專利名稱：通過光動(dòng)力療法與免疫佐劑聯(lián)合應(yīng)用治療癌癥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明廣泛涉及治療腫瘤的方法。更具體地，本發(fā)明結(jié)合光動(dòng)力療法和腫瘤免疫療法以誘導(dǎo)惡變細(xì)胞損傷并刺激自身免疫防御系統(tǒng)抵抗殘余的惡變細(xì)胞。
2.背景腫瘤是一種由于比正常組織快得多的細(xì)胞增殖生成的異常組織。甚至在啟動(dòng)其生長(zhǎng)的刺激消散后仍繼續(xù)生長(zhǎng)。腫瘤顯示部分或完全喪失與正常組織的結(jié)構(gòu)組織和功能協(xié)調(diào)，并通常形成可能是良性或惡性的性質(zhì)不同的團(tuán)塊。
癌癥是一個(gè)總的術(shù)語，常用來表示各種類型的惡性腫瘤，其中大多數(shù)侵襲周圍組織，可能轉(zhuǎn)移到幾個(gè)部位，且切除后很可能再生，如果沒有適當(dāng)治療的話會(huì)導(dǎo)致病人死亡。癌癥能在任何年齡、任何器官的任何組織中產(chǎn)生。
一旦做出明確的癌癥診斷，治療決定是首要的。雖然沒有一種治療方法對(duì)所有癌癥適用，但成功的療法必須針對(duì)原發(fā)腫瘤及其轉(zhuǎn)移，不論是臨床上明顯的還是細(xì)微的。
常規(guī)療法歷史上，局部和區(qū)域療法如外科或放射與系統(tǒng)療法如藥物已用于癌癥治療。
手術(shù)是癌癥治療的最古老有效形式。1988年，大約1,500,000人患有癌癥；其中約515,000為皮膚或?qū)m頸癌。約985,000具其它系統(tǒng)形式；64％具有可動(dòng)手術(shù)的損傷，約有62％治愈率。如果早期發(fā)現(xiàn)，可只用手術(shù)進(jìn)行正面影響的癌癥包括宮頸、乳腺、膀胱、結(jié)腸、前列腺、喉、子宮內(nèi)膜、卵巢、口腔、腎、睪丸(非精原細(xì)胞的)和肺(非小細(xì)胞)癌。但必須注意治療成功的百分率因腫瘤部位差異很大。
放射在治療下述疾病中起重要作用何杰金病，結(jié)節(jié)和彌散非何杰金淋巴瘤，頭頸部鱗狀細(xì)胞癌，縱隔精細(xì)胞腫瘤，精原細(xì)胞瘤，前列腺癌，早期乳腺癌，早期非小細(xì)胞肺癌和成神經(jīng)管細(xì)胞瘤。在前列腺癌和乳腺癌中當(dāng)存在骨轉(zhuǎn)移時(shí)，在多發(fā)性骨髓瘤，晚期肺和下咽部癌癥，胃癌，肉瘤以及腦轉(zhuǎn)移中，放療可用作減輕病痛療法。只用放療可治愈的癌癥包括何杰金病，早期非何杰金淋巴瘤，睪丸(精原細(xì)胞的)、前列腺、喉、宮頸癌及輕度鼻咽、鼻竇、乳腺、食管和肺癌。
抗腫瘤藥物是阻止細(xì)胞分裂(有絲分裂)，發(fā)展，成熟或腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散的藥物。理想的抗腫瘤藥物是對(duì)正常細(xì)胞沒有副作用或有毒性的破壞癌細(xì)胞的藥物，但這種藥不存在。盡管許多藥物有較窄的治療指數(shù)，但對(duì)某些病人可能治療甚至治愈。已發(fā)現(xiàn)絨毛膜癌，何杰金病，擴(kuò)散巨細(xì)胞淋巴瘤，Burkitt’s淋巴瘤和白血病的某些階段如睪丸(非精原細(xì)胞)和肺(小細(xì)胞)癌一樣對(duì)抗腫瘤藥敏感?？鼓[瘤藥物的常見類型包括烷化劑、抗代謝劑、植物生物堿、抗生素、nitrosoureas、無機(jī)離子、酶和激素。
盡管有一些成功，但上述療法沒達(dá)到期望的有效程度，已經(jīng)繼續(xù)研究更有效的療法。
最近進(jìn)展醫(yī)學(xué)界調(diào)查研究的兩種較新近的腫瘤治療形式為光動(dòng)力療法和腫瘤免疫療法。
I.光動(dòng)力療法許多年來已知光敏化合物當(dāng)暴露于光時(shí)呈現(xiàn)光化學(xué)反應(yīng)。光動(dòng)力療法(PDT)利用這些光敏化合物和激光使腫瘤壞死。PDT治療實(shí)體瘤通常包括系統(tǒng)給予定位腫瘤的光敏化合物然后用激光來激活。吸收合適波長(zhǎng)的光后，敏感劑從穩(wěn)定的原子結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成激發(fā)態(tài)。在被治療的組織中，通過敏感劑與分子氧之間相互作用介導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒單線態(tài)氧，導(dǎo)致細(xì)胞毒性和最終腫瘤毀滅。
關(guān)于PDT，生物醫(yī)學(xué)激光和光敏化合物，包括光發(fā)射和劑量參數(shù)的兩篇好的全面性參考文獻(xiàn)為，光敏化合物其化學(xué)，生物學(xué)和臨床應(yīng)用，由John Wiley and Sons Ltd.，Chichester，U.K.，ISBN0471923087于1989年出版；光動(dòng)力療法和生物醫(yī)學(xué)激光光動(dòng)力療法及醫(yī)學(xué)激光應(yīng)用國際會(huì)議文集，米蘭，1992年6月24-27日，由Elsevier SciercePublishers B.V.，Amsterdam，The Netherlands，ISBN 0 444 8143 02出版，均在此引入做為參考。
有關(guān)PDT的美國專利包括U.S.Patent Nos.5,095,030 and 5,283,255授予Levy等人；5,314,905授予Pandey等人；5,214,036授予Allison等人；and 5,258,453授予Kopecek等人，全部在此引入作為參考。Levy專利公開了與腫瘤特異抗體偶聯(lián)的受670-780nm波長(zhǎng)影響的光敏劑使用，抗體如受體特異的配基，免疫球蛋白或免疫球蛋白的免疫特異性部分。Pandey專利指用于標(biāo)準(zhǔn)光動(dòng)力療法的焦脫鎂葉綠甲酯酸(pyropheophorbide)化合物。Pandey還公開了用配基和抗體偶聯(lián)他的組合物。Allison專利類似于Levy專利，因?yàn)榫G色卟啉被偶聯(lián)到質(zhì)脂復(fù)合物以增強(qiáng)卟啉化合物對(duì)靶腫瘤細(xì)胞的特異性。Kopecek專利還公開了處理癌組織的組合物。這些組合物由兩種連接到共聚合載體的藥物組成，一種是抗癌藥，一種是可光激活藥。該組合物通過胞飲作用進(jìn)入靶細(xì)胞。靶細(xì)胞被侵襲后抗癌藥物起作用。過一段時(shí)間后，用光源激活光敏取代基。
II.腫瘤免疫療法免疫系統(tǒng)的主要作用是形成“自身”的概念并消除“異己”的東西。雖然微生物是每天遇到的最主要異己實(shí)體，但免疫系統(tǒng)還消除腫瘤和移植物。見默克診斷與治療手冊(cè)，第16版，18和103章，由Merck ResearchLaboratories of Rahway，N.J.，ISBN 0911910-16-6 and 0076-6526于1992年出版；同樣在此插入作為參考。
