專利名稱：核酸轉(zhuǎn)移載體、含有它們的組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的載體及其轉(zhuǎn)移核酸的應(yīng)用。具體講，本發(fā)明涉及能夠引導核酸至特定細胞或細胞腔室的新載體。
核酸轉(zhuǎn)移是主要生物技術(shù)應(yīng)用的一項基礎(chǔ)技術(shù)，核酸轉(zhuǎn)移效率的提高構(gòu)成了這些應(yīng)用發(fā)展的很重要的賭注。核酸轉(zhuǎn)移效率取決于多種因素，其中包括核酸到達靶細胞的能力、其跨越漿膜的性能及其被轉(zhuǎn)運至細胞核中的性能。
核酸轉(zhuǎn)移效率的一個主要障礙是遺傳信息常不能導向目標靶器官或效果差。另外，一旦核酸穿透到靶細胞中，其還應(yīng)該被導向細胞核以在其中表達。而在分化或靜息細胞中轉(zhuǎn)移核酸時，細胞核被限于核膜內(nèi)，這又構(gòu)成了核酸通過的另一屏障。
用作載體的重組病毒具有保證核酸進入細胞核的成熟有效的機制。但病毒載體具有病毒固有的一些缺點，遺憾的是無法完全排除它們。因而另一策略就是要么轉(zhuǎn)移裸DNA、要么使用能夠促進DNA在真核細胞中轉(zhuǎn)移的非病毒試劑。但這些非病毒載體不具有對亞細胞或核的靶向信號。因此，裸DNA或與非病毒試劑一起在胞漿中向細胞核的轉(zhuǎn)移是一個效率很低的階段(Zabner等，1995)。
已進行了附加靶向信號的各種嘗試。具體講，在一種反義寡核苷酸靶向轉(zhuǎn)運策略中寡核苷酸上共價連接了靶向肽片段[Eritja等，含核轉(zhuǎn)運信號序列的特定肽-寡核苷酸雜合體的合成，四面體(Tetrahedron)，Vol．47，No．24，4113-4120頁，1991]。這樣形成的復合物作為內(nèi)源基因表達之潛在抑制劑的良好候選物。
在專利申請WO95／31557中還公開了含有與DNA序列以靜電作用偶聯(lián)的合成多肽的轉(zhuǎn)染載體，所述多肽由一個堿性氨基酸多聚鏈、一個NLS肽和一個連接NLS肽和多聚鏈并可避免立體相互作用的鉸鏈區(qū)構(gòu)成。但這類結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性問題，因為DNA和靶的信號間起作用的作用力是靜電性質(zhì)的。
另外專利申請WO 95／34664中公開了核酸-特異性靶向肽的嵌合體，兩者之間的鍵是化學性質(zhì)的。但這種方法已過時，特別因為酶步驟難以控制，而且不能產(chǎn)生大量的核酸。
最后，已證明可能借助于環(huán)丙烷吡咯并吲哚將NLS序列(“核定位信號”)連在質(zhì)粒DNA上(自然生物技術(shù)(Nature Biotechno1ogy)，Vol．16，80-85頁，1998年1月)。還觀察到目標基因轉(zhuǎn)錄的完全抑制現(xiàn)象，這是由于幾百個NLS序列偶然連在了一個質(zhì)粒上。其他人提出了解決這一問題的一種方法，即將NLS序列連在DNA的線性片段上，然后將這些修飾的片段與其他未修飾片段偶聯(lián)。但這一技術(shù)具有前述的不能通過至少一個酶步驟的缺點。
因此，迄今提出的所有方法不能滿意地解決與雙鏈DNA靶向轉(zhuǎn)移相關(guān)的困難。
本發(fā)明提出了對這些問題的有利的方案。具體講，本發(fā)明提供了與靶向信號綴合并能夠與存在于雙鏈DNA分子中的特定序列形成三螺旋的寡核苷酸。
這種載體具有由靶向信號帶來的能夠引導雙鏈DNA至特定的細胞或細胞腔室中的優(yōu)點，而遺傳表達不被抑制。申請人證明，由于位點特異性的穩(wěn)定三螺旋的形成，可能以位點特異性方式在雙鏈DNA上連接靶向信號。結(jié)果，可以在待轉(zhuǎn)基因表達盒之外固定靶向信號。申請人從而證明盡管有DNA的化學修飾，細胞中遺傳表達不會被抑制。另外，三螺旋的存在作為在DNA上連接靶向信號的工具是特別有利的，因為這可以保留適于轉(zhuǎn)染的DNA大小。
所獲載體還有靶向信號與雙鏈DNA連接很穩(wěn)定的優(yōu)點，特別是當易于形成三螺旋的寡核苷酸在烷化劑存在下被修飾時。
本發(fā)明的另一個優(yōu)點是可以在連接待轉(zhuǎn)移DNA和靶向信號時，同時控制后者的數(shù)量和性質(zhì)。實際上可以通過向所述雙鏈DNA分子引入對形成三螺旋有利的適當數(shù)目的特異序列來控制連接在每個雙鏈DNA分子上的靶向信號的數(shù)目。同樣，可以在同一雙鏈DNA分子上引入與不同靶向信號(細胞內(nèi)和／或細胞外)連接的幾種寡核苷酸，在此情形下也可能預(yù)先確定各自的比例。此外，這些不同的靶向信號可以與雙鏈DNA分子以或高或低的穩(wěn)定性連接，這取決于三螺旋的形成中有或無共價鍵(即有無使用烷化劑)。
最后，所獲功能性三螺旋只來自化學轉(zhuǎn)化步驟，因而可以以簡單、可重復的方式獲得很大的量，特別是工業(yè)規(guī)模。
因此，本發(fā)明的第一個主題涉及一種能靶向特定細胞和／或細胞腔室的轉(zhuǎn)染用載體。具體講，本發(fā)明的載體包含一個雙鏈DNA分子和至少一個與靶向信號偶聯(lián)并能夠通過雜交與所述雙鏈DNA分子中特定序列形成三螺旋的寡核苷酸。
本發(fā)明中的“雙鏈DNA”指雙鏈脫氧核糖核苷酸，其來源于人、動物、植物、細菌、病毒等。它可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)獲得，特別是通過文庫篩選、文庫篩選所獲序列的化學或酶合成。它還可以經(jīng)化學或酶法修飾。
該雙鏈DNA可以呈線性或環(huán)狀。對于后一種情況，雙鏈DNA可以是超級纏繞狀態(tài)或松弛狀態(tài)。優(yōu)選DNA分子是環(huán)形的并呈超級纏繞構(gòu)象。
雙鏈DNA還可以帶有一個在靶細胞中有或無功能的復制起點、一個或多個標志基因、轉(zhuǎn)錄或復制調(diào)節(jié)序列、治療性目標基因、經(jīng)修飾或否的反義序列、與其他細胞成分結(jié)合的區(qū)域等。優(yōu)選雙鏈DNA包含一個表達盒，其由一個或多個在靶細胞中有活性的啟動子和一個轉(zhuǎn)錄終止子控制下的一個或多個目標基因構(gòu)成。
本發(fā)明的“目標基因表達盒”指可被插入在載體的特定限制酶位點的DNA片段。該DNA片段包含編碼目標RNA或多肽的核酸序列，另外還含有所述序列表達所需的序列(增強子、啟動子、多腺苷酸化序列等)。設(shè)計該表達盒和限制位點以保證該表達盒以適于轉(zhuǎn)錄和翻譯的方式插入在讀框中。
所述DNA分子還可以是帶有一個或多個治療性目標基因的質(zhì)?；蚋郊芋w。例如可以舉出專利申請WO 96／26270和WO 97／10343(并入本文作為參考)中描述的質(zhì)粒。
