專利名稱：1,3－氧硫環(huán)戊烷核苷類似物藥物組合物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及核苷類似物及其在醫(yī)藥中的用途。更確切地說，本發(fā)明涉及1，3-氧硫環(huán)戊烷核苷類似物，其藥物組合物及其治療病毒性感染的用途。
下式(I)的化合物 (亦稱作BCH-189或/VGPB-21)被認為是具有抗病毒活性，特別是抗愛滋病致病因素——人體免疫力缺陷病毒(HIV′S)(見5th Anti-Aids Conference，Montreal，Canada5th-9th June 1989Abstracts T.C.O.1 andM.C.P.63；European Patent Application Publi-cation NO.0382562)。式(I)化合物是一種下式(I—1)和(I—2)兩種對映體的外消旋混合物 而且以其外消旋鹽的形式進行了說明和檢測。目前批準用于治療由HIV造成的病癥的唯一化合物是3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷(AZT，zidovudine，BW 509U)。但是，這種化合物具有顯著的付作用，所以或者不能使用，或者用后多數(shù)患者必須排出。因此，仍需要提供能有效地抗HIV、同時治療指數(shù)要好得多的化合物。
本發(fā)明人令人驚異地發(fā)現(xiàn)，式(I)化合物的對映體等效地抗HIV，但對映體之一〔(-)對映體〕比另一對映體具有低得多的細胞毒性。所以，在本發(fā)明的第一方面提供了式(I)化合物的(-)(或左旋)對映體及其藥用衍生物。
(-)對映體的化學名稱為(-)4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(以下稱作化合物(A))。它具有式(I—1)化合物的絕對立體化學構型，其名稱為(2R，順)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮。
最好提供基本上無相應的(+)對映體的化合物(A)，即存在不高于約5％(W/W)的(+)對映體，優(yōu)選不高于約2％，特別是低于約1％(W/W)。
所謂“藥用衍生物”意指化合物，(A)的任何藥用鹽、酯或這種酯的鹽，或給受體服用后能直接或間接地提供化合物(A)或抗病毒活性代謝物或其殘余物的任何其它化合物。
本領域普通技術人員都知道，在氧硫環(huán)戊烷環(huán)的堿部分中的官能團或羥基上對化合物(A)進行改性，可提供其藥用衍生物。所有這些官能團的改性均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。但是，特別關注的是由氧硫環(huán)戊烷環(huán)的2-羥甲基改性得到的藥用衍生物。
優(yōu)選的化合物(A)的酯包括其2-羥甲基的氫用?；倌軋FR-C＝0-取代的化合物〔其中該酯的非羰基部分R選自氫，直鏈或支鏈烷基(如甲基，乙基，正丙基，叔丁基，正丁基)，烷氧基烷基(如甲氧基甲基)，芳烷基(如芐基)，芳氧基烷基(如苯氧基甲基)，芳基(如可取代有氫、C1-4烷基或C1-4烷氧基的苯基)〕；磺酸酯，例如烷基-或芳烷基磺?；?如甲磺?；?；氨基酸酯(如L-異戊氨?；騆-亮氨?；?和一-、二-或三-磷酸酯。
就上述酯而言，除非另外注明，在這類酯中存在的任何烷基部分最好含1～16個碳原子，特別是1～4個碳原子。在這類酯中存在的任何芳基部分含一個苯基。
具體地說，所述酯可以是C1-16烷基酯，未取代的芐基酯或由至少一個鹵素(溴，氯，氟或碘)、C1-6烷基、C1-8烷氧基、硝基或三氟甲基取代了的芐基酯。
化合物(A)的藥用鹽包括那些由藥用無機酸和有機酸和堿得到的鹽。合適的酸的例子有鹽酸，氫溴酸，硫酸，硝酸，高氯酸，富馬酸，馬來酸，磷酸，羥基乙酸，乳酸，水揚酸，琥珀酸，對甲苯磺酸，酒石酸，乙酸，檸檬酸，甲磺酸，甲酸，苯甲酸，丙二酸，萘-2-磺酸和苯磺酸。其它酸(如草酸)即使本身不能藥用，但可用作制備本發(fā)明的化合物及其藥用酸加成鹽的中間體。
由合適的堿得到的鹽包括堿金屬(如鈉)、堿土金屬(如鎂)、銨和NR4+(其中R是C1-4烷基)的鹽。
以下參考的本發(fā)明化合物包括化合物(A)及其藥用衍生物。
本發(fā)明的化合物既可以本身具有抗病毒活性，也可以是這類化合物的代謝物。具體地說，這些化合物能有效地抑制逆病毒的復制，包括人體逆病毒在內(nèi)，例如導致AIDS病因的人體免疫力缺陷病毒(HIV′S)。
所以，本發(fā)明的另一方面提供用作活性治療劑、特別是用作抗病毒劑(如治療逆病毒感染)的化合物(A)或其藥用衍生物。
在又一方面中，提供一種治療病毒感染、特別是包括人體在內(nèi)的哺乳動物中因逆病毒(如HIV)造成的感染的方法，該方法包括服用有效量的化合物(A)或其藥用鹽。
在又一方面中，還提供化合物(A)或其藥用衍生物在制造用于治療病毒感染的藥物中的用途。
本發(fā)明的化合物還可用于治療與愛滋病有關的病癥，例如與愛滋病有關的復征(ARC)，逐漸形成的淋巴結病(PGL)，與愛滋病有關的神經(jīng)病癥(如癡呆或熱帶輕截癱)，抗HIV抗體陽性和HIV陽性病癥，卡波濟氏肉瘤，血小板減少的紫癜和伴生的機會致感染(如卡氏肺囊蟲)。
本發(fā)明的化合物還可用于防治抗HIV抗體或HIV抗原陽性的病人的疾病和預防HIV的暴露。
化合物(A)或其藥用衍生物還可用于預防生理流體的病毒感染(例如血液或體內(nèi)精液)。