有幾種性質(zhì)不同的免疫類型。非特異或先天免疫力指沒有被先前的感染或疫苗免疫(敏化或變應(yīng))的物種顯示的固有抵抗。其主要的細(xì)胞成分是吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，其功能為攝入并消化侵入的微生物。吞噬細(xì)胞包括血液中的中性白細(xì)胞和單核細(xì)胞以及組織中的巨噬細(xì)胞。補(bǔ)體蛋白是非特異免疫的主要可溶性成分。急性期反應(yīng)物和細(xì)胞因子如干擾素也是先天免疫的一部分。
特異性免疫是一種免疫狀態(tài)，其中只針對(duì)刺激它的抗原決定簇(感染物或其它)有改變的反應(yīng)性。它有時(shí)稱作獲得性免疫。它可以是主動(dòng)的和特異的，作為天然獲得(明顯的或非明顯的)感染或故意接種的結(jié)果；它也可是被動(dòng)的，從來自另一個(gè)人或動(dòng)物的抗體轉(zhuǎn)移獲得。特異性免疫具有學(xué)習(xí)、適應(yīng)性和記憶的標(biāo)志。細(xì)胞成分為淋巴細(xì)胞(如T細(xì)胞，B細(xì)胞，自然殺傷(NK)細(xì)胞)，免疫球蛋白為可溶性成分。
T細(xì)胞和NK細(xì)胞識(shí)別和破壞寄生的或外來細(xì)胞的作用叫做細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相反，體液免疫與復(fù)合物識(shí)別過程后B細(xì)胞產(chǎn)生的循環(huán)抗體有關(guān)。
關(guān)于腫瘤免疫學(xué)，淋巴細(xì)胞在腫瘤免疫中的重要性已被反復(fù)展示。細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤的宿主反應(yīng)包括免疫監(jiān)督的概念，借此與細(xì)胞介導(dǎo)的免疫相關(guān)的細(xì)胞機(jī)制在識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原(在正常細(xì)胞上不出現(xiàn)的與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的抗原)后破壞新轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。這類似于來自非同一供體的移植組織的排斥過程。在人體內(nèi)，腫瘤結(jié)節(jié)的生長(zhǎng)已被病人外周血淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的混合懸液抑制，提示對(duì)腫瘤的細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)。體外研究已顯示來自患某種腫瘤的病人的淋巴細(xì)胞對(duì)相應(yīng)培養(yǎng)的人腫瘤細(xì)胞顯示細(xì)胞毒性。這些細(xì)胞毒細(xì)胞通常是T細(xì)胞，已在成神經(jīng)細(xì)胞瘤，惡性黑色素瘤，肉瘤和結(jié)腸、乳腺、宮頸、子宮內(nèi)膜、卵巢、睪丸、鼻咽和腎癌中發(fā)現(xiàn)。當(dāng)存在腫瘤相關(guān)抗原，淋巴因子或干擾素時(shí)，巨噬細(xì)胞也可參與細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)腫瘤的宿主反應(yīng)。
體外與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的體液抗體已被相應(yīng)于被化學(xué)致癌劑或病毒誘導(dǎo)的各種動(dòng)物腫瘤而產(chǎn)生。體外雜交瘤技術(shù)允許檢測(cè)和產(chǎn)生直接針對(duì)各種動(dòng)物和人類腫瘤的單克隆抗腫瘤抗體。體內(nèi)由抗體介導(dǎo)的針對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的保護(hù)作用僅在某些動(dòng)物白血病和淋巴瘤中可證明。相反，體內(nèi)淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的保護(hù)作用出現(xiàn)在廣范圍的動(dòng)物腫瘤系統(tǒng)。
癌癥的免疫療法最好被認(rèn)為是廣泛題目的部分，叫做生物療法或生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的施用。這些試劑通過一種或多種不同機(jī)制起作用(1)通過增加效應(yīng)細(xì)胞的數(shù)目或產(chǎn)生一種或多種可溶中介體來刺激宿主的抗腫瘤反應(yīng)；(2)作為效應(yīng)物或中介體；(3)減少宿主抑制機(jī)制；(4)改變腫瘤細(xì)胞以增加其免疫原性或使它們更易被免疫方法損壞；(5)改善宿主對(duì)細(xì)胞毒或放射療法的耐受性。迄今細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫療法的中心為病人淋巴細(xì)胞體外經(jīng)白介素2處理擴(kuò)增后的再灌注。一種變更方案是分離和擴(kuò)增已在體內(nèi)浸潤(rùn)了腫瘤的淋巴細(xì)胞種群，所謂腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞。另一種是與干擾素同時(shí)使用，它被認(rèn)為增加腫瘤細(xì)胞上組織相容抗原和腫瘤相關(guān)抗原的表達(dá)，因而通過灌注效應(yīng)細(xì)胞增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的殺傷。
在另一方面體液療法已長(zhǎng)期集中于將抗腫瘤抗體用作被動(dòng)免疫療法的一種形式，與宿主自身免疫系統(tǒng)的主動(dòng)刺激形成對(duì)照。另一種變更方案是將單克隆抗腫瘤抗體與毒素如蓖麻蛋白或白喉毒素或放射性同位素偶聯(lián)，因此這些抗體將特異地向腫瘤細(xì)胞釋放這些有毒物。輻射、神經(jīng)氨酸酶處理、半抗原偶聯(lián)或雜交后，用宿主自身腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)免疫也被嘗試。在如此治療的少數(shù)病人中可見臨床改善。其它的腫瘤細(xì)胞與佐劑偶聯(lián)后經(jīng)照射用于緩解后的急性成淋巴細(xì)胞白血病和急性成髓細(xì)胞白血病。在某些系列但不是大多數(shù)系列中，已報(bào)道緩解延長(zhǎng)或改善的再誘導(dǎo)率。干擾素，腫瘤壞死因子和淋巴毒素也已被用來影響免疫介導(dǎo)的機(jī)制。最近使用細(xì)胞和體液機(jī)制的方法是“異源交叉連接抗體”的建立，包括與腫瘤細(xì)胞反應(yīng)的抗體連接到與細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞反應(yīng)的第二抗體，使后者更特異地靶向腫瘤。已有報(bào)道宿主免疫細(xì)胞浸潤(rùn)入PDT處理的小鼠腫瘤。
