(30天以上)可以抑制心室擴(kuò)張、改善纖維化與促進(jìn)血管生成的作用，對(duì)于心梗具有良好的綜合治療作用。

5、本發(fā)明提供的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片具有良好的抗氧化能力、機(jī)械性能、抗酶解能力與低免疫原性，并且對(duì)機(jī)體無(wú)毒性，制備方法簡(jiǎn)單，成本低廉，取材方便，可大量生產(chǎn)，效果顯著。經(jīng)茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱治療的大鼠的病理性重塑得到明顯緩解。對(duì)茶多酚交聯(lián)補(bǔ)片治療區(qū)的心肌組織進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qrt-pcr)和總rna測(cè)序(rna-seq)，結(jié)果表明，茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞豬橫膈膜肌腱補(bǔ)品可下調(diào)凋亡基因與炎癥基因并上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)。

6、綜上，經(jīng)驗(yàn)證茶多酚交聯(lián)的脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片具有很強(qiáng)的抗氧化性能、機(jī)械性能、抗酶解性能與低免疫原性可以提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力、促進(jìn)心肌組織血管化與抑制纖維化，在心梗治療上具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)特征：

1.一種茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱補(bǔ)片的制備方法，其特征在于，有以下步驟實(shí)現(xiàn)：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)中使用pbs配置1％磷酸三丁酯。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)搖床處理的設(shè)置條件為勻速80rpm/min，溫度為20℃。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)搖床處理的設(shè)置條件與步驟(1)相同。

5.權(quán)利要求1方法制備的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱樣片在制備治療心梗補(bǔ)片中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱通過(guò)下調(diào)凋亡基因與炎癥基因并上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，通過(guò)抑制心室擴(kuò)張、改善纖維化與促進(jìn)血管生成的作用。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱的制備及其應(yīng)用，由1％TNBP將豬橫膈膜肌腱脫細(xì)胞后與茶多酚交聯(lián)后形成。經(jīng)茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱可下調(diào)凋亡基因與炎癥基因并上調(diào)抗氧化基因的表達(dá)，具有很強(qiáng)的抗氧化性能、機(jī)械性能、抗酶解性能與低免疫原性，可以提高心肌細(xì)胞的抗氧化能力、促進(jìn)心肌組織血管化與抑制纖維化，抑制心室擴(kuò)張、改善纖維化與促進(jìn)血管生成的作用，可在制備治療心梗補(bǔ)片中應(yīng)用。本發(fā)明提供的茶多酚交聯(lián)脫細(xì)胞橫膈膜肌腱在心梗治療上具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)研發(fā)人員：王華南,葉蒂,沈馮婷,朱旸,吳心宇,陳晨,沈宜樺
受保護(hù)的技術(shù)使用者：浙江大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/10/21