本領域普通技術人員可以理解，這里參考治療方法可以拓展到預防以及治療成例感染或病癥。
本領域普通技術人員可以理解，用于治療所需的本發(fā)明化合物的量不僅隨所選的特定化合物而變化，而且還隨給藥途徑、治療病癥的性質(zhì)以及患者的年齡和體征而變化，最終將根據(jù)藥劑師或護理醫(yī)師的判斷而定。但一般來說，合適的劑量是每千克體重每天約0.1—約750mg/kg，優(yōu)選為0.5～60mg/kg/天，最佳為1～20mg/kg/天。
所需劑量可以一次服用，也可以在合適的間隔內(nèi)(如每天兩次、三次、四次或多次)分劑量服用。
化合物以單位劑量形式給藥較為方便，例如每單位劑量形式含10～1500mg、優(yōu)選20～1000mg、最佳50～700mg活性成份。
活性成分應最好能達到活性化合物的峰值血漿濃度約1～約75μm、優(yōu)選約2～50μm、最佳約3～約30μm給藥。舉例來說，通過靜脈注射0.1～5％活性成分和選加鹽水的溶液、或采用含約1～約100mg活性成分的團塊口服，可達到這一目的。通過連續(xù)注入約0.01～約5.0mg/kg/小時活性成分或間斷注入含約0.4～約15mg/kg的活性成分，可使血含量達到所需水平。
盡管對于治療來說可以原料化合物的形式服用本發(fā)明的化合物，但優(yōu)選以藥物組合物的形式提供活性成分。
因此，本發(fā)明還提供一種含化合物(A)或其藥用衍生物以及一種或多種藥用載體和選加的其它治療和/或理療成分的藥物組合物。所用載體在能與配方中其它成分相容的意義上須是可接受的，而且對其賦形劑無害。
藥物組合物包括適用于口、直腸、鼻、皮膚表面(包括頰和舌下在內(nèi))、陰道或腸胃外(包括肌內(nèi)，表皮下和靜脈內(nèi))給藥或適用于吸入法給藥形式的配方。合適的話，藥物細合物可以具體劑量單位存在，也可以采用制藥領域公知的方法加以制備。所有方法包括使活性化合物與液體載體或細分散固體載體或這兩種載體接觸，然后需要的話將產(chǎn)物成型為所需配方。
適用于口服的藥物組合物可以具體劑量單位存在，例如膠囊、扁囊劑或片劑，各含有預定量的活性成分；也可以粉末或顆粒、溶液、懸浮液或乳濁液形式存在?；钚猿煞忠部梢詧F塊、干藥糖劑或糊膏的形式存在?？诜玫钠瑒┖湍z囊可含有常用的賦形劑，例如粘合劑、填料、潤滑劑、崩解劑或濕潤劑。片劑可按照本領域公知方法包衣?？诜后w制劑可以是例如水或油懸浮液、溶液、乳液、糖漿或酯劑形式，也可以干產(chǎn)物的形式在用前與水或其它合適的媒體混合而成。這種液體制劑可含有常用的添加劑，例如懸浮劑、乳化劑、非水媒體(可包括食用油)或保存劑。
本發(fā)明的化合物也可配制成腸胃外給藥(例如采用注射，象團塊注射或連續(xù)注入等方法)，而且可以安瓶、預填充注射器、小體積浸注的單位劑量形式提供，或加有保存劑的多劑量容器形式提供。組合物可以呈以下形式，例如懸浮液，溶液成油或水媒體的乳濁液，而且可含有配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。另外，活性成分也可以呈由滅菌固體的無菌化或由與合適的媒體(如滅菌的無熱源水)構成的溶液在使用前經(jīng)低壓凍干法得到的干粉末形式。
對于局部表皮給藥，本發(fā)明的化合物可配制成油膏、乳膏或洗劑，或配制成貫通表皮的被片。舉例來說，油膏或乳膏可以用水或油基質(zhì)加合適的增稠劑和/或凝膠劑配制。洗劑可以用水或油基物質(zhì)配制，而且一般還含有一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。
適用于口中表皮給藥的配方包括在香味基料(一般為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠)中含活性成分的糖錠；在惰性基料(如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠)中含活性成分的軟錠劑；和在合適的液體載體中含活性成分的漱口水。
適用于直腸給藥的藥物組合物(其中載體是固體)最優(yōu)選地是呈單位劑量的栓劑形式。合適的載體是可可油和其它本領域常用的物質(zhì)。將活性化合物與軟化的或熔融的載體混合，然后在模具中急冷和成型，可便利地形成栓劑。
適用于陰道給藥組合物可以是陰道栓劑、塞、乳膏、凝膠、糊膏、泡沫或噴劑，它們除了含有活性成分之外，還含有本領域公知的合適的載體。
對于鼻內(nèi)給藥，本發(fā)明的化合物可以液體噴霧劑或分散性粉末或滴劑形式使用。
滴劑可用水或非水基料配制，這種基料也含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑。液體噴霧劑用加壓塞輸送較為方便。
對于吸入法給藥，本發(fā)明的化合物用吹入法、噴霧法或加壓塞或其它能輸送氣溶膠噴霧的便利裝置輸送較為方便。加壓塞可含有一種合適的推進劑，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟甲烷、二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可通過提供一個輸送劑量閥確定單位劑量。
另外，對于吸入法給藥，本發(fā)明的化合物可呈干粉組合物的形式，例如化合物和合適的粉基料(如乳糖或淀粉)構成的混合粉。粉末組合物可呈單位劑量形式，例如在膠襄或扁膠囊或例如明膠或氣孔塞(借助于吸入器給藥)中。
若需要時，上述配方可采用緩釋的形式輸送活性成分。
本發(fā)明的藥物組合物也可含有其它活性成分，例如抗微生物劑或保存劑。