聯(lián)合PDT與免疫療法Krobelik，Krosl，Dougherty和Chaplin探索了PDT與免疫療法聯(lián)合的可能性。見Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers，同上，pp518-520。在他們的研究中，他們調(diào)查了對(duì)PDT免疫反應(yīng)的擴(kuò)增可能性以及其對(duì)被處理腫瘤更具有滲透性破壞的方向。腫瘤鱗狀細(xì)胞癌SCCVII生長(zhǎng)在雌性C3H小鼠。結(jié)束于PDT前一天或PDT后立即開始肌內(nèi)給予七天免疫激活劑SPG(刺激巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞使對(duì)細(xì)胞因子和其它免疫信號(hào)具有更強(qiáng)反應(yīng)的高分子量B-葡聚糖)。采用基于photofrin的PDT；在光療前24小時(shí)靜脈已給予photofrin。SPG免疫療法顯示增強(qiáng)PDT的直接殺傷作用。未接受SPG的動(dòng)物的腫瘤中，間接殺傷作用(原位殘余的腫瘤細(xì)胞存活減少)更明顯。PDT之前或之后進(jìn)行的SPG免疫療法的效果差異提示最大相互作用在光釋放的時(shí)候或緊隨其后的免疫激活達(dá)到峰值時(shí)獲得。PDT后開始用SPG(并在5-7天后獲得最佳活化)，顯然對(duì)于有益的反應(yīng)太晚了。
在另一個(gè)研究中，調(diào)查了在缺氧條件下PDT對(duì)發(fā)揮細(xì)胞毒生物反應(yīng)藥物的作用的用途。見Photodynamic Therapy and Biomedical Lasers，同上，pp.698-701。發(fā)現(xiàn)這些藥物的抗腫瘤活性當(dāng)與加強(qiáng)腫瘤缺氧的治療聯(lián)合使用時(shí)，在體內(nèi)可被增強(qiáng)。
目的本發(fā)明的一個(gè)目的是通過聯(lián)合使用光動(dòng)力和免疫療法而改善腫瘤的治療，以引起直接的腫瘤細(xì)胞損傷同時(shí)刺激自身免疫防御系統(tǒng)，抵抗殘留的或轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的增殖。
發(fā)明摘要根據(jù)本發(fā)明，通過向腫瘤導(dǎo)入生色團(tuán)和免疫佐劑來取得上述及其它目的和優(yōu)點(diǎn)。該腫瘤然后以足夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞破壞并刺激細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫反應(yīng)的輻照度激光照射。
按照本發(fā)明的一個(gè)方面，腫瘤如惡性腫瘤注射以含有生色團(tuán)和免疫佐劑的溶液。發(fā)射與生色團(tuán)互補(bǔ)的輻射波長(zhǎng)的低能激光聚焦在腫瘤上一段時(shí)間，足以使腫瘤的溫度升高到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷的水平，并剌激自身免疫防御系統(tǒng)抵抗腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增。提供了其它幾種生色團(tuán)和免疫佐劑及其輻照度參數(shù)。
按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，制備indocyanine green(ICG)和糖化脫乙酰殼多糖溶液，濃度為ICG/脫乙酰殼多糖比為0.1∶2％。該溶液以劑量為70-400μl注射入腫瘤。然后用激光照射腫瘤，激光功率為5瓦，并且輻射波長(zhǎng)能容易地穿透正常細(xì)胞組織而無明顯損傷。照射持續(xù)1-10分鐘，足以升高腫瘤溫度，達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷并刺激細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫反應(yīng)的水平。
本發(fā)明比其它常規(guī)和非常規(guī)物理療法有一些優(yōu)點(diǎn)。致敏劑與免疫刺激佐劑的聯(lián)合是主要的。最重要的優(yōu)點(diǎn)是一種聯(lián)合的急性和慢性腫瘤破壞。急性腫瘤損傷是由廣泛并可控范圍內(nèi)腫瘤組織的光蒸發(fā)、光消融或熱殺傷引起的，在直接區(qū)域，減少腫瘤負(fù)擔(dān)和隨后的擴(kuò)增基礎(chǔ)，以使自身防御系統(tǒng)對(duì)抗較弱的敵人。當(dāng)光熱破壞發(fā)生時(shí)，破裂的組織和細(xì)胞分子在免疫增強(qiáng)物質(zhì)如脫乙酰殼多糖的存在下，在宿主內(nèi)分配。實(shí)際上形成原位疫苗。這種物質(zhì)混合物然后在宿主內(nèi)循環(huán)，由免疫監(jiān)視系統(tǒng)監(jiān)測(cè)。接著是細(xì)胞介導(dǎo)免疫的直接帶動(dòng)轉(zhuǎn)移，包含NK細(xì)胞和征集的殺傷T細(xì)胞。這些細(xì)胞遷移到相似抗原或化學(xué)物質(zhì)的位點(diǎn)。此時(shí)，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫轉(zhuǎn)換為體液免疫并伴隨細(xì)胞毒抗體產(chǎn)生。這些抗體在體內(nèi)自由循環(huán)，并粘附被編碼的細(xì)胞和物質(zhì)上。如果這種粘附發(fā)生在補(bǔ)體因子存在的情況下，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這兩種免疫作用形式的時(shí)間范圍對(duì)細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)是0-2周，而體液臂(humoral arm)成熟大約在30天并應(yīng)該保持長(zhǎng)時(shí)間，最長(zhǎng)可長(zhǎng)至宿主的壽命。