在本發(fā)明中，關(guān)于“有治療意義的基因”尤其應(yīng)該理解為任何具有治療作用的蛋白質(zhì)產(chǎn)品的編碼基因。如此編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)品可以是一種蛋白質(zhì)、肽等。這種蛋白質(zhì)產(chǎn)品對靶細胞可以是同源的(即當靶細胞不存在任何病理性問題時，在該細胞中正常表達的產(chǎn)品)。在這種情況下，蛋白質(zhì)的表達例如能夠克服在該細胞中表達不充分或因修飾失活或低活性的蛋白質(zhì)的表達，或超量表達所述蛋白質(zhì)。治療基因還可以編碼細胞蛋白質(zhì)的突變體，其穩(wěn)定性提高、活性改變等。蛋白質(zhì)產(chǎn)品對靶細胞還可以是異源的。在這種情況下，表達的蛋白質(zhì)例如可以補足或提供在該細胞中缺失的活性，使它們能夠抵抗疾病，或刺激免疫應(yīng)答。
在本發(fā)明有治療意義的產(chǎn)品中，更具體地可列舉酶、血液衍生物、激素、淋巴因子[白介素、干擾素、TNF等(FR92／03120)]、生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)或它們的前體或合成酶、營養(yǎng)因子(BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、aFGF、bFGF、NT3、NT5、HARP／多效因子等)、肌營養(yǎng)不良蛋白或小肌營養(yǎng)不良蛋白(minidystrophine)(FR91／11947)，與先天性粘液稠厚癥相關(guān)的CFTR蛋白質(zhì)、腫瘤抑制基因[p53，Rb，Rapl A，DCC，k-rev等(FR93／04745)]、凝血相關(guān)因子的編碼基因(因子Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ)、參與DNA修復的基因、自殺基因(胸腺嘧啶核苷激酶、胞嘧啶脫胺酶)、血紅蛋白基因或其他轉(zhuǎn)運蛋白的基因、參與脂質(zhì)代謝的蛋白選自載脂蛋白A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅳ、B、C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、F、G、H、J和apo(a)的載脂蛋白類的相應(yīng)基因、代謝酶如像脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶、7-α-膽固醇羥化酶、磷脂酸磷酸酶，或脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白如膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白和磷脂轉(zhuǎn)移蛋白、HDL結(jié)合蛋白質(zhì)或例如選自LDL受體、乳靡微粒-遺余物受體和清除劑受體等的受體。
有治療意義的核酸還可以是這樣一種基因或一種反義序列，它們在靶細胞中的表達能夠控制基因表達或細胞mRNA的轉(zhuǎn)錄。根據(jù)專利EP140 308中描述的技術(shù)，這樣的序列例如可以在靶細胞中轉(zhuǎn)錄成細胞mRNA的互補RNA，并因此阻斷它們轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)。治療基因還包括核酶編碼序列，這些核酶能夠選擇性地破壞靶RNA(EP 321 201)，或包括編碼單鏈細胞內(nèi)抗體如ScFv的序列。
如前面所指出的，脫氧核糖核酸還可以含有一個或多個編碼抗原性肽的基因，這種肽在人體或動物中能夠造成免疫應(yīng)答。在這種特定實施方式中，本發(fā)明因此使得有可能制備用于人體或動物的疫苗或進行免疫治療，尤其是用于抗微生物、病毒或癌。特別涉及對E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(EP 185 573)、偽狂犬病病毒、“合包體形成病毒”、流感病毒、巨細胞病毒(CMV)或其他病毒特異的、或?qū)δ[瘤特異的抗原性肽(EP 259 212)。
優(yōu)選地，脫氧核糖核酸還含有能夠使有治療意義的基因和／或抗原肽編碼基因在細胞或所希望的器官中表達的序列?？梢陨婕疤烊回撠熕紤]的基因表達的序列，只要這些序列在感染的細胞中能夠起作用。還涉及不同來源的序列(負責其他蛋白質(zhì)的表達，或甚至是合成的)。具體地，可以涉及真核細胞或病毒基因的啟動子序列。例如，可以涉及來自人們希望感染的細胞基因組的啟動子序列。同樣地，可以涉及來自病毒基因組的啟動子序列。為此，例如可以列舉基因E1A、MLP、CMV、RSV等的啟動子。另外，這些表達序列可以通過加入活化序列、調(diào)節(jié)序列等進行修飾。也可以涉及可誘導的或可抑制的啟動子。
三螺旋相當于經(jīng)修飾或否的寡核苷酸與雙鏈DNA通過第三條鏈的堿基和雙螺旋區(qū)域的堿基間所謂的“de Hoogsteen”氫鍵的結(jié)合。這種配對發(fā)生在雙螺旋的大溝紋中并對所述序列是特異性的[Frank-Kamenetski，M．D．，DNA三螺旋結(jié)構(gòu)，Ann．Rev．Biochem．，1995，64，65-95頁]。雙螺旋的特異性序列特別可以是一種全嘌呤-全嘧啶序列。根據(jù)第三條鏈的堿基的性質(zhì)將三螺旋分為兩類[Sun，J．和C．Hélène，寡核苷酸引導的三螺旋形成，Curr．Opin．Struct．Biol．1993，3，345-356頁]嘌呤堿基可獲得C-G*G和T-A*A的配對，嘧啶堿基可獲得C-G*C+和T-A*T的配對(符號*相當于與第三條鏈的配對)。
已通過許多NMR(核磁共振)、雜交溫度或抗核酶保護的研究從物理化學角度表征了這些結(jié)構(gòu)，從而得以確定它們的特性和穩(wěn)定化條件。對嘌呤第三鏈的三螺旋，該第三鏈與DNA的嘌呤鏈是反平行的，三螺旋的形成很大程度上取決于二價離子的濃度諸如Mg2+等的離子可以穩(wěn)定與第三鏈形成的這種結(jié)構(gòu)。對于全嘧啶第三鏈的三螺旋，該第三鏈與嘌呤鏈是平行的，三螺旋的形成取決于pH低于6的酸性pH可以使胞嘧啶質(zhì)子化并形成穩(wěn)定C-G*C+三聯(lián)體的額外氫鏈。還存在“混合”三螺旋，其第三條鏈帶有嘌呤和嘧啶堿基。這種情況下，第三條鏈的方向取決于全嘌呤區(qū)的堿基序列。
本發(fā)明所用的寡核苷酸是直接與雙鏈DNA雜交的寡核苷酸。這些寡核苷酸可以含有以下堿基-胸腺嘧啶(T)，它能與雙鏈DNA的二聯(lián)體A．T形成三聯(lián)體(Rajagopal等，Biochem 28(1989)7859)，-腺嘌呤(A)，它能與雙鏈DNA的二聯(lián)體A．T形成三聯(lián)體，-鳥嘌呤(G)，它能與雙鏈DNA的二聯(lián)體G．C形成三聯(lián)體，-質(zhì)子化胞嘧啶(C+)，它能與雙鏈DNA的二聯(lián)體G．C形成三聯(lián)體，-尿嘧啶(U)，它能與堿基對A．U或A．T形成三聯(lián)體。
