專利名稱：尿多酸肽組合物的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種尿多酸肽組合物、尿多酸肽組合物的制備方法以及尿多酸肽組合物在治療及防止癌癥復發(fā)方面的用途，屬于藥物領(lǐng)域。
惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的常見病，其發(fā)病率和死亡率都很高?？梢哉f是目前人類死亡的主要殺手之一，尤其是晚期惡性腫瘤患者一般已失去手術(shù)、化療、放療等機會。傳統(tǒng)的四大療法各有利弊，但往往難以從根本上解決問題，因而，治愈或部分治愈惡性腫瘤，減少患者的痛苦，延長生存期，改善生活質(zhì)量，在臨床上是一個十分棘手的難題，故癌癥疾患的攻克和治療是各國醫(yī)學界都十分關(guān)注的課題。
目前臨床上繼手術(shù)、化療、放療、免疫療法后，有人又提出一種誘導惡性腫瘤細胞向正常細胞分化的治療方法，一般稱為細胞分化療法。其主要機理為人惡性腫瘤細胞異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶活性升高，是可能導致腫瘤細胞不斷分裂的重要原因之一，從本質(zhì)上說，甲基轉(zhuǎn)移復合酶的異常阻斷了癌細胞的分化，從而使癌細胞不斷地分裂，如能有效地抑制該酶的活性才能誘導腫瘤細胞走向正常分化。
既然異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶是癌癥的核心問題，那么消除這些異常酶之后，癌細胞應該可以象正常細胞那樣被誘導進行分化而變成不再分裂的終末細胞。我們的實驗顯示癌細胞的rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶對類似寡腺嘌呤核苷酸的寡聚核苷酸特別敏感，但是正常酶對這類的抑制劑毫無反應，這是因為正常和異常的甲基轉(zhuǎn)移復合酶有很顯著的差異，我們可以利用這種差異來尋求有選擇性的抗癌藥物，這種藥物通常被稱為分化誘導劑。寡腺嘌呤核苷酸是一個很理想的分化誘導劑，事實上目前廣泛應用的分化誘導劑如干擾素，維甲酸，維生素D3，六甲撐二乙酰胺(HMBA)，二甲基亞砜(DMSO)和佛波脂(phorbol ester)大都是通過誘導寡腺嘌呤核苷酸來促成癌細胞的終末分化；由于癌細胞必需具有很多這些分化誘導劑的受體才能達到分化的目的，這類分化誘導劑能夠影響到的癌細胞范圍很小。具有很多受體的幾乎都是一些特例，如毛細胞白血癥細胞有很多干擾素受體，急性早幼粒白血病細胞有很多維甲酸和維生素D3受體，六甲撐二乙酰胺最能產(chǎn)生作用的是紅白血病細胞等等，但是寡腺嘌呤核苷酸本身因為構(gòu)造特殊不容易被細胞吸收，不能作為藥物。
研究發(fā)現(xiàn)尿中含有類似寡腺嘌呤核苷酸功能的化合物，可以將異常的甲基轉(zhuǎn)移復合酶改變成為正常酶，這種制劑因為沒有受體的限制，所以對多種癌細胞都能夠誘導分化，并促進癌細胞走向正常分化或使癌細胞凋亡，通常認為尿提取物中的有色肽為分化誘導劑(US4470970)。
Liau，M．C．在J．Exptl．Clin．Chemother．59-17，1992中公開了丁酸和苯甲酸可以作為分化幫助劑，單獨或與分化誘導劑共用，用于癌癥的治療；US5783605中公開了以合成的N-烷基苯乙酰胺、苯甲酸酯類和吲哚乙酸作為分化幫助劑，用于治療癌癥。
US4470970中公開了一種可以從尿中提取、也可以合成的新型抗癌藥物--抗瘤酮A10，其結(jié)構(gòu)為3-苯乙酰氨基-2，6-哌啶雙酮，具有抗多種癌癥的作用；通常認為抗瘤酮A10具有抑制人體過多排泄體內(nèi)抗癌物質(zhì)--低分子量代謝物的作用；實驗證明抗瘤酮A10注射劑是其開環(huán)產(chǎn)物，以苯乙酰谷氨酰胺和苯乙酰異谷酰胺鈉鹽的形式存在，見Hendry L．B．“DrugsExptl Clin．Res，1987，Suppl．171”。
事實上尿和尿的提取物的醫(yī)學用途被國內(nèi)外人們所認識已有幾個世紀了，公元后二世紀希臘人Xenokrates用尿治療癌癥(見Turner，F(xiàn)．C．Effects of extracts of human urine on tumorsin mice．U．S．Public Health Service，1855，1939)；Floydc．Tumer在1939年發(fā)現(xiàn)從尿中產(chǎn)生的生長抑制物質(zhì)能防止小鼠腫瘤的形成(Fleming，R．F．，Peczenik．O．Alkalinephosphatase and tumor inhibition．Nature，162，338，1948)；英國和德國對人尿中提取的未知結(jié)構(gòu)物名為H-11的多肽研究(見Fleming，R．，Walters，C．L，Williams，J．L．The effectof adrenal and urinary extracts on malignant tissue．Acta．Un．Inter．can．，7，456，1951．Walters，C．L．A competitive alkaline phosphatase inhibitor from extracts ofnormal male urine．Enzymologia，20，33，1958．Von Klose，G．Chemotherapie in derNachbehandlung von Geschwulstkrankheiten．Schleswig-Holstenisches Artztenblatt，442，1962．)，在早期臨床研究中有16例不宜手術(shù)的肺癌患者通過注射該提取物治療，觀察到多數(shù)病人癥狀緩解、延長生命且無明顯的副作用；1968年Klose和Below闡明在更長期的治療方案中用該提取物治療49例不宜手術(shù)的肺癌患者，取得良好效果(見Klose，G．BelowR．verlaufsbeobachtungen bei Kranken mit inoperablen Lungentumoren bei Behandlungmitkombinierter interner Therapie (alkylierend Substanz und korpereigenesPolypeptid)．Krebsarzt，24，1，1969)；Burzynski(Von Burzynski，S．R．，Stolzmann，Z．，Szopa，B．et al．Antineplaston A in cancer therapy(I) physiol．Chem．Phys．，9，485，1977)用人尿提取的抗癌物抗瘤酮A10來醫(yī)治晚期癌癥病人21個，靜滴給藥有顯著的抗腫瘤作用且無任何毒性，目前正在二期臨床，據(jù)美國NCI報告，如按FDA規(guī)定的臨床方案，該藥的三期臨床治療non-Hodgkins淋巴瘤患者可能會取得抗腫瘤的預期效果(佐野鎌太郎，消滅癌癥，世茂出版社，臺北，臺灣，1997226)，山東醫(yī)科大學學報1998，264中公開了抗瘤酮A10的初步抑瘤實驗，當給藥量為1500mg／kg時，對S180的抑制率為28％。
由此可見，尿的提取物是一類很有前途的治療癌癥的藥物，但是現(xiàn)有技術(shù)只是公開了尿提取物的某一組份或某些組份及其作用，在提取尿液中的有效成分時，通常由于吸附劑的不同、淋洗液及流速不同，得到的產(chǎn)物及收率不同，后處理時采用的工藝和方法不同，也直接影響產(chǎn)品的組成、性質(zhì)、產(chǎn)率和治療效果，如現(xiàn)有技術(shù)中，一般產(chǎn)率較低，而且將提取物濃縮過濾后不再進行處理直接用于藥物制劑，由于尿提取物中可能含有各種病毒，直接應用，對人體存在不可預見的潛在危險；并且現(xiàn)有技術(shù)中對于組合物的提取、成分和結(jié)構(gòu)的研究及其在治療癌癥方面的作用亦沒有詳細的報道。
本發(fā)明的目的在于彌補現(xiàn)有技術(shù)的不足，從人尿中提取有效成分，提供一種治療和預防癌癥的藥物組合物----尿多酸肽組合物。
本發(fā)明的另一個目的是確定尿多酸肽組合物的組成。
本發(fā)明的另一個目的是確定尿多酸肽組合物各個主要成分的含量。
本發(fā)明的另一個目的是公開一種制備治療和預防癌癥的藥物組合物-尿多酸肽組合物及中間體的制備方法。
本發(fā)明的再一個目的是公開尿多酸肽組合物在治療和預防癌癥復發(fā)方面的用途。
為了完成上述任務，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下1．制備尿多酸肽組合物將新鮮尿酸化，使PH小于等于3，以保證其穩(wěn)定并易于提??；過濾除去酸化尿中直徑大于20微米的大顆粒；超濾除去酸化尿中分子量較大的有機物質(zhì)，用乙醇浸泡吸附劑后，用醇和去離子水分別洗滌吸附劑，裝吸附柱，以一定的流速將超濾后的酸化尿加入吸附柱內(nèi)，用吸附劑吸附濾液中的有效成分；酸化尿中有大量的無機鹽離子和有機物，在進入吸附劑后未被吸附的積存于柱內(nèi)，用軟水洗滌未被吸附但殘留在吸附劑中的無機物及親水性有機物，純化有效成分；用醇洗脫吸附在硅膠柱上的有效成分；收集有色流出液，濃縮后，用堿調(diào)整PH至中性，控制PH為6．0-8．5，低溫靜置析出濃縮過程中形成的聚合物，經(jīng)過濾除去結(jié)晶及膠體雜質(zhì)，得到尿多酸肽組合物中間體。
上述中間體經(jīng)冷凍干燥，可以得到干燥的尿多酸肽組合物，該原料藥可以制成口服膠囊，或經(jīng)過稀釋、除病毒等純化及包裝制成口服液或注射液。
以蒸餾水20L溶解干燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；將粗品在低溫庫中放置；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，細胞內(nèi)毒素檢測至合格，整個制備工藝見附

圖1。
上述原料尿的酸化可以用鹽酸、硫酸以及適合本發(fā)明的其他酸。
原料尿酸化時，控制酸化尿的PH為小于等于3，優(yōu)選小于等于2，最優(yōu)選1．0-1．8；酸化尿超濾的壓力為1-5Mpa。
超濾除去酸化尿中分子量大于10000或大于9000的有機物質(zhì)。
相對于20公斤原料尿，吸附劑的用量為5-20公斤；上述吸附劑可以選用C18柱、XAD-7、XAD-8或XAD-16以及適合本發(fā)明的其他吸附劑，優(yōu)選C18柱和XAD-7，最優(yōu)選XAD-7；浸泡吸附劑的醇的用量為15-25升，浸泡時間為5-20分鐘；洗滌吸附劑的醇和去離子水的用量為15-25升；酸化尿加入分離柱的流速為0．1-2L／min；洗脫液蒸餾水的用量為5-30L，洗脫速度為0．1-3L／min；洗脫液醇的用量為5-20L，洗脫速度為0．1-3L／min；上述洗脫可以使用乙醇、甲醇、丙醇以及適合本發(fā)明的其他醇類，優(yōu)選甲醇；上述除溶劑可以使用減壓蒸餾、膜技術(shù)以及適合本發(fā)明的其它方法；減壓蒸餾時，物料的溫度控制在30-80℃；調(diào)整PH值時，可以用氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉以及適合本發(fā)明的其他堿，優(yōu)選氫氧化鈉；濃縮液的PH值調(diào)整為6．0-8．5，優(yōu)選PH7．0-8．0，最優(yōu)選PH7．2-7．8；用堿調(diào)整PH至中性的過程，可以在流出液濃縮后干燥之前，也可以在濃縮液干燥再稀釋后。
上述在低溫庫中放置；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒的過程，可以在流出液濃縮后干燥之前，也可以在濃縮液干燥再稀釋后進行。上述在低溫庫的溫度控制在0-10℃；放置時間為80-160小時。
上述干燥可以用冷凍干燥，也可以用減壓或常壓干燥，優(yōu)選冷凍。
整個過程的收率為原料尿的0．2-4．0％。經(jīng)上述方法制備的尿多酸肽組合物可以直接用于制備各種劑型的藥物。
2．尿多酸肽組合物的分離和鑒定將尿多酸肽干品稀釋，用高效液相色譜法對采用上述方法制備的尿多酸肽組合物進行分離，并測定其組成，發(fā)現(xiàn)從健康人尿中提取的藥物組合物含有四種有機酸，分別是馬尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和吲哚乙酸，以及一系列多相性小分子肽，還含有較多的無機鹽，根據(jù)其組成，我們稱之為尿多酸肽組合物。主要包括①按照常規(guī)方法檢測本發(fā)明方法制備的尿多酸肽組合物的化常數(shù)，包括外觀、不溶性微粒含量、PH值、固體總重量、熾灼殘渣、含氮量等；②確認本發(fā)明藥物組合物中所含的有機酸；③測定有機酸含量以馬尿酸，苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸、吲哚乙酸的純品為參照標樣，并且對每一種有機酸進行了定量分析，四種有機酸的含量分別為馬尿酸4．17-7．94mg／ml；苯乙酰谷氨酰胺4．87-10．86mg／ml；苯乙酸0．66-4．5mg／ml；吲哚乙酸0．11-0．28mg／ml；尿多酸肽組合物中四種有機酸的總含量為26．34-57．65％；④測定肽含量采用HPLC，Waters公司專一分析柱PICO·TAGTM分別測定藥物組合物的水解總氨基酸與游離氨基酸，從而計算出肽氨基酸的含量(水解總氨基酸總量與游離氨基酸含量之差值)，獲知小分子肽氨基酸的含量約為7．7-10．9mg／m；⑤測定分子量用HPSEC法測定本發(fā)明尿多酸肽組合物液的分子量分布，采用美國Sigma公司多肽與小分子蛋白分子量標準品；獲知三個主要峰的分子量分別為7000-9200，4000-5800，1000-2100；尿多酸肽溶液樣品的分子量最大為9200，所含多肽的分子量均小于10000道爾頓，確定其所含多肽的分子量小于1萬；由此可見，該品中肽基本以小分子肽的形式存在。
⑥測定尿多酸肽組合物中肽的成分，經(jīng)用HPLC排阻層析法，凝膠柱Protein60分離并檢測本發(fā)明尿多酸肽組合物的肽成分，得到一系列的肽峰(見附圖28-30)，數(shù)量為12-15個。其中有二個十分明顯的主峰，特征峰之一的保留時間為6．805-7．493，三批相對百分含量分別為15．89％、16．16％、16．27％、．16．56％、17．56，即15．89-17．56；而另一個特征峰保留時間的均值為7．722-8．824，三批相對百分含量分別為18．68％、19．27％、19．61％、19．19％、19．98％，即18．68-19．19；⑦測定無機元素的含量采用原子吸收分光光度法測定無機元素的含量，獲知尿多酸肽中含有Ca、Mg、Fe、Zn、Mn、Cu、Cr、Co、Na、K等無機離子，總含量為5103-6126μg／ml。
⑧含氮量按中國藥典1995年版附錄Ⅶ D半微量法檢驗，測得含氮量不低于2．0mg／ml。
此外，尿多酸肽組合物中還含有微量的尿紅素和維生素B2。
3．尿多酸肽組合物的藥理及毒理用在體和離體試驗方法，對多種瘤株細胞或他們所致的病理模型，進行了多方位的試驗研究，結(jié)果如下在體試驗在體試驗表明本發(fā)明的藥物組合物溶液劑量在100-1000mg／kg時，對裸鼠或經(jīng)免疫抑制的昆明種小鼠接種人腫瘤細胞的動物模型的腫瘤有明顯抑制生長作用，抑瘤率均在30％以上，其中對經(jīng)免疫抑制的昆明種小鼠，腎囊膜下接種的急性早幼粒白血病HL-60細胞有顯著的生長抑制作用，劑量在640mg／kg時，抑制率達64％以上，并且HL-60細胞形態(tài)上呈現(xiàn)明顯分化現(xiàn)象，癌組織中出現(xiàn)大量中晚幼粒及成熟細胞。600mg／kg時，對裸鼠肝包膜下接種的高轉(zhuǎn)移性人肝癌LCI-D20裸鼠模型，有一定的抑制腫瘤生長作用，抑瘤率約43％；并可大大減少移植性肝癌的腹腔轉(zhuǎn)移，尤以高劑量(1800mg／kg)更為顯著。分子生物學研究表明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液(1200-1800mg／kg)對上述LCI-D20肝癌組織中與增殖分化相關(guān)的原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表達有非常明顯的下調(diào)作用(P＜0．01)；并能有效地下調(diào)反映腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力的指標MMP9基因的mRNA轉(zhuǎn)錄(P＜0．05)。腫瘤在生長和轉(zhuǎn)移過程中有粘附分子表達的改變，整合素β1亞基是一類重要的異型粘附分子，介導異種細胞間的粘附，參與細胞的信息傳導，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液(1200-1800mg／kg)可使整合素β1亞基的量下降(P＜0．05)；E-鈣粘素是同型粘附分子，參與同種細胞間的粘附，腫瘤轉(zhuǎn)移時原灶的E-鈣粘素表達會有明顯減少，而本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液1800mg／kg治療后，可增加組織中E-鈣粘素含量(P＜0．05)，且上述作用均與5-FU有協(xié)同作用。本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液劑量為100-400mg／kg時，對裸鼠接種人肝癌細胞株(Smmu7721)有一定的抑制作用，抑瘤率為51．8-83．5％。劑量為1000mg／kg時能抑制小鼠(前臂皮下接種HCP肝癌細胞)肝癌實體瘤的生長，抑制率達34％。裸鼠肝包膜接種高轉(zhuǎn)移性肝癌LCI-D20瘤塊后，早期肝癌組于16天切除肝癌，晚期肝癌組于22天切除肝癌，皮下注射本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液960mg／kg，早、晚期肝癌切除后肝臟切緣處局部復發(fā)腫瘤直徑均非常小于對照組(P＜0．01)，肝內(nèi)和累及臟器轉(zhuǎn)移灶數(shù)目也明顯減少(P＜0．05)，表明對LCI-D20裸鼠肝癌高轉(zhuǎn)移模型，早期和晚期肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移和復發(fā)有一定的防治作用。
離體試驗本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對體外培養(yǎng)的癌細胞有生長抑制、分化誘導作用。其中對人急性早幼粒白血病HL-60細胞作生長曲線和細胞形態(tài)學研究，發(fā)現(xiàn)有生長抑制作用，藥物作用6天后，呈量效關(guān)系，IC50為0．18mg／mL；劑量為1．2mg／mL時作用7天后，NBT細胞還原陽性百分率增多，大于50％的細胞由早幼粒向中晚期幼粒方向分化(而未用藥組分化率＜3％)，即細胞核縮小，偏向一邊，核漿比例減少，出現(xiàn)腎型核，顯示細胞已向晚幼粒成熟方向分化。濃度為5mg／mL以上可抑制MHCC97高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株的浸潤性；15mg／mL以上能抑制MHCC97對纖維連接蛋白的粘附能力，而該粘附是癌細胞侵襲的始動步驟。濃度為1mg／mL時，能明顯抑制人骨髓血癌細胞(HL-60)的生長，并能抑制該細胞中端粒酶的活性。以上均表明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液可能是一種細胞分化劑。對人肝癌細胞Smmu7721有抑制作用，其IC50及95％可信限為0．78mg／mL(0．72-0．83mg／mL)。對人肺癌細胞AGZY-83A的生長有抑制作用，呈量效關(guān)系，濃度為2．5mg／mL時抑制率約30％左右。