本發(fā)明的化合物也可與其它治療劑(如其它抗感染劑)混用。具體地說，本發(fā)明的化合物可與公知的抗病毒劑混用。
因此，本發(fā)明又一方面提供一種含化合物(A)或其藥用衍生物和另一種治療活性劑(特別是抗病毒劑)的混合物。
上述混合物以藥物組合物形式使用比較方便，所以這種含上述混合物和藥用載體的藥物組合物構成了本發(fā)明的又一方面。
用于這種混合物的合適的治療劑包括無環(huán)核苷類，例如阿昔洛維或甘昔洛維，干擾素，例如α，β或γ-干擾素；腎分泌抑制劑，例如丙磺舒；核苷輸送抑制劑，例如潘生??；2′，3′-二脫氧核苷，例如AZT，2′，3′-二脫氧胞苷，2′，3′-二脫氧腺苷，2′，3′-二脫氧肌苷，2′，3′-二脫氧胸苷，2′，3′-二脫氧-2′，3′-二脫氫胸苷和2′，3′-二脫氧-2′，3′-二脫氫胞苷，免疫調(diào)節(jié)劑，例如內(nèi)白細胞殺菌素II(IL2)和粒性白細胞巨噬細胞菌落刺激素(GM—CSF)，促紅素，安普力芹，胸莫度林，胸腺素，磷甲酸，二氮唑核苷和結合到CD4受體(如可溶CD4，CD4片段，CD4雜交分子)的HIV抑制劑，糖基化抑制劑，例如2-脫氧-D-葡糖，卡洛波明，和1-脫氧野尻霉素等等。
這種混合物的各組分在單獨或合并的藥物組合物中既可連續(xù)給藥也可同時給藥。
當化合物(A)或其藥用衍生物與第二種抑制同種病毒的治療活性劑混用時，各化合物的劑量既可與單獨使用化合物時的效量相同，也可不同。本領域?qū)I(yè)人員可以很容易確定合適的劑量。
化合物(A)及其藥用衍生物可以按制備類似結構的化合物的本領域任何公知方法加以制備(例如參見歐洲專利申請公開號0382562)。
本領域普通專業(yè)人員將會知道，對于下述某些方法，既可從旋光性純的原料開始得到化合物(A)的所需立體化學構型，也可通過在合成中任何合適的階段拆分消旋混合物而得之。在所有方法中，通過再溶解各反應目的產(chǎn)物可得到旋光純的所需產(chǎn)物。
在一個這樣的方法(A)中，使式(VIII)的1，3-氧硫環(huán)戊烷 (其中異頭基L是一個可取代的基團)與一種合適的堿反應。合適的L基包括-OR基，其中R是烷基，例如C1-6烷基(如甲基)或R是?；?，例如乙酰基或鹵素的C1-6烷基，鹵素的例子是碘，溴或氯。
在一種相容的溶劑(例如二氯甲烷)中使用Lewis酸(如四氯化鈦，錫(IV)化合物如SnCl4，或三甲基甲硅烷基三氟酸鹽)，式VIII的化合物可方便地與胞嘧啶或合適的嘧啶堿前體反應(預先用甲硅烷化試劑如六甲基二甲硅烷甲硅烷化)。
將式(VII)的醛與式(VI)的硫基乙縮醛在相溶有機溶劑，如甲苯中于酸催化劑，如路易斯酸，如氯化鋅存在下進行反應，即可制成式(VIII)的1，3-氧硫環(huán)戊烷。
HSCH2CH(OC2H5)2(VI)C6H5CO2CH2CHO(VII)式(VI)的硫基乙縮醛可按已知方法，如G.Hesse和I.Jor-der，Chem Ber 85，924～932(1952)所述方法制得。
式(VII)醛可按本領域已知方法，如E.G.Hallofuist和H.Hibbert，Can.J.Research，8，129～136(1933)所述方法制得。式(VII)醛粗產(chǎn)品轉(zhuǎn)化成結晶亞硫酸氫鹽加合物后再轉(zhuǎn)化成游離醛即可將其提純。
在第二方法(B)中，化合物(A)制法是將式(IX)化合物進行堿基轉(zhuǎn)化 其中B為可轉(zhuǎn)化成胞嘧啶的堿基。這種轉(zhuǎn)化既可為簡單化學轉(zhuǎn)化(如尿嘧啶轉(zhuǎn)化成胞嘧啶)，也可為脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶進行的酶轉(zhuǎn)化。堿基轉(zhuǎn)化的方法和條件在核苷化學領域已眾所周知。
在第三方法(C)中，通過將異頭NH2基按核苷化學領域已知方法轉(zhuǎn)化成胞嘧啶堿基，可將式(XI)化合物轉(zhuǎn)化成化合物(A)。 上述許多反應已在核苷合成文獻中作了廣泛報道〔見Nucleo-side Aralogs-Chemistry，Biology and MedicalApplications，R.T.Waker et al.，eds，PlenumPress，New York(1979)，pp.165～192和Chemisty of Necleosides and Nucleotides，Vol.I，T.Ueda，L B Townselld ed.，PlenumPress，New York (1988)，pp.165～192〕，其公開內(nèi)容均引用于此供參考。
上述反應可能要求采用，或者說可方便地應用于帶保護官能團的原料，而且可能要求中間或最終步驟脫保護基以得到所需化合物。官能團受保護或脫保護均按常見方法進行。例如，氨基可用選自芳烷基(如芐基)，酰基或芳基(如2，4-二硝基苯基或甲硅烷基)的基團保護，然后必要時在常規(guī)條件下經(jīng)水解或氫解脫保護基。羥基可用任何常見羥基保護基進行保護，如參見以下文獻〔Protective Groupsin Organic Chemistry，Ed.J.F.W.McOmie(Plenum Press，1973)or′ProtectiveGroups in Organic Synthesis′，Theodora W.Greene(John Wiloy and Sons，1981)〕。適宜的羥基保護基例子包括選自烷基(如甲基，叔丁基或甲氧甲基)，芳烷基(如芐基，二苯基甲基或三苯基甲基)，雜環(huán)基，如四氫吡喃基，?；?如乙?；虮郊柞；?以及甲硅烷基，如三烷基甲硅烷基(如叔丁基二甲基甲硅烷基)的基團。羥基保護基可用常規(guī)技術脫除。例如，烷基，甲硅烷基，酰基和雜環(huán)基可在酸或堿性條件下經(jīng)溶劑分解，如水解而去除。芳烷基，如三苯基甲基也可類似地在酸性條件下經(jīng)溶劑分解，如水解而去除。用BF3/醚合物和乙酸酐處理后去除合成過程適當步驟中形成的乙酸根，即可使芳烷基，如芐基裂解。甲硅烷基還可用氟離子源，如四正丁基氟化銨而方便地脫除。