為了通過雜交形成三螺旋，寡核苷酸與DNA上存在的特定序列互補是很重要的。因此，為了獲得最好的結(jié)合和最好的選擇性，對于本發(fā)明的載體使用一種寡核苷酸和完全互補的特異序列。特別可能使用聚一CTT寡核苷酸和聚-GAA特異性序列。例如可以使用如下序列的寡核苷酸5’-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3’(GAGG(CTT)7，SEQ ID N°1)，其中堿基GAGG不形成三螺旋但其可以將偶聯(lián)臂與寡核苷酸隔開。還可以舉出序列(CTT)7(SEQ ID No．2)。這些寡核苷酸能夠與帶有互補基元(GAA)的特異性序列形成三螺旋，特別是含有7、14或17個GAA基元的區(qū)域。另一個特異性目標序列是如下序列5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’(SEQ ID No．3)。該序列與下列寡核苷酸形成三螺旋5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID N°4)或5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3’(SEQ ID N°5)。
此時寡核苷酸以反向平行方向結(jié)合在聚嘌呤鏈上。這些三螺旋只在Mg2+存在下穩(wěn)定，這如前所述(Vasquez等，生物化學(Biochemistry)，1995，34，7243-7251；Beal和Dervan，科學(Science)，1991，251，1360-1363)。
特異性序列可以是雙鏈DNA中天然存在的一種序列，或者人工插入其中的天然來源的或合成的序列。使用能與雙鏈DNA上天然存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸是特別有利的。實際上，這樣就可以從未經(jīng)修飾的質(zhì)粒、特別是pUC、pBR322、pSV等類型的商業(yè)質(zhì)粒來有利地獲得本發(fā)明的載體。在雙鏈DNA中存在的天然全嘌呤-全嘧啶序列中，可以舉出含存在于大腸桿菌復制起點中的5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’(SEQ ID No．6)之全部或部分的序列。此時形成三螺旋的寡核苷酸具有如下序列5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3’(SEQ ID No．7)并交替地與雙螺旋的兩條鏈結(jié)合，如Beal和Dervan(J．Am．Chem．Soc．1992，114，4976-4982)和Jayasena和Johnston(核酸研究(Nucleir Aeids Res．)，1992，20，5279-5288)所述。還可以舉出質(zhì)粒pBR322 β-內(nèi)酰胺酶基因的序列5’-GAAAAAGGAAGAG-3’(SEQ ID No．8)(Duval-Valentin等，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1992，89，504-508)。另一序列是存在于具有條件性復制起點的質(zhì)粒如pCOR的γ復制起點中的AAGAAAAAAAAGAA(SEQ ID No．9)。
雖然優(yōu)選完全互補的序列，但應(yīng)認識到可以容忍寡核苷酸序列和DNA上所存在序列間一定的錯配，只要不導致太大的親和力損失。可以舉出大腸桿菌β-內(nèi)酰胺酶基因中存在的序列5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’(SEQ ID No．10)。此時打斷聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可被第三條鏈的鳥嘌呤識別，形成三聯(lián)體ATG，當被夾在兩個三聯(lián)體TAT之間時是穩(wěn)定的(kiessling等，生物化學，1992，31，2829-2834)。
所用的寡核苷酸可以是天然的(由天然堿基組成，未經(jīng)修飾)或是經(jīng)化學修飾的。更具體地講，寡核苷酸可以帶有一些有利的化學修飾，以提高其抗性、對抗核酶的保護、其對特異序列的親和性或帶來其他額外的特性(J．Goodchild，寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的綴合其合成和特性的綜述，生物綴合物化學(Bioconjugate Chemistry)，Vol．1，No．3，1990，165-187頁)。
在本發(fā)明中，寡核苷酸還包括已進行了骨架修飾的任何核苷的鏈。在可能的修飾中可以舉出，能夠與DNA形成三螺旋的硫代磷酸酯寡核苷酸(Xodo等，核酸研究，1994，22，3322-3330)，及具有甲縮醛或甲基膦酸酯骨架的寡核苷酸(Matteucci等，J．Am．Chem．Soc．，1991，113，7767-7768)。還可以使用用核苷酸的α-端基異構(gòu)體合成的寡核苷酸，它也與DNA形成三螺旋(Le Doan等，核酸研究，1987，15，7749-7760)。另一種骨架修飾是氨基磷酸酯鍵。例如可以舉出Gryaznov和Chen描述的核苷酸間N3’-P5’氨基磷酸酯鍵，這樣給出了與DNA形成特別穩(wěn)定的三螺旋的寡核苷酸(J．Am．Chem．Soc．，1994，116，3143-3144)。對于骨架的其他修飾，還可以提到使用核糖核苷酸、2’-O-甲基核糖、磷酸三酯等(Sun和Hélène，Curr．Opinion Struct．Biol．，116，3143-3144)。含磷骨架最終可以被聚酰胺骨架代替，如PNA中(肽核酸)，它也可以形成三螺旋(Nielsen等，科學，1991，254，1497-1500；Kim等，J．Am．Chem．Soc．，1993，115，6477-6481)，或被基于胍的骨架所替代，如在DNG中(脫氧核糖核胍，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，92，6097-6101)，DNA的聚陽離子類似物，它們也形成三螺旋。
第三條鏈的胸腺嘧啶還可以被5-溴尿嘧啶替代，從而提高寡核苷酸對DNA的親和力(Povsic和Dervan，J．Am．Chem．Soc．，1989，111，3059-3061)。第三條鏈還可以含有非天然堿基，其中可舉出7-脫氮-2’-脫氧黃苷(Milligan等，核酸研究，1993，21，327-333)、1-(2-脫氧-b-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑并[4，3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan，J．Am．Chem．Soc．，1992，114，1470-1478)、8-氧代腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2’-O-甲基-假異胞苷或本領(lǐng)域已知的任何其他修飾(見Sun和Hélène的綜述，Curr．OpinionStruct．Biol．，1993，3，345-356)。