由于使用的輻照波長(zhǎng)不易被正常細(xì)胞組織吸收，伴隨的損傷減少到可耐受的水平。特別是當(dāng)激光能量被小心選擇在某一損傷閾值之下時(shí)，激光對(duì)在光束通路中的組織如皮膚幾乎沒有傷害。這種特點(diǎn)使非侵害治療成為可能。甚至于在疾病組織深置于體內(nèi)的情況下，內(nèi)窺鏡和光導(dǎo)纖維可容易地到達(dá)治療部位。
互補(bǔ)吸收波長(zhǎng)的生色團(tuán)使激光治療高度選擇。只有注射生色團(tuán)的區(qū)域獲得可觀的組織破壞。生色團(tuán)的濃度，生色團(tuán)和免疫佐劑的劑量以及給藥時(shí)間允許誘導(dǎo)光熱作用的時(shí)間和空間控制。最佳給藥可通過考慮生色團(tuán)的物理和化學(xué)特點(diǎn)及對(duì)考慮光熱相互作用的組織應(yīng)答來得到。無任何激光刺激下，生色團(tuán)與其宿主組織之間的自然反應(yīng)，如分子隨時(shí)間分解，以及分子通過循環(huán)和排泄系統(tǒng)遷移，也同樣重要。本發(fā)明的優(yōu)選生色團(tuán)ICG是無毒的，并能容易地通過肝和腎在短期內(nèi)排除。
總之，通過本發(fā)明可獲得完全癌癥根除的長(zhǎng)期存活。它是由光熱相互作用所致的腫瘤負(fù)擔(dān)減少與脫乙酰殼多糖或其它免疫調(diào)節(jié)劑所引起的免疫系統(tǒng)反應(yīng)增強(qiáng)聯(lián)合的結(jié)果。
本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員從下列詳述中可顯而易見，其中僅通過解釋試圖完成本發(fā)明的最佳方式只來顯示和描述本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。正如將會(huì)實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明能在多種顯而易見的方面進(jìn)行修改，而不背離本發(fā)明。因此，該描述實(shí)質(zhì)上應(yīng)被當(dāng)做解釋而非限制。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是關(guān)于鼠乳腺癌研究的圖，表示特定受治療鼠隨時(shí)間的腫瘤負(fù)擔(dān)，其原發(fā)瘤以本發(fā)明的方式處理。
圖2是類似于圖1的第二個(gè)受治療鼠的圖。
圖3是表示圖1的受治療鼠中未處理的繼發(fā)(secondary)腫瘤隨時(shí)間變化的腫瘤負(fù)擔(dān)圖表。
圖4是表示圖2的受治療鼠中未處理的繼發(fā)(secondary)腫瘤隨時(shí)間變化的腫瘤負(fù)擔(dān)圖表。
圖5是其它三種處理的受治療鼠，隨時(shí)間變化的腫瘤負(fù)擔(dān)圖表。
優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明通過向腫瘤中導(dǎo)入生色團(tuán)和免疫佐劑(也叫免疫調(diào)節(jié)劑或免疫強(qiáng)化劑)將光動(dòng)力和免疫療法結(jié)合起來。使用足夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷的激光輻照度后，免疫佐劑成分刺激(增強(qiáng))針對(duì)借此釋放的腫瘤抗原而發(fā)生的細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫反應(yīng)。
生色團(tuán)和免疫佐劑優(yōu)選混合到一種溶液，再注射入腫瘤塊的中央。然而應(yīng)該認(rèn)識(shí)到其它方法對(duì)在腫瘤部位定位生色團(tuán)和免疫佐劑也是足夠的。一種這類的替代轉(zhuǎn)送方式是將生色團(tuán)或免疫佐劑或兩者與組織特異性抗體或組織特異性抗原偶聯(lián)，以使向腫瘤部位的轉(zhuǎn)運(yùn)增強(qiáng)。任何一種在腫瘤部位定位生色團(tuán)和免疫佐劑的方法或不同方法的組合，只要轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制確保在腫瘤中有足夠濃度的該組分便可接受。
合適生色團(tuán)的選擇基本上配合可接受的輻射激光波長(zhǎng)。使用的輻射波長(zhǎng)當(dāng)然必須與生色團(tuán)的光學(xué)性質(zhì)(即吸收峰)互補(bǔ)。其它的生色團(tuán)選擇標(biāo)準(zhǔn)包括產(chǎn)生熱能、發(fā)生單線態(tài)氧及其它活性分子或自身毒性如順鉑的能力。在本發(fā)明中，優(yōu)選的輻射波長(zhǎng)為808±10nm。期望的生色團(tuán)對(duì)紅色和近紅外光譜區(qū)有強(qiáng)烈的吸收，因?yàn)榻M織對(duì)此相對(duì)可被透射。該波長(zhǎng)的另一優(yōu)點(diǎn)是避免了紫外光激發(fā)的致敏劑遇到的潛在致突變作用。然而，在個(gè)別情況下150-2000nm之間波長(zhǎng)可證明是有效的。優(yōu)選生色團(tuán)為indocyanine綠。也可用其它生色團(tuán)，但其選擇基于所期望的光物理和光化學(xué)性質(zhì)，它們決定了光敏效能和光細(xì)胞毒性。其它生色團(tuán)的實(shí)例包括但不限于DHE(聚血卟啉酯/醚)，m-THPP(四(間-羥苯基)卟啉)，AlPcS4(四磺酸phthalocyanine鋁)，ZnET2(原紫紅素鋅)和Bchla(細(xì)菌-葉綠素a)。
優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是脫乙酰殼多糖。脫乙酰殼多糖是殼多糖的衍生物，一種通常分離自某些甲殼動(dòng)物如蟹、龍蝦和蝦的殼。殼多糖是一種通過β1→4糖苷鍵將N-乙酰葡糖胺單元連接而組成的線性同聚物。殼多糖，脫乙酰殼多糖(部分脫乙?；臍ざ嗵?及其衍生物被賦有有趣的化學(xué)和生物性質(zhì)，致使具有多種廣泛的工業(yè)和醫(yī)學(xué)用途。脫乙酰殼多糖中存在的伯和仲醇基團(tuán)以及伯胺基團(tuán)利于進(jìn)行一些化學(xué)修飾，主要用來獲得其溶解并為具體用途賦予具體性質(zhì)。由于其降解產(chǎn)物可用于活組織的葡糖偶聯(lián)成分的生物合成，其生物可降解性及無毒性使它們“生物學(xué)上友好的”。脫乙酰殼多糖及其衍生物已用于繃帶與縫合，燒傷敷料，皮膚代用品，骨骼和牙修復(fù)，食品包裝，藥物密封，化妝品，金屬螯合物及相關(guān)抗氧化作用，廢水處理，止血，抗促凝劑(硫酸鹽化作用后)和染料添加劑及其它。
可通過部分水解為寡糖而增溶殼多糖和脫乙酰殼多糖。對(duì)脫乙酰殼多糖來說，用各種有機(jī)及無機(jī)酸處理，通過游離氨基的質(zhì)子化形成水溶性脫乙酰殼多糖氨鹽。氨基的其它修飾包括導(dǎo)入化學(xué)基團(tuán)如羰甲基，甘油基，N-羥丁基等。還原穩(wěn)定后，糖化即脫乙酰殼多糖的游離氨基的非酶促糖基化為脫乙酰殼多糖凝膠的制備和用于本發(fā)明溶液的制備提供了一種新方法。