在上述方法中，化合物(A)一般是以順式和反式異構體混合物得到的，其中順式異構體為要求化合物。
這些異構體分離方法可采取物理方式，如硅膠色譜法或分餾結晶法，既可直接分離，也可以其合適衍生物，如乙酸鹽(如用乙酸酐制得)分離后再轉(zhuǎn)化成母體產(chǎn)品(如用甲醇氨液脫乙酰)。
本發(fā)明化合物藥用鹽制法還見于USP4,383,114，其公開內(nèi)容引用于此供參考。例如，要求制成化合物(A)的酸加成鹽時，上述任一方法的產(chǎn)品可用合適的酸按常規(guī)方法處理形成的游離堿基而轉(zhuǎn)化成鹽。將母體化合物與合適酸(必要時在適當溶劑，如酯(如乙酸乙酯)或醇(如甲醇，乙醇或異丙醇)存在下)反應而制成藥用酸加成鹽。將游離堿基與合適的堿，如醇鹽(如甲醇鈉)(必要時在溶劑，如醇(如甲醇)存在下)反應即可制成無機堿性鹽。還可按常用方法用化合物(A)的其它鹽，包括用其它藥用鹽制成藥用鹽。
化合物(A)與磷?；瘎鏟OCl2或合適的酯化劑，如酰鹵或酸酐反應即可將其轉(zhuǎn)化成藥用磷酸鹽或酯化合物A的酯或鹽通過水解可轉(zhuǎn)化成母體化合物。
最終產(chǎn)物或其中間產(chǎn)物或原料的拆分可用任何適宜的已知方法進行〔例如′Stereochemistry of earbon Compounds′E.L.Eliel(McGraw Hill，1962)和′Tables ofResolving Agewts′S.H.Wilen〕。
例如，化合物(A)可用手性HPLC得到，其中采用合適的固定相，如乙?；?環(huán)糊精或三乙酸纖維素以及合適的溶劑，如醇，如乙醇或乙醇三乙銨水溶液。另一方面，用合適的酶，如胞嘧啶核苷脫氨基酶進行酶解對映體選擇性分解代謝或用5′-核苷酸酶使合適衍生物進行選擇性酶降解，即可拆分出這些化合物。用酶進行拆分時，可用酶溶液，更方便是用固定化酶。酶可用任何已知方法固定，如用樹脂，如Eupergit C吸附法。
下述實例詳述本發(fā)明，但并不以任何方式限制本發(fā)明，其中所有溫度指攝氏度。
中間體15-甲氧基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-2-甲醇，苯甲酸鹽將氯化鋅(1.6g)的熱甲醇(15ml)溶液加入硫基乙醛，二甲基乙縮醛(34.2g)和苯甲酰氧基乙醛(48.3g)的甲苯(1300ml)溶液中，同時進行攪拌，然后氮氣中加熱回流50分鐘?；旌衔锢鋮s后濃縮，用一些甲苯稀釋后用Kiesulguhn過濾。濾液和甲苯合并后用飽和碳酸氫鈉水溶液(×2)和鹽水洗滌，干燥(MgSO4)后蒸發(fā)成油，硅膠柱色譜(2kg，Merck9385，氯仿作洗脫液)分析得油狀標題化合物(45.1g)，即一種異頭異構體混合物(ca 1∶1)；1H NMR(DMSO-d6)3.1～3.3(4H)，3.42(6H)，4.4-4.6(4H)，5.41(1H)，5.46(1H)，5.54(H)，5.63(1H)，7.46(4H)，7.58(2H)，8.07(4H)；rmax(CHBr3)1717.6cm-1。
中間體2(±)-順式-1-(2-苯甲酰氧甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2，4-二酮細粒尿嘧啶(9.62g)，六甲基二硅氮烷(50ml)和硫酸銨(30mg)的混合物氮氣中回流加熱，直至得到透明液為止。冷卻后蒸發(fā)得無色油，再將其氮氣中溶于乙腈(100ml)。該溶液攪拌加入冰冷的5-甲氧基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-2-甲醇，苯甲酸鹽(中間體1)(19.43g)的乙腈(600ml)溶液中，然后加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(14.7ml)。去除冰浴，溶液在氮氣中回流加熱45分鐘。冷卻并蒸發(fā)后，剩余物用氯仿/甲醇9∶1作洗脫劑的1kg硅膠(Merck 9385)柱色譜法提純。將適用成分冷卻并蒸發(fā)而得剩余粗產(chǎn)品。用最少量的熱甲醇(C.1200ml)分級結晶而得標題化合物白色晶體(6.32g)。1H NMR(d6DMSO)δ11.36(1H，bs)，7.50-8.00(6H，m)，6.20(1H，t)，5.46(2H，m)，4.62(2H，m)，3.48(1H，m)，3.25(1H，m)。
中間體3