另一種類型的寡核苷酸修飾更特異地涉及對寡核苷酸和特異序列間的相互作用和／或親和性。具體講，一種特別有利的修飾是在寡核苷酸上連接烷化劑。這種連接可以是化學的，或通過一種光活性功能團進行光化學連接。有利的烷化劑特別有可光活化的烷化劑，例如補骨脂素。在光作用下，它們在DNA的嘧啶堿基上形成共價鍵。當這些分子被插入在雙鏈DNA片段中的序列5’ApT-3’或5’-TpA-3’中時，它們形成與雙鏈的連接。這種由光誘發(fā)的連接反應(yīng)可發(fā)生在質(zhì)粒的特定位點上。
如前文已強調(diào)過的，本發(fā)明的一個優(yōu)點是由于通過烷化劑形成共價鍵，因而可以在寡核苷酸和雙鏈DNA的特異序列之間形成很穩(wěn)定的位點特異性的三螺旋。
本發(fā)明方法中所用的寡核苷酸的長度為至少3個堿基，優(yōu)選5-30個堿基。優(yōu)選使用10-30個堿基長度的寡核苷酸。當然本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)所尋求的選擇性和相互作用的穩(wěn)定性具體調(diào)節(jié)該長度。
本發(fā)明的寡核苷酸可通過任何已知技術(shù)合成。具體講，它們可利用核酸合成儀來制備。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他方法。
本發(fā)明中，“靶向信號”指各種性質(zhì)的靶向分子。在大多數(shù)情況下涉及已知的靶向肽。當進行基因治療基因的非病毒轉(zhuǎn)移時，它們可被用于與細胞外基質(zhì)的成分、與漿膜受體相作用，用于靶向細胞內(nèi)腔室或用于改善DNA的細胞內(nèi)路徑。
這些靶向信號包括例如生長因子(EGF、PDGF、TGFb、NGF、IGFI、FGF)、細胞因子(IL-1、IL-2、TNF、干擾素、CSF)、激素(胰島素、生長激素、催乳素、胰高血糖素、甲狀腺激素、類固醇激素)、識別凝集素的糖、免疫球蛋白、ScFv、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、維生素如維生素B12、肽激素或神經(jīng)肽(速激肽、神經(jīng)降壓素、VIP、內(nèi)皮素、CGRP、CCK等)、或被整聯(lián)蛋白識別的任何基元，例如RGD肽，或由細胞膜非固有的其他蛋白識別的基元。
可以使用完整蛋白、或來自這些蛋白的肽序列、或結(jié)合其受體并經(jīng)“噬菌體展示”技術(shù)或組合合成獲得的肽。
還可以考慮細胞內(nèi)靶向信號。已鑒別出了許多由不同氨基酸組成的核定位信號序列(NLS)，使得可以靶向于參與蛋白或核酸核轉(zhuǎn)運的不同蛋白。這些序列中可特別指出短序列(例如SV40 T抗原的NLS(PKKKRKV，SEQ ID No．11))、二分序列(含有兩個核轉(zhuǎn)運必需結(jié)構(gòu)域的核質(zhì)蛋白(nucleoplasmine)的NLSKRPAATKKAGQAKKKKLDK，SEQ ID No．12)、或hnRNPA1蛋白的M9序列(NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY，SEQ ID No．13)。帶有這些NLS序列的蛋白與特異性受體結(jié)合，如輸入蛋白(importine)或核周蛋白(karyopherine)家族的受體。這些序列的作用是引導DNA至核內(nèi)，在其中DNA立即就可被轉(zhuǎn)錄機器所利用，并可以表達。
“混合”靶向信號，即可以同時用于細胞外和細胞內(nèi)靶向的信號，也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如可以指出靶向凝集素的糖，所述凝集素處于細胞膜上也存在于核孔中。因此這些糖的靶向作用不僅涉及細胞外靶向也涉及核輸入。
另一些信號參與靶向線粒體(如大鼠鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶(OTC)的T-末端部分)或在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的定位。最后，一些信號可以進行核保留或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的保留(如KDEL序列)。
本發(fā)明的靶向信號可以有利地特異性引導雙鏈DNA進入某些細胞或某些細胞腔室。例如，本發(fā)明的靶向信號可以靶向于細胞表面的受體或配體，特別是該細胞表面或鄰近的細胞外基質(zhì)上特有的胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、葉酸、或任何其他生長因子、細胞因子或維生素或多糖的受體。
寡核苷酸-靶向信號嵌合體的合成以固相或液相進行，并考慮到寡核苷酸和靶向信號差異很大的化學穩(wěn)定性特征[Erijita，R等，含核轉(zhuǎn)運信號序列的特定肽-寡核苷酸雜合體的合成，四面體，1991，47(24)，4113-4120頁]。對于液相合成，可以設(shè)想一步偶連例如可以用帶有二硫鍵、馬來酰亞胺、胺、羧基、酯、環(huán)氧、溴代氰或醛的基團合成靶向信號，并與經(jīng)末端基團硫醇、胺或羧基在3’或5’位修飾的寡核苷酸偶連。通過在寡核苷酸和靶向信號之間建立二硫鍵、硫醚鍵、酯鍵、酰胺或胺發(fā)生這些偶連。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它方法，如用雙功能偶聯(lián)反應(yīng)物。
本發(fā)明的另一主題是含有如上所定義載體的組合物。
最好，本發(fā)明的載體還可以與已知用于轉(zhuǎn)移DNA的一種或多種試劑結(jié)合?？梢耘e出具有有利特性的陽離子脂類。這些載體由與核酸作用的陽離子極性部分、與能夠保護生成的復合物不受外部環(huán)境影響的疏水脂部分構(gòu)成。作為實例可以列舉單陽離子脂類(DOTMALipofectin_)、某些陽離子去污劑(DDAB)、脂多胺，特別是雙十八烷基氨基甘氨酰基精胺(DOGS)或棕櫚?；字Ｒ掖及返?-羧基精胺基酰胺(DPPES)，在專利申請EP 394 111中描述過它的制備方法。另一類有益的脂多胺家族以在專利申請WO97／18185(作為參考文獻列于本文)中列出的化合物為代表。已開發(fā)出許多其他陽離子脂類試劑，可與本發(fā)明的載體一起使用。
在已開發(fā)的合成轉(zhuǎn)染試劑中，聚賴氨酸和DEAE葡聚糖類型的陽離子聚合物也是有利的。還可能使用聚乙烯亞胺(PEI)聚合物和聚丙烯亞胺(PPI)聚合物，它們可以在市場上購得也可以按專利申請WO96／02655中描述的方法制備。
一般而言，已知用于核酸轉(zhuǎn)染的任何合成試劑都可與本發(fā)明的載體結(jié)合。
本發(fā)明的組合物還可以含有能夠與本發(fā)明載體／轉(zhuǎn)染試劑復合物結(jié)合并能夠改善其轉(zhuǎn)染能力的添加劑。在另一實施方案中，本發(fā)明因而涉及含有如上定義的載體、一種或多種如上所述轉(zhuǎn)染試劑和一種或多種能夠與本發(fā)明載體／轉(zhuǎn)染試劑復合物結(jié)合并能夠改善其轉(zhuǎn)染能力的添加劑的組合物。這種類型添加劑(如脂類、肽或蛋白)可以有利地提高化合物的轉(zhuǎn)染能力。