用于本發(fā)明的糖化脫乙酰殼多糖的制備步驟如下將3克還原單糖(如葡萄糖，半乳糖，核糖)或等量的還原寡糖在溫和和磁攪拌下，溶于Erlenmeyer燒瓶的100ml蒸餾水中。加入1克脫乙酰殼多糖。當(dāng)懸液均勻后，加入0.25ml甲苯，然后將燒瓶用鋁箔密封。在室溫繼續(xù)磁攪拌24小時(shí)。攪拌后該溶液置于通風(fēng)蒸汽罩，其中加入1.327克硼氫化鈉于5ml 0.1M NaOH中以還原希夫堿和Amadori產(chǎn)物。該溶液然后用箔松散蓋上，室溫?cái)嚢?0分鐘并冰浴中攪拌50分鐘。此攪拌步驟后，燒瓶移出冰浴，在磁攪拌下滴加冰乙酸(約1.9ml)使溶液酸化至pH5.5以分解過量的硼氫化物。溶液然后在五個(gè)玻璃(Corex)離心管中以15,000rpm(在Sorval上，轉(zhuǎn)頭SS-34，4℃)離心15分鐘。輕輕倒出上清，覆蓋在沉淀上的透明凝膠層用鋼鏟小心刮取。用來自兩個(gè)離心管中的上清重懸沉淀，并在兩個(gè)管中再離心。再將上清倒出，如上收集凝膠。用一個(gè)管中的上清重懸后，匯集的沉淀第三次離心。傾去上清后再收集凝膠。匯集的凝膠然后分散在匯集的上清中得到均一懸液，并裝于三個(gè)透析袋(Spectrapor，25mm扁平寬度，截?cái)喾肿恿?2000-14000mol.)。懸液對(duì)35加侖蒸餾水4℃透析過夜。然后袋子置于新的蒸餾水中，再透析7小時(shí)。透析后，從袋中移出透析物并在Warmg攪拌器上以高速均漿三下(每次10秒)。得到的粘性溶液冷凍貯存。在本發(fā)明使用前，冷凍材料在37℃水浴融化，然后用Waring攪拌器混合來得到均一混合物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，ICG粉末與糖化脫乙酰殼多糖制品混合，得到ICG占糖化脫乙酰殼多糖溶液0.1～2％(0.1～2g/100ml)濃度的溶液。該溶液在使用前一直保持溫?zé)帷Ｈ芤旱挠行┝繛?0-2000μl。
雖然優(yōu)選糖化脫乙酰殼多糖，也可從廣泛的免疫活性劑中選擇其它免疫增強(qiáng)劑，如細(xì)菌細(xì)胞壁或釋放蛋白，減毒活細(xì)菌，各種油，修飾的脫乙酰殼多糖或?qū)λ拗鳛橥鈦淼牡珶o毒的脫乙酰殼多糖樣物質(zhì)。
對(duì)激光參數(shù)，雖然可用其它激光，包括可能是或不全是相同波長(zhǎng)的各種激光的匯集，但優(yōu)選通過直徑100-2000μm的光纖以連續(xù)波發(fā)射光的固態(tài)二極管激光。使用的激光能量介于1-60瓦，優(yōu)選功率1-5瓦。輻照持久度應(yīng)持續(xù)1-60分鐘，最好3-6分鐘。照射瘤塊的溫度應(yīng)優(yōu)選升高到(be raised to)約140°F或60℃。
在最優(yōu)選實(shí)施例中，ICG和糖化脫乙酰殼多糖溶液以ICG比脫乙酰殼多糖為0.25∶2％的濃度如上制備。該溶液以70-400μl劑量注射入腫瘤中央。然后用激光照射腫瘤，激光功率約5瓦，輻照波長(zhǎng)則能容易地穿過正常細(xì)胞組織而無明顯破壞。輻照持續(xù)1-10分鐘，足以將該腫瘤的溫度升至誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷并釋放刺激細(xì)胞介導(dǎo)的及體液免疫反應(yīng)的腫瘤抗原的水平。
本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的進(jìn)一步描述，包括成分、參數(shù)和程序，包含在下面鼠乳腺癌研究的摘要中。
鼠乳腺腫瘤的研究A.材料和方法1.激光此研究中用二極管激光。工業(yè)半導(dǎo)體激光ISL50F(McDonnellDouglas Aerospace，St.Louis，MO)采用二極管驅(qū)動(dòng)作電動(dòng)力的二極管陣列。激光以脈沖或連續(xù)方式發(fā)射波長(zhǎng)808±10nm的輻射?？傻玫轿恍屋敵龅淖畲蠼t外功率為35瓦。激光用標(biāo)準(zhǔn)電能(110/120VAC)操縱。微處理機(jī)監(jiān)測(cè)和調(diào)節(jié)激光操作參數(shù)。激光能量可通過不同規(guī)格的光導(dǎo)纖維傳送。紅色激光二極管發(fā)射0.9mW 670nm光做為目標(biāo)光束。在此實(shí)驗(yàn)中采用連續(xù)波方式。
實(shí)驗(yàn)中，使用不同的激光輻照功率和持續(xù)時(shí)間，從5瓦3分鐘到15瓦5分鐘。在過程之前期間和之后用Joule/Watt表(Ophir Optics，Israel)測(cè)量輸出功率。使用兩種光纖直徑600μm和1200μm。
2.動(dòng)物準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)選擇6-7周，體重100-125克的雌性Wistar Furth大鼠。模型為轉(zhuǎn)移的可移植大鼠乳腺腫瘤。瘤株為DMBA-4。通過向皮膚和肌肉層之間的淺層腹腔溝區(qū)域注射，給大鼠接種腫瘤細(xì)胞(約25,000細(xì)胞)。為了同時(shí)的腫瘤生長(zhǎng)，某些被選定的大鼠在左側(cè)和右側(cè)腹股溝區(qū)域均注射腫瘤細(xì)胞。
大鼠喂以高飽和脂肪飲食的特殊食物以利于腫瘤的生長(zhǎng)。腫瘤通常在接種10-14天內(nèi)長(zhǎng)約1-4cm3。在多數(shù)情況下，等到5cm3之前處理大鼠腫瘤。
在激光處理前，進(jìn)行麻醉(100μl xylazme和氯胺酮溶液IM)并修剪和刮除腫瘤上覆蓋的毛。處理后，大鼠放在隔離的籠中并仍喂以相同的高脂肪飲食。每天觀察大鼠，激光處理的及未處理對(duì)照組腫瘤的形態(tài)學(xué)測(cè)量每周進(jìn)行再次。
3.給與致敏物致敏物indocyanme綠(ICG)(Sigma Chemical Co.，St.Louis)以兩種形式使用ICG溶于水和ICG溶于糖化脫乙酰殼多糖，ICG∶水或∶脫乙酰殼多糖的濃度為0.5％和1％(g/100ml)。在脫乙酰殼多糖溶液的情況下，膠從冷凍狀態(tài)(-4℃)拿到37℃后，在玻璃研缽中將ICG粉末與如前所述制得的糖化脫乙脂殼多糖混合，得到均一的溶液。然后將致敏物溶液注射到靶腫瘤的中心，在激光處理前24小時(shí)或僅10分鐘前注射。劑量在每瘤70-400μl之間變動(dòng)。
對(duì)于兩側(cè)腹股溝區(qū)域移植原發(fā)瘤的大鼠，只有一側(cè)腫瘤注射ICG-脫乙酰殼多糖。但兩側(cè)腫瘤均用相同激光參數(shù)處理。
