專利名稱：制備高免疫原性乙型肝炎疫苗的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用親和層析法，高度純化含有具人血清蛋白結(jié)合活性(HSA-BA)之前S2蛋白的乙型肝炎表面(HBs)抗原，以制備能夠產(chǎn)生100%抗HBs之乙型肝炎疫苗的方法。
近年來(lái)，在美國(guó)、法國(guó)、日本及其他國(guó)家已開發(fā)了編碼前S2的重組HB疫苗，但即使在3次重復(fù)接種后仍不能產(chǎn)生100%的抗HBs。
本發(fā)明第一次闡明，如果以親和層析法純化含有具人血清白蛋白結(jié)合活性(HSA-BA)之前S2蛋白的HBs抗原，則有可能大量產(chǎn)生能夠通過(guò)兩次接種產(chǎn)生100%抗HBs的高免疫原性乙型肝炎疫苗。
因此也就有可能完全排除在開發(fā)HBs疫苗中遇到的存在非反應(yīng)者這一最大問(wèn)題，以及以高技術(shù)制得的重組HB疫苗的缺陷。
可借助免疫擴(kuò)散法(ID)然后進(jìn)行高度純化由羊體內(nèi)產(chǎn)生效價(jià)高于1∶4096的高免疫性抗HBs，然后將其吸附到用CNBr強(qiáng)活化的瓊脂糖凝膠上以形成用于親和層析的載體，其中所說(shuō)的CNBr的濃度范圍為50-600mg/ml，較好為50-300mg/ml，抗HBs為每100ml瓊脂糖8000-10000單位(ID)，吸附時(shí)間為2-5小時(shí)。
用5MMgCl2將未完全與所說(shuō)的載體結(jié)合的蛋白質(zhì)物質(zhì)如抗HBs洗掉。從人血清或分娩后胎盤血清中收集含有具人血清白蛋白結(jié)合活性(PHA效價(jià)大于1∶64)之前S2抗gen(RPHA效價(jià)大于1∶512)的HBs抗原陽(yáng)性血清(RPHA效價(jià)大于1∶1024)，然后用親和層析法純化之。
然后用鹽水和蒸餾水在4℃下將所說(shuō)的純化的樣品連續(xù)透析2天，以使其中不再含有痕量高免疫抗HBs和羊衍生的IgG等。
為了使包含在所說(shuō)樣品中的HBV完全失活，向樣品內(nèi)加入0.01-0.02%(體積)的化學(xué)物質(zhì)如多氧-乙烯脫水山梨醇，并于98-100℃下熱處理30分鐘，然后再加入1∶2000的甲醛水溶液和1∶10000的merciolate，之后使所說(shuō)的樣品在37℃下失活96小時(shí)。
通過(guò)0.45μm薄膜過(guò)濾所說(shuō)的樣品并使之完全吸附到氫氧化鋁凝膠中，以形成有更高免疫原性的HB疫苗。
實(shí)施方案1按照已知方法用libanol-硫酸銨純化效價(jià)大于1∶4096(ID效價(jià))的羊衍生的高免疫抗HBs。然后用Sepharose 6B(Phar-macia，Sweden)進(jìn)行凝膠過(guò)濾。將300mg/mlCNBr加入到100mlSepharose 4B(Pharmacia，Sweden)中進(jìn)行活化，再加入效價(jià)為8000(ID)的高免疫抗HBs，于室溫?cái)嚢柘挛?-5小時(shí)，然后用5MMgCl2洗2次，使1500ml含效價(jià)為1∶512(PHA)之HSA-BA，1∶512(RPHA)之前S2，1∶2048(RPHA)之HBs抗原的人血清吸附到連接了抗HBs的凝膠柱上(室溫下吸附5小時(shí))，用5M MgCl2洗脫以得到120ml含效價(jià)為1∶16384(RPHA)之前S2蛋白的HBs抗原溶液。
所得樣品分別用鹽水和蒸餾水透析2天，用鹽水稀釋以使其效價(jià)(RPHA)變?yōu)?∶2048，然后加入吐溫80使其終濃度達(dá)到0.02%，再于98℃下熱處理30分鐘。
為使HBV完全失活，于98℃將樣品熱處理30分鐘，然后加入甲醛水溶液(1∶2000)和0.01%的merciolate，并再于37℃下熱滅活96小時(shí)。
通過(guò)0.45μm薄膜過(guò)濾所說(shuō)的樣品，并使之完全被氫氧化鋁凝膠吸附，以得到450ml有高免疫原性的HB疫苗。
實(shí)施方案2用150mg/mlCNBr活化200ml Sepharose 4B，然后加入1200單位(ID)用DEAE纖維素(DE52，Whatman，England)高度純化的抗HBs，以制成親和層析柱。
用親和層析法純化2000ml含1∶1024(PHA)之HSA-BA，1∶2048(RPHA)之前S2，1∶32768(RPHA)之HBs抗原的分娩后胎盤血清，以得到230ml含前S2蛋白的HBs抗原溶液(1∶65536RPHA)。連續(xù)用鹽水和蒸餾水透析樣品，然后加入吐溫20使其終濃度達(dá)到0.015%，并于98℃下熱失活40分鐘。
然后，再次失活、無(wú)菌過(guò)濾并用氫氧化鋁凝膠吸附，以得到1800ml有高度免疫原性的HB疫苗。
對(duì)按照本發(fā)明方法制得的所說(shuō)疫苗成分的分析數(shù)據(jù)及其產(chǎn)生抗HBs效力如下所示。
1.成分分析數(shù)據(jù)(經(jīng)氫氧化鋁凝膠吸附后直接純化的樣品)1).HBs抗原的效價(jià)大于1∶2048(RPHA);
2)前S2蛋白效價(jià)大于1∶512(RPHA);
3)HSA-BA效價(jià)大于1∶128(PHA);