在這種選擇中，本發(fā)明的組合物可以含有一種或多種中性脂作為添加劑，使用這樣一些組合物是特別有利的。申請人已證明加入一種中性脂能夠改善核脂顆粒的生成，還通過使膜失穩(wěn)定有利于該顆粒的細胞穿透。
更優(yōu)選地，在本發(fā)明范圍內(nèi)使用的中性脂是具有兩個脂肪鏈的脂類。特別有利地，使用在生理條件下為兩性離子或無離子電荷的天然或合成脂類。更具體地，它們可以選自二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、油酰基棕櫚?；字Ｒ掖及?POPE)、二硬脂?；?、二棕櫚?；?、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺以及它們的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂?；视?、二?；视汀⑻腔；视?、腦苷脂(具體如半乳糖腦苷脂)、鞘脂(具體如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(具體如脫唾液酸GM1和GM2)。
這些不同的脂類可采用本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法用合成方法，或者從器官(例如腦)或蛋提取的方法得到。具體地，采用有機溶劑的方法可以提取天然脂類(也可參見Lehninger Biochemistry)。
申請人已證明，使用干預(yù)或非直接地干預(yù)DNA濃集(condensation)的化合物作為添加劑也是特別有利的(WO96／25508)。在本發(fā)明組合物中，這樣一種化合物的存在，能夠降低轉(zhuǎn)移化合物的量，在毒理學方面由此獲得有益結(jié)果，對轉(zhuǎn)染活性不會帶來任何損害。關(guān)于干預(yù)核酸濃集的化合物，應(yīng)該定義為直接或非直接地壓緊DNA的化合物。更確切地，這種化合物或者直接作用于待轉(zhuǎn)染DNA，或者作用于直接參與核酸濃集作用的其它化合物。優(yōu)選地，直接作用于DNA。這種直接作用于DNA的試劑特別可以是任何多陽離子物，例如聚賴氨酸。根據(jù)一種優(yōu)選實施方式，這種試劑可以是完全或部分地從魚精蛋白、組蛋白、核仁蛋白和／或它們的衍生物得到。這種試劑還可以全部或部分地由肽基元(KTPKKAKKP)和／或(ATPAKKAA)構(gòu)成，基元數(shù)可以是2-10。在本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)中，這些基元可以連續(xù)地或不連續(xù)地重復。因此它們可以通過生物化學性質(zhì)的連接(例如一個或多個氨基酸)隔開，或通過化學性質(zhì)的連接隔開。
本發(fā)明還涉及如上定義的載體在制備用于通過轉(zhuǎn)染DNA至初級細胞或已建細胞系中治療疾病的藥物中的應(yīng)用。涉及的細胞可以是成纖維細胞、肌肉細胞、神經(jīng)細胞(神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞、膠質(zhì)細胞)、肝細胞、造血細胞系(淋巴細胞、CD34、樹狀細胞等)、上皮細胞等，它們呈分化形式或多潛能形式(前體)。
本發(fā)明的載體例如可用于編碼蛋白或多肽之DNA的體外、離體或體內(nèi)轉(zhuǎn)染。
對于體內(nèi)應(yīng)用，即用于治療或用于研究基因調(diào)節(jié)或疾病動物模型的建立，本發(fā)明組合物經(jīng)配制可以采用局部、皮膚、口、直腸、陰道、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)等方式用藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的藥物組合物含有下述藥學上可接受的賦形劑，該賦形劑適用于注射劑，尤其是用于在所希望器官中直接注射的注射劑，或適于用局部方式(皮膚和／或粘膜上)用藥。特別涉及等滲的無菌溶液，或干的尤其是凍干的組合物，這些組合物可根據(jù)情況加入無菌水或生理鹽水配制成注射溶液。注射使用的核酸劑量以及用藥次數(shù)可以根據(jù)不同的參數(shù)而變化，特別是根據(jù)用藥方式、涉及的疾病、待表達基因或所進行治療的時間長短。更具體地對于用藥方式，可以在組織或循環(huán)通路中直接注射，或者處理培養(yǎng)細胞接著采用注射或移植方法將它們再植入。
本發(fā)明還涉及在細胞中轉(zhuǎn)染DNA的方法，其包括以下步驟(1)按前述方法合成寡核苷酸-靶向信號嵌合體，(2)將(1)中合成的嵌合體與雙鏈DNA接觸以形成三螺旋，(3)必要時，將(2)中獲得載體與一種或多種轉(zhuǎn)染劑和／或一種或多種添加劑復合，及(4)將細胞與(2)或(3)中形成的復合物接觸。
細胞與復合物的接觸可通過細胞與所述復合物一起保溫(對于體外或離體應(yīng)用)，或通過將復合物注射入機體中(對體內(nèi)應(yīng)用)來實現(xiàn)。
因此本發(fā)明提供一種用于治療疾病的特別有利的方法，包括給予含有適于治療所述疾病之核酸的本發(fā)明載體。更具體地講，該方法可用于由蛋白或肽產(chǎn)物缺陷造成的疾病，所給予的DNA編碼所述蛋白或肽產(chǎn)物。本發(fā)明也包括本發(fā)明載體對體內(nèi)、離體或體外細胞轉(zhuǎn)染的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及含有如上定義載體的任何重組細胞，優(yōu)選真核細胞，如酵母、動物細胞等。這些細胞通過能在給定的細胞中引入DNA的為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何技術(shù)獲得。
以下實施例用于說明本發(fā)明而不限制其范圍，其將顯示本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點。
附1寡核苷酸(ODN)和馬來酰亞胺-NLS肽的偶連。
圖2經(jīng)胰蛋白酶蛋白酶水解作用的寡核苷酸-肽嵌合體(Pso-GA19-NLS)在15％聚丙烯酰胺凝膠上的分析。
1=寡核苷酸Pso-GA19-SH2=寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA19-NLS3=胰蛋白酶消化后的寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA19-NLS。
圖3質(zhì)粒pXL2813的圖示。
圖4質(zhì)粒pXL2652的圖示。
圖5在15％聚丙烯酰胺凝膠上分析質(zhì)粒pXL2813和寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA19-NLS間的三螺旋形成。