4.激光治療激光能量通過直徑為600或1200μm的纖維傳送到治療部位。纖維頭端與皮膚保持4mm。纖維頭平穩(wěn)緩慢地移動(dòng)經(jīng)過腫瘤的各側(cè)面以保證均一的能量分布。治療部位表面經(jīng)常加一薄水膜(20℃)以防由于表面過熱引起的不必要皮膚損傷。
對(duì)于同時(shí)用兩個(gè)原發(fā)腫瘤接種的大鼠，一個(gè)腫瘤借助ICG-脫乙酰殼多糖進(jìn)行激光照射，另一個(gè)僅用激光治療。56只大鼠用不同的激光參數(shù)，偶聯(lián)ICG-脫乙酰殼多糖溶液治療。16只大鼠注射100-200μl 1％的ICG-H2O溶液，并用不同輻照度，從3-10瓦，3-5分鐘進(jìn)行激光照射。
B.結(jié)果1.存活率至1995年4月1日，共有在105只大鼠用于研究。所有的大鼠在一側(cè)或雙側(cè)腹股溝區(qū)域注射轉(zhuǎn)移的可移植大鼠乳腺腫瘤細(xì)胞。大鼠分成三組(1)對(duì)照組，(2)有ICG-H2O溶液的激光治療，和(3)有ICG-脫乙酰殼多糖溶液的激光治療。各組動(dòng)物的存活率總結(jié)于表I。
表1具有移植腫瘤的大鼠存活率
*6只長(zhǎng)期存活大鼠中，3只仍然活著。表中數(shù)據(jù)采至1955年1月16日**這6只長(zhǎng)期存活大鼠用此激光功率和持續(xù)時(shí)間范圍處理(詳見表II)移植腫瘤后，33只對(duì)照組大鼠的平均存活時(shí)間是31.5天；僅注射水溶性ICG并激光治療的大鼠平均存活29.0天；注射ICG-脫乙酰殼多糖并激光治療大鼠的總體平均存活時(shí)間45.6天。在最后一組的56只大鼠中，6只大鼠獲得長(zhǎng)期存活(至少為對(duì)照組大鼠的兩倍)，除了它們之外，該組存活率為32.8天。另一方面，這6只大鼠平均存活152.0天。值得注意的是三只大鼠Srat3，Srat4和Srat6在寫此報(bào)告時(shí)仍存活，到1995年4月1日分別已有存活220，192和147天。
2.腫瘤對(duì)激光治療的反應(yīng)表I顯示組2和組3的荷瘤大鼠均對(duì)激光能量呈陽性反應(yīng)。幾乎所有腫瘤在激光治療后溫度馬上升高。注射ICG-H2O或ICG-脫乙酰殼多糖的溶液的腫瘤溫度通常升高40°F，而無ICG腫瘤溫度僅升高較少水平，常常高于體溫20-30°F，這取決于激光功率和持續(xù)時(shí)間。
由于溫度突然升高，在過程中常出現(xiàn)內(nèi)部激增。在高功率激光，如10瓦以上更明顯。在大多數(shù)情況下，即使在治療表面不斷給予小水滴，高功率仍產(chǎn)生皮膚損傷。
高激光功率下(10-15w)的腫瘤細(xì)胞損傷是淺層的，較深的腫瘤細(xì)胞常幸免激光的攻擊。使用較低激光功率時(shí)可獲得較好結(jié)果。6只長(zhǎng)期存活大鼠均接受的5瓦治療(4只3分鐘，2只5分鐘)。見表II。
表II激光-ICG-脫乙酰殼多糖處理的長(zhǎng)期存活大鼠參數(shù)
*共42只大鼠用此范圍參數(shù)處理，得到14％存活率**大鼠仍存活總共43只大鼠用5瓦功率的激光輻照3-6分鐘；在這組中導(dǎo)致了14％的長(zhǎng)期存活率。在該參數(shù)下，不計(jì)算6只長(zhǎng)期存活大鼠，平均存活達(dá)32.8±6.3天。
激光治療后，所有腫瘤立即在最初的幾天內(nèi)生長(zhǎng)較緩慢，然后又回到正常的生長(zhǎng)速度。腫瘤經(jīng)常部分被咬或咀嚼，但那不能停止或減慢腫瘤生長(zhǎng)。除了列于表II的大鼠外，大多數(shù)大鼠約30-35天死亡。大約一半被治療大鼠后來形成了繼發(fā)腫瘤，多數(shù)如“手袋”(轉(zhuǎn)移到腋下區(qū)域的淋巴結(jié))；淋巴結(jié)中也有原發(fā)腫瘤的局部擴(kuò)散。在任何一種情況下，除表II中的大鼠外，繼發(fā)腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)直至死亡。
3.長(zhǎng)期存活大鼠的腫瘤發(fā)生表II中6只大鼠均用5瓦功率治療3分鐘(4只大鼠)或5分鐘(2只大鼠)。更重要的是它們?nèi)孔⑸銲CG-脫乙酰殼多糖膠溶液。移植兩個(gè)原發(fā)腫瘤的大鼠，只有一個(gè)腫瘤接受ICG-脫乙酰殼多糖溶液，另一個(gè)無任何ICG致敏劑進(jìn)行激光照射。只有一個(gè)原發(fā)腫瘤的大鼠采用ICG-脫乙酰殼多糖。IDG-脫乙酰殼多糖溶液為0.5-1％，劑量每個(gè)腫瘤70μl-150μl。在激光治療前24小時(shí)或10分鐘，通常直接向腫瘤注射ICG-脫乙酰殼多糖。
象所有其它大鼠一樣，治療后腫瘤繼續(xù)生長(zhǎng)，而且大多數(shù)腫瘤沿乳線向腋下淋巴結(jié)和對(duì)側(cè)腹股溝結(jié)節(jié)轉(zhuǎn)移。然而，腫瘤的發(fā)生在后來的階段發(fā)生巨大轉(zhuǎn)變。圖1和圖2顯示Srat1和Srat2的原發(fā)腫瘤經(jīng)激光治療后的生長(zhǎng)圖表；左腹股溝腫瘤注射ICG-脫乙酰殼多糖，右腹股溝的不注射。腫瘤移植后約50天生長(zhǎng)達(dá)峰值，然后開始退步。腫瘤繼續(xù)收縮到約90天達(dá)最小體積。然后腫瘤又開始生長(zhǎng)Srat1比Srat2生長(zhǎng)更快。注意兩種情形中(無ICG-脫乙酰殼多糖注射)右腹股溝的負(fù)擔(dān)較大。
Srat1和Srat2的繼發(fā)腫瘤在腫瘤移植后約第20天出現(xiàn)，并經(jīng)過與原發(fā)相同的模式一生長(zhǎng)/收縮/生長(zhǎng)，見圖3和4。Srat2的情況中，繼發(fā)腫瘤的再出現(xiàn)幾乎可忽略。
其它三只大鼠的腫瘤生長(zhǎng)見圖5。Srat3和Srat6僅始于一個(gè)原發(fā)腫瘤，而Srat4始于兩個(gè)。圖5表示更早的反應(yīng)腫瘤減小約20-25天開始。而且，甚至無繼發(fā)腫瘤，原發(fā)腫瘤僅變成一個(gè)纖維組織小硬核；僅為腫瘤的殘余。因?yàn)槿辉诖藭r(shí)(1995年4月1日)仍活著，所以將進(jìn)一步觀察。
4.實(shí)驗(yàn)的改進(jìn)早期實(shí)驗(yàn)曾主要集中在建立可工作的條件，包括激光參數(shù)以及ICG-脫乙酰殼多糖的濃度和劑量。在開始的幾組中沒觀察到長(zhǎng)期存活。體外和體內(nèi)結(jié)果提示，實(shí)驗(yàn)曾以3-5瓦的激光功率范圍進(jìn)行。0.5％-1％的ICG-殼多糖溶液看來是有效的。得到了穩(wěn)定的10％長(zhǎng)期存活率，在最近的一組大鼠中竟達(dá)20％存活率。
C.討論顯然，當(dāng)使用吸收峰約800nm的生色團(tuán)ICG時(shí)，808nm二極管激光對(duì)有組織的組織的光熱效應(yīng)會(huì)大大增強(qiáng)。808nm激光能量可容易地穿透正常組織，而在調(diào)節(jié)的功率范圍內(nèi)使細(xì)胞結(jié)構(gòu)大多完整。