4)總蛋白量少于0.006%(60μg/ml);
5)羊衍生的抗HBs其可用RIA或PHA法檢測(cè);即使以痕量存在，也只限于少至5mIU/ml的可忽視量;
6)羊產(chǎn)生的正常IgG成分的含量即使以痕量存在，也只限于少至0.00000034%以下的可忽視量;
7)正常人血清蛋白免疫電泳法測(cè)定為陰性。
2.產(chǎn)生抗HBs的作用1)在接種者中產(chǎn)生抗HBs的效果在30個(gè)高免疫原性HB疫苗接種者中，在第二次接種(15歲以上的成年每次各接種1.0ml，兒童每次各接種0.25-0.5ml，兩次間隔一個(gè)月，第三次接種在第90天進(jìn)行)后，觀察期間未顯示任何付作用，沒(méi)有出現(xiàn)抗HBs，也沒(méi)有出現(xiàn)酶值(GPT，GOT)波動(dòng)。
另一方面，如表1中所示，在第二次接種后產(chǎn)生了100%的抗HBs。
2)由編碼前S2的重組HB疫苗和較高免疫原性HB疫苗產(chǎn)生抗HBs的情況已發(fā)現(xiàn)，雖然以重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的酵母衍生之疫苗(Takeda，TGP-943T，Japan，1989)含有前S2蛋白，但在第二次接種后只產(chǎn)生47%的抗HBs，即使在第三次接種后也只產(chǎn)生92%的抗HBs(表2)。
表 1較高免疫原性HBs疫苗產(chǎn)生抗HBs的作用
然而，已證明按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的較高免疫原性HB疫苗只作兩次接種即能夠完全解決存在非反應(yīng)者的問(wèn)題。
雖然已參照特定實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但其詳細(xì)內(nèi)容并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制;很顯然，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員可在本發(fā)明范圍內(nèi)作各種等同的改動(dòng)或改進(jìn)。
權(quán)利要求
1.用親和層析法制備較高免疫原性HB疫苗的方法，其特征在于所說(shuō)的方法包括將較高免疫原性羊衍生的抗HBs與瓊脂糖凝膠結(jié)合以制備親和載體，吸附、洗脫含有具人血清白蛋白結(jié)合活性(HBA-BA)之前S2蛋白的人血清式分娩后胎盤血清，用連續(xù)透析方法除去以痕量包含于其中的蛋白質(zhì)，以及在98-100℃的高溫度下完全失活HBV的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的制備較高免疫原性HBs疫苗的方法，特征在于在使較高免疫原性的羊衍生之抗HBs與瓊脂糖凝膠結(jié)合以制備親和載體的步驟中，所說(shuō)抗HBs的效價(jià)保持在1∶4096(ID)以上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的制備較高免疫原性HB疫苗的方法，特征在于在使較高免疫原性的羊衍生之抗HBs與瓊脂糖凝膠結(jié)合以制備親和載體的步驟中，被100ml瓊脂糖凝膠吸附的抗HBs的總活性在8000-10000單位(ID)范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3的制備較高免疫原性HB疫苗的方法，特征在于在使較高免疫原性的羊衍生之抗HBs與瓊脂糖凝膠結(jié)合以制備親和載體的步驟中，人血清或分娩后胎盤血清的HSA-BA效價(jià)在1∶64(PHA)以上，前S2抗原在1∶512(RPHA)以上，HBs抗原效價(jià)為1∶1024(RPHA)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3和4的制備較高免疫原性HBs疫苗的方法，特征在于在從樣品中除去其中以痕量包含之蛋白質(zhì)的步驟中，連續(xù)透析方法是在0.85-1%鹽水中透析2-4天，在蒸餾水中透析1-2天。
6.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4或5的制備較高免疫原性HB疫苗的方法，特征在于完全失活HBV的步驟是在98-100℃下進(jìn)行30分鐘以上。
7.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4、5或6的制備較高免疫原性HB疫苗的方法，特征在于在熱處理時(shí)為穩(wěn)定HBs抗原蛋白質(zhì)，向其中加入如多氧乙烯脫水山梨醇等化學(xué)物質(zhì)，以使其終濃度達(dá)到0.01-0.002%，然后再進(jìn)行熱處理。
全文摘要
制備通過(guò)兩次接種能產(chǎn)生100％抗HB
文檔編號(hào)A61K39/00GK1073604SQ9211365
公開日1993年6月30日 申請(qǐng)日期1992年11月30日 優(yōu)先權(quán)日1991年12月1日
發(fā)明者高真南, 李英愛(ài) 申請(qǐng)人:高真南, 李英愛(ài)