(±)-(順式)-4-氨基-1-(2-苯甲酰氧甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮方法(a)胞嘧啶(20.705g)和硫酸銨(幾mg)的六甲基二硅氮烷(110ml)的懸浮液在氮氣中攪拌并回流加熱2.5小時。蒸除溶劑后剩余固體溶于無水乙腈(350ml)中。氮氣中用撓性針技術將該溶液轉(zhuǎn)移到攪拌的冰冷的5-甲氫基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-2-甲醇，苯甲酸鹽(中間體1)(43.57g)的乙腈(650ml)溶液之中，加入三氟甲磺酸三甲基甲硅烷基酯(33ml)，溶液回到室溫后(2.5小時)回流加熱過夜。剩余混合物濃縮，用飽和碳酸氫鈉水溶液(500ml)稀釋后用乙酸乙酯(3×500ml)萃取。萃取液合并后用水(2×250ml)和鹽水(350ml)洗滌，干燥(MgSO4)后蒸發(fā)成泡沫，硅膠柱色譜(600g，Merck 7734，乙酸乙酯-甲醇混合物作洗脫液)提純而得異頭異構體混合物(約1∶1，31.59g)?；旌衔镉盟?45ml)和乙醇(9.0ml)結晶而得固體(10.23g)，乙醇(120ml)水(30ml)重結晶而得標題產(chǎn)品白色固體(9.26g)；λmax(MeOH)229.4mm(E1cm1％610)；272.4mm(E1cm1％293)；1H NMR(DMSO d6)δ3.14(1H)，3.50 (1H)，4.07(2H)，5.52(1H)，5.66(1H)，6.28(1H)，7.22(2H)，7.56(2H)，7.72(2H)，8.10(2H)。
方法(b)磷酰氯(7.0ml)滴加入攪拌冰冷的1，2，4-三唑(11.65g)的乙腈(120ml)懸浮液中，內(nèi)部溫度保持在15℃以下再滴加入三乙胺(22.7ml)。10分鐘后緩慢加入(±)-順式-1-(2-苯甲酰氧甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2，4-二酮(中間體2)(6.27g)的乙腈(330ml)溶液。室溫攪拌過夜。冰浴冷卻混合物后緩慢加入三乙胺(30ml)，再加水(21ml)。所得溶液蒸發(fā)后剩余物分配到飽和碳酸氫鈉溶液(400ml)和氯仿(3×200ml)之間。合并的氯仿萃取液干燥(MgSO4)后過濾和蒸發(fā)得剩余粗產(chǎn)品(9.7g)。剩余物溶于1，4-二噁烷(240ml)中，加入濃氨水溶液(s.g0.880，50ml)。1.5小時后蒸發(fā)溶液并將剩余物溶于甲醇中。這會沉淀出固體，將其濾除。母液用硅膠(Merck 9385，600g)柱色譜提純。合適成分沉淀后蒸發(fā)而得到標題化合物淺黃褐色固體(2.18g)，同于方法(a)所得產(chǎn)品。
實例1(±)-(順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(順式)-4-氫基-1-(2-苯甲酰氧甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(中間體3)(8.19g)和Amberlite IRA-400(OH)樹脂(8.24g)在甲醇(250ml)中的懸浮液攪拌并加熱回流1.25小時。濾除固體后用甲醇洗滌。蒸發(fā)合并的濾液。剩余物用乙酸乙酯(80ml)研磨。所得白色固體過濾收集而得標題產(chǎn)品(5.09g)，1H NMR(DMSO-d6)3.04(1H)，3.40(1H)，3.73(2H)，5.18(1H)，5.29(1H)，5.73(1H)，6.21(1H)，7.19(2H)，7.81(1H)。
實例2手性HPLC分離(±)-(順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮對映體(A)實例1的外消旋產(chǎn)物在下列條件下進行制備HPLC分析柱Merck Hibar三乙酸纖維素，250×10mm，10μ洗脫液乙醇；流速3ml/min；檢測UV，270nm；溫度室溫蒸發(fā)合適沉淀成分得到(2R，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(6.8mg，e.e.約100％)和(2S，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氨硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(3.6mg，e.e.約90％)。
(B)實例1的外消旋產(chǎn)品(26mg)在下列條件下進行制備HPLC分析柱ASTEC環(huán)鍵I乙?；?50×4.6mm；洗脫液0.2％乙酸三乙銨(將冰醋酸加入0.2％三乙胺水溶液中直至最終pH7.2而制得)；
流速2ml/min；檢測UV，300nm；溫度室溫。
蒸發(fā)合適成分而得(2R，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(25mg)粗產(chǎn)品和(2S，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(17mg)粗產(chǎn)物。這些成分再于下列條件下進行制備HPLC分析柱ASTEC環(huán)鍵I乙酰基，250×4.6mm；洗脫液15mM乙酸銨，pH6.8；流速0.5ml/min；檢測UV，300nm；溫度5℃。
蒸發(fā)合適沉淀成分得到(2R，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(5.0mg，e.e.約91％)和(2S，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(7.6mg，e.e.約96％)。
實例3(-)順式-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(ⅰ)(±)-順式-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-酮，二氫磷酸銨鹽