上述實驗結(jié)果與對比文獻提供的數(shù)據(jù)相比，抗癌活性明顯提高。
具體實驗內(nèi)容如下①尿多酸肽組合物對人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)離體和在體生長抑制以及誘導分化作用以臺盼蘭排染法觀察尿多酸肽組合物注射液對體外培養(yǎng)的HL-60細胞的生長抑制作用，并尋找其誘導細胞分化的濃度，以分化濃度的注射液尿多酸肽組合物注射液作用HL-60細胞7天后，再用Giemsa染色鏡檢。發(fā)現(xiàn)，＞50％的HL-60細胞由早幼粒向晚期幼粒方向分化，細胞的NBT還原反應陽性率明顯增多。分化的程度與藥物劑量有一定依賴性。
以腎囊膜下接種法進行體內(nèi)試驗，將體外培養(yǎng)的HL-60細胞接種于經(jīng)免疫抑制的昆明種小鼠腎囊膜下，腹腔注射尿多酸肽組合物注射液。試驗結(jié)果顯示，尿多酸肽組合物注射液對接種于小鼠腎囊膜下的HL-60細胞有顯著的生長抑制作用，劑量在640mg／kg時，抑制率達64％以上。
②本發(fā)明尿多酸肽組合物抗人原發(fā)性肝細胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的作用。
用裸鼠以瘤塊肝包膜下接種的方法，制備高轉(zhuǎn)移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20。接種后10天隨機分為4組，(對照組；尿多酸肽組合物低、中、高劑量組)。第11天腹腔注射給藥，連續(xù)給藥20天后處死，剝離腫瘤稱重，計算抑瘤率，并觀察腹腔轉(zhuǎn)移情況。
應用RT-PCR方法，半定量研究與肝癌相關(guān)的癌基因c-myc，N-ras，c-fos和c-jun的基因表達以及與侵襲相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9的基因表達。應用Western印跡及斑點免疫印跡法，檢測整合素β1和E-鈣粘素的表達。應用免疫組織化學的方法對肝癌組織的增殖性細胞核抗原PCNA Ki67及E-鈣粘素的表達進行半定量觀察。
應用與上述模型同源的MHCC97高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株，觀察本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對MHCC97粘附、侵潤和移動的抑制作用。試驗結(jié)果表明a．600-1800mg／kg的本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液，對裸鼠肝包膜下接種的高轉(zhuǎn)移性人肝癌裸鼠模型LCI-D20，有一定的抑瘤作用，抑瘤率約43％。
b．本發(fā)明尿多酸肽組合物高劑量組能抑制肝癌的腹腔轉(zhuǎn)移，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，腫瘤呈單個生長。
c．分子生物學研究表明，高劑量本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對上述肝癌組織中原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表達有明顯的下調(diào)作用(P＜0．01)。中劑量(M組)本發(fā)明尿多酸肽組合物僅能減少N-ras的表達(P＜0．05)。本發(fā)明尿多酸肽組合物能有效地下調(diào)MMP9基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄。
d．本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液使整合素β1亞基下降，且與5-FU有協(xié)同作用；使E-鈣粘素表達增加。且兩者均有統(tǒng)計學意義。
e．細胞學實驗結(jié)果表明，本發(fā)明尿多酸肽組合物在15mg／ml以上的劑量范圍內(nèi)能抑制MHCC97高轉(zhuǎn)移細胞株對纖維連接蛋白的粘附能力。在5mg／ml濃度以上可抑制MHCC97細胞株的浸潤能力，但對該細胞的運動無作用。
結(jié)論在高轉(zhuǎn)移性原發(fā)性肝癌LCI-D20中，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對實體瘤的生長有明顯抑制作用。在高劑量(1800mg／kg)作用時能減少腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)腫瘤呈單個生長(6／8)。分子生物學研究表明，本發(fā)明尿多酸肽組合物處理能下調(diào)c-myc、N-ras、c-fos和c-jun基因的表達，能明顯增加粘附分子E-鈣粘素的表達，部分抑制整合素β1亞基的表達。
③尿多酸肽組合物注射液離體試驗對人類血癌細胞的生長和端粒酶活性的抑制離體試驗表明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對人骨髓血癌細胞(HL-60)有抑制作用并呈量效關(guān)系；并且對該細胞中端粒酶的活性有抑制作用，效果隨時間的延長而加強。故認為本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液可能有促進細胞分化的作用。
④尿多酸肽組合物注射液離體和在體對人肝癌Smmu的藥效研究離體試驗證明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對人肝癌細胞Smmu7721有抑制作用，其IC50及95％可信限為0．78mg／ml(0．72-0．83mg／ml)。在體試驗表明，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液劑量為100-400mg／kg時，對裸鼠接種人肝癌細胞株的抑瘤率在51．8-83．5％，具有一定的抑制腫瘤生長的作用。
⑤尿多酸肽組合物注射液離體對肺癌細胞，在體對腹水性肝癌、肝癌實體瘤以及肺癌實體瘤的影響為了觀察本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液的抗腫瘤藥效，進行了如下4項試驗。離體試驗分為7組陰性(模擬處理)對照組；受試藥物5個濃度組；陽性(絲裂霉素)對照組。在體試驗都分為5組陰性對照組；受試藥物低、中、高三個劑量組；陽性對照組。①離體抗腫瘤作用試驗將AGZY-83A細胞在5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，表明受試藥物對人肺癌細胞的生長有抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。②在體延長腹水型肝癌動物生存期作用的試驗小鼠腹腔內(nèi)接種HCP肝癌細胞，受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，在一定劑量時能延長動物生存期(延長率24％左右)。③在體對抗動物肝癌實體瘤作用的試驗小鼠前臂皮下接種HCP肝癌細胞，受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，在3種劑量時都能抑制腫瘤生長，抑制率平均可達29％左右，高劑量組可達34．5％(P＜0．05)；而絲裂霉素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質(zhì)量明顯惡化。④在體對抗動物肺癌實體瘤作用的試驗受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，3種劑量都能抑制腫瘤的生長，有量效關(guān)系，中高劑量組抑制率平均可達20％左右；而絲裂霉素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質(zhì)量明顯惡化，約1／3動物在試驗終止日期前死亡。
結(jié)果證明受試藥物有一定的抗腫瘤效果，且作用性質(zhì)與絲裂霉素不同，前者改善而后者惡化動物生活質(zhì)量。
⑥尿多酸肽組合物注射液防治裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的療效觀察采用如下方法證明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對裸鼠早期和晚期肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移復發(fā)有防治作用裸鼠肝癌高移模型腫瘤接種后，于轉(zhuǎn)移發(fā)生前后分別進行肝癌切除術(shù)，術(shù)后皮下注射本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液(1200mg／kg)。腫瘤接種后35天處死動物，記錄動物體重、切緣復發(fā)、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果證明①晚期肝癌切除后，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液組動物體重較高，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生減少，肝濕重降低，切緣局部復發(fā)腫瘤也較小，反映遠處轉(zhuǎn)移的肺轉(zhuǎn)移灶和轉(zhuǎn)移累及的臟器數(shù)目也減少；②早期肝癌切除后，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液組動物肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶和轉(zhuǎn)移累及臟器數(shù)目也減少，無肺內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生。
⑦尿多酸肽組合物注射液逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥性的研究用離體試驗方法，觀察到不同劑量的本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液能有效地增加VCR對KBV200耐藥性細胞的抑制作用，使KBV200耐用藥細胞對VCR敏感性提高16倍。但本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液并未引起KBV200耐藥細胞中MDR1基因表達發(fā)生明顯變化，也未誘導出MRP和GST-π基因表達。進一步研究表明，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液均可使敏感H23和耐藥H1435細胞中MDR1和GST-π基因的表達隨者本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液劑量增加而減弱或消失，均未誘導出MRP基因表達。提示本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對KBV200和H1435耐藥細胞均有不同程度的逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用，而對KBV200耐藥作用可能涉及P-gp以外逆轉(zhuǎn)耐藥途徑。
⑧毒理研究急性毒性試驗給小鼠和大鼠靜脈推注或腹腔注射最大容積的本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液都不能使動物致死，不能測得系列的LD值。根據(jù)最大耐受量試驗，認為本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對小鼠iv或ip的LD50＞50ml／kg(相當2000mg／kg)。對大鼠iv或ip的LD50＞30ml／kg(相當1200mg／kg)。給小鼠iv濃縮受試物，測得LD50及其95％可信限為3794mg／kg(3165~4547mg／kg)。
長期毒性試驗共用大鼠和狗二種動物進行了實驗，結(jié)果表明無論大鼠和狗經(jīng)過6個月的用藥，給藥組與模擬處理對照組相比較，各項觀察指標皆無有意義的差別。說明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液在該種劑量連用6個月的情況下是安全的，無蓄積毒性，未發(fā)現(xiàn)任何對機體有害的影響。
一般藥理試驗所進行的實驗表明，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液小劑量對貓和大鼠血壓無明顯影響；中、大劑量是貓和大鼠血壓輕度和中等度下降，均為一過性。小、中、大劑量對貓心率無明顯影響；中、大劑量使大鼠心率輕度減慢，但無統(tǒng)計學意義。除大劑量使貓和大鼠7例中各1例出現(xiàn)一過性節(jié)律不齊外，其余無心電和心律改變。小劑量對貓和大鼠呼吸頻度和幅度無明顯影響；中劑量使呼吸頻度和幅度輕度增大。小、中、大劑量對貓和大鼠精神神經(jīng)系統(tǒng)各有關(guān)指標無影響。
特殊毒性試驗用微生物回復突變、微核、精子畸形和致畸4項試驗進行了安全性評價。實驗結(jié)果表明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液無致突變、致畸和生殖毒性作用。提示本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液應用在臨床上是安全的。
4．尿多酸肽組合物的藥理分析尿多酸肽組合物治療和預防癌癥的主要有效成分包括分化誘導劑，分化幫助劑和抗惡病質(zhì)劑。
(1)分化誘導劑分化誘導劑是尿多酸肽組合物最重要的有效成分，但含量很少，化學結(jié)構(gòu)也還沒有完全清楚。主要的分化誘導物質(zhì)是與色素結(jié)合的有色肽和一特殊的有機酸。這兩種分化誘導成分和oligoisoadenylate一樣針對異常的癌蛋白質(zhì)使其消失作用，將導常甲基轉(zhuǎn)移復合酶改變成為正常酶，結(jié)果癌細胞就通過缺甲基核酸的合成進行終末分化而停止分裂或產(chǎn)生凋亡。正常細胞的生長和功能則不受尿分化誘導劑的干擾，因為正常細胞沒有異常的癌因子，因此這種分化誘導劑是具有很高選擇性的抗癌物質(zhì)。
從酶的研究角度看，異常的甲基轉(zhuǎn)移復合酶轉(zhuǎn)變成正常酶是誘導癌細胞進行終末分化的一個轉(zhuǎn)折點。分析細胞內(nèi)AdoMet和AdoHcy的量也證明酶的變化在癌細胞分化中所起的重要作用。癌細胞的AdoMet量遠比正常細胞為高，因為癌細胞的MATLT比正常細胞的MATLKm嵩出許多。癌細胞一旦分化變成終末細胞，AdoMet和AdoHcy的量也減低很多，也可以說明MATLT和SAHHLT失去致癌因素而變成MATLT和SAHHLT，這些結(jié)果從另一角度也證明我們的發(fā)現(xiàn)是正確的。
(2)分化幫助劑尿多酸肽組合物的主要化學成分之一是分化幫助劑，分化幫助劑是甲基轉(zhuǎn)移復合酶各成員酶的抑制劑，這些抑制劑的量高到可以明顯地抑制各成員酶時也有很好的分化誘導作用，但是因為病因，即異常的癌蛋白因子沒有除去，分化是可逆性的，要單獨用這類制劑達到抗癌作用不可能，所以我們要強調(diào)協(xié)助的功能。在劑量不大時，對癌細胞的分裂和分化并沒有產(chǎn)生明顯的作用，這種劑量卻有增強分化誘導劑消除異常癌因子的功能，因此我們把這種化合物命名為分化幫助劑。尿多酸肽組合物中MAT的競爭性抑制劑有苯乙酸、吲哚乙酸和馬尿酸，MT的抑制劑則有尿赤素和維生素B2。MA物抑制劑需要mM的劑量才有明顯的促進作用，MT的抑制劑只需數(shù)μM的劑量就有相同的促進作用，所以MT的抑制劑有比較好的分化協(xié)助活性。
分化幫助劑雖然名為協(xié)助，其實在分化療法中是不可或缺的角色。癌細胞用單一的分化誘導劑時總有一小部分細胸，5-10％左右，不能被誘導分化。很可能是在細胞分裂時期某些細胞特別容易受到分化誘導劑的傷害而停頓下來。分化的程序需要經(jīng)過兩個分裂周期，如果細胞受到傷害不能完成兩個周期分裂，就不能完成終末分化，因此會有少數(shù)沒有分化的細胞。造成細胞的傷害是分化誘導劑引起的，當甲基轉(zhuǎn)移復合酶分化誘導劑修正去掉癌蛋白質(zhì)因子，復合酶會分解成單獨成員酶，它們有分解核酸的活性從而造成傷害，經(jīng)過一段長時間的停頓和修復，癌細胞又恢復原狀。這是臨床應用單個分化誘導劑所面臨的問題，維甲酸對急性早幼粒細胞白血病有良好的療效，但緩解期只能維持數(shù)月就又復發(fā)，復發(fā)是因為有少數(shù)的癌細胞沒有完全分化造成的。如果分化是在有分化幫助劑的存在下地行，不管是MAT或MT的抑制劑，則癌細胞的分化可以達到百分之百。分化幫助劑一方面可以促進分化，另一方面又可以防止分化誘導劑引起的細胞傷害使分化順利完成，復發(fā)就可以明顯減低；可以減低分化誘導劑的需求量；單用分化幫助劑也有效果，苯乙酸對星形腦瘤的治療已經(jīng)肯定。腦局部比較特殊，內(nèi)在的分化誘導成分消失，所以用分化幫助劑療效顯著。
(3)尿多酸肽組合物與天然化學監(jiān)察尿中的細胞分化誘導劑和分化幫助劑是人體細胞的低分子代謝產(chǎn)物，既然人體內(nèi)有天然的抗癌物質(zhì)，為什么會有癌癥發(fā)生？我們發(fā)現(xiàn)癌癥病人絕大多數(shù)從尿排泄多于正常人的低分子量代謝物質(zhì)，持久的過量排泄造成體內(nèi)缺乏抗癌物質(zhì)，因而無法抑制細胞的增殖，終于出現(xiàn)床癥狀，越嚴重的病人缺失越厲害。這是一種惡性循環(huán)，到后來完全失去監(jiān)控能力，這時癌細胞可以毫不受約束地繁殖下去。異常的甲基轉(zhuǎn)移復合酶是一個很重要的因素，但是天然化學監(jiān)控能力的破壞也是一個很重要的因素。所以要有效的克服癌癥必須要同時顧及這兩個因素，即要抑制異常的甲基轉(zhuǎn)移復合酶，也要減低病人過度排泄天然抗癌化學物質(zhì)，這樣才會收到事半功倍的效果。從尿精制的抗癌制劑--尿多酸肽組合物，能兼顧到這兩個因素，病人過量排泄低分子代謝物慢慢減少，等到病情好轉(zhuǎn)也就恢復到正常的狀態(tài)。