當(dāng)向靶組織注射時(shí)，是ICG分子強(qiáng)烈地吸收808nm輻射并達(dá)到激發(fā)態(tài)。當(dāng)分子返回基態(tài)時(shí)，貯存的能量以熱的形式釋放，并被周圍的組織吸收以升高溫度。(激發(fā)的ICG分子還可引起其它生化反應(yīng)，它們也許在我們誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)中是關(guān)鍵的)。當(dāng)足夠量的ICG分子在某段時(shí)間(正常地比組織熱弛豫時(shí)間短)被激發(fā)時(shí)，釋放的熱被組織細(xì)胞吸收比其擴(kuò)散更快。如果暴露于激光足夠長(zhǎng)時(shí)間，積蓄的熱能可將組織溫度提高到有組織的組織可發(fā)生光熱破壞的水平。此損傷可用某些選擇的激光功率和輻照持續(xù)時(shí)間來獲得?？磥?-5瓦的激光功率對(duì)引起腫瘤細(xì)胞致命損傷是足夠的。
較高的功率與ICG偶聯(lián)使用可對(duì)組織引起快速并更猛烈的熱損傷，但可引起某些不期望的結(jié)果。高功率輻射引起更快的溫度升高，常致使內(nèi)部爆炸及快速組織碳化，特別是當(dāng)空氣中氧豐富時(shí)發(fā)生在治療表面上。通過水膜或氦氣的表面冷卻步驟不能減慢碳化，碳化將表面組織性質(zhì)從近乎可以穿透變?yōu)閷?duì)808nm波長(zhǎng)高度吸收。因而808nm輻照會(huì)進(jìn)一步被碳化組織吸收。這將妨礙激光能量的穿透，導(dǎo)致指定惡變組織的表層及局限空間熱損傷。
僅熱影響可能減慢短期的腫瘤生長(zhǎng)，但不能改變已得腫瘤的宿主的預(yù)定命運(yùn)。如表I所示，輔以ICG-H2O溶液進(jìn)行激光治療的第2組在存活率上未顯示任何改善。當(dāng)然，光熱相互作用對(duì)腫瘤細(xì)胞的破壞是主要作用。然而，由于腫瘤的進(jìn)攻性，僅通過熱損傷很難完全根除；就像手術(shù)切除和放療的情況那樣。
結(jié)論顯然，其它機(jī)制必須用來對(duì)付惡性細(xì)胞增殖的根源。當(dāng)然，理想的機(jī)制是自身免疫防御系統(tǒng)，它可阻止異常細(xì)胞的生長(zhǎng)。只有當(dāng)天然免疫功能衰弱或不足以對(duì)外來侵入起反應(yīng)進(jìn)才發(fā)生癌。假如天然免疫防御不能阻止失控的細(xì)胞生長(zhǎng)，就需要內(nèi)源或外源的刺激免疫反應(yīng)。如前所述，很久已知某些化合物可增強(qiáng)天然防御機(jī)制，但這種增強(qiáng)常常是腫瘤生長(zhǎng)后的一步或幾步。這里描述的模型涉及聯(lián)合的PDT和免疫療法治療。
其它治療方式如化療和放療常無選擇地殺傷細(xì)胞以致伴生的損害成為致命的。雖然PDT依賴于激光和某些光敏化劑產(chǎn)生的熱和/或毒性單線態(tài)氧來殺死腫瘤細(xì)胞，但它仍不是影響宿主自身免疫防御系統(tǒng)的方法。通過聯(lián)合使用激光、生色團(tuán)和免疫調(diào)節(jié)劑，本發(fā)明提供了一種新的癌癥療法。
本發(fā)明對(duì)刺激宿主中細(xì)胞介導(dǎo)的和體液免疫反應(yīng)的作用見圖1-5。生長(zhǎng)圖(圖1和2)表示腫瘤負(fù)擔(dān)的變化。移植腫瘤后50天(激光-ICG脫乙酰殼多糖治療后40天)原發(fā)腫瘤達(dá)到其最大體積。后來腫瘤生長(zhǎng)和體積的減小只能由產(chǎn)生的免疫反應(yīng)來解釋，因?yàn)橹挥挟?dāng)自身防御機(jī)制完全形成時(shí)，才能減慢和停止腫瘤生長(zhǎng)，并且無功能的腫瘤細(xì)胞可被巨噬細(xì)胞吞噬。沒有這種外來特性，沒有大鼠能存活超過35或40天，正如表I中前兩組實(shí)驗(yàn)大鼠所證明的。
注射ICG-脫乙酰殼多糖的腫瘤多數(shù)在(表II中6只大鼠左腹股溝)具有較慢的生長(zhǎng)速率、對(duì)免疫佐劑更直接影響的跡象，雖然兩側(cè)腫瘤均用相同的激光功率和持續(xù)時(shí)間治療?？偟膩碚f注射ICG-脫乙酰殼多糖的腫瘤對(duì)激光治療有更大反應(yīng)。偶聯(lián)ICG，僅熱相互作用在大范圍內(nèi)有效地減少腫瘤負(fù)擔(dān)。脫乙酰殼多糖顯然增加了免疫刺激。熱與免疫作用的組合似乎可用來解釋為什么如圖1和2所示，左腹股溝腫瘤比右側(cè)的生長(zhǎng)慢。
免疫防御系統(tǒng)反應(yīng)的產(chǎn)生和加速進(jìn)一步被長(zhǎng)期存活大鼠繼發(fā)腫瘤的演變所支持。轉(zhuǎn)移通常發(fā)生在移植原發(fā)腫瘤后約15-20天的半數(shù)大鼠上。多數(shù)情況下繼發(fā)腫瘤沿乳線繼續(xù)生長(zhǎng)至死亡。然而，圖3和4的Srat1和Srat2的移植腫瘤顯示與原發(fā)腫瘤(圖1和2)完全相同的趨勢(shì)，不注射ICG-脫乙酰殼多糖也不激光治療。圖5描述了三只大鼠(Srat3，Srat4和Srat6)原發(fā)腫瘤的生長(zhǎng)，它們?nèi)駨南嗤陌l(fā)生—生長(zhǎng)/治療/生長(zhǎng)/減小。而且，這三只大鼠較早形成了其完全反應(yīng)；腫瘤移植后20-25天腫瘤生長(zhǎng)停止并且從未出現(xiàn)繼發(fā)腫瘤。這一誘導(dǎo)免疫防御機(jī)制的早期建立可解釋為什么這些大鼠仍然活著并沒有腫瘤復(fù)發(fā)的跡象。
總之，通過激光-生色團(tuán)-佐劑誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)可獲得全部癌癥根除的長(zhǎng)期存活。這是由于光熱相互作用而減少腫瘤負(fù)擔(dān)與由于加入脫乙酰殼多糖或其它免疫調(diào)節(jié)劑而加強(qiáng)的免疫系統(tǒng)反應(yīng)的綜合結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果正不斷改善。最初幾組沒有產(chǎn)生長(zhǎng)期存活者，而現(xiàn)在已獲得穩(wěn)定的10％長(zhǎng)期存活率。在目前可接受的激光功率(5瓦)和輻照持續(xù)時(shí)間(3-6分鐘)，長(zhǎng)期存活率達(dá)14％。
雖然本發(fā)明以某種程度具體性來描述，但證明可在不背離此公開的精神和范圍下，對(duì)上述方法進(jìn)行許多改變。本發(fā)明被認(rèn)為不僅限于用來舉例的這里給出的實(shí)施方案，而僅受所附權(quán)利要求的范圍限制，包括每一提及因素的等價(jià)的全部范圍。
權(quán)利要求