(±)-順式-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(1.00g)(實例1)的無水磷酸三甲酯(20ml)懸浮液冷卻(0℃)攪拌條件下用磷酰氯(2.44ml)處理，混合物0℃攪拌35分鐘后冰水(60g)驟冷。加N-氫氧化鈉水溶液將冷混合物調(diào)至pH2.5，然后送入炭柱(10g，DARCO)，用水和乙醇-氨水洗脫。含單磷酸酯成分合并濃縮。所得溶液送入含25gDEAE Sephadex A-25(HCO3-式)的柱中。用水(120ml)至0.1M NH4HCO3(240ml)的梯度，然后是0.2，0.3和4M NH4HCO3(分別為120，240，400ml)進行洗脫。合適成分合并后濃縮。剩余液用水(40ml)稀釋后凍干而得標題化合物白色固體(1.37g)；λmax(pH6緩沖液)，271.0nm(E1cm1％190)；1H NMR (D2O)δ3.23(1H)，3.55(1H)，4.0-4.2(2H)，5.43(1H)，6.07(1H)，6.33(1H)，8.08(1H)。
(ⅱ)(2R，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮和(2S，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮將5′-核苷酸酶(來自crotalus atrox毒液)〔EC3.1.3.5〕(60mg，17單位/mg)加入到(±)-順式-4-氨基-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮，6′-二氫磷酸，銨鹽(1.35g)的緩沖液(30ml，由甘油(526mg)和氯化鎂(190mg)在水(100ml)中制得)溶液中，混合物37℃保溫2.5小時。再加酶(20ml)，并再持續(xù)保溫3.5小時。所得混合物送入DEAESephadex A-25(HCO3-式)柱中。用水(160ml)，0.1，0.2，0.3和0.4M NH4HCO3(每次200ml)進行洗脫。含第一洗脫成分的各合適組分合并后蒸發(fā)，剩余物進行硅膠(60g，Merck 7734)柱色譜提純，用氯仿，甲醇混合物洗脫。從甲醇-乙酸乙酯中分出的合適成分蒸發(fā)而得(2R，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮白色固體(0.30g)-〔α〕D21+137°(C.1.04MeOH)；1H NMR(DMSO)δ3.04(1H)，3.40(1H)，3.73(2H)，5.18(1H)，5.29(1H)，5.73(1H)，6.21(1H)，7.19(2H)，7.81(1H)。
從Sephadex柱中分出的含第二洗脫組分的合適成分合并后蒸發(fā)。剩余物溶于水(30ml)中。用堿性磷酸酯酶(用Eseher-ichia coli制得)〔EC3.1，3.1〕(1.5ml，416單位/ml)處理，然后37°保溫1小時。蒸除溶劑后剩余物進行硅膠(60g，Merck7734)提純，用氯仿-甲醇混合物洗脫。從甲醇-乙酸乙酯中分出的合適成分蒸發(fā)而得(2S，順式)-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮白色固體(0.32g)；〔α〕D21-132°(C.1.08MeOH)；1H NMR(DMSO)δ3.04(1H)，3.40(1H)，3.73(2H)，5.18 (1H)，5.29(1H)，5.73(1H)，6.21(1H)，7.19(1H)，7.8(1H)。
實例4(-)-順式-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮(ⅰ)三個50ml營養(yǎng)肉汁(Oxoid Ltd)燒瓶均接種1鉑環(huán)量Escherichia coli(ATCC23848)，它是從Nutrient Agar板上刮下的。燒瓶250rpm搖動過夜后每一燒瓶用來在7l發(fā)酶罐中接種4l CDD培養(yǎng)基(谷氨酸，3g/lMgSO4，0.2g/l；K2SO4，2.5g/l；NaCl，2.3g/l；Na2HPO42H2O，1.1g/l；NaH2PO42H2O，0.6g/l和胞嘧啶核苷，1.2g/l)。培養(yǎng)物進行發(fā)酵，其中750rpm，37℃，通氣4l/min。生長24小時后細胞離心法(5000g，30分鐘)收集起來，得72g濕重。再將細胞丸懸浮于300ml的20mM Tris HCl緩沖液(pH7.5)中并進行超聲破碎(4×45秒)。離心法(30000g，30分鐘)去除細胞碎屑并加入75％飽和硫酸銨使上層清液中的蛋白質(zhì)沉淀。該沉淀離心法(30000g，30分鐘)收集起來并將丸再懸浮于25ml HEPES緩沖液(100mM，pH7.0)中，其中含硫酸銨(75％飽和)。12000rpm離心分離30分鐘而得酶溶液。上層清液去除后將丸溶于Tris HCl緩沖液(pH7.0；100mM)中，并使其達到原來的體積。
(ⅱ)實例1的產(chǎn)品(115mg)溶于水(100ml)中并進行攪拌。加入酶溶液(0.5ml)，持續(xù)加HCl(25mM)使混合物保持恒定pH。手性HPLC監(jiān)控轉(zhuǎn)化，表明底物的(+)對映體優(yōu)先脫氨基。22小時后，底物(+)對映體(RT12.5分鐘)完全去除，加濃氫氧化鈉將溶液調(diào)至pH10.5。