寡核苷酸Pso-GA19-NLS和質(zhì)?；旌显诤?00mM MgCl2的緩沖液中。寡核苷酸與質(zhì)粒相比過量0-200M。在37℃過夜后將該混合物光活化，然后用分別切割質(zhì)粒和三螺旋形成區(qū)的兩種限制酶消化。
1=無寡核苷酸2=寡核苷酸過量質(zhì)粒15M3=寡核苷酸過量質(zhì)粒50M4=寡核苷酸過量質(zhì)粒100M5=寡核苷酸過量質(zhì)粒200M6=僅有光活化的寡核苷酸7=僅有未光活化的寡核苷酸8=寡核苷酸過量質(zhì)粒30M，混合物未被光活化。
圖6用單獨質(zhì)粒pXL2813、載體pXL2813-Pso-GA19-NLS及無質(zhì)粒時進行試驗，轉(zhuǎn)基因(β-半乳糖苷酶)的體外表達。
圖7通過與輸入蛋白60-GST的作用鑒定寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA19-NLS的肽部分(在15％聚丙烯酰胺凝膠上分析)。
1=寡核苷酸Pso-GA19(1μg)2=寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA19-NLS(1μg)3=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸Pso-GA19的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
4=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸Pso-GA19的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的沉淀。
5=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA10-NLS的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
6=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合體Pso-GA19-NLS的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的元件)和上清液后收集的沉淀。
圖8在15％聚丙烯酰胺凝膠上分析胰蛋白酶蛋白水解作用下的寡核苷酸-肽嵌合體(GA19-NLS)。
1=寡核苷酸GA19-SH(200μg)2=高壓液相色譜純化前的寡核苷酸-肽嵌合體GA19-NLS(1μg)3=純化后的寡核苷酸-肽嵌合體GA19-NLS(1μg)4=胰蛋白酶消化后的寡核苷酸-肽嵌合體GA19-NLS(1μg)。
圖9質(zhì)粒pXL2813和嵌合體GA19-NLS間三螺旋形成動力學的圖示(被占據(jù)的三螺旋位點百分數(shù)隨時間的變化)。


圖10通過與輸入蛋白60-GST的相互作用鑒定寡核苷酸-肽嵌合體GA19-NLS的肽部分。
1=寡核苷酸=肽嵌合體GA19-NLS，2=寡核苷酸GA19’3=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合體GA19-NLS的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
4=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸-肽嵌合體GA19-NLS的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的沉淀。
5=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸GA19的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的上清液。
6=保溫包被輸入蛋白60和寡核苷酸GA19的小珠-谷胱甘肽并分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液后收集的沉淀。
圖11質(zhì)粒pXL2997的圖示。
圖12質(zhì)粒pXL2997和嵌合體pim-NLS間三螺旋形成動力學的圖示(被占領(lǐng)三螺旋位點百分率隨時間的變化)。
圖13以RLU(相對光單位)／腫瘤表示的質(zhì)粒pXL2813(在圖中以Bgal表示)和pXL2813-Pso-GA19-NLS(在圖中以NLS-Bgal表示)在人肺腫瘤H1299中的體內(nèi)β-半乳糖苷酶活性棒圖。
利用諸如專利申請WO 99／01157和WO 99／01158中描述的電轉(zhuǎn)移技術(shù)實現(xiàn)轉(zhuǎn)染。材料和方法1．寡核苷酸和肽的偶連寡核苷酸所用的寡核苷酸要么是19個堿基長的序列5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID No．4)，在下文中稱其為“GA19”，要么是13個堿基長的序列5’-GGGGAGGGGGAGG-3’(SEQ ID No．15)，在下文中稱其為“pim”(因為它與原癌基因pim-1的序列有關(guān))。
稱為GA19-SH或pim-SH的寡核苷酸具有分別與GA19和pim相同的序列，在5’端帶有巰基，在巰基和5’端的磷酸之間有一個6碳間隔基。稱為Pso-GA19-SH的寡核苷酸在3’端有一巰基(SH)，另外在5’端有一補骨脂素(Pso)，在補骨脂素和5’-端磷酸之間有一6碳間隔基。稱為Pso-GA19的寡核苷酸沒有巰基。
所用的名稱匯總在下表Ⅰ中。
表Ⅰ
將這些凍干的寡核苷酸溶入醋酸三乙銨100mM，pH7緩沖液中。肽用于偶連的肽是經(jīng)固相自動合成的，包括-SV40T抗原的核定位序列(PKKKRKV，SEQ ID No．11)，-不能靶向也不能進行核轉(zhuǎn)運(由于突變)的突變序列(PKNKRKV，SEQ ID No．14)。
這些肽還在N端帶有4個氨基酸的間隔臂KGAG。N-末端的賴氨酸被化學修飾其ε碳上含有馬來酰亞胺基團，在α碳的胺上含有保護基9-芴基甲氧羰基(Fmoc)。該Fmoc基團在260nm處吸光，這使得可以用反相高壓液相色譜跟蹤該肽。C-末端基團也被保護(CONH2基團)，為了肽合成而引入保護。
這些肽的結(jié)構(gòu)示于下表Ⅱ中表Ⅱ
將這些凍干的肽溶于100mM醋酸三乙銨(pH7)緩沖液中。濃度為0．4mg／ml。偶連對于與寡核苷酸的偶連，所用的策略是讓寡核苷酸所帶巰基與肽所帶馬來酰亞胺基團反應(yīng)[Eritja，R．等，含核轉(zhuǎn)運信號序列的特定肽-寡核苷酸雜合體的合成，四面體，1991，47(24)，4113-4120頁]。