病人之所以排泄過量小分子量代謝物質(zhì)可能是炎癥的結(jié)果，有發(fā)炎的癥狀就有過度排泄的現(xiàn)象。發(fā)炎的結(jié)果促使巨噬細胞產(chǎn)生惡病質(zhì)素(cachectin)，惡病質(zhì)素的生理作用導致病人過度排泄。急性發(fā)炎因為很快恢復正常，對癌癥的形成沒有很大關(guān)系。慢性發(fā)炎持久的影響才會促成癌癥，愛滋病人及B型肝炎病人到后來往往會發(fā)生癌癥的原因也與此有關(guān)。癌細胞本身也構(gòu)成慢性炎癥的病源，癌細胞越繁殖，發(fā)炎的現(xiàn)象越嚴重，過度的排泄也越明顯。有效地控制過度排泄對癌癥的治療是一個很重要的課題。細胞毒藥物本身會促進過度排泄，對天然化學監(jiān)察沒有保護反而有破壞作用，不難想像細胞毒療法的成功需要依賴所有癌細胞消除干凈，否則病人經(jīng)長期細胞毒藥物的破壞，沒有自衛(wèi)能力去抑制殘余的癌細胞。相反的，從尿精制的抗癌制劑中有些成分可以改善癌癥人的過度排泄，病人的天然化學監(jiān)察能力恢復后，就可依賴本身的自衛(wèi)能力來消除殘余的癌細胞，不用清除所有的癌細胞即可痊愈。這種尿抗癌制劑中的苯乙酰谷氨酰胺就有改善癌癥病人過度排泄的功能，雖然這個化合物本身對異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶沒有作用，對癌細胞也沒有直接抑制作用，但是由于能夠防止過度排泄抗癌物質(zhì)，保護天然化學監(jiān)察能力，對癥狀較輕的癌癥病人也有醫(yī)療效果，同時對動物的癌變有顯著的預防作用。動物細胞的癌變過程在細胞培養(yǎng)中比在動物體內(nèi)容易進行，因為動物有天然的化學監(jiān)察能力，要一段很長的促進時期去除這種自衛(wèi)能力，癌細胞才能繁殖起來。一般來說，像巴豆油這種發(fā)炎促進物質(zhì)可以縮短促進期，苯乙酰谷氨酰胺可以保護化學監(jiān)察的能力則可預防癌癥的發(fā)生。
(4)分化療法的其它優(yōu)點癌基因和抑癌基因大多是細胞分裂的調(diào)節(jié)基因，一旦癌細胞分化了，癌基因的表達會下降，而抑癌基因的表達會上升，這是分化的結(jié)果。但是有些和細胞分裂以及分化沒有直接關(guān)系，而和癌細胞惡變有關(guān)聯(lián)的因素也會隨著癌細胞的分化而消失，例如端粒酶(telomerase)是促成癌細胞持續(xù)分裂的因子，在癌細胞分化后自然消失，我們發(fā)現(xiàn)癌細胞經(jīng)過尿多酸肽組合物處理后也會導致telomerase消失。抑制細胞凋亡的熱休克蛋白質(zhì)或bcl-2也會隨著癌細胞的分化而消失。擴增出來的基因也會因癌細胞分化而消失，包括擴增的myc基因，擴增的多藥耐藥基因。最重要的是癌細胞轉(zhuǎn)移能力的消失，研究顯示尿多酸肽組合物能有效地抑制肝癌的肝內(nèi)以及肺轉(zhuǎn)移。以上實驗充分地說明癌細胞一旦分化成終末細胞就已不再是癌細胞，癌細胞本來具有的種種特性都會隨著細胞的分化而消失，所以已經(jīng)分化的癌細胞即使沒有凋亡，對病人已不再構(gòu)成威脅。
(5)細胞的分化與凋亡正常的干細胞如果缺乏生長素就會凋亡，不過一旦變成終末分化的細胞就不再受缺乏生長素的影響；同樣固醇激素的靶干細胞如果缺乏固醇激素也會導致細胞的凋亡；癌細胞如果甲基轉(zhuǎn)移復合酶的成員酶受到干擾或抑制也會促成細胞的凋亡。這些結(jié)果很強地暗示甲基轉(zhuǎn)移復合酶和細胞的凋亡有直接的關(guān)系，如果甲基轉(zhuǎn)移復合酶能夠維持復合酶的狀態(tài)細胞不會凋亡，否則細胞就會凋亡，所以細胞的凋亡和甲基轉(zhuǎn)移復合酶以及單酶的互變有密切的關(guān)系。我們的觀察顯示核小體的rRNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性和RNA分解酶的活性正好成的比的關(guān)系，很有可能甲基轉(zhuǎn)移酶在復合酶中的主要功能是甲基轉(zhuǎn)移，一旦分解成單獨酶時就轉(zhuǎn)變成核酸分解酶，這正好說明為什么oligoisoadenglate有很強的誘導核酸分解酶的活性，核酸分解酶強烈表現(xiàn)的結(jié)果會中止細胞的分裂而導致細胞的凋亡。這種甲基轉(zhuǎn)移酶與核酸分解酶的互變關(guān)系就像微生物DNA甲基轉(zhuǎn)移酶與DNA核酸分解酶同是一個酶，但有兩種不同的活性一樣。
細胞分化誘導劑抑制異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶的結(jié)果，會促成癌細胞的分化，也會促成癌細胞的凋亡，因此有些癌細胞分化之后即自行凋亡。我們的實驗數(shù)據(jù)也顯示HL-60癌細胞經(jīng)尿多酸肽組合物處理后，時間一久分化的細胞數(shù)會減低，而凋亡的細胞數(shù)則在增加。雖然有些癌細胞有分化后即自行凋亡的因果關(guān)系，但這種關(guān)系并不是必然的，因為控制細胞分化和細胞凋亡的因素畢竟不同?？刂瓢┘毎姆只惓５募谆D(zhuǎn)移復合酶是最重要的因素，只要抑制這種酶，癌細胞一定會分化，可是決定細胞凋亡的因素很多，線粒體膜的變化、自殺基因的表達、蛋白質(zhì)合成、新蛋白酶的出現(xiàn)、DNA的分解，以及抗凋亡的成分的多寡等等。所以分化和凋亡不是必然的因果關(guān)系，有些癌細胞向正常細胞分化后反而更不容易凋亡。
(6)尿多酸肽組合物作為輔助療法分化療法的缺點是不一定能使腫瘤很快地消失。細胞毒化和放療主要在促進癌細胞的凋亡，所以腫瘤的縮小較明顯，可以用來彌補分化療法的不足。而這種療法因為沒有控制異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶而引起的嚴重后果，則可以用尿多酸肽組合物來補救。我們發(fā)現(xiàn)由于細胞毒藥物引起的DNA過度甲基化，如果有細胞分化誘導劑時就不會發(fā)生，所以尿多酸肽組合物可以防止化療因DNA過度甲基化引起的嚴重后果。不但如此，尿多酸肽組合物甚至可以增進放療和化療的效果，因為癌細胞對這兩種療法的抵抗性往往是因為癌基因或抗凋亡因素的表達過多，而這些因素會因癌細胞的分化而降低，因此分化的結(jié)果會增加放療和細胞毒化療的敏感度。實驗已證明本來對放療有抵抗性的癌細胞經(jīng)分化誘導劑處理后會變成對放療敏感，同樣也可以增加對化療的敏感。尿多酸肽組合物在臨終病人臨床應用的結(jié)果也證明可以顯著增加化的療效，并且減輕副作用，提高病人的生活質(zhì)量。尿多酸肽組合物有明顯抑制癌細胞轉(zhuǎn)移的作用，本身又沒有毒性，無疑是手術(shù)后防止復發(fā)的理想藥物。
(7)分化療法的效果分化療法還處在萌芽階段，Burzynski用尿抗癌制劑抗瘤酮A10醫(yī)治晚期的癌癥病人，有40-60％的病人達到50％以上或全部腫瘤消失，其中三分之一超出五年而無復發(fā)，這類藥物最大的優(yōu)點是沒有副作用。
甲基轉(zhuǎn)移復合酶是由MAT、MT和SAHH結(jié)合組成。有生長素時復合酶的活性提高，核糖體的產(chǎn)生和DNA甲基分布的復制主可以順利進行，細胞乃得以在分裂周期運轉(zhuǎn)。一旦生長素不復存在，甲基轉(zhuǎn)移復合酶率先失去活性，而核酸合成酶的活性仍相當穩(wěn)定，這時細胞會合成缺甲基的核酸，細胞從而由分裂轉(zhuǎn)入分化，核糖體不再產(chǎn)生，分化基因得以表達，這樣細胞就分化成終末細胞而停止分裂。
癌細胞產(chǎn)生特異的蛋白質(zhì)因子與MAT和SAHH結(jié)合在一起，這種異常的癌因子使復合酶維持在活性很高的穩(wěn)定狀態(tài)，因此癌細胞無法進行終末分化而停留在分裂周期運轉(zhuǎn)不息，癌細胞需要外來的抑制因素，如尿多酸肽組合物將異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶的癌因子抵消掉，那么癌細胞就會像正常細胞進行終末分化。
綜上所述，尿多酸肽組合物是由新鮮人尿經(jīng)科學提煉精制而成的抗癌物質(zhì)，有效成分包括分化誘導劑、分化幫助劑和抗惡病質(zhì)劑，分化誘導劑是異常甲基轉(zhuǎn)移復合酶的特殊對抗劑；分化幫助劑是甲基轉(zhuǎn)移復合酶各成員酶之抑制劑，有很強的增進分化誘導劑的誘導作用；抗過多排泄劑則能恢復病人的化學監(jiān)察協(xié)能，本發(fā)明的尿多酸肽組合物綜合了分化療法的各種藥物，通過其協(xié)同作用，大大提高了對癌癥的治愈效果。
本發(fā)明從人尿中經(jīng)提取和純化等現(xiàn)代手段，制得含一定比例的肽、氨基酸衍生物、有機酸及無機微量元素的混合物質(zhì)，系統(tǒng)進行了理化、藥效、藥理、毒理等系統(tǒng)研究，該制劑對腫瘤有分化誘導、分化幫助和抗過多排泄的協(xié)同作用，且毒性低，能促進癌細胞走向正常分化或使癌細胞凋亡，作為新型的抗腫瘤藥物，在臨床上可用于多種晚期惡性腫瘤的治療，實驗結(jié)果表明該藥物對多種腫瘤有治療效果且無毒性，具有很高選擇性，可為癌癥病人帶來福音。
下面結(jié)合附圖和實施例詳細描述本發(fā)明藥物的制備方法、藥物組合物及藥物組合物的藥理及毒理性附圖簡要說明圖1為尿多酸肽的制備工藝流程2為供試品溶液的色譜3尿多酸肽組合物溶液離體對肺癌細胞影響的測試組、及陰、陽性3個組的肺癌細胞生長曲線圖4為馬尿酸對照樣品的HPLC譜5為苯乙酰谷氨酰胺對照樣品的HPLC譜6為苯乙酸對照樣品的HPLC譜7為吲哚乙酸對照樣品的HPLC譜8為四種有機酸對照樣品的HPLC譜9為尿多酸肽組合物溶液(批號980906)有機酸的HPLC譜10為尿多酸肽組合物溶液(批號980907)有機酸的HPLC譜11為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)有機酸的HPLC譜12為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)馬尿酸確證的HPLC譜13為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)苯乙酰谷氨酰胺確證的HPLC譜14為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)苯乙酸確證的HPLC譜15為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)吲哚乙酸確證的HPLC譜16為17種氨基酸國家標準品的HPLC譜17為尿多酸肽組合物溶液(批號980906)游離氨基酸的HPLC分析譜18為尿多酸肽組合物溶液(批號980907)游離氨基酸的HPLC分析譜19為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)游離氨基酸的HPLC分析譜20為尿多酸肽組合物溶液(批號980906)水解氨基酸的HPLC分析譜21為尿多酸肽組合物溶液(批號980907)水解氨基酸的HPLC分析譜22為尿多酸肽組合物溶液(批號980908)水解氨基酸的HPLC分析譜23為肽標樣分子量測定的HPLC譜24為分子量測定的標準曲線圖25尿多酸肽組合物溶液(批號980906)分子量測定的HPLC譜26尿多酸肽組合物溶液(批號980907)分子量測定的HPLC譜27尿多酸肽組合物溶液(批號980908)分子量測定的HPLC譜28尿多酸肽組合物溶液(980906)肽成分分析HPLC色譜29尿多酸肽組合物溶液(980907)肽成分分析HPLC譜30尿多酸肽組合物溶液(980908)肽成分分析HPLC譜31尿多酸肽組合物溶液對體外培養(yǎng)的HL-60細胞生長抑制作用圖32尿多酸肽組合物溶液(1．2mg／ml)作用6天對HL-60細胞生長抑制作用圖33對照組作用體外培養(yǎng)的HL-60細胞7天后的顯微攝影照片圖34本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液(1．2mg／ml)作用體外培養(yǎng)的HL-60細胞7天后的顯微攝影照片圖35RA(1μg／ml)作用體外培養(yǎng)的HL-60細胞7天后的顯微攝影照片圖36腹腔注射尿多酸肽組合物溶液對小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的生長抑制作用圖37尿多酸肽組合物溶液作用于小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的作用7天后切片，HE染色的顯微攝影照片--對照組圖38尿多酸肽組合物溶液作用于小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的作用7天后切片，HE染色的顯微攝影照片圖39維甲酸陽性對照組作用于小鼠腎囊膜下生長的HL-60細胞的作用7天后切片，HE染色的顯微攝影照片圖40尿多酸肽組合物溶液對肝癌組織中原癌基因表達的影響圖41尿多酸肽組合物溶液對肝癌組織的MMP-9基因表達的影響圖42尿多酸肽組合物溶液對肝癌組織的整合素β1亞基和E-鈣粘素含量的影響圖43尿多酸肽組合物溶液對MHCC97肝癌細胞株的體外浸潤的抑制圖44尿多酸肽組合物溶液對人原發(fā)性肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20生長的抑制作用AC組(上圖)L組(下圖)圖45尿多酸肽組合物溶液對人原發(fā)性肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20生長的抑制作用BM組(上圖)H組(下圖)圖46尿多酸肽組合物溶液對人肝細胞肝癌LCI-D20基因影響A．RNA的鑒定(甲醛變性凝膠電泳)(上左)B．尿多酸肽組合物對人肝細胞肝癌LCI-D20 MMP-9基因影響(RT-PCR)(上右)C．尿多酸肽組合物對人肝細胞肝癌LCI-D20原癌基因影響(RT-PCR)(下中)圖47免疫組織化學檢測人肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中E-鈣粘素的表達A．肝細胞膜E-鈣粘素表達陽性(上)B．正常肝細胞中E-鈣粘素表達強陽性(×100)(+++)(下)圖48免疫組織化學檢測人肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中E-鈣粘素表達陽性增多(X100)(++)圖49免疫組織化學檢測人肝細胞肝癌裸鼠模型LCI-D20中Ki67的表達A．尿多酸肽組合物處理組肝癌組織中Ki67的表達(×100)(+)(A)B．尿多酸肽組合物處理組肝癌組織中Ki67的表達(×100)(++)(B)C．尿多酸肽組合物處理組肝癌組織中Ki67的表達(×100)(+++)(C)圖50生長于無尿多酸肽組合物和尿多酸肽組合物在劑量為1和2mg／ml時血癌細胞(HL-60cells)的生長曲線圖51以劑量1或2mg／ml的尿多酸肽組合物溶液測試2，4和6天后與對照組相比，血癌細胞(HL-60cells)的增殖(細胞生存率(％))的測試圖52血癌細胞在對照和兩個尿多酸肽組合物劑量下的相關(guān)的端粒酶活性圖53生長于有、無尿多酸肽組合物溶液的血癌細胞(HL-60cells)的相關(guān)端粒酶活性。
圖54尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的CTX陽性對照組瘤的外觀圖55尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的生理鹽水陰性對照組瘤的外觀圖56尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的高劑量組瘤的外觀圖57尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的中劑量組瘤的外觀圖58尿多酸肽組合物溶液在體對人肝癌Smmu藥效研究的低劑量組瘤的外觀圖59尿多酸肽組合物溶液離體對肺癌細胞影響的測試組、及陰、陽性3個組的肺癌細胞生長曲線實施例一．尿多酸肽的制備將1mol／L鹽酸溶液約450ml加入20kg新鮮尿液中，調(diào)節(jié)至pH值約為3；過濾后，收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開始納濾，控制壓力5Mpa，流速800ml／分鐘，收集分子量低于10000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將C18硅膠5kg，用乙醇15L浸泡5分鐘，裝入袋中放置于漏斗狀塑桶內(nèi)，制成吸附柱，柱截面積0．018m2，用去離子水洗去乙醇，再依次用15升乙醇及25升去離子水洗滌C18硅膠各一次；然后將低分子量濾液以2L／分鐘的流速加入柱中；加完后，先用25L蒸餾水以0．5L／分鐘的流速洗滌C18硅膠柱；再用10L乙醇以3L／分鐘的流速加入C18硅膠柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空干燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為30℃，直到溶劑基本蒸發(fā)掉；冷凍干燥，得到尿多酸肽組合物干品。
以蒸餾水20L溶解干燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)尿多酸肽粗品的pH值到6．0后；將粗品在1℃的低溫庫中放置80小時；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的0．18％左右(體積比)，經(jīng)細胞內(nèi)毒素檢測合格。
尿多酸肽干粉可以復合其它添加劑制成口服片劑或膠囊，尿多酸肽溶液可以制成口服液，也可以制成注射液。
實施例二．尿多酸肽的制備將1mol／L鹽酸溶液約500ml加入20kg新鮮尿液中，調(diào)節(jié)至pH值約為2；過濾后收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為1Mpa，流速900ml／分鐘，收集分子量低于10000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-8硅膠10kg，用乙醇25L浸泡20分鐘，裝入袋中放置于塑桶內(nèi)，制成吸附柱，用去離子水洗去乙醇，再依次用25升乙醇及20升去離子水洗滌XAD-8硅膠各一次；然后將低分子量濾液以1．5L／分鐘的流速加入柱中；加完后，先用20L蒸餾水以3L／分鐘的流速洗滌XAD-8柱；再用15L乙醇以1．0L／分鐘的流速加入XAD-8柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空干燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為70℃，蒸發(fā)掉部分溶劑后；得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)尿多酸肽粗品的pH值到8．0后；將粗品在10℃的低溫庫中放置160小時；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，再通過真空干燥，得到尿多酸肽組合物干品。
回收率為投料量的0．8％左右(體積比)，經(jīng)細胞內(nèi)毒素檢測合格。
實施例三．尿多酸肽的制備將1mol／L鹽酸溶液約520ml加入20kg新鮮尿液中，調(diào)節(jié)至pH值約為1．2；過濾后收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為2Mpa，流速1200ml／分鐘，收集分子量低于10000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-7硅膠15kg，用乙醇20L浸泡10分鐘，裝入袋中放置于漏斗狀塑桶內(nèi)，制成吸附柱，用去離子水洗去乙醇，再依次用20升乙醇及15升去離子水洗滌XAD-7各一次；然后將低分子量濾液以1．0L／分鐘的流速加入柱中；加完后，先用15L蒸餾水以1．5L／分鐘的流速洗滌XAD-7柱；再用15L乙醇以0．5L／分鐘的流速加入XAD-7柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空干燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為80℃，直到蒸發(fā)掉溶劑；冷凍干燥，得到尿多酸肽組合物干品。