1.治療人及其它動(dòng)物腫瘤的方法，包含下列步驟(a)向所述腫瘤導(dǎo)入一種生色團(tuán)和免疫佐劑；并(b)以足夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷并刺激自身免疫防御系統(tǒng)抵抗腫瘤細(xì)胞增殖的輻照度激光照射所述腫瘤。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述生色團(tuán)和選自indocyanine綠，DHE，m-THPP，AlPcS4，ZnET2和Bchla。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫佐劑選自糖化脫乙酰殼多糖，細(xì)菌細(xì)胞壁，釋放的蛋白，減毒活細(xì)菌，油，修飾的脫乙酰殼多糖以及對(duì)宿主是外來的無毒脫乙酰殼多糖樣物質(zhì)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中所述生色團(tuán)是indocyanine綠。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫佐劑是糖化脫乙酰殼多糖。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述生色團(tuán)是indocyanine綠，而且所述免疫佐劑是糖化脫乙酰殼多糖。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述生色團(tuán)和所述免疫佐劑以組合物的形式。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物注射入所述腫瘤。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述生色團(tuán)為indocyanine綠，所述免疫佐劑為糖化脫乙酰殼多糖。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述組合物包含所述indocyanine綠和所述糖化脫乙酰殼多糖的溶液。
11.權(quán)利要求10的方法，其中所述溶液包含所述indocyanine綠∶糖化脫乙酰殼多糖為0.1∶2％的濃度。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述溶液以700-2000μl的劑量導(dǎo)入所述腫瘤。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述溶液在所述激光照射前0-24小時(shí)導(dǎo)入所述腫瘤。
14.權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物向所述腫瘤的導(dǎo)入通過給予所述混合物與一種腫瘤特異性抗體的偶聯(lián)物來完成。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述偶聯(lián)物是系統(tǒng)給藥的。
16.權(quán)利要求14的方法，其中所述偶聯(lián)物是腫瘤內(nèi)給藥的。
17.權(quán)利要求7的方法，其中所述組合物向所述腫瘤的導(dǎo)入是通過給予所述組合物與一種腫瘤特異性抗原的偶聯(lián)物來完成。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述偶聯(lián)物是系統(tǒng)給藥的。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述偶聯(lián)物是腫瘤內(nèi)給藥的。
20.權(quán)利要求1的方法，其中約1-60瓦的激光功率與所述激光照射相關(guān)。
21.權(quán)利要求1的方法，其中約1-5瓦的激光功率與所述激光照射相關(guān)。
22.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤約照激光照射1-60分鐘。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述腫瘤激光照射約1-10分鐘。
24.權(quán)利要求1的方法，其中使用約5瓦的激光功率，并且所述腫瘤激光照射約3-6分鐘。
25.權(quán)利要求1的方法，其中150-2000nm的輻照波長(zhǎng)用于與所述激光照射相關(guān)。
26.權(quán)利要求1的方法，其中808±10nm的輻照波長(zhǎng)用于與所述激光照射相關(guān)。
27.權(quán)利要求1的方法，其中所述激光照射用二極管激光完成。
28.權(quán)利要求26的方法，其中所述激光照射用連續(xù)波形式完成。
29.權(quán)利要求26的方法，其中所述激光照射用脈沖形式完成。
30.權(quán)利要求1的方法，其中所述激光照射用直徑100-2000μm的光纖完成。
31.權(quán)利要求1的方法，其中所述激光照射連續(xù)進(jìn)行直至所述腫瘤的溫度升至高于140°F。
32.治療人和其它動(dòng)物腫瘤的方法，包含下列步驟(a)向所述腫瘤注射含有生色團(tuán)和免疫佐劑的溶液；及(b)用低能量激光照射所述腫瘤，其輻照波長(zhǎng)與所述生色團(tuán)的波長(zhǎng)互補(bǔ)，并照射足夠長(zhǎng)時(shí)間以升高所述腫瘤的溫度來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷并刺激自身免疫防御系統(tǒng)抵抗腫瘤細(xì)胞的增殖。
33.治療人和其它動(dòng)物腫瘤的方法，包含下列步驟(a)以所述indocyanme綠所述糖化脫乙酰殼多糖為0.1∶2％的濃度制備indocyanine綠和糖化脫乙酰殼多糖的溶液；(b)向所述腫瘤注射70-400μl所述溶液；及(c)用功率約為5瓦、照射波長(zhǎng)能容易地穿透正常細(xì)胞組織而無明顯損傷的激光照射所述腫瘤持續(xù)1-10分鐘，使所述腫瘤的溫度升高以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞損傷并刺激自身免疫防御系統(tǒng)抵抗腫瘤細(xì)胞增殖。
全文摘要
公開一種治療腫瘤如人或其他動(dòng)物惡性腫瘤的方法。向腫瘤內(nèi)導(dǎo)入生色團(tuán)及免疫佐劑。該腫瘤然后用激光照射,其輻照度是以誘導(dǎo)惡性細(xì)胞損傷并刺激自身免疫防御系統(tǒng)抵抗惡性細(xì)胞擴(kuò)增。
文檔編號(hào)A61K35/74GK1186440SQ96194438
公開日1998年7月1日 申請(qǐng)日期1996年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1995年4月4日
發(fā)明者R·E·努德奎斯, W·R·陳, R·卡勒貝利 申請(qǐng)人:俄克拉荷馬創(chuàng)傷治療所