以等摩爾方式向肽溶液中加入寡核苷酸，室溫靜置反應(yīng)液2小時。在含直徑5μm孔隙率300_之球形二氧化硅的Vydac C8柱上高壓液相色譜純化寡核苷酸-肽嵌合體。使用0．1M醋酸三乙銨(TEAA)緩沖液和35分鐘內(nèi)5％至50％乙腈的梯度。在260nm處檢測產(chǎn)物。胰蛋白酶消化嵌合體的分析將綴合的寡核苷酸-肽用胰蛋白酶進行蛋白水解作用，這可以證明嵌合體的肽部分[Reed，M．W．等，核定向肽-反義寡核苷酸綴合物的合成和評價，生物綴合物化學，1995，6，101-108頁]。含有1μg寡核苷酸-肽的7μl0．1M醋酸三乙銨(TEAA)純化緩沖液中的溶液與1μl胰蛋白酶溶液(5mg／ml)混合。向其中加入1μl100mM Tris，HCl pH=9的緩沖液和1μl 500mM EDTA。消化一小時后將樣品置于15％聚丙烯酰胺凝膠(7M脲)孔中。在100mM Tris、90mM硼酸、1mM EDTA(pH=8．3)中進行電泳。用Biorad試劑盒銀染后取下核酸。2．與嵌合體形成三螺旋質(zhì)粒用于研究與嵌合體GA19-肽形成三螺旋的質(zhì)粒稱為pXL2813(7257bp，見圖3)。該質(zhì)粒表達巨細胞病毒(CMV)早熟基因強啟動子控制下的β-半乳糖苷酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。
在啟動子的上游，7238和7256位之間按分子生物學常規(guī)方法克隆了序列GA19(5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’，SEQ ID No．4)。
已將它克隆在質(zhì)粒pXL2652中(7391bp，其結(jié)構(gòu)示于圖4中)，該質(zhì)粒表達巨細胞病毒(CMV)早熟基因強啟動子控制下的β-半乳糖苷酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。該啟動子來自pCDNA3，LacZ基因和其polyA來自pCH110，其余來自pGL2。
這些序列被克隆在啟動子上游單一酶切位點MunI和XmaI之間。為此，將含有待克隆序列6651(5’-AATTGATTCCTCTCCTCCCTCCCTTAC-3’)和6652(3’-CTAAGGAGAGGAGGGAGGGAATGGG-5’)的兩個互補寡核苷酸95℃加熱5分鐘，然后讓溫度緩緩降低而雜交。然后質(zhì)粒pXL2652用酶MunI和XmaI于37℃消化2小時，該雙消化的產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上分離并用溴化乙錠染色。
用于隨后克隆的目標片段按Jetsorb方法(Genomed)洗脫，將200ng這種片段與10ng雜交寡核苷酸混合物在T4連接酶作用下16℃再連接16小時。
感受態(tài)大腸桿菌DH5α株鋪在含LB培養(yǎng)基和氨芐青霉素的培養(yǎng)皿中，用反應(yīng)混合物經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化。挑選氨芐青霉素抗性克隆，通過堿溶解提取DNA，在1％瓊脂糖上分析。對一個大小相應(yīng)的克隆測序，產(chǎn)物與預(yù)期相符。
在寡核苷酸是pim的情況下，用于研究三螺旋形成的質(zhì)粒是圖11所示的pXL2997。該質(zhì)粒表達巨細胞病毒(CMV)早熟基因強啟動子控制下的β-半乳糖苷酶基因，以及氨芐青霉素抗性基因。
在啟動子上游，按分子生物學常規(guī)方法克隆了pim序列(SEQ IDNo．15)。三螺旋的形成通過質(zhì)粒pXL2813(3pmol質(zhì)粒，即15μg)或pXL2997和不同量的寡核苷酸或嵌合體在100mM Tris，HCl pH=7．5和100mM MgCl2中混合進行三螺旋的形成。三螺旋的光活化保溫過夜后，在冰中用365nm波長的單色燈(Biorad)照射15分鐘。光活化產(chǎn)物用限制酶MfeI和SpeI消化，并在15％聚丙烯酰胺凝膠(7M脲)上用100mM Tris、90mM硼酸、1mM EDTA、pH=8．3的遷移緩沖液進行分析。通過用Biorad試劑盒銀染取下核酸[Musso，M．J．C．Wang和M．W．V．Dyke，含連有補骨脂素之寡脫氧核苷酸的DNA三螺旋的體內(nèi)存留，核酸研究，1996，24(24)，4924-4932頁]。三螺旋的研究方法該方法基于含待形成三螺旋之質(zhì)粒及寡核苷酸溶液的排阻色譜的原理。所用的排阻柱(Columus，Linkers 6，Boehringer Mannheim)由Sepharose珠組成，并具有194堿基對的排阻限，這得以將沒有與質(zhì)粒配對的寡核苷酸保留在柱中。
首先，用dATPα35S經(jīng)末端轉(zhuǎn)移酶對寡核苷酸3’末端放射標記。所用的程序來自Amersham在50μl體積的含二甲胂酸鈉的緩沖液中在10單位末端轉(zhuǎn)移酶存在下將10pmol寡核苷酸與50μCi dATPα35S保溫2小時。按如下方法評價標記寡核苷酸的百分比將標記后溶液1／100稀釋的樣品1μl點在兩張Whatman DE81紙上。一張紙用2×SSC洗2次5分鐘，用水洗30秒鐘，用乙醇洗2分鐘。比較兩張紙的放射活性。經(jīng)洗滌的紙放射活性相應(yīng)于有效摻入的35S。
在35μl體積中實現(xiàn)三螺旋的形成。質(zhì)粒濃度(40nM)和寡核苷酸濃度(20nM)、所用緩沖液(100mM Tris HCl pH=7．5，50mM MgCl2)和溫度(37℃)是固定的，而保溫時間在1-24小時間。在使用前，Sepharose柱用反應(yīng)緩沖液平衡，以2200轉(zhuǎn)／分離心4分鐘以將它們壓緊。將25μl反應(yīng)液上樣于該柱上，在前述相同條件下離心。然后將25μl反應(yīng)緩沖液上樣于這些柱上，再次離心。收集洗脫液。
測定5μl反應(yīng)液中所含的放射活性，稱為cpm(樣品)，和洗脫液中所含放射活性，稱為cpm(洗脫液)，從而得出洗脫寡核苷酸的百分比％洗脫的寡核苷酸=cpm(洗脫液)／[5×cpm(樣品)]×100通過測定洗脫液和樣品在260nm處的光密度評價實驗過程中有效洗脫的質(zhì)粒百分比，從而可以計算結(jié)合在總質(zhì)粒上的寡核苷酸的百分比％結(jié)合的寡核苷酸=[％洗脫的寡核苷酸／％洗脫的質(zhì)粒]×100在考慮三螺旋形成反應(yīng)中所用質(zhì)粒濃度(稱為[質(zhì)粒])和寡核苷酸濃度(稱為[oligo])的基礎(chǔ)上，該參數(shù)可用于評價被有效占據(jù)的三螺旋形成位點百分比％占據(jù)的三螺旋位點=％結(jié)合的寡核苷酸×[oligo]／[質(zhì)粒]3．與輸入蛋白的作用重組蛋白用于研究與寡核苷酸-肽(NLS或突變NLS)綴合物相互作用的亞單位輸入蛋白60來自鼠，并與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)融合。輸入蛋白60的序列已克隆在載體pGEX-2T中以與GST融合。該重組蛋白已在大腸桿菌中生產(chǎn)[Imamoto，N．等，核孔定向復合物的58kDa成分參與核蛋白轉(zhuǎn)入的體內(nèi)證據(jù)，The EMBO Journal，1995，14(15)，3617-3626頁]。與重組蛋白的相互作用所有相互作用實驗在結(jié)合緩沖液中進行(20mM HEPES，pH=6．8，150mM醋酸鉀，2mM醋酸鎂，2mMDTT和100μg／mlBSA)。