以蒸餾水20L溶解干燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)尿多酸肽粗品的pH值到7．4后；將粗品在5℃的低溫庫中放置120小時；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的2．5％左右(體積比)，經(jīng)細胞內(nèi)毒素檢測合格。
實施例四．尿多酸肽的制備將1mol／L鹽酸溶液約510ml加入20kg新鮮尿液中，調(diào)節(jié)至pH值約為1．5；過濾后收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為1．5Mpa，流速1000ml／分鐘，收集分子量低于9000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-16 12kg，用甲醇22L浸泡23分鐘，裝入尼龍袋中放置于漏斗狀塑桶內(nèi)，制成吸附柱，柱截面積0．022m2，用去離子水洗去甲醇，再依次用17升乙醇及23升去離子水洗滌XAD-16各一次；然后將低分子量濾液以0．5L／分鐘的流速加入柱中；加完后，先用22L蒸餾水以1．2L／分鐘的流速洗滌XAD-16柱；再用20L甲醇以2L／分鐘的流速加入XAD-16柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空干燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為65℃，直到蒸發(fā)掉溶劑；冷凍干燥，得到尿多酸肽組合物干品。
以蒸餾水20L溶解干燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)尿多酸肽粗品的pH值到7．0后；將粗品在5℃的低溫庫中放置110小時；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液；用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的3．2％左右(體積比)，經(jīng)細胞內(nèi)毒素檢測合格后包裝為成品。
實施例五．尿多酸肽的制備將1mol／L鹽酸溶液約490ml加入20kg新鮮尿液中，調(diào)節(jié)至pH值約為2．5；過濾后收集尿液。
用超濾設備超濾在超濾設備中加入去離子水，洗泡超濾膜；將收集尿液倒入加料桶中，開啟進料泵，開始納濾，控制壓力為2．5Mpa，流速1100ml／分鐘，收集分子量低于9000的低分子濾液，棄去高分子量濾液。
將XAD-16硅膠20kg，用乙醇17L浸泡8分鐘，裝入尼龍袋中放置于漏斗狀塑桶內(nèi)，制成吸附柱，柱截面積0．010m2，用去離子水洗去乙醇，再依次用22升乙醇及18升去離子水洗滌XAD-16各一次；然后將低分子量濾液以0．7L／分鐘的流速加入柱中；加完后，先用18L蒸餾水以1．2L／分鐘的流速洗滌XAD16柱；再用8L乙醇以0．8L／分鐘的流速加入XAD-16柱中，使被吸附的有效成分解吸附，收集有色部分為有效洗脫液；將收集的有效洗脫液加入真空干燥機，緩慢加熱升溫，控制料液溫度為60℃，直到蒸發(fā)掉溶劑；冷凍干燥，得到尿多酸肽組合物干品。
以蒸餾水20L溶解干燥殘留物，即得尿多酸肽粗品溶液；用2mol／L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)尿多酸肽粗品的pH值到7．0后；將粗品在5℃的低溫庫中放置100小時；取靜置處理后的粗品上層液，在100000級潔凈室內(nèi)，用微孔濾紙過濾，收集濾液，即得尿多酸肽溶液。
用一萬分子量的超濾膜超濾，以除去熱源，再經(jīng)PALL公司Ultipor VFTMDV50除病毒過濾器過濾除病毒，回收率為投料量的3．9％左右(體積比)，經(jīng)細胞內(nèi)毒素檢測合格后包裝為成品。
實施例六．尿多酸肽組合物的理化常數(shù)分別稱取尿多酸肽組合物干粉約0．4g各四份，加入10ml去離子水，得到尿多酸肽組合物溶液，批號分別為980905、980906、980907、980908、980909每份的固含量見下表；
分別取樣測試如下1．性狀與溶液的顏色本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液五批供試品(批號980905、980906、980907、980908、980909)外觀均呈淺黃色、棕色至深棕色澄明液體。
2．不溶性微粒檢查按中國藥典1995年版二部附錄IX C檢驗，本品均符合規(guī)定。
3．pH值按中國藥典1995年版二部附錄Ⅵ H檢查，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液的pH值為
4．熾灼殘渣按中國藥典1995年版二部附錄Ⅷ N檢查，本品的熾灼殘渣為
依結(jié)果熾灼殘渣定為不得超過2．0％(w／v)。
5．含氮量按中國藥典1995年版附錄Ⅶ D半微量法檢驗，精密量取本品1ml測定，測定含氮量為
依結(jié)果含氮量不得低于2．0mg／ml。
6．元素測定方法原子吸收分光光度法測定結(jié)果如下所示(單位μg／ml)
實施例七．尿多酸肽組合物中有機酸結(jié)構(gòu)的確認用HPLC分析確認本發(fā)明的藥物組合物中主要含有四種有機酸馬尿酸、苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸和吲哚乙酸，并測定了含量。
供試品尿多酸肽組合物，批號980908(固含量0．0405mg／ml)；參照標樣購于Sigma公司的純品，馬尿酸，苯乙酰谷氨酰胺、苯乙酸、吲哚乙酸；方法HPLC法儀器及色譜條件Waters510高效液相色譜儀，481型檢測器，U6K手動進樣器，島津C-6RA積分儀柱ZORBAX 300SB-C18 4．6×150mm 5μ流動相甲醇∶水(15∶85)0．5％乙酸流速0．6ml／min柱溫35℃檢測波長260nm對照品溶液的配制分別稱取馬尿酸、苯乙酸、苯乙酰谷氨酰胺、吲哚乙酸適量，用0．4M氫氧化鈉溶液溶解并配成以下濃度的對照品溶液馬尿酸6．559mg／ml，苯乙酰谷氨酰胺7．576mg／ml，苯乙酸4．09mg／ml、吲哚乙酸0．214mg／ml。
分別經(jīng)0．45μm薄膜過濾，取各濾過液1μl(苯乙酰谷氨酰胺取5μl)，記錄相應的色譜圖，特征峰為馬尿酸Rt=5．9；苯乙酰谷氨酰胺Rt1=6．3，Rt2=7．117；苯乙酸Rt=11．467；吲哚乙酸Rt=13．98，見附圖4-7。
供試品溶液制備取供試品適量，經(jīng)0．45μm薄膜過濾，以濾過液作為供試品溶液，進樣1μl，記錄相應的色譜圖見圖2。
確證溶液的制備分別取苯乙酸、吲哚乙酸、馬尿酸、苯乙酰谷氨酰胺溶液對照品溶液，與供試品溶液適量混合，經(jīng)0．45μm薄膜過濾，濾過液作為加入對照品的供試液(確證溶液)。分別進樣2μl，記錄相應的色譜圖，并與樣品有機酸分析圖譜比較。
馬尿酸的確證(見附圖12)通過與馬尿酸譜圖比較，可以看出加入馬尿酸后的供試品色譜圖中，除Rt=6．1的峰面積比未加馬尿酸的樣品譜圖中相應位置(Rt=5．933)的峰面積明顯增大外，其余各峰峰面積基本一致，從而確證樣品色譜圖中9#峰(Rt=5．933)即為馬尿酸。
苯乙酰谷氨酰胺的確證(見附圖13)通過與苯乙酰谷氨酰胺譜圖比較，可以看出加入苯乙酰谷氨酰胺后的供試品色譜圖中，除Rt=6．398的峰面積比未加苯乙酰谷氨酰胺的樣品譜圖中相應位置(Rt=6．383)的峰面積明顯增大外，其余各峰峰面積基本一致，從而確證尿多酸肽樣品色譜圖中10#峰(Rt=6．383)即為苯乙酰谷氨酰胺。
苯乙酸的確證(見附圖14)通過與苯乙酸譜圖比較，可以看出加入苯乙酸后的供試品色譜圖中，除Rt=11．833的峰面積比未加苯乙酸的樣品譜圖中相應位置(Rt=11．333)的峰面積明顯增大外，其余各峰峰面積基本一致，從而確證樣品色譜圖中19#峰(Rt=11．333)即為苯乙酸。
吲哚乙酸的確證(見附圖15)通過與吲哚乙酸譜圖比較，可以看出加入吲哚乙酸后的供試品色譜圖中，除Rt=13．767的峰面積比未加吲哚乙酸的樣品譜圖中相應位置(Rt=13．733)的峰面積明顯增大外，其余各峰峰面積基本一致，從而確證樣品色譜圖中22#峰(Rt=11．733)即為吲哚乙酸。
實施例八．尿多酸肽組合物中有機酸含量的確定儀器、色譜條件儀器Waters510高效液相色譜儀柱ZORBAX SB-C18 3．0 mm×150mm流動相 甲醇∶水(15∶85)0．5％乙酸流速0．4ml／min
柱溫35℃檢測波長260nm操作A．對照品溶液的配制①馬尿酸取5．7毫克溶于2．5毫升甲醇。
②苯乙酰谷氨酰胺取8．3毫克溶于2．5毫升0．4mol／L氫氧化鈉溶液。
③苯乙酸取43．0毫克溶于2．5毫升甲醇。
④吲哚乙酸取4．7毫克溶于2．5毫升甲醇。
各取200μl，混勻，進樣量為10μl；四種有機酸對照品的HPLC圖譜見圖8B．供試品溶液配制供試品批號980905(固含量0．0372mg／ml)980906、980907、980908、980909(固含量0．0409mg／ml)取原液用超純水稀釋5倍后，0．45μm薄膜過濾，進樣10μl；供試品的HPLC譜圖見圖9-11。通過分析，四種有機酸的含量如下表所示表6．四種有機酸的含量
以上結(jié)果得出，四種有機酸的含量分別為馬尿酸4．17-7．94mg／ml；苯乙酰谷氨酰胺4．87-10．86mg／ml；苯乙酸0．66-4．5mg／ml；吲哚乙酸0．11-0．28mg／ml；尿多酸肽組合物中四種有機酸的總含量為26．34-57．65％。
實施例九．尿多酸肽組合物肽氨基酸含量的測定本發(fā)明尿多酸肽組合物主成份之一是小分子肽，通過測定游離氨基酸和水解氨基酸量的方法，確定肽氨基酸的量，測試方法和結(jié)果如下一、游離氨基酸的測定方法Waters公司PICO．TAGTM氨基酸測定方法。
試劑及儀器十七種氨基酸對照品；異硫氰酸苯酯(PICO)衍生劑；三乙胺；醋酸鈉；乙腈。
高壓泵、梯度控制儀、紫外檢測器、積分儀、柱恒溫器、PICO．TAGTM工作站及氨基酸分析專用柱。
色譜條件1．流動相A液三水醋酸鈉19．0g溶解于1000mL超純水中，加三乙胺0．5mL，用冰醋酸調(diào)pH6．4，過濾。取濾液940mL加乙腈60mL；B液60％乙腈溶液；2．檢測波長254nm；3．柱溫38℃；4．洗脫梯度
5．樣品稀釋液取磷酸氫二鈉710mg加超純水1000mL溶解，用10％磷酸∶乙腈液(95∶5)調(diào)pH7．4備用。
測定方法將供試品溶液和5μL對照品溶液分別置于樣品小管中，并裝入反應瓶，于PICO．TAG工作站上真空干燥30分鐘后，每管加10μL再干燥液(乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1)，真空干燥30分鐘，每管加20μL衍生劑(異硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)，室溫放置20分鐘后，真空干燥。每管加200μL樣品稀釋液，進樣測定。
計算按外標法以國家氨基酸標準品為標準進行計算；得到游離氨基酸的含量為
水解氨基酸的測定方法方法Waters公司PICO．TAGTM氨基酸測定方法。
試劑及儀器十七種氨基酸對照品；異硫氰酸苯酯(PICO)衍生劑；三乙胺；醋酸鈉；乙腈。
兩臺高壓泵、梯度控制儀、紫外檢測器、積分儀、柱恒溫器、PICO．TAGTM工作站及氨基酸分析專用柱。
色譜條件1．流動相A液三水醋酸鈉19．0g溶解于1000mL超純水中，加三乙胺0．5mL，用冰醋酸調(diào)pH6．4，過濾。取濾液940mL加乙腈60mL；B液60％乙腈溶液；2．檢測波長254nm；3．柱溫38℃；4．洗脫梯度
5．樣品稀釋液取磷酸氫二鈉710mg加超純水1000mL溶解，用10％磷酸∶乙腈液(95∶5)調(diào)pH7．4備用。
測定方法將供試品溶液和5μL對照品溶液分別置于樣品小管中，并裝入反應瓶，于PICO．TAG工作站上真空干燥30分鐘后，在反應瓶底加入含1％苯酚的6mol／L鹽酸200μl后，用氮氣置換空氣，操作重復三次。將反映瓶裝入恒溫加熱器(105℃水解2小時)。每管加10μL再干燥液(乙醇∶水∶三乙胺=2∶2∶1)，真空干燥30分鐘，每管加20μL衍生劑(異硫氰酸苯酯∶乙醇∶三乙胺∶水=1∶7∶1∶1)，室溫放置20分鐘后，真空干燥。每管加200μL樣品稀釋液，進樣測定。
計算按外標法以國家氨基酸標準品為標準進行計算；得到水解氨基酸的含量為
肽氨基酸含量∶肽氨基酸=水解總氨基酸-游離氨基酸結(jié)果(1)氨基酸國家標準品(中國藥品生物制品檢定所分發(fā))的HPLC色譜圖(見附圖16)。
(2)尿多酸肽組合物溶液的游離氨基酸的HPLC色譜圖及各峰對應的游離氨基酸見附圖17-19。
(3)尿多酸肽組合物溶液的水解總氨基酸的HPLC色譜圖及各峰對應的游離氨基酸見附圖20-22)由圖16-22可見，三批尿多酸肽組合物溶液的游離氨基酸及水解氨基酸測定中，各氨基酸的保留時間與對照品(十七種氨基酸國家標準品)的保留時間基本一致。
例如十七種氨基酸國家標準品中，谷氨酸(Glu)的保留時間Rt=1．867，尿多酸肽組合物溶液(批號980906)中游離氨基酸的保留時間Rt=1．800，水解后谷氨酸的保留時間Rt=1．817；對照品中丙氨酸的保留時間Rt=6．483，尿多酸肽組合物溶液(批號980906)中游離丙基酸的保留時間Rt=6．508，水解后丙氨酸的保留時間Rt=6．308；對照品中酪氨酸的保留時間Rt=8．383，尿多酸肽組合物溶液(批號980906)中游離酪基酸的保留時間Rt=6．508，水解后酪氨酸的保留時間Rt=8．342；可見各氨基酸的保留時間與對照品中各峰的保留時間基本一致，略有漂移。
(4)尿多酸肽組合物溶液中氨基酸含量的實驗結(jié)果如下
HPLC，PICO·TAGTM專一性系統(tǒng)檢測本品游離氨基酸含量為0．8-1．3mg／ml，水解總氨基酸含量為8．5-11．4mg／ml，通過計算得出肽氨基酸量為7．7-10．9mg／ml，肽氨基酸占水解總氨基酸量為90．6-95．6％，總肽含量約為20．7-26．7％，因而該肽的成份應為本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液的主成份之一。
實施例十．尿多酸肽組合物肽分子量的測定本發(fā)明尿多酸肽組合物中肽的分子量，目前尚未見報導，現(xiàn)用HPSEC法測定本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液的分子量。
1．供試品尿多酸肽組合物溶液由本公司生產(chǎn)提供，批號980905、980906、980907、980908、980907。
2．肽標樣由中國藥品生物制品檢定所提供多肽與小分子蛋白分子量標準品。
3．實驗材料與方法儀器組成Waters510泵、481型檢測器、U6K進樣器、積分儀或工作站、pH計。
色譜條件流動相0．05％TFA10％乙腈的水溶液流速1．0ml／min柱TSK GEL G2000SW×L7．8mm×300mm 5μ。
柱溫室溫檢測波長214nm分子量標準曲線制作稱取核糖核酸酶A(M．W13700)2mg，胰島素(M．W．5808)2mg，Somatostain(M．W．1521)2mg、6肽(M．W．564)2mg，分別溶于1ml流動相中，再各取等量混合，經(jīng)0．45μm薄膜過濾后，進樣1μl，記錄相應的保留時間，重復進樣5次，其保留時間相對標準偏差不得大于2．0％。以保留時間為橫坐標，分子量對數(shù)為縱坐標進行線性回歸，相關(guān)系數(shù)不得小于0．99。通過回歸方程計算出對應于分子量1．0萬的保留時間。
供試品測定取供試品適量，0．45μm薄膜過濾，進樣1μl，記錄相應的譜圖，按面積歸一化方法計算。
4．實驗結(jié)果肽標樣分子量測定的HPLC譜圖見附圖23。
①肽標樣分子量測定結(jié)果如下表所示
②回歸方程及標準曲線以前三點進行線性回歸(舍6肽一點)，得回歸方程，標準曲線見圖24Y=6．685-0．39X，r=0．9991(線性范圍Rt6．5748-90064)③根據(jù)回歸方程計算，對應分子量1萬的保留時間為Rt=6．88④尿多酸肽組合物溶液樣品的分子量測定譜圖見附圖25-27，譜圖中，前三個峰的保留時間均在標準曲線的線性范圍內(nèi)，根據(jù)回歸方程計算，這三個峰(1#、2#、3#)對應的分子量如下表
三個各峰對應的分子量分別為7000--9200，4000-5800，1000-2100。
⑤尿多酸肽組合物溶液樣品的分子量最大為9200，所含多肽的分子量均小于10000道爾頓，由此可見，該品中肽基本以小分子肽的形式存在。
實施例十一．尿多酸肽組合物的肽成份分析尿多酸肽組合物的主成份，除游離氨基酸及四種有機酸外，尚有一定比例的小分子肽，經(jīng)用HPLC排阻層析法分離該品的肽成分，獲得分子量一萬以下多相性小分子肽組分。
1．供試品本公司生產(chǎn)提供，批號980906、980907、980908。
2．HPLC排阻層析法試劑磷酸鹽緩沖液(0．02mol／L)稱取磷酸二氫鉀2．72g，溶于500ml超純水中，用0．1mol／L NaOH調(diào)pH至7．4，用超純水稀釋至1000ml。
儀器及系統(tǒng)Waters HPLC510型泵、481型檢測器、740型數(shù)據(jù)處理器柱Protein-Pak．TM60 7．8mm×300mm；流速1．0ml／min；流動相磷酸鹽緩沖液(0．02mol／L)；柱溫37℃；檢測波長280nm。
取待測供試品5μl，進樣，記錄分析結(jié)果，計算出肽的相對百分含量。
3．結(jié)果經(jīng)用HPLC排阻層析法，凝膠柱Protein60分離并檢測本發(fā)明尿多酸肽組合物的肽成分，得到一系列的肽峰(見附圖28-30)，數(shù)量為12-15個。其中有二個十分明顯的主峰，特征峰之一的保留時間為6．805-7．493，三批相對百分含量分別為15．89％、16．16％、16．27％、．16．56％、17．56，即15．89-17．56；而另一個特征峰保留時間的均值為7．722-8．824，三批相對百分含量分別為18．68％、19．27％、19．61％、19．19％、19．98％，即18．68-19．19。
其結(jié)果如下
實施例十二．尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞離體和在體實驗中的生長抑制作用以及誘導分化作用。
1．受試藥物尿多酸肽組合物溶液由本公司生產(chǎn)提供，批號970813，玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml，固形物含量200mg／ml2．動物小鼠為昆明種封閉群，體重18-22g，皆為雌性，由中科院上海實驗動物中心提供。合格證號中科動管會005。各組動物數(shù)為8只，健康，預飼養(yǎng)7日。
3．飼養(yǎng)管理條件群養(yǎng)，每籠5只，室內(nèi)溫度、濕度、光照和通風自然，必要時開通風扇。自由攝食充足供水。實驗前觀察1周并記錄相應情況。
4．腫瘤細胞株人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)由中科院上海藥物所腫瘤藥理組傳代培養(yǎng)。
5．試劑維甲酸(RA)上海瑞金醫(yī)院提供，批號961109。
環(huán)磷酰胺上海第十二制藥廠生產(chǎn)，批號960706。
凝血酶、纖維蛋白原、RPMI-1640、NBT、PMA，均購自Sigma公司。
6．尿多酸肽組合物溶液離體對HL-60細胞生長抑制作用6．1試驗方法及步驟臺盼蘭排染法用于觀察對細胞的生長抑制情況，試驗設空白對照，制劑對照，用藥組和陽性對照組。