上面得到的溶液經(jīng)過QAE Sephadex(A25；Parma-cia；30×1.6cm)預平衡至pH11的柱而加以洗脫。該柱用水(200ml)后用HCl(0.1M)洗滌。取出合適成分(40ml)并用反相HPLC分析。含有底物未反應(-)對映體的成分5～13綜合后用HCl調(diào)至pH7.5。含有脫氨基產(chǎn)品的成分47用稀NaOH調(diào)至pH7.5。手性HPLC分析表明，該物料為混合物，由一種作主要成分的對映體(RT10.2min)和另一種作為次要成分的對映體(RT8.5min)構成。
(ⅲ)以更大規(guī)模重復上述步驟(ⅱ)。實例1化合物(363mg)的250ml水溶液用步驟(ⅰ)中制成的酶溶液(0.5ml)培育。18和47小時后再加等分量(0.5ml)酶。反應混合物攪拌70小時，然后放置64小時。手性HPLC分析表明，底物的(+)對映體已完全脫氨基，所得溶液用NaOH調(diào)至pH10.5。
上述溶液送到相同QAE柱上，如同步驟(ⅰ)進行洗脫。含剩余底物和脫氨基產(chǎn)品的成分2-6組合起來。含剩余底物((-)對映體)的成分7-13細合起來后調(diào)至pH7.5。含脫氨基產(chǎn)品的成分25-26組合后進行中和。
上述成分2-6再經(jīng)QAE柱洗脫。該第二柱分出的成分3-11含未反應底物((-)對映體)。成分70含脫氨基產(chǎn)品。
(ⅳ)第(ⅱ)和(ⅲ)步的再溶解底物成分組合后調(diào)至pH7.5。該溶液經(jīng)過XAD-16(40×2.4cm)洗脫，其中充水。該柱用水洗滌，再用丙酮∶水(1∶4，V/V)洗脫。
含BCH189的(-)對映體的成分組合凍干得白色粉末(190mg)。
上述應用的HPLC法如下1.反相分析HPLC柱Capital CartridgeSpherisorb ODS-2(5μM)150×4.6mm洗脫劑二氫磷酸銨(50mM)＋5％MeCN流速1.5ml/min檢測UV，270nm保持時間BCH189 5.5分鐘脫氨基BCH-1898.1分鐘2.手性分析HPLC柱環(huán)鍵I乙?；?50×4.6mm洗脫劑0.2％乙酸三乙胺(pH7.2)流速1.0ml/min檢測UV，270nm保持時間BCH189 11.0和12.5分鐘脫氨基BCH-189 8.5和10.2分鐘(生物轉(zhuǎn)化后12.5分鐘監(jiān)測峰值損失，10.2分鐘產(chǎn)品收集)。實施例5(-)-順式-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H)-嘧啶-2-酮一鉑環(huán)量從生長良好的營養(yǎng)瓊脂板上刮下的E.coli B細胞(ATCC32848)用來接種兩個平底燒瓶，其中每個含250ml營養(yǎng)泡沫培養(yǎng)物37℃培育18小時，同時使瓶擺動(250rpm，移動5cm)。然后將其用于70l發(fā)酵罐中用胞嘧啶核苷接種40L CDD培養(yǎng)基。
發(fā)酵條件如下40L/min沖氣，750rpm攪拌，溫度37℃。發(fā)酵罐中裝有3個Rushton推進器。進行18小時發(fā)酵后用Sharples連續(xù)離心分離機收集物料。細胞糊(150g凈重)-20℃冷凍后再分裂。
CDD培養(yǎng)基 g/LL-古氨酸 3MgSO40.2K2SO42.5NaCl 2.3Na2HPO41.1NaH2PO40.6用蒸餾水制成。121℃滅菌30分鐘。胞嘧啶核苷(1.2g/L)過濾滅菌并加料后接種。
凍細胞糊溶化后懸浮于750ml的100mM Hepes(N-[2-羥乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])緩沖液(PH7.5)(其中含有1mM乙二銨四乙酸鈉鹽)。上懸浮液經(jīng)過MantonGaulln均化器(7500psi下操作)而使細胞分裂。這樣進行3次，每次經(jīng)過均化器后冷至大約5℃。均化物離心法澄清(1400g；60分鐘)。胞嘧啶核苷脫氨基酶活性吸附到Q-瓊脂糖凝膠柱上(490mg床層體積)，已用含1mM-氯化鈉的50mM三(羥甲基)甲基胺(PH7.5)預平衡。沉淀細胞物(210ml)加入苯基-瓊脂糖凝膠柱中(490ml床體積)，已用含有3.2M硫酸銨的緩沖液樣品預平衡。結合酶用濃度梯度減少硫酸銨液洗脫。含有胞嘧啶核苷脫氨基酶活性的成分然后用80％硫酸銨沉淀。離心分離(1400g；60分鐘)后，丸粒再懸浮于54ml上述貯存于4℃的上層清液中。
將6.2ml該溶液離心分離(18000g，90分鐘)并將丸粒溶于24ml的0.5M磷酸鉀緩沖液(PH7.5)。懸浮液用1M磷酸鉀緩沖液(PH7.5)滲析過夜。殘留部分(20ml)然后用等體積蒸餾水稀釋。向35ml該溶液中加干燥的Eupergit C珠(1g)并讓混合物室溫下放置150-300小時(由測試溶液中剩余脫氨基酶活性而確定)。固定酶用100mM Tris/Hcl緩沖液(PH7.0)洗滌，緩沖液中含1mM EDTA，1mM DTT，0.5M NaCl和500ppm對羥基苯甲酸乙脂貯存緩沖液)，固定酶(2.7g凈重)貯4c存于該緩沖液中，直到要求生物轉(zhuǎn)化為止。
實施例1產(chǎn)品(3g)溶于500ml蒸餾水中，在1L磁性攪拌燒瓶中進行，32c下固定PH進行生物轉(zhuǎn)化。加1M乙酸使PH保持恒定。凈重1g的固定酶珠用蒸餾水洗滌后再進行反應。轉(zhuǎn)化過程由手性-HPLC監(jiān)控，其中表明底物的(+)對映體優(yōu)先脫氨基。反應結束時(72小時)，濾出酶珠，濾液用來分離要求的(-)對映體。