取對數(shù)生長的細胞，計數(shù)，用RPMI-1640培液配制細胞懸液，細胞數(shù)為2．0×105／ml，細胞液加入96孔板，置于37℃、CO2培養(yǎng)箱，藥物作用6天，加臺盼蘭計數(shù)活細胞數(shù)，計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率。
以抑制率作為評價標準，計算方法如下抑制率=(對照組活細胞數(shù)-用藥組活細胞數(shù))／對照組活細胞數(shù)×100％6．2試驗結(jié)果首先觀察尿多酸肽組合物溶液作用6天時，對HL-60細胞的抑制作用(即量效關(guān)系試驗)，試驗共三批，結(jié)果合列于表7。其中一批結(jié)果作成附圖31。可知本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對體外培養(yǎng)的HL-60細胞有直接生長抑制作用。藥物作用細胞6天后，其IC50為0．18mg／ml。
表7不同濃度尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞生長的抑制作用
#μg／ml，*P＜0．01又以1．2mg／ml的尿多酸肽組合物溶液，進行了處理不同天數(shù)對HL-60細胞生長曲線抑制作用的動態(tài)觀察，每日計數(shù)細胞數(shù)，結(jié)果見表8及附圖32?？芍獙φ战M細胞呈線性生長，用藥組細胞生長受抑制，至接種后的第6天，用藥組細胞與接種時細胞數(shù)仍相近。
表8尿多酸肽組合物作用細胞不同天對HL-60細胞生長的抑制情況
6．3試驗結(jié)論體外實驗結(jié)果表明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞有明顯抑制的作用，且有量效關(guān)系。藥物作用6天，當濃度大于2mg／ml時，細胞全部死亡，其對HL-60細胞的IC50為0．18mg／ml，而且能使HL-60細胞生長曲線明顯受到抑制(曲線變平)。
7．本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液溶液對HL-60細胞誘導分化作用7．1試驗方法及步驟7．1．1NBT還原反應藥物作用細胞7天，取細胞懸液，以1000rpm的速度離心分離，收集細胞棄上清液，以PBS洗1次，加入含有TPA的NBT工作液，37℃保溫45分鐘，離心1000rpm收集細胞，鏡檢，顯微鏡下觀察200個細胞，胞漿中有藍紫色者為NBT還原陽性細胞，算出NBT反應陽性細胞百分數(shù)。
7．1．2形態(tài)學變化的觀察藥物作用細胞7天，取細胞懸液，離心1000rpm收集細胞棄上清液，細胞涂于載玻片上，晾干，用甲醇固定3分鐘，緩沖液沖洗晾干，Giemsa染色，在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。計數(shù)200個細胞，算出成熟細胞百分數(shù)。
7．2試驗結(jié)果NBT還原反應和細胞形態(tài)學的觀察結(jié)果綜合列于表9。可知①藥物作用HL-60細胞7天，細胞NBT還原反應陽性百分率增高，有大于50％的細胞向中、晚幼粒方向分化，與對照組相比差異在統(tǒng)計學上有非常顯著意義(P＜0．01)。未用藥組的分化率小于3％。②用藥組分化成熟細胞百分率也明顯高于對照組(P＜0．01)。③RA組的相應數(shù)值也都明顯高于對照組(P＜0．01)，說明本試驗方法有效可靠。
顯微鏡下細胞形態(tài)觀察結(jié)果列于附圖33-35。
表9尿多酸肽組合物體外作用HL-60細胞7天后的誘導分化作用
7．3試驗結(jié)論體外試驗表明本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液在1．2mg／ml時對HL-60細胞有生長抑制作用，在此藥物濃度作用下，HL-60細胞培養(yǎng)7天后NBT還原反應陽性細胞增多，有50％以上的細胞形態(tài)發(fā)生改變，細胞核縮小，偏向一邊，核漿比例減少，出現(xiàn)腎型核。顯示細胞由早幼粒向晚幼粒成熟方向分化。
8．尿多酸肽組合物溶液在體試驗對人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)生長抑制及誘導分化作用8．1試驗方法及步驟8．1．1試驗方法體內(nèi)試驗選用小鼠腎囊下接種法。
8．1．2試驗步驟纖維蛋白凝塊的制備取對數(shù)生長期的HL-60細胞，1000×g／min離心5min，濃縮體積到1ml，其中含細胞4×107個。先后加人纖維蛋白和凝血酶工作液使之形成細胞凝塊，在培液中將它切成等體積小塊用于移植。
接種選用25-28g的昆明小鼠，接種前一天腹腔注射環(huán)磷酰胺(150mg／kg)以抑制其機體免疫反應。移植時將凝塊插入到小鼠腎囊膜下。
8．1．3分組及劑量設置給藥前動物隨機分組，每組動物數(shù)為8只。本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液溶液設320，640，1280mg／kg三個劑量組，不同劑量組用生理鹽水稀釋成所需濃度，陽性對照組用維甲酸(RA)，RA為目前臨床上應用的腫瘤誘導分化劑。對照組用生理鹽水。
8．1．4給藥方法均為腹腔注射給藥。本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液溶液于接種后次日給藥，連續(xù)7天?？瞻讓φ战o生理鹽水。
8．1．5療效評價第8天處死動物，在解剖鏡下以接目測微尺測量腫瘤長短徑。
腫瘤體積=長徑×短徑×短徑／2。
抑瘤率=(對照組瘤體積-用藥組瘤體積)／對照組瘤體積×100％。
8．1．6形態(tài)觀察將荷瘤鼠腎在10％甲醛中固定，用石蠟包埋，切片，HE染色，顯微鏡下觀察形態(tài)變化。
8．2試驗結(jié)果數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理用t-檢驗和Logit法計算ED50，均以“藥理學計算與統(tǒng)計程序”軟件進行處理。
各組試驗結(jié)果列于表10(包括重復試驗在內(nèi)共三批)和附圖36?？梢婋S本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液溶液劑量的增加其抑瘤率也因之上升。對第一批結(jié)果，Logit法計算本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液溶液對小鼠荷瘤的ED50為87mg／kg。二、三批結(jié)果數(shù)值高一些。t-檢驗表明各用藥劑量組的抑瘤率與對照組相比均有顯著差異。藥物在中劑量和高劑量時的抑瘤率與陽性對照組RA抑瘤率相似，給藥后小鼠體重毛色均無明顯不良變化。
表10不同劑量本發(fā)明尿多酸肽組合物對小鼠腎囊下HL-60細胞生長抑制作用
*P＜0．05．**P＜0．01
各組腎囊膜下生長的HL-60細胞的形態(tài)學顯微照片見附圖37-39。
8．3試驗結(jié)論通過體內(nèi)試驗表明，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液對HL-60細胞生長有明顯的抑制作用，劑量在640mg／kg時抑瘤率達到66％左右，三次重復試驗結(jié)果表明，加大用藥劑量后其抑瘤率依然維持在此水平，顯示了分化誘導劑的非殺傷性特點。
目前體內(nèi)的分化誘導試驗模型不多，我們采用國際上比較成熟的方法即Fimgert的腎囊膜下接種分析法，將體外培養(yǎng)的人體腫瘤細胞接種于經(jīng)免疫抑制的昆明小鼠腎囊膜下，用藥后經(jīng)固定、切片、HE染色，鏡檢觀察細胞形態(tài)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明尿多酸肽組合物溶液在640-1280mg／ml時HL-60細胞形態(tài)上呈現(xiàn)明顯的分化現(xiàn)象，瘤組織中出現(xiàn)大量中晚幼粒及成熟細胞，其分化程度在1280ml／kg時更為明顯。
實施例十三尿多酸肽組合物溶液抗人原發(fā)性肝細胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的作用1．受試藥物注射用尿多酸肽組合物由本公司生產(chǎn)提供。合衛(wèi)藥批(95)003號，批號980701，固含量200mg／ml，每瓶100ml。
2．受試動物裸小鼠品系SPF級，BALB／C裸小鼠。由中國科學院上海藥物研究所實驗動物部(上海市實驗動物管理委員會認可并頒發(fā)和合格證的單位)提供。合格證號滬動合證字122號。體重18-22克，每組動物數(shù)為8只。
3．細胞株LCI-D20人原發(fā)性肝癌的高轉(zhuǎn)移模型，由上海醫(yī)科大學肝癌研究所建立。該肝癌在肝包膜下原位接種后可快速生長并有腹腔內(nèi)和肺轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率可達100％。
人肝癌細胞系MHCC97由上海醫(yī)科大學肝癌研究所建立。該細胞與LCI-D20人原發(fā)性肝癌的高轉(zhuǎn)移模型同源，具有高轉(zhuǎn)移特性。
4．在體注射用尿多酸肽組合物對人原發(fā)性肝細胞肝癌生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用4．1實驗方法4．1．1LCI-D20人原發(fā)性肝癌高轉(zhuǎn)移裸鼠模型的制備將LCI-D20人原發(fā)性肝癌高轉(zhuǎn)移瘤塊在無菌條件下切割成1mm3大小備用。裸鼠預飼養(yǎng)7天后施行手術(shù)。裸鼠麻醉后常規(guī)消毒，打開腹腔，將瘤塊行包膜下套管接種，關(guān)腹并將動物放回飼養(yǎng)，觀察。術(shù)后無感染，傷口愈合良好。術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)10天，第11天開始給藥，連續(xù)20天。
4．1．2實驗分組給和給藥方案對照組生理鹽水低劑量組(L)注射用尿多酸肽組合物600mg／kg。
中劑量組(M)注射用尿多酸肽組合物1200mg／kg。
高劑量組(H)注射用尿多酸肽組合物1800mg／kg。
由于LCI-D20人原發(fā)性肝癌高轉(zhuǎn)移裸鼠對細胞分化劑視黃酸(RA)并不敏感，無肯定的療效，故本實驗未設陽性對照組。
4．1．3實驗方法和觀察指標藥物均為腹腔注射。模型鼠在術(shù)后繼續(xù)喂養(yǎng)10天，第11天開始給藥，連續(xù)20天。第21天處動物，剖腹觀察腫瘤生長和腹腔轉(zhuǎn)移的情況。
腫瘤稱重并用下列公式計算抑瘤率腫瘤抑制率(％)=(1-T／C)×100式中T為給藥組平均瘤重；C為對照組平均瘤重。
肝癌轉(zhuǎn)移觀察指標肉眼觀察腹腔腫瘤的播散結(jié)節(jié)，多發(fā)結(jié)節(jié)和廣泛轉(zhuǎn)移的狀況。
4．2實驗結(jié)果
4．2．1注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉(zhuǎn)移肝癌LCI-D20生長的抑制作用結(jié)果見表11?？芍⑸溆媚蚨嗨犭慕M合物3劑量對瘤的生長均有抑制作用。
表11注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉(zhuǎn)移肝癌LCI-D20生長的抑制作用
*P＜0．05，**P＜0．01，按Student t-test統(tǒng)計處理4．2．2注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉(zhuǎn)移肝癌LCI-D20腹腔轉(zhuǎn)移的影響結(jié)果見表12。表明注射用尿多酸肽組合物治療可大大減少移植性肝癌的腹腔轉(zhuǎn)移。治療各組均未發(fā)現(xiàn)廣泛轉(zhuǎn)移其中尤以H組的療效顯著。
表12注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉(zhuǎn)移肝癌LCI-D20腹腔轉(zhuǎn)移的影響
5．注射用尿多酸肽組合物對肝癌組織中原癌基因表達的影響5．1實驗材料和方法5．1．1實驗材料肝癌組織取自對照組和注射用尿多酸肽組合物處理各組。組織置于-80℃保存?zhèn)溆谩RIzol購自GIBOCO公司。AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，Taq DNA聚合酶，Rnasin，dNTP，Oligo(dT)15購自PROMAGA公司。PCR引物由上海賽百盛公司代理在加拿大合成。引物序列如下
5．1．2 RNA提取本實驗采用TRIzol一步法。50mg肝癌勻漿后加入1ml TRIzol液，震蕩混勻，室溫放置5-10分鐘。加入0．2ml氯仿，顛倒混勻，冰上放置5分鐘，12000rpm，4℃離心15分鐘。取約0．6ml上層液體，加入0．5ml異丙醇，室溫放置30分鐘，12000rpm，4℃離心10分鐘。棄去上清，用預冷的75％乙醇洗兩次。棄乙醇后置室溫20分鐘以揮發(fā)至干。每管的純化的DNA用50μl DEPC處理的水溶解，保存在-70℃。
5．1．3逆轉(zhuǎn)錄反應(Reverse Transcription，RT)10μl RNA樣品在70℃變性10分鐘，分別加入5X逆轉(zhuǎn)錄緩沖液10μl，2．5mM dNTPs，12μl；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶20U，RNasin50U，Oligo(dT)15200ng；用DEPC水補足體積至50μl。42℃溫育1小時，95℃變性10分鐘。
5．1．4多聚酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)分別取逆轉(zhuǎn)錄反應物(cDNA)用于PCR反應。其體系為逆轉(zhuǎn)錄反應物，5μl；10xPCR緩沖液，5μl；上，下游引物各20pmol；Taq DNA聚合酶，5U；2．5mM dNTPs，2μl；15mM MgCl25μl，最后用水補足體積至50μl。反應條件為95℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1．5分鐘。共35個循環(huán)；然后72℃下延伸10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖(含0．5μg／ml的溴化乙啶)電泳，電泳圖譜由VDS凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描分析得測定條帶的積分光密度(IntegratedOptical Density，IOD)。
5．1．5計算和統(tǒng)計本實驗以β-actin作為內(nèi)參照標準。
基因相對表達值=IOD測定條帶／IODβ-actinStudent t- test為統(tǒng)計方法。
5．2試驗結(jié)果5．2．1注射用尿多酸肽組合物對移植性高轉(zhuǎn)移肝癌LCI-D20組織中原癌基因表達的影響結(jié)果見表13和圖40。研究表明，高劑量注射用尿多酸肽組合物(H組和H+CT組)對上述肝癌組織中原癌基因c-myc，N-ras，c-jun和c-fos的表達有明顯的下調(diào)作用。中劑量(M組)注射用尿多酸肽組合物僅能減少N-ras的表達，而低劑量注射用尿多酸肽組合物(L組)對上述基因的mRNA的表達無作用。表13注射用尿多酸肽組合物對人移植性高轉(zhuǎn)移肝癌LCI-D20組織中原癌基因表達的下調(diào)作用
本表數(shù)據(jù)為基因相對表達值，*P＜0．05，**P＜0．01，與對照組相比6．注射用尿多酸肽組合物對肝癌組織中基質(zhì)金屬蛋白酶9(Matrix Metalproteinase-9，MMP-9)基因表達的調(diào)節(jié)6．1材料和方法RT-PCR的方法同B-1-1 。
MMP-9的上游引物5′-TGGCCGGCCACTGTGCGCCCCTCCGAG-3′。下游引物5′-CACTAGGTTCACCTTCGTTCCGGGTACT-3′。擴增片段長度為633bp。PCR反應條件94℃，1min；55℃，1min；72℃，1min；共40個循環(huán)，72℃延伸5min。
6．2結(jié)果結(jié)果見表14的MMP-9項和圖41。MMP-9是近年來發(fā)現(xiàn)的，與腫瘤細胞水解細胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)的能力相關(guān)，是反映腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移能力的客觀指標之一。注射用尿多酸肽組合物能有效地下調(diào)該基因的mRNA的轉(zhuǎn)錄。研究表明，本研究所采用的劑量范圍內(nèi)，呈一定的劑量效應。且與5-FU(5-氟尿嘧啶上海旭東海普藥業(yè)有限公司，滬衛(wèi)藥準字(1995)第013013號，批號980704，制劑0．5g／10ml)有協(xié)同效果。
表14注射用尿多酸肽組合物對MMP-9基因轉(zhuǎn)錄的抑制作用；注射用尿多酸肽組合物治療對肝癌組織的整合素β1亞基和E-鈣粘素含量的作用
與C組相比，*P＜0．05；**P＜0．01．數(shù)據(jù)以積分光密度Mass／g組織表示。
7．注射用尿多酸肽組合物對整合素β1亞基和E-鈣粘素表達的影響7．1材料和方法材料肝癌組織的收集同上?？拐纤卅?亞基單克隆抗體(Anti-human Integrin β1mAb)由上海醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學教研組查錫良教授饋贈?？笶-鈣粘素抗體(Anti-human E-Cadherin mAb)，購自Santa-Crus公司。HRP-羊抗鼠IgG，華美公司。其他試劑均為分析純。
Western印跡法樣品稱重后加入裂解液RIPA1ml，冰浴放置10分鐘。然后4℃下500rpm離心15分鐘，取上清液。將處理的樣品液上樣后作SDS聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后將凝膠置于半干式電轉(zhuǎn)移儀中，從凝膠上直接將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，然后以含3％BSA的封閉液中封膜二小時后加入第一抗體，4℃過夜，第二天按常規(guī)洗滌后加入HRP標記的二抗，溫育二小時后，用DAB顯色。將顯色后的PVDF膜晾干。在VDS圖像分析系統(tǒng)下掃描半定量，得條帶的IOD值。凝膠則作考馬斯亮藍染色以了解電轉(zhuǎn)移的情況。
斑點免疫印跡(Dot Immunoblotting)先將PVDF膜放在甲醇中浸透(約3分鐘)，以去離子水漂3次后，用0．02M PBS洗膜兩次，然后將膜置于電雜交儀內(nèi)，但形成負壓后，每孔加樣品原液10μl．(標本處理同Western印跡法)。標本均作雙份點樣，點樣后將膜以含3％BSA的封閉液中封膜二小時后加入第一抗體，4℃過夜，第二天按常規(guī)洗滌后加入HRP標記的二抗，溫育二小時后，用DAB顯色。將顯色后的PVDF膜晾干。在VDS圖像分析系統(tǒng)下掃描半定量，得斑點的Mass值。
結(jié)果表示以IOD或Mass／g肝癌組織表示。
7．2結(jié)果腫瘤在生長和轉(zhuǎn)移過程中，往往有粘附分子表達的改變。整合素β1亞基(Integrinβ1 subunit)是一類重要的異型粘附分子，介導異種細胞間的粘附，參與細胞的信息傳導。而E-鈣粘素(E-Cadherin)也是一類重要的同型粘附分子，參與同種細胞間的粘附；腫瘤轉(zhuǎn)移時原位灶的E-鈣粘素表達會有明顯的減少。結(jié)果顯示與對照組(C組)相比，注射用尿多酸肽組合物治療后，M組，H組，H+CT組的整合素β1亞基量的下降有統(tǒng)計學意義。而H組和H+CT組的E-鈣粘素的含量的上升有顯著意義。見表14的相關(guān)項和圖42。
8．應用免疫組織化學檢測注射用尿多酸肽組合物治療對肝癌組織的E-鈣粘素和增殖性細胞核抗原Ki67的影響8．1．材料和方法材料抗人增殖性細胞核抗原Ki67抗體購自華美公司。其余試劑同上述部分。
方法1)新鮮肝癌標本用甲基纖維素(OCT)包埋后，在恒冷切片機上制備8μ冰凍切片，然后用丙酮在室溫下固定10分鐘，備用。
2)切片用正常羊血清封閉半小時后洗去。分別加上E-鈣粘素或Ki67工作液(1∶50)，置于4℃過夜。
3)用PBS液洗去一抗，共三次，用濾紙吸去組織周圍的緩沖液(以下同)，再加入生物素化二抗(抗羊或抗鼠IgG)，在室溫下溫育一小時。再用PBS洗去二抗后加上三抗(A+B混合物)，室溫下溫育一小時，然后用PBS洗去。
4)DAB溶液(0．5mg／ml)加3％ H2O25-10μl混勻后滴在切片上染色。濕片在顯微鏡下看到出現(xiàn)棕黃色顆粒，然后洗去DAB液。切片在以蘇木精復染，脫水封片鏡檢。
5)判斷標準E-鈣粘素棕黃色顆粒定位于胞漿和／胞膜的癌細胞為陽性細胞。陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分比≤5％為+；≤20％為++；＞20％為+++。
Ki67棕黃色顆粒定位于胞核的癌細胞為陽性細胞。陽性細胞占腫瘤細胞總數(shù)的百分比≤5％為+；≤20％為++；＞20％為+++。
8．2結(jié)果8．2．1注射用尿多酸肽組合物對LCI-D20肝癌組織中E-鈣粘素表達的免疫組織化學檢測結(jié)果見表15，顯示，注射用尿多酸肽組合物可增加組織中E-鈣粘素的表達。與對照組相比，治療各組的陽性率增加。其中以M組增加最為顯著。
表15免疫組織化學法對肝癌組織中E-鈣粘素、Ki67檢測的半定量結(jié)果
8．2．2注射用尿多酸肽組合物對LCI-D20肝癌組織中Ki67表達的免疫組織化學檢測結(jié)果顯示見表15右側(cè)，各種劑量的注射用尿多酸肽組合物處理對LCI-D20肝癌組織中Ki67表達無明顯的影響。
9．注射用尿多酸肽組合物對高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株MHCC97粘附、浸潤和移動性能的影響9．1注射用尿多酸肽組合物對高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株MHCC97粘附性能的影響9．1．1材料和方法1)纖維連接蛋白包被板的制備將1mg／ml纖維連接蛋白(Fibronectin，Sigma公司)用0．01mol／L PBS稀釋至10ng／ml。用無血清的DMEM培養(yǎng)液洗后用無血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)配至5×103細胞／50μl。以每孔100μl包被96孔酶標板，37℃，2小時溫育后4℃過夜。次日以PBS洗板，再用0．1％BSA(Sigma公司)封閉，37℃，2小時。用PBS洗后待用。
2)細胞制備用0．25％胰酶；0．02％EDTA消化細胞，并用無血清的DMEM培養(yǎng)液洗后用無血清的DMEM培養(yǎng)液調(diào)配至5×103細胞50μl。
3)粘附實驗在纖維連接蛋白包被板上加入已處理的人肝癌細胞MHCC97，5×103細胞／孔。對照孔加入50μl PBS；實驗孔加入注射用尿多酸肽組合物至設定的濃度。每孔總體積為100μl。37℃，5％CO2孵育4小時，輕柔洗去未粘附的細胞。每孔用100μl 10％中性福爾馬林固定30分鐘，5％結(jié)晶紫染色10分鐘。SLT210酶標儀測定光密度，波長為595nm。
4)分組對照組50μl DMEM(含5×103細胞)+50μl PBS
注射用尿多酸肽組合物實驗組10mg／ml組50μl DMEM(含5×103細胞)+25μl注射用尿多酸肽組合物+25μl PBS15mg／ml組50μl DMEM(含5×103細胞)+37．5μl注射用尿多酸肽組合物+12．5μl PBS20mg／ml組50μl DMEM(含5×103細胞)+50μl注射用尿多酸肽組合物9．1．2結(jié)果結(jié)果列于表16。本實驗共進行6次，其結(jié)果相同，趨勢一致。除10mg／ml注射用尿多酸肽組合物與對照相比無顯著差異外，15mg／ml和20mg／ml注射用尿多酸肽組合物對MHCC97高轉(zhuǎn)移細胞株對纖維連接蛋白的粘附抑制作用與對照相比有顯著性差異(P＜0．05)。
表16注射用尿多酸肽組合物對高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株MHCC97粘附性能的影響
p＜0．0001，注射用尿多酸肽組合物整體與對照組相比方差分析(F檢驗)的結(jié)果9．2注射用尿多酸肽組合物對高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株MHCC97浸潤性能的影響、注射用尿多酸肽組合物離體對MHCC97人高轉(zhuǎn)移肝癌細胞株蛋白酶的抑制作用9．2．1材料和方法用0．05mol／L TBS液(Tris-HCl，pH7．6；0．17mol／L NaCl，0．02mol／L CaCl2)配制2％瓊脂糖，高壓消毒，冷卻至37℃時與預熱的Ⅰ型膠原(Collagen Type I Solution，3mg／ml，日本和光純藥工業(yè)株式會社)按1∶1混合后，加入到24孔培養(yǎng)板，每孔800μl，4℃凝結(jié)過夜。次日用打孔機打孔，然后將處理好的MHCC97細胞分別加入不同的孔中，每孔20μl(含1×104細胞)。每組3孔。小心加入無血清的DMEM培液。37℃，24小時孵育。小心取出凝膠片，用生理鹽水充分洗滌后，浸于0．1％考馬斯亮藍R250溶液(以45％甲醇-10％冰醋酸配制)中，室溫下染色30分鐘，移至45％甲醇-10％冰醋酸溶液中脫色，拍照。
細胞制備同前。注射用尿多酸肽組合物濃度設置為1．25mg／ml，2．5mg／ml和5．0mg／ml。
9．2．2結(jié)果結(jié)果見表14及附圖43。對照組中，由于MHCC97細胞有分泌膠原酶和明膠酶的能力，對細胞外基質(zhì)，如膠原蛋白有強的降解的能力。故本實驗中，細胞外的膠原蛋白大部分被降解，所以考馬斯亮藍R250不染色或較少染色。與對照組相比，1．25mg／ml的注射用尿多酸肽組合物處理并不表現(xiàn)對膠原酶的抑制；而2．5mg／ml的注射用尿多酸肽組合物呈現(xiàn)對膠原酶的抑制；5．0mg／ml以上的注射用尿多酸肽組合物表現(xiàn)出最大的抑制作用。說明注射用尿多酸肽組合物能抑制MHCC97細胞的浸潤性。
9．3注射用尿多酸肽組合物對高轉(zhuǎn)移人肝癌細胞株MHCC97移動性能的影響9．3．1材料和方法用0．01mol／L PBS液配制0．7％瓊脂糖，高壓消毒，稍冷卻加到24孔培養(yǎng)板，每孔2000μl，4℃凝結(jié)過夜。次日用打孔機打孔，然后將處理好的MHCC97細胞分別加入不同的孔中，每孔20μl(含5000個細胞)。每組3孔。小心加入含10％人AB型血清的DMEM培液1．5ml。24小時后吸去培液。分別再加含0．625mg／ml，1．25mg／ml，2．5mg／ml，5mg／ml和10mg／ml注射用尿多酸肽組合物的DMEM培液(含10％人AB型血清)。每孔加1．5ml，每組3孔。每二天換液一次，共培養(yǎng)5天，每24小時觀測細胞的移動距離。
9．3．2結(jié)果除10mg／ml注射用尿多酸肽組合物的細胞趨變性壞死，未見明顯的細胞向外移動外，其余各組與對照組相比無明顯差異；細胞均有向外移動，且移動距離的差異無統(tǒng)計學意義。實施例十四．注射用尿多酸肽藥物組合物離體試驗對人類血癌細胞的生長和端粒酶活性的抑制人的骨髓血癌細胞(HL-60cells)株從長庚大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學研究所獲得。細胞株保持在懸浮于RPMI-1640的培養(yǎng)基中(GIBCO，長島，紐約)，包含10％的牛胎血清(HyClone，Ligan，UT)在5％二氧化碳和95％空氣溫度、37℃的培養(yǎng)箱中。
注射用尿多酸肽藥物組合物(亦稱分化誘導劑)是從新鮮人尿中純化出來的，能引導異常甲基復合酶轉(zhuǎn)變成正常甲基復合酶。注射用尿多酸肽藥物組合物為本公司樣品。
血癌細胞的生長曲線在有、無注射用尿多酸肽藥物組合物的存在下在實驗時構(gòu)造出來?？偧毎麛?shù)是以血細胞計數(shù)器計算。細胞生存力決定于染色細胞用0．25％胎盼蘭染色計數(shù)，不被染色的細胞的部份當做殘存的部份。細胞形態(tài)用顯微鏡觀察。分化情況的評定是經(jīng)過觀察生長能力的消失而沒有失去細胞的生存力和細胞形態(tài)的改變。
細胞提取制造CHAPS細胞分解緩沖液的原料溶液[10mM Tris-鹽酸(pH 7．5)，1mM氯化鎂，1mM EGT，0．5％CHAPS，10％甘油(v／v)]貯藏于4℃溫度中。使用前加入phenylmethanesulphonyl floride(PMSF)和巰基乙醇，使最后濃度分別為0．1和5mM。細胞的提取是將細胞懸浮于CHAPS緩沖液中，細胞數(shù)為2×103cells／ml，置于冰中培養(yǎng)30分鐘，然后以14，000g在4℃離心30分鐘，上清液移入試管用作端粒酶活性測試。蛋白質(zhì)濃度用Commassie蛋白質(zhì)測試劑測定(Pierce)。
端粒酶的測試端粒酶活性的定量是用PCR方法將端粒單位擴增復制(TRAP)(Kim et al．1994)。TS引物(5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′)和CX引物(5′-[CCCTAA]3 CCCTAA-3′)是用長庚儀器中心的DNA合成儀器(Model 380B，Applied Biosystems)合成。TS引物的5′-終端用T4多核苷酸激酶以[γ-32P]ATP標志。TRAP的定量，首先讓端粒酶來延伸TS引物，與0．1μgTS引物，500nCi放射性元素標志的2．5mM dNTPs，20mM Tris-鹽酸(pH8．2)，1．5mM氯化鎂，63mM氯化鉀，0．005％ Tween-20，1mM EGTA，0．1mg／ml BSA，以及2單位的Tag DNA合成酶。在反應液里也加入0．5μg的RNase A。端粒酶延伸反應后，加入0．1μg的CX引物來進行PCR擴增，總共30周期在94℃30秒，55℃30秒，然后72℃1．5分鐘。PCR產(chǎn)物用膠電泳用54mM硼酸，1．2mM EDTA分離，DNA帶型用自體放射照片和SyBr染色顯示出來。染色照片在254nm紫外光照射下拍照。至于端粒酶活性的定量，TRAP產(chǎn)物的自體放射照片用ImageQuaNTm(Molecular Dynamics)作電腦密度掃描。每一處理過的樣本除去緩沖液底值后與沒有處理的樣本比較相對密度。
試驗結(jié)果1．注射用尿多酸肽藥物組合物誘導分化后對血癌細胞繁殖的抑制圖50．表示血癌細胞成長于無注射用尿多酸肽藥物組合物和用兩種注射用尿多酸肽藥物組合物劑量使用6天的血癌細胞的生長曲線。在劑量2mg／ml時，細胞對注射用尿多酸肽藥物組合物顯示有毒性的反應，因為有生存力的細胞迅速地降低到1×104cell／culture的水平下。到第4天和第6天細胞數(shù)更降低到少于開始細胞數(shù)的一個對數(shù)的水平(圖51)。在1mg／ml時到第4天和第5天，與對照組相比顯示細胞大約減少90％。
2．注射用尿多酸肽藥物組合物分化誘導后血癌細胞端粒酶的活性狀態(tài)過去曾顯示細胞抽取物可能因含有某些未知的因素而能減少TRAP的定量值(Bnoccoli etal．1995)。為了正確的定量我們用不同的細胞液濃度(0．01到3μg)以獲得酶活性的直線幅度。圖52顯示血癌細胞在對照和兩個注射用尿多酸肽藥物組合物劑量存在下的相關(guān)的端粒酶活性。用1mg／ml濃度的注射用尿多酸肽藥物組合物時，很清楚的可以看到端粒酶的密度減少，PCR產(chǎn)物的復雜性與密度隨培養(yǎng)時間遞減(圖52C、D、E)。當血癌細胞用2mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物培養(yǎng)時，生存了2天和4天的血癌細胞的端粒酶活性兩者都減到幾乎不能察覺的程度(圖532F、G)。當我們對血癌細胞在沒有注射用尿多酸肽藥物組合物存在的同樣的溶液中生存了2天，4天和6天的細胞進行測試發(fā)現(xiàn)與在第4天和第6天收成的血癌細胞的端粒酶活性類似(沒有提示資料)。這與血癌細胞在2天收成如圖52第二行(B)所示的沒有什么基本的不同。PCR產(chǎn)品的自體放射照片在生長于無注射用尿多酸肽藥物組合物(第2天，B行)或注射用尿多酸肽藥物組合物濃度在1mg／ml時(第2天，C行；第4天，D行；第6天，E行)的血癌細胞(HL-60cells)體外抽取物。同時以注射用尿多酸肽藥物組合物濃度在2mg／ml時進行相似的測試(第2天，F(xiàn)行；第4天，G行)。A行，陽性對照(結(jié)果取自無細胞抽取物的端粒酶測試)。血癌細胞(HL-60cells)在第4天和第6天收成的端粒酶活性顯示與第2天B行(沒有顯示)的照片外形基本上完全相同。
上述用自體放射照片定量PCR產(chǎn)物的結(jié)果如用密度器定量時可以更清楚表示端粒酶活性的消失，在1mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物，端粒酶的活性隨培養(yǎng)時間遞減(圖53上半部)。另一方面，在第2天和第4天收成的細胞的端粒酶的活性顯示有劇烈減低到不能察覺的程度(圖53下半部)。結(jié)果列于圖中的曲線表示相關(guān)密度的百分率(％)。設每第2，4或6天的無受試物的對照的密度為100％。密度的值數(shù)是從圖3試驗的自體放射照片以密度器測讀軟片而轉(zhuǎn)換獲得。每一受試例子的活性是以受試例子的端粒酶活性除無受試對照×100％。
討論一個連續(xù)重復5’TTAGGG3’順序是發(fā)生在真核染色體兩端的端粒(Harley，1991；Blackburn，1992；de Lange，1994；Morin，1995；Kiplin，1995；Rhyu，1995)。端粒假定的功能包括下列幾項(i)保護染色體末端以防止外切核酸酶和連接酶的作用；(ii)防止DNA損害調(diào)查點的活性；(iii)補償DNA在每一次復制時末端的損失(Hartey 1992；Blackburn，1992；de Lange，1994；Kipling，1995)。端粒的六核苷酸是由核糖核酸核蛋白這種端粒酶促成的(Blackburn，1992)。有不少文獻報告端粒酶的作用涉及細胞的老化和癌細胞的永恒分裂活性(Rhyu，1995)。人類細胞端粒酶的活性在胎兒和成人的睪丸和卵巢的卵泡可以測出(Kim et al．1994)。但是端粒酶的活性在大部分的人體細胞組織測不出來(Counter et al．1995；Kim et al．1994)。相對的端粒酶的活性在大部分的腫瘤和永恒的培養(yǎng)細胞里是能被察覺的(Kim et al．1995；Taharaet al，1995；Chadeneau et al．1995；Hiyama et al．1995)。
本研究里，我們證明了注射用尿多酸肽藥物組合物是一種有效的分化誘導制劑，它可以抑制血癌細胞中端粒酶的活性。將這些細胞暴露于注射用尿多酸肽藥物組合物時產(chǎn)生抑制作用(圖50)?；贒NA分析血球記數(shù)流量的試驗，這些被分化的細胞顯示停留在細胞周期的G1階段(資料沒有顯示)。同時也顯示使用1或2mg／ml注射用尿多酸肽藥物組合物時端粒酶活性的抑制與時間的長久有密切的關(guān)系，端粒酶活性的抑制很可能是因為分化的誘導而不是單純的抗生長的效果。
因為人類端粒酶活性與癌的特殊關(guān)聯(lián)，這個酶成為很好的醫(yī)療靶。對癌細胞里的端粒酶的特殊抑制或向下調(diào)節(jié)就可能限制這些細胞分裂次數(shù)，終于達到抑制腫瘤的生長。到目前為止關(guān)于體內(nèi)端粒酶活性的調(diào)節(jié)知道的不多。端粒酶活性的減低細胞變成靜止狀態(tài)曾有過此類的報導(Holt et al．1996)。除此之外，對于幾種癌細胞株以細胞分化誘導向下調(diào)節(jié)端粒酶的活性最近有一些報導。這些結(jié)果可從細胞從早幼粒白血病細胞(Shanna et al．1995；Albanell et al．1996)，紅白血病(Sharma et al．1995)，骨髓細胞的血癌細胞(Zhang et al．1996)，胚胎癌(Albanellet al．，1996；Kurk et al．1996)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑瘤(Cheng et al．1997)等的細胞取得。然而兩種小鼠細胞株和兩種人的腫瘤，神經(jīng)膠質(zhì)瘤和黑瘤用分化誘導的方法并沒有失去端粒酶活性(Cheng et al．1997)。這可能與所用以研究的癌細胞的種類不同有關(guān)。
端粒酶活性在Xenopus模型(Mantell和Greider，1994)的細胞周期抽取物的S和M階段顯示很活躍，這提示端粒酶活性并不是被染色體的DNA復制所調(diào)節(jié)。因此，一次細胞周期的停止也許不能足夠抑制端粒酶的活性。另一方面，不是所有分裂的細胞需要端粒酶的活性。這種可能可以部份的解釋為什么有一些分化的細胞保留繁殖的能力，而且是在沒有端粒酶活性下進行分裂；同時為什么如上面所述在各種體外惡性腫瘤分化誘導結(jié)果對端粒酶活性有不同的抑制。前者顯明的例子有分化的纖維細胞、淋巴細胞、良性的腫瘤和某種血癌如ALL和CML(Morin，1995；Kim et al．1994；Tahara et al．1995)。
總而言之，我們研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射用尿多酸肽藥物組合物對血癌細胞經(jīng)過細胞分化的誘導有抗腫瘤的療效，附隨的有抑制端粒酶活性的效果。端粒酶活性的抑制與劑量和時間有非常密切的關(guān)系。我們初步研究的結(jié)果顯示兩種人的黑瘤細胞株以0．5-4mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物劑量處理7天結(jié)果并沒有抑制端粒酶的活性。從造血原始干細胞獲得的癌細胞對分化誘導有反應而向下調(diào)節(jié)他們的端粒酶活性是很可能的，而從再回復突變得來的實體腫瘤細胞可能對端粒酶活性的分化調(diào)節(jié)沒有反應。不同種類的癌細胞的端粒酶活性對分化抑制的敏感性不同，有些癌細胞可能對“分化療法”有反應而其他的癌細胞就沒有反應。然而有一點應當記住，即使對注射用尿多酸肽藥物組合物治療沒有反應的腫瘤細胞，若與其它療法如放射療法合用時，與單獨接受放射療法相比較，發(fā)現(xiàn)更容易把癌細胞殺死，因此在使用注射用尿多酸肽藥物組合物以前，應當取樣少量癌組織鑒定其是否含有端粒酶，以確定其是否適用注射用尿多酸肽藥物組合物治療。
試驗結(jié)論通過離體試驗證明注射用尿多酸肽藥物組合物能抑制人骨髓血癌細胞(HL-60)的生長；并能抑制該細胞中端粒酶的活性，提示注射用尿多酸肽藥物組合物可能是一種細胞分化劑。