反應混合物的PH用氨水(1M)調(diào)至PH10.5，溶液送入OH循環(huán)Duolite All超級樹脂中(50ml；0.4床體積/小時)。樹脂上尚存的任何(-)對映體用0.04％氨水(2床層體積；流速0.8床層體積/小時)洗滌而去除。
廢液和洗滌液(600ml)的PH用濃硫酸調(diào)為PH7.0，溶液送入XAD16樹脂中(50ml；流速1.4床層體積/小時)。柱用蒸餾水洗滌(2.5床層體積，流速2床層體積/小時)，而(-)對映體用丙酮∶水(1∶3)混合物洗脫(流速1.5床層體積/小時)。大部分含(-)對映體的成分(4床層體積)用Buchi蒸發(fā)器濃縮而得小體積后讓濾液通過No.3玻璃燒結器。過濾液凍干而得1。2g標題化合物，同于實例4所得二合物。
實例6片劑配方A.用普洛維頓(Providone)水溶液將各成分濕法造粒，干燥、過篩、加硬脂酸鎂并壓制而得到以下配方。
mg/片(a)活性成分 250(b)乳糖B.P. 210(c)普洛維頓B.P. 15(d)淀粉甘醇酸鈉 20(e)硬脂酸鎂 5500B.直接壓制成以下配方，乳糖為直接壓制類物料。
mg/片活性成分250乳糖145阿維塞爾100硬脂酸鎂5500C.(緩解配方)用普洛維頓水溶液將各成分(如下)濕法造粒，干燥并篩分后加硬脂酸鎂并壓制而得該配方。
mg/片(a)活性成分 500(b)羥丙甲基纖維素 112(Methocel K4M Premium)(c)乳糖B.P. 53(d)普洛維頓B.P. 28(e)硬脂酸鎂 7700實例7膠囊配方將下列各成分混合后填入雙組分硬明膠膠囊中，得到膠囊配方。
mg/片活性成分125乳糖72.5阿維塞爾50硬脂酸鎂2.5250實例8注射液配方活性成分氫氧化鈉溶液，0.1Mg.s.至約pH11蒸餾水、qs.至10ml活性成分懸浮在一些水中(水可加熱)，用氫氧化鈉將pH調(diào)為約11。配料再加水至要求體積并經(jīng)無菌級膜過濾器過濾而進入10ml無菌玻璃管瓶中，用無菌瓶塞和外包裝密封。
實例9mg/栓劑活性成分250硬脂肪B.P 17702020硬脂肪的五分之一最高45℃熔于蒸汽封鍋中?；钚猿煞诌^200μm篩后混入熔融基質(zhì)中，其中采用高剪力攪拌器，直至達到均勻分散?；旌衔锞S持45℃，剩余硬脂肪加入懸浮液后攪拌，以保證均勻混合。全部懸浮體經(jīng)過250μm不銹鋼篩，其中持續(xù)進行攪拌，再讓其冷至40℃。38℃-40℃下將2.02g混合物填入2ml合適的塑料模中。再讓栓劑冷至室溫。
實例10生物活性抗病毒活性在以下細胞系中用3株HIV-1和1株HIV-2測定實例2化合物的抗病毒活性。
JM細胞，半成熟T-細胞系，從成淋巴細胞白血病患者體內(nèi)分離出來，感染HIV-1株GB8。
C8166細胞，人T成淋巴細胞瘤細胞系，感染HIV-1株RF。
MT-4細胞，人T-細胞性白血病細胞系，感染HIV-1株RF。
CEM細胞，人T成淋巴細胞樣細胞系，感染HIV-1株RF和U455或HIV-2株ROD。
在C8166，JM和CEM細胞中抑制合胞體形成(Tock-ikura et al，Virology，164，542-546)而確定抗病毒活性，在MT-4細胞中抑制甲轉(zhuǎn)化(Baba et al；(1987)Biochem Biophys Res Commun.，142128-134；Mossman(1983)J.Immun Meth；65，55-57)而確定抗病毒活性。也可通過分析在對映體存在和不存在時合成的HIVp24抗原量而確定抗病毒活性。
結果示于下表1和2。
表1
表2抑制HIV p24合成
B.細胞毒性在5株CD4細胞系H9，JM，CEM，C8166和U937中測定實例2化合物，外消旋化合物(BCH-189，實例1)和兩種對映體的50/50混合物的細胞毒性。
在96孔微滴定板中將試驗化合物按順序從100μg/ml稀釋至0.3μg/ml(最終濃度)。在孔板中每一孔內(nèi)接種3.6×104細胞，其中包括無藥對照組。37℃培育5天后，去除細胞懸浮體并在血細胞計數(shù)器中數(shù)出排除錐蟲藍的細胞數(shù)，從而確定活性細胞數(shù)。
結果列于表3。
表3細胞毒性
ND＝不確定
權利要求
1.一種制備包括(-)-順-4-氨基-1-(2-羥甲基-1，3-氧硫環(huán)戊烷-5-基)-(1H-嘧啶-2-酮或其藥用衍生物〔化合物(A)〕活性成分及其藥用載體的藥物組合物的方法，它包括混合該活性成分和該載體。
2.按照權利要求1所述的方法，其中化合物(A)基本上無相應的(+)對映體。
3.按照權利要求1或2所述的方法，其中化合物(A)中(+)對映體含量不高于5％(W/W)。
4.按照權利要求1或2所述的方法，其中化合物(A)中(+)對映體含量不高于2％(W/W)。
5.按照權利要求1或2所述的方法，其中化合物(A)中(+)對映體含量不高于1％(W/W)。
全文摘要
公開了(－)－4－氨基－1－(2－羥甲基－1,3－氧硫環(huán)戊烷－5－基)－(1H)－嘧啶－2－酮,它的藥用衍生物及其藥用組合物。還公開了制備這類化合物及其衍生物和藥物組合物的制備方法,以及作為抗病毒劑的用途。
文檔編號A61K31/513GK1326743SQ99126580
公開日2001年12月19日 申請日期1999年12月22日 優(yōu)先權日1990年5月2日
發(fā)明者喬納森·A·V·科茨, 伊恩·M·馬頓, 查爾斯·R·佩恩, 里查德·斯拖勒, 查里斯托弗·威廉森 申請人:希雷生物化學有限公司