實施例十五．注射用尿多酸肽藥物組合物離體和在體對人肝癌Smmu的藥效研究受試藥物注射用尿多酸肽藥物組合物由本公司生產(chǎn)提供。批號970810。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml。固形物含量200mg／ml。外觀呈深棕色澄明液。無沉淀和絮狀物現(xiàn)象，流動性良好，振蕩不起泡沫。避光室溫保存。試驗前直接或以無牛血清的DMEM適當稀釋備用。
動物裸鼠雌雄各半，體重18-20g，中國藥品生物制品檢定所動物繁育場提供。健康，預飼養(yǎng)7日。
飼養(yǎng)管理條件按SPF動物要求管理飼養(yǎng)。群養(yǎng)，每籠5只，室內(nèi)溫度、濕度、光照和通風控制合乎標準。自由攝食充足供水。實驗前觀察1周并記錄相應情況。
腫瘤細胞株人肝癌Smmu7721細胞，由中國藥品生物制品檢定所生化藥物與基因工程藥物室傳代培養(yǎng)。
試劑和器材試劑培養(yǎng)基DMEM(Sigma)液加入10％小牛血清，青、鏈霉素各100單位／ml，pH調(diào)至7．2-7．4。
MTT Sigma產(chǎn)，以DMEM液配制成0．4mg／ml的溶液。
二甲基亞砜北京化工廠，分析純。
環(huán)磷酰胺(CTX)200mg／支，上海華聯(lián)制藥有限公司。
儀器培養(yǎng)箱二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma Scientific333型)酶標儀ETERTECH∑960型檢測項目、方法及試驗結(jié)果1．離體抗腫瘤試驗1．1試驗方法及步驟MTT法測定供試品對癌細胞的抑制作用。取對數(shù)生長期的癌細胞，用Versens消化液將細胞消化，懸浮于培養(yǎng)基中，將細胞濃度調(diào)至1．0×105個／ml，鋪96孔細胞培養(yǎng)板，100μl／孔，加供試品100μl／孔，每濃度4孔，設空白對照及正常細胞對照孔，培養(yǎng)板置37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72小時，棄去上清液，加入MTT液100μl／孔，置37℃5％二氧化碳培養(yǎng)箱中4小時，棄去上清液，加入二甲基亞砜100μl／孔，置振蕩器上振蕩，至顆粒溶解為止，用酶標儀測定OD值，波長550nm，回歸計算IC50，即50％細胞存活濃度。OD值為4孔平均值。
1．2試驗結(jié)果試驗結(jié)果見表17。對照組OD值為1．131，細胞存活率定為100％。
細胞存活率=注射用尿多酸肽藥物組合物各劑量組的OD均值／對照組OD均值×100％可見隨著注射用尿多酸肽藥物組合物濃度增加OD及細胞存活率明顯減小，有密切的劑量依賴關(guān)系。
由表1數(shù)據(jù)求出注射用尿多酸肽藥物組合物的IC50等于0．78±0．41(x±s-)表17不同濃度注射用尿多酸肽藥物組合物離體對人肝癌Smmu7721細胞的作用
1．3結(jié)論注射用尿多酸肽藥物組合物對體外人肝癌細胞的半數(shù)抑制濃度IC50在0．72-0．83mg／ml的范圍內(nèi)。
2．在體抗腫瘤試驗2．1試驗方法及步驟分組共5個組；注射用尿多酸肽藥物組合物3個劑量組；陽性對照為CTX；陰性對照為生理鹽水。
接種肝癌細胞懸浮液1-2×107個／鼠，背部皮下接種。接種一周后選擇接種上腫瘤的裸鼠(肉眼可見小米粒大小)，隨機均為分組，每組4-6只。
給藥劑量供試品以生理鹽水稀釋成200、100、50mg／ml，腹腔注射0．2ml／只／次，即400、200、100mg／kg體重，每天1次，連續(xù)10天。
給藥途徑按《新藥(西藥)臨床前研究指導原則匯編》臨床用藥靜脈給藥者可用腹腔注射代替，故本實驗采用腹腔注射。
2．2試驗結(jié)果表18各組各批次裸鼠體內(nèi)抗腫瘤試驗結(jié)果
*P＜0．05，**P＜0．01連續(xù)給藥10天，停藥24小時后處死動物，解剖剝離瘤塊，稱瘤重，計算抑瘤率及與空白對照作t-測驗，P＜0．05時表示差異有顯著性意義。4次試驗結(jié)果見表18。
計算公式抑瘤％=100×(C-T)／C式中T為給藥組平均瘤重，C為對照組平均瘤重。
5個組的瘤的外觀大小見附圖54-58。
2．3結(jié)論注射用尿多酸肽藥物組合物劑量為100-400mg／kg裸鼠體重時，對裸鼠接種人肝癌細胞株的抑瘤率在51．8-83．5％，具有一定的抑制腫瘤生長的作用。實施例十二注射用尿多酸肽藥物組合物離體對肺癌細胞，在體對腹水性肝癌、肝癌實體瘤以及肺癌實體瘤的影響受試藥物注射用尿多酸肽藥物組合物本公司生產(chǎn)提供。共3個批號960601，960606，960608。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100mL。固形物含量40mg／mL。外觀呈深棕色澄明液。無沉淀和絮狀物現(xiàn)象，流動性良好，振蕩不起泡沫。避光室溫保存。
試驗前直接或以生理鹽水適當稀釋應用。
動物小鼠為昆明種封閉群，體重18-22g，皆為雌性，由中國醫(yī)科大學實驗動物部(遼寧省實驗動物管理委員會認可并頒發(fā)合格證書單位，沈陽110001)提供，合格證號遼實動字第521號。健康，預飼養(yǎng)7日。
C57／BL純系黑鼠體重18-21g，皆為雌性，由中國醫(yī)科大學實驗動物部提供，合格證號遼實動字第532號。健康，預飼養(yǎng)7日。
飼養(yǎng)管理條件群養(yǎng)，每籠5只，室內(nèi)溫度、濕度、光照和通風自然，冬季有暖氣，必要時開通風扇。飼料為沈陽市實驗動物飼料廠提供的實驗動物鼠全價顆粒飼料，標準代號DB21-741-93，自由攝食充足供水。實驗前觀察1周并記錄相應情況。
4．腫瘤細胞株(1)人肺癌細胞株AGZY-83A，引自鞍山市腫瘤研究所。用于離體試驗。
(2)肝癌細胞株HCP，中科院上海藥物研究所藥理研究室提供。液氮保存。用于小鼠腹水瘤及實體瘤模型。
(3)鼠肺癌細胞株Lewis肺癌，中科院上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥物所提供。用C57／BL鼠進行實體瘤造型。
試劑和器材RPMI培養(yǎng)粉 美國JR Scientific Inc生產(chǎn)。
小牛血清天津系列化制品所生產(chǎn)。
絲裂霉素日本Kyowa Hakko Kogyo有限公司生產(chǎn)，批號098AFC。
24孔培養(yǎng)板美國Corning(New York)產(chǎn)品。
檢測項目、方法及試驗結(jié)果1．離體抗腫瘤作用1．1試驗方法(1)試驗分組、濃度及給藥方案設計分為以下7組陰性(模擬處理)對照組加RPMI／1640培養(yǎng)液；低濃度組加受試藥物(0．157mg／mL)；中濃度組加受試藥物(0．313mg／mL)；高濃度組加受試藥物(0．625mg／mL)；超高濃度組(2組)加受試藥物(1．25或2．5mg／mL)；陽性對照組加絲裂霉素(0．01mg／mL)。
每組設3個重復孔。
(2)方法及步驟先將AGZY-83A細胞復蘇培養(yǎng)，待細胞生長旺盛時，將細胞制成為1×104個／mL的濃度，向24孔板內(nèi)每孔加1mL，再按上述分組加入等容相應藥液，置37℃5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔24小時用0．4％臺盼蘭染色計數(shù)死、活細胞數(shù)，連續(xù)計測7天。
(3)計算公式細胞生長抑制率(％)=(1-各組活細胞數(shù)／陰性對照組活細胞數(shù))×1001．2試驗結(jié)果試驗結(jié)果列于表19，可知受試藥物在一定濃度時對癌細胞有一定的抑制作用，且有量-效關(guān)系。但濃度較高濃度組再大時(1．25或2．5mg／mL)抑制作用并不再增加，因而測不到具體的IC50值。
表19各組對人肺癌細胞的抑制率(％，第7天3個孔均值)
陽性對照組 絲裂霉素陰性對照、高濃度及陽性對照組的生長曲線如圖3所示。
1．3試驗結(jié)論由以上結(jié)果可知離體試驗中受試藥物對人肺癌細胞的生長有抑制作用，且呈現(xiàn)量-效關(guān)系。但作用強度和性質(zhì)與絲裂霉素不同，后者使細胞迅速死亡，不再生長。這說明受試藥物不是典型的細胞毒劑。
2．在體延長腹水型肝癌動物生存期作用的試驗2．1試驗方法(1)腫瘤造型將液氮保存的肝癌細胞復蘇后，接種于小鼠腹腔內(nèi)使形成腹水。抽出腹水收取癌細胞，用生理鹽水稀釋使癌細胞密度為2×106個／mL。取75只小鼠，每只小鼠腹腔接種0．2mL(4×105個癌細胞)，隨機分組，24小時后開始試驗。
(2)試驗分組、劑量及給藥方案設計分為以下5組(每組15只小鼠)。受試藥物高劑量為1250mg／kg，相當人臨床用量(167mg／kg)的7．5倍。絲裂霉素劑量為1mg／kg，亦相當人臨床用量的8倍左右。
陰性(模擬處理)對照組iv生理鹽水；低劑量組iv受試藥物(6．25mg／20g)；中劑量組iv受試藥物(12．5mg／20g)；高劑量組iv受試藥物(25．0mg／20g)；陽性對照組iv絲裂霉素(0．02mg／20g)。
藥物以生理鹽水稀釋(高劑量組不稀釋)，每只小鼠經(jīng)尾靜脈iv鹽水或藥液0．5mL／20g，每天一次，連續(xù)14天。
(3)方法及步驟各組連續(xù)給藥14天后停止iv，但繼續(xù)飼養(yǎng)觀察動物一般狀況，記錄各組各動物的死亡時間及死時體重。
(4)計算公式生命延長率(％)=100×(T-C)／CT……各組的半均生存天數(shù)C……陰性對照組的平均生存天數(shù)2．2結(jié)果如上試驗先后共進行了兩批，結(jié)果合并列于表20。除表內(nèi)數(shù)據(jù)外還重點觀察了動物的一般狀態(tài)(食欲、精神狀態(tài)、活動、皮毛)。絲裂霉素組動物，皆有食欲不佳、精神不振、萎蘼、活動少、皮毛無光和瘦小；而受試物組與陰性對照組則無此情況。
表20各組動物死時體重、生存天數(shù)及生命延長率的均值
結(jié)果表明受試藥物較之絲裂霉素能改善動物生活質(zhì)量，動物體重不減少；在一定劑量時能延長動物生存期，有量效關(guān)系，雖然未達＞30％的療效標準，但延長率可達24％左右。
3．在體對抗動物肝癌實體瘤作用的試驗31試驗方法(1)腫瘤造型將液氮凍存的HCP肝癌細胞株復蘇后，接種于小鼠前臂皮下，形成腫瘤后，取出腫瘤，制備癌細胞懸液。取50只小鼠，每只小鼠按3×105個癌細胞接種于小鼠前臂皮下。隨機分為5組，每組10只。稱體重，24小時后開始試驗。
(2)試驗分組、劑量及給藥方案設計分為以下5組(每組10只小鼠)陰性(模擬處理)對照組iv生理鹽水；低劑量組iv受試藥物(5．0mg／20g)；中劑量組iv受試藥物(10．0mg／20g)；高劑量組iv受試藥物(20．0mg／20g)；陽性對照組iv絲裂霉素(0．03mg／20g)。
藥物以生理鹽水稀釋(高劑量組不稀釋)，每只小鼠經(jīng)尾靜脈iv鹽水或藥液0．5mL／20g，每天一次，連續(xù)14天。
(3)方法及步驟各組連續(xù)給藥14天后，用乙醚處死小鼠，稱體重，剝離出腫瘤并稱瘤重。肉眼觀察后取主要臟器與瘤一并放入中性福爾馬林中固定。
(4)計算公式腫瘤抑制率(％)=(1-T／C)100T……各組的平均瘤重C……陰性對照組的平均瘤重3．2結(jié)果如上試驗先后共進行了三批，結(jié)果合并列于表20。除表內(nèi)數(shù)據(jù)外還重點觀察了動物的一般狀態(tài)(食欲、精神狀態(tài)、活動、皮毛)。絲裂霉素組動物，皆有食欲不佳、精神不振、萎蘼、活動少、皮毛無光和瘦??；而受試物組與陰性對照組則無此情況，且受試物組動物狀態(tài)還好于陰性對照組。試驗過程中各組動物均有死亡。
表21各組動物存活數(shù)、瘤重及抑制率的均值(x±s)
** P＜0．01，*P＜0．05結(jié)果表明受試藥物在3種劑量時都能抑制腫瘤的生長，有量效關(guān)系，抑制率平均可達29％左右，高劑量組可達34．5％，與陰性對照相比差異在統(tǒng)計學上有尚顯著的意義(P＜0．05)。受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，而絲裂霉素雖有明顯抑瘤效果但使動物生活質(zhì)量明顯惡化。
4．在體對抗動物肺癌實體瘤作用的試驗41試驗方法(1)腫瘤造型將兩只已皮下荷Lewis肺癌株的C57黑鼠處死，75％乙醇消毒皮膚，切皮取出瘤塊，剪碎研磨后，過200目網(wǎng)、離心，用生理鹽水調(diào)細胞濃度為1×106個／mL，共28mL。取70只C57／BL純系黑鼠，每只皮下注射0．25mL。按體重組間一致原則分為5組，每組10只。24小時后開始試驗。
(2)試驗分組、劑量及給藥方案設計分為以下5組(每組10只小鼠)陰性(模擬處理)對照組ip生理鹽水；低劑量組ip受試藥物(5．0mg／20g)；中劑量組ip受試藥物(10．0mg／20g)；高劑量組ip受試藥物(20．0mg／20g)；陽性對照組ip絲裂霉素(0．025mg／20g)。
藥物以生理鹽水稀釋，每只小鼠ip鹽水或藥液0．5mL／20g，每天一次，連續(xù)10天。
(3)方法及步驟各組連續(xù)給藥10天后，頸椎脫臼處死小鼠，稱體重，剝離出腫瘤并稱瘤重。肉眼觀察后取主要臟器與瘤一并放入中性福爾馬林中固定。
(4)計算公式腫瘤抑制率(％)=(1-T／C)×100T……各組的平均瘤重C……陰性對照組的平均瘤重4．2結(jié)果如上試驗先后共進行了三批，結(jié)果合并列于表22。除表內(nèi)數(shù)據(jù)外還重點觀察了動物的一般狀態(tài)(食欲、精神狀態(tài)、活動、皮毛)。絲裂霉素組動物，皆有食欲不佳、精神不振、萎蘼、活動少、皮毛無光澤和瘦小；而受試物組與陰性對照組則無此情況，動物進食飲水和活動狀態(tài)良好，皮毛順滑有光澤。試驗過程中各組動物均有死亡。
表22各組動物存活數(shù)、瘤重及抑制率的均值(x±s)
**P＜0．01結(jié)果表明受試藥物在3種劑量時都能抑制腫瘤的生長，有量效關(guān)系，中高劑量組抑制率平均可達20％左右。受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，而絲裂霉素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質(zhì)量明顯惡化，約1／3動物在試驗終止日期前死亡。
試驗總結(jié)4項試驗的結(jié)果證明了注射用尿多酸肽藥物組合物有一定程度的抗腫瘤藥效。①離體抗腫瘤作用試驗表明受試藥物對人肺癌細胞的生長有抑制作用，且呈現(xiàn)量效關(guān)系。②在體延長腹水型肝癌動物生存期作用的試驗受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，在一定劑量時能延長動物生存期(延長率24％左右)。③在體對抗動物肝癌實體瘤作用的試驗受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，在3種劑量時都能抑制腫瘤生長，抑制率平均可達29％左右，高劑量組可達34．5％(P＜0．05)；而絲裂霉素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質(zhì)量明顯惡化。④在體對抗動物肺癌實體瘤作用的試驗受試藥物能改善動物生活質(zhì)量，3種劑量都能抑制腫瘤的生長，有量效關(guān)系，中高劑量組抑制率平均可達20％左右；而絲裂霉素雖有明顯抑瘤效果(P＜0．01)但使動物生活質(zhì)量明顯惡化，約1／3動物在試驗終止日期前死亡。故認為受試藥物有一定的抗腫瘤效果，且作用性質(zhì)與絲裂霉素不同，前者改善而后者惡化動物生活質(zhì)量。
實施例十六．尿多酸肽藥物組合物防治裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的療效觀察肝癌的轉(zhuǎn)移復發(fā)是目前影響肝癌療效的主要因素之一。即使是小肝癌早期根治性切除后，五年復發(fā)率也高達43．5％[1]。本實驗在裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生前后行肝癌切除術(shù)，術(shù)后采用尿多酸肽藥物組合物皮下注射，觀察在體試驗其是否有防治裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移復發(fā)的療效。
受試藥物尿多酸肽藥物組合物由本公司生產(chǎn)提供，批號970508。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml。固形物含量40mg／ml。外觀呈深棕色澄明液。無沉淀和絮狀物現(xiàn)象，流動性良好，振蕩不起泡沫，避光室溫保存。試驗前直接或以生理鹽水適當稀釋應用。
動物裸鼠為BALB／CA品系，雄性，上海藥物研究所提供。鼠齡4-6周，體重17-20g。共13只。健康，預飼養(yǎng)7日。
飼養(yǎng)管理條件按SPF動物要求管理飼養(yǎng)。群養(yǎng)，每籠5只，室內(nèi)溫度、濕度、光照和通風控制合乎標準。自由攝食充足供水。實驗前觀察1周并記錄相應情況。
腫瘤細胞株瘤源為上海醫(yī)科大學中山醫(yī)院肝癌研究所LCI-D20□裸鼠肝癌高轉(zhuǎn)移模型，斷頸處死動物，開腹取腫瘤組織，將其切成0．2×0．2×2cm3大小，置于4℃的生理鹽水中備用。
試驗方法動物模型的制作裸鼠用1％戊巴比妥鈉40-50ng／kg腹腔注射麻醉；左上腹橫切口約1cm，將肝臟暴露于切口處，切開肝包膜0．3cm，將瘤塊植于肝內(nèi)，8-0無損傷外科縫線縫合肝包膜固定瘤塊，將肝臟輕輕送回腹腔，關(guān)腹。麻醉清醒后送回籠內(nèi)飼養(yǎng)，術(shù)后自由進食。
本模型動物于種植后第19天發(fā)生轉(zhuǎn)移。實驗動物隨機分二組，早期癌組于接種后16天行肝癌切除術(shù)，晚期肝癌組于接種后22天行肝癌切除術(shù)。以上述同樣方法麻醉動物后，取右上腹橫切口，長約1cm，將肝臟暴露于切口下，仔細觀察肝內(nèi)種植瘤生長的范圍，在距腫瘤邊緣約0．2cm處絞鎖縫合正常肝組織，局部切除肝癌組織。檢查局部無肝癌組織殘留后，按壓片刻，無活動出血后關(guān)腹。皮下注射生理鹽水1ml，麻醉清醒后送回籠內(nèi)飼養(yǎng)，自由進食。
藥物用量與注射方案為增強療效同時合用鈣離子和Vit C?；旌先芤号渲?；尿多酸肽藥物組合物注射液1ml(40mg)+10％葡萄酸鈣0．1ml+Vit C 0．5ml(250mg)。藥量為每只動物每天皮下注射1．6ml。早期肝癌組在接種后16-24天連續(xù)皮下注射共9天，晚期肝癌組接種后23-31天連續(xù)皮下注射共9天。對照組注射等容的生理鹽水。
觀察指標于接種后35天，裸鼠稱重后以摘眼球放血的辦法處死動物，取雙肺稱重后，放于10％福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，每個蠟塊間隔50μm切取5μm厚切片一張，連續(xù)10張，雙側(cè)肺共20張，記錄轉(zhuǎn)移灶的數(shù)目。完整取出肝組織，記錄肉眼肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶數(shù)目、分布及切緣復發(fā)情況。切緣復發(fā)灶大小按(腫瘤最大徑+與其垂直的腫瘤直徑)÷2計算，觀察記錄轉(zhuǎn)移累及臟器的數(shù)目。
試驗結(jié)果1．裸鼠體重改變早期肝癌切除對照組平均體重為24．3±2．1g，尿多酸肽藥物組合物組為25．8±1．9g，雖然尿多酸肽藥物組合物組稍高，但經(jīng)過計量資料t-檢驗統(tǒng)計學處理，差異無顯著性(P＞0．05)。
晚期肝癌切除對照組平均體重為21．3±1．8g，尿多酸肽藥物組合物組為25．1±2．0g。經(jīng)統(tǒng)計學分析，尿多酸肽藥物組合物組比對照組體重增高差異有顯著性(P＜0．05)。
2．肝內(nèi)局部轉(zhuǎn)移復發(fā)情況表23不同治療組肝癌內(nèi)轉(zhuǎn)移復發(fā)情況(x±s)
*與相應對照組比較P＜0．05，**與相應對照組比較P＜0．01正常裸鼠肝臟為7個葉，早期肝癌切除對照組5只動物均出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目7．2個，累及葉數(shù)為3．7個。尿多酸肽藥物組合物組5只動物有3只發(fā)生轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目2．6個，累及葉數(shù)1．8個。晚期肝癌切除對照組5只動物均出現(xiàn)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶，最多為22個，所有7個葉均受累；最少肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶1個，但較大同時累及3個葉；平均轉(zhuǎn)移灶數(shù)目8．6個，累及葉數(shù)4．6個。尿多酸肽藥物組合物組5只動物只有3只發(fā)生肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移灶數(shù)目1．0個，累及葉數(shù)1．2個。因本組數(shù)據(jù)離散度較大，未做統(tǒng)計學分析，但從以上數(shù)據(jù)可看出，尿多酸肽藥物組合物組早期和晚期裸鼠肝癌切除后的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移均較對照組輕。(見表23)肝濕重早期切除二組無差別(P＞0．05)，晚期切除尿多酸肽藥物組合物組明顯減輕。
早、晚期切除切緣局部復發(fā)尿多酸肽藥物組合物組腫瘤直徑均較對照組小，但與對照組比較早期切除時在統(tǒng)計學上差異有顯著性(P＜0．01)．晚期切除時二組比較差異無顯著性(P＞0．05)。
3．肺遠處血行轉(zhuǎn)移情況表24不同治療組肝癌肺內(nèi)轉(zhuǎn)移情況(x±s)
*與相應對照組相比P＜0．05雙肺共連續(xù)切片20張，在光鏡下計數(shù)轉(zhuǎn)移灶發(fā)生的數(shù)目之和。2個對照組5只動物均見肺轉(zhuǎn)移灶，早期肝癌切除尿多酸肽藥物組合物組無肺轉(zhuǎn)移發(fā)生，晚期肝癌切除只有3只動物有轉(zhuǎn)移灶，相應的二組比較統(tǒng)計學上均有顯著性．肺濕重治療與否均無差別。
4．轉(zhuǎn)移灶發(fā)生部位肺瘤接種后35天觀察，除上述肝原位轉(zhuǎn)移灶和肺遠處轉(zhuǎn)移灶外，尚可見切口、腸系膜、生殖腺、肝門部、腎下極、脾門、膈肌、胰腺上緣轉(zhuǎn)移，早、晚期肝癌切除后應用尿多酸肽藥物組合物都可以抑制遠處轉(zhuǎn)移的程度。結(jié)果見表25。
表25不同組轉(zhuǎn)移灶累及臟器(x±s)
*與相應對照組相比P＜0．05討論與結(jié)論惡性腫瘤細胞無論在形態(tài)、功能和代謝上均類似于未分化的胚胎細胞，分化誘導劑可使腫瘤細胞的生物學和免疫學特性向正常細胞轉(zhuǎn)化。目前已取得較好臨床應用的是全反式視黃酸對早幼粒細胞白血病的治療，85．4％的病人可獲完全緩解。研究表現(xiàn)，細胞表面粘附分子在細胞未成熟期表達較高，隨著細胞成熟表達下降。肝癌的高轉(zhuǎn)移與細胞表面的細胞間粘附分子-1(ICAM-1)高表達有關(guān)。
尿多酸肽藥物組合物是一種細胞分化誘導劑，我們希望它能誘導細胞分化成熟，使肝癌切除術(shù)后殘留的癌細胞或有癌變傾向的細胞逆轉(zhuǎn)；也希望因此降低癌細胞表面粘附分子的表達，使其轉(zhuǎn)移能力下降。
實驗結(jié)果表明裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生后行局部腫瘤切除后應用尿多酸肽藥物組合物，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生減少，肝濕重降低，切緣局部復發(fā)腫瘤也較少，能有效抑制內(nèi)轉(zhuǎn)移和復發(fā)。反映遠處轉(zhuǎn)移的肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目和轉(zhuǎn)移累及的臟器的數(shù)目也減少，因此認為尿多酸肽藥物組合物能降低裸鼠晚期肝癌的轉(zhuǎn)移復發(fā)。裸鼠肝癌轉(zhuǎn)移發(fā)生前行局部肝癌切除后行尿多酸肽藥物組合物治療，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移灶和轉(zhuǎn)移累及臟器數(shù)目也減少，無肺內(nèi)轉(zhuǎn)移發(fā)生，證明其對裸鼠早期肝癌切除術(shù)后的轉(zhuǎn)移復發(fā)也有良好的防治效果。
實施例十七．注射用尿多酸肽藥物組合物逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的初步研究受試藥物注射用尿多酸肽藥物組合物由本公司生產(chǎn)提供。批號980508。玻璃瓶膠塞鋁蓋無菌封裝，每瓶100ml。固形物含量40mg／ml。外觀呈棕褐色半透明液。無沉淀和絮狀物現(xiàn)象，流動性良好，振蕩不起泡沫。避光室溫保存。
試驗前直接或以生理鹽水適當稀釋應用。
腫瘤細胞株人口腔磷狀上皮癌細胞(KB)VCR耐用藥株(KBV200)，由軍事醫(yī)學科學院附屬醫(yī)院腫瘤分子生物學實驗室保存。
人肺癌細胞(H23)，肺癌ADR、CDDP耐藥株(H1435)由臺灣饋贈。
試劑長春新堿(VCR)北京醫(yī)科大學實驗廠產(chǎn)生。
鹽酸阿霉素(ADR)深圳萬樂藥業(yè)產(chǎn)品。
順鉑(DDP)齊魯制藥廠產(chǎn)品。
維拉帕米(Ver)江蘇連云港制藥廠產(chǎn)品。
噻唑蘭(MTT)、異硫氰酸胍、RNasin、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶均系Promega公司產(chǎn)品。
Taq DNA聚合酶寶生生物公司產(chǎn)品。
試驗方法及結(jié)果1．試驗方法細胞耐藥逆轉(zhuǎn)取對數(shù)生長期細胞，胰酶消化，調(diào)節(jié)細胞濃度3-5×104／ml，0．1ml／孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)1d，實驗組分別加注射用尿多酸肽藥物組合物0．4、0．8、1．2mg／ml。實驗對照組加Ver 6μg／ml。單獨作用組加抗癌藥。平行3孔。繼續(xù)培養(yǎng)3d，棄去培養(yǎng)液，每孔加0．4mg／ml的MTT200μl，培養(yǎng)4h，棄去MTT，每孔加DMSO 150μl，待溶解后，于Anthos2010酶標儀，在570nm處測光吸收值。實驗對照組以單加Ver為對照孔，實驗組以單加注射用尿多酸肽藥物組合物為對照孔，求出半數(shù)抑制濃度IC50。
引物設計MDR1基因引物取自其cDNA序列5′(2596～2615bp)；(2733～2725bp)；擴增片段167bp。MRP基因引物取自其cDNA序列5′(4670～4691bp)；3′(4988～500bp)；擴增片斷336bp。GST-π基因引物取自其cDNA序列5′(863～882bp)；3′(1192～1213bp)；擴增片段350bp。β-肌動蛋白(β-actin)基因引物取自其cDNA序列5′(346～367bp)；3′(558～580bp)；擴增片斷234bp。上述各引物均為上海醫(yī)科大學肝病研究所設計，上海生工公司合成。
細胞總RNA提取接種細胞3-5×105／瓶，貼壁培養(yǎng)48小時，至細胞生長對數(shù)期，實驗組給以注射用尿多酸肽藥物組合物至終濃度2mg／ml、4mg／ml。與對照組共同培養(yǎng)48小時后，胰酶消化，PBS洗滌離心后，采用異硫氰酸胍、酚-氯仿一步法提取細胞總RNA。
逆轉(zhuǎn)錄-PCR方法取細胞總數(shù)RNA 1μg，5×RT緩沖液4μl，10μg／ml oligo(dT)，0．5mmol／LdNTP Mix，65預變性5min，冰浴3min，加RNasin 10u，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶10u，42反應60min，合成cDNA第一條鏈。在2μl上述cDNA產(chǎn)物加入10×PCR緩沖液2μl、MDRl、MRP、GST-π、β-actin引物各10pmol／L、Tap DNA聚合酶1u，(總體系統(tǒng)20μl)進行PCR擴增。循環(huán)參數(shù)為95變性40s，55退火40s，72延伸1min，30個循環(huán)，72補平10min。
PCR產(chǎn)物定量分析取擴增產(chǎn)物10μl，行2％瓊脂糖電泳，溴化乙錠染色。Kodak DigitalScience凝膠成像系統(tǒng)照相，1D軟件定量分析各條帶的含量，計算MDR1、MRP、GST-π與β-actin的化值。
2．試驗結(jié)果2．1注射用尿多酸肽藥物組合物注射液對腫瘤敏感和耐藥細胞的抑制作用結(jié)果列于表26?？芍⑸溆媚蚨嗨犭乃幬锝M合物，對KB和KBV200以及H23和H1435的敏感和耐藥兩類腫瘤細胞株，在抑制作用的敏感性上均無明顯差異。
表26注射用尿多酸肽藥物組合物對各類腫瘤細胞抑制作用的敏感性
2．2注射用尿多酸肽藥物組合物協(xié)同化療藥對耐藥逆轉(zhuǎn)作用的影響實驗中我們以鈣通道阻滯劑維拉帕米(Ver)，作為有效對照組。結(jié)果列于表27?？芍嵌拘詽舛?μg／ml的Ver與VCR聯(lián)合應用，能有效降低KBV300細胞的IC50值，從4．38μmol／L降至0．083μmol／L，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為52倍。而0．4mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物與VCR協(xié)同作用，同樣能增強VCR對KBV200耐藥細胞的毒性，使耐受VCR的KBV300的細胞的IC50值從4．38μmol／L降至0．266μmol／L，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為16倍。與單獨VCR作用組相比，P值＜0．01。0．8mg／ml和1．2mg／ml(IC20、IC30)的注射用尿多酸肽藥物組合物能有效逆轉(zhuǎn)KBV200對VCR的耐受，介逆轉(zhuǎn)程度不如0．4mg／ml(IC50)劑量組。
表27注射用尿多酸肽藥物組合物與VCR聯(lián)用對KBV200耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用
☆指IC50時所需VCR濃度，**P＜0．01*，與單獨VCR組相比2．3注射用尿多酸肽藥物組合物對MDR1、MRP、GST-π耐用藥相關(guān)基因表達的影響2．3．1KB和KBV200細胞MDR1、MRP、GST-π基因表達4mg／ml的注射用尿多酸肽藥物組合物作用KB細胞48h后，均誘導出MDR1、MRP、GST-π基因弱表達。KBV200細胞為基因高表達細胞株，隨著注射用尿多酸肽藥物組合物劑量的增加，MDR1基因的表達量有增加趨勢，但差異較小。均未誘導出MRP和GST-π基因的表達。
2．3．2H23和H1435細胞MDR1、MRP、GST-π基因表達H23和H1435細胞在未給藥前均有MRP和GST-π基因的表達，H23細胞H1435基因的表達經(jīng)注射用尿多酸肽藥物組合物誘導后而消失，對GST-π基因表達影響不大。給藥前后未見MRP基因表達。H1435細胞MDR1和GST-π基因表達量均隨注射用尿多酸肽藥物組合物劑量增加而下降。未誘導出MRP基因的表達。
討論及結(jié)論腫瘤多藥耐藥性的分子基礎是多方面的。由于抗腫瘤藥物的長期作用，并誘導細胞相關(guān)基因的表達和調(diào)控異常，從而引起與耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)、功能及表達水平發(fā)生改變，導致耐藥性。耐藥產(chǎn)生的機制主要有(1)P-糖蛋白(P-gp)泵出理論，減少細胞內(nèi)藥物蓄積，與多耐藥基因(MDR1)和多藥耐藥相關(guān)蛋白(MRP)過表達有關(guān)。(2)通過細胞內(nèi)解毒系統(tǒng)，促進藥物代謝或降低細胞內(nèi)藥物毒性，與谷胱苷肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)表達水平有關(guān)。因此，MDR1、MRP、和GST-π在耐藥中起著極其重要的作用。腫瘤多藥耐藥性逆轉(zhuǎn)，近年研究較多的是針對P-gp通過增加藥物在MDR細胞中的蓄積而增強化療藥物的細胞毒性作用。本實驗是以具有抗腫瘤作用的注射用尿多酸肽藥物組合物藥物，在研究其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性。
我們以Ver為逆轉(zhuǎn)有效對照組，平行觀察注射用尿多酸肽藥物組合物在耐藥逆轉(zhuǎn)達中的作用。草藥初步結(jié)果表明，0．4mg／ml注射用尿多酸肽藥物組合物能有效地增加VCR對KBV200耐藥細胞的毒性，與VCR聯(lián)合作用，使KBV200細胞的IC50值從4．38μmol／L降至0．26μmol／L，逆轉(zhuǎn)耐藥倍數(shù)為16倍。KBV200為耐藥(MDR相關(guān))細胞，其耐藥機理主要是由于P-糖蛋白過表達導致藥物外排的增多所致[1]。我們的實驗結(jié)果表明，注射用尿多酸肽藥物組合物并未引起耐藥KBV200細胞中MDR1基因發(fā)生明顯變化，也未誘導出MRP和GST-π基因表達。因此，僅從MDR1基因過表達的角度來解釋腫瘤細胞MDR現(xiàn)象是片面的。我們的實驗結(jié)果提示，注射用尿多酸肽藥物組合物逆轉(zhuǎn)MDR介導的多藥耐藥性可能不是依賴P-gp的功能，而是參與其它逆轉(zhuǎn)耐藥途徑而發(fā)揮其作用。
我們的實驗還觀察到，注射用尿多酸肽藥物組合物對逆轉(zhuǎn)MDR耐藥作用與所需藥物濃度有密切關(guān)系，當藥物濃度在IC50即0．4mg／ml時，逆轉(zhuǎn)耐藥作用最強，優(yōu)于注射用尿多酸肽藥物組合物的高劑量濃度。這種注射用尿多酸肽藥物組合物劑量增加且逆轉(zhuǎn)程度降低的現(xiàn)象，可能性是注射用尿多酸肽藥物組合物與VCR藥物的相互作用，抵消了VCR的有效濃度。
從耐藥基因表達的實驗結(jié)果表明，注射用尿多酸肽藥物組合物對人肺癌細胞，無論是敏感H23和耐藥H1435細胞中MDR1和GST-π基因的表達量隨著注射用尿多酸肽藥物組合物劑量增加而減弱或消失。均未誘導出MRP基因表達。這一結(jié)果提示，注射用尿多酸肽藥物組合物對人肺癌H1435耐藥也可有逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥的作用。
權(quán)利要求
1．一種尿多酸肽組合物的制備方法，其特征在于將新鮮尿酸化，使PH小于等于3，以保證其穩(wěn)定并易于提??；過濾除去酸化尿中的大顆粒；超濾除去酸化尿中分子量較大的有機物質(zhì)，用醇浸泡吸附劑后用乙醇和去離子水分別洗滌吸附劑，裝吸附柱，以一定的流速將超濾后的酸化尿加入吸附柱內(nèi)，用吸附劑吸附濾液中的有效成分；酸化尿中的無機鹽離子和有機物在進入吸附劑后未被吸附的積存于柱內(nèi)，用軟水洗滌未被吸附但殘留在吸附劑中的無機物及親水性有機物，純化有效成分；用醇洗脫吸附在吸附柱上的有效成分；收集有色流出液，除溶劑濃縮后，干燥得到尿多酸肽干品，加水溶解，用堿調(diào)整PH至中性，低溫靜置析出濃縮過程中形成的結(jié)晶、聚合物，過濾除去結(jié)晶及膠體等雜質(zhì)，得到尿多酸肽藥物組合物中間體，經(jīng)除熱源、除病毒等工藝進一步純化。
2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于所述的酸化可以用鹽酸、硫酸，酸化至PH小于3。
3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于酸化至PH1．0-2．5。
4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于優(yōu)選酸化至PH1．2-1．8。
5．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用超濾的方法除去分子量大于1萬的有機物質(zhì)。
6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用超濾的方法除去分子量大于9000的有機物質(zhì)。
7．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用C18、XAD-6、XAD-7和XAD-16作為吸附劑吸附尿中的有效成分，優(yōu)選C18和XAD-7。
8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用軟水洗滌去除酸化尿中的無機鹽離子，以及在進入硅膠柱后未被吸附而積存于柱內(nèi)的有機物，以純化有效成分。
9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用乙醇、甲醇洗脫吸附在硅膠柱上的有效成分，優(yōu)選甲醇。
10．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用減壓蒸餾或膜技術(shù)除溶劑濃縮收集的有效成分。
11．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用冷凍干燥或真空干燥的方法干燥產(chǎn)物，優(yōu)選冷凍干燥。
12．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于用氫氧化鈉、碳酸鈉或碳酸氫鈉調(diào)整產(chǎn)物的PH值，優(yōu)選氫氧化鈉。
13．根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于回收率為投料量體積比的0．2--4％左右。
14．尿多酸肽組合物在用于治療癌癥及防止癌癥復。
全文摘要
本發(fā)明公開了尿多酸肽組合物的制備方法,將新鮮尿酸化,過濾除去酸化尿中的大顆粒;超濾除去酸化尿中分子量較大的有機物質(zhì),將超濾后的酸化尿加入吸附柱內(nèi),吸附其中的有效成分;用軟水洗滌末被吸附劑吸附但殘留在吸附劑中的無機物及親水性有機物用醇洗脫吸附在吸附柱上的有效成分;收集有色流出液,濃縮后,干燥得到干品;加水溶解,用堿調(diào)整pH至中性,低溫靜置析出濃縮過程中形成的雜質(zhì),經(jīng)除熱源、除病毒等工藝進一步純化。
文檔編號A61K35/22GK1294000SQ99122050
公開日2001年5月9日 申請日期1999年10月26日 優(yōu)先權(quán)日1999年10月26日
發(fā)明者張銘烈 申請人:合肥永生制藥有限公司