首先，將重組蛋白與包被谷胱甘肽基團的Sepharose珠(PharmaciaBiotech)保溫，10μg珠使用1μg重組蛋白。在500μl結(jié)合緩沖液中，室溫保溫30分鐘后，以2000G離心混合物30秒，取上清液。通過將小珠重懸于500μl結(jié)合緩沖液中并如前所述離心，洗滌5次。將小珠重懸在結(jié)合緩沖液中以獲得含50％重組蛋白包被小珠的懸浮液。
其次，將60μl該含50％重組蛋白包被小珠的懸浮液在500μl結(jié)合緩沖液中與2μg寡核苷酸或寡核苷酸-肽保溫。室溫保溫30分鐘后，以2000G離心混合物30秒，取上清液。收集30μl上清液用于分析不結(jié)合在小珠上的成分。通過重懸于500μl結(jié)合緩沖液并如前所述離心洗滌小珠5次。將小珠重懸于15μl上樣緩沖液(0．05％溴酚藍、40％蔗糖、0．1M EDTA，pH=8，0．5％月桂基硫酸鈉)，90℃下加熱10分鐘。在15％聚丙烯酰胺凝膠(7M脲)上分析上清液和沉淀的內(nèi)容，遷移緩沖液為100mM Tris，90mM硼酸，1mM EDTA，pH=8．3。通過用Biorad試劑盒銀染取出核酸[Rexach，M和G．Blobel，蛋白的細胞核輸入涉及轉(zhuǎn)運底物、轉(zhuǎn)運因子和核孔蛋白的結(jié)合及解離反應(yīng)，細胞(Cell)，1995，83，683-692頁]。4．細胞轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)所用細胞類型為NIH3T3(ATCC CRL-1658)，為小鼠的成纖維細胞。這些細胞培養(yǎng)在含4．5g／l葡萄糖(DMEM Gidco)、2mM谷氨酰胺、青霉素(100U／ml)和鏈霉素(100μg／ml)和10％胎牛血清(Gibco)的改良Dulbecco培養(yǎng)基中。于5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前一天，在24孔板的孔中接種50000個細胞／孔。用150mMNaCl稀釋載體，與陽離子脂(下式化合物H2N(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NHCH2COGlyN[(CH2)17CH3]2，如專利申請WO 97／18185中以序號(6)所示)混合，用150mM NaCl稀釋。以每微克質(zhì)粒6nmol脂的比例混合。該混合物在無血清培養(yǎng)基中稀釋1／10，上樣于細胞上。在37℃、5％CO2孵箱中培養(yǎng)2小時后，加入10％胎牛血清。β-半乳糖苷酶的定量培養(yǎng)48小時后，細胞用PBS洗2次，用250μl溶胞緩沖液(Promega)溶解。按“Lumigal β-半乳糖苷酶遺傳報道系統(tǒng)”操作程序(Clontech)對β-半乳糖苷酶定量。在發(fā)光計Lumat LB9501(Berthold)上測定活性。用BCA試劑盒(Pierce)測量蛋白的量。
實施例實施例1本實施例證明寡核苷酸Pso-GA19-SH與肽馬來酰亞胺-NLS偶連的可行性。
寡核苷酸Pso-GA19-SH，序列為5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’，在3’-末端帶有巰基，按前文“材料與方法”部分“寡核苷酸與肽的偶連”一節(jié)中描述的方法將其與N-末端帶有馬來酰亞胺基團的肽NLS偶連。
通過反相高壓液相色譜(HPLC)跟蹤偶連反應(yīng)。反應(yīng)以等摩爾化學計量法進行，2小時內(nèi)偶連完成，用HPLC純化嵌合體。
偶連反應(yīng)流程圖示于圖1中。
在胰蛋白酶蛋白水解作用后在聚丙烯酰胺凝膠上通過電泳分析嵌合體寡核苷酸-肽(Pso-GA19-NLS)，在變性聚丙烯酰胺凝膠上遷移并對核酸銀染色后得以顯示嵌合體的肽部分的存在(如“材料和方法”部分“胰蛋白酶消化嵌合體的分析”一節(jié)中所述)。
嵌合體Pso-GA19-NLS的電泳遷移相對于寡核苷酸Pso-GA19-SH要滯后，在Pso-GA19-NLS和Pso-GA19-SH的遷移水平之間顯現(xiàn)并觀察到了蛋白水解消化產(chǎn)物，如圖2中所示。
嵌合體Pso-GA19-NLS含有可被胰蛋白酶水解的肽部分。這些結(jié)果清楚地證明了寡核苷酸和肽之間發(fā)生了偶連，而且偶連產(chǎn)率較高。實施例2本實施例證明質(zhì)粒pXL2813和經(jīng)可光活化烷基化試劑修飾的嵌合體Pso-GA19-NLS間三螺旋的形成。本實施例還指出了按寡核苷酸相對質(zhì)粒的過量摩爾濃度所修飾質(zhì)粒的比例。
質(zhì)粒pXL2813(示于圖3)含有與GA19互補的全嘌呤序列，其可與寡核苷酸GA19、Pso-GA19、Pso-GA19-SH或Pso-GA19-NLS形成三螺旋。二價陽離子如Mg2+可穩(wěn)定這些三螺旋。將寡核苷酸Pso-GA19-NLS和質(zhì)粒在含100mM MgCl2的緩沖液中混合。寡核苷酸相對質(zhì)粒過量的摩爾濃度在0-200之間。
在37℃保溫12小時后，將混合物光活化15分鐘(如“材料和方法”部分“三螺旋的光活化”一節(jié)中所述)，然后用兩種限制酶MfeI和SpeI消化，它們分別切割質(zhì)粒部分和三螺旋形成區(qū)。這樣未修飾的質(zhì)粒pXL2813經(jīng)消化后釋放出含70個堿基對的核酸片段。用質(zhì)粒和與雙螺旋共價連接的形成三螺旋的寡核苷酸所得片段含有70個堿基對加上寡核苷酸的19個堿基。通過在變性聚丙烯酰胺凝膠上遷移，可以將這些不同大小的片段分離來自經(jīng)三螺旋修飾之質(zhì)粒的片段遷移距離短于來自未修飾質(zhì)粒的片段。因而通過變性聚丙烯酰胺凝膠上的電泳，可以對根據(jù)寡核苷酸過量于質(zhì)粒的摩爾濃度而不同的修飾質(zhì)粒的比例進行定量。
結(jié)果如圖5所示。對于寡核苷酸相對質(zhì)粒過量的摩爾濃度大于50的，所有質(zhì)粒均被修飾，與寡核苷酸Pso-GA19-NLS結(jié)合。在無光活化時，喪失了消化片段在變性凝膠上的遷移延遲。
看來與寡核苷酸Pso-GA19-SH或Pso-GA19-NLS形成的三螺旋在光活化后發(fā)生了與雙螺旋良好的共價連接。
另外，如前所述消化質(zhì)粒骨架的其余部分并分析，可以證實光活化不會導致寡核苷酸Pso-GA19-NLS在含形成三螺旋序列區(qū)域之外的非特異性共價連接。
這些結(jié)果清楚地顯示了將肽序列與質(zhì)粒特異性共價結(jié)合的條件，而這發(fā)生在調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達的啟動子之外，這避免了轉(zhuǎn)基因表達受到影響。實施例3本實施例證明盡管質(zhì)粒被修飾轉(zhuǎn)基因在體外被表達的能力。
通過轉(zhuǎn)染NIH3T3細胞，比較了本修飾的或與寡核苷酸Pso-GA19-NLS結(jié)合的質(zhì)粒pXL2813對β-半乳糖苷酶的表達。
結(jié)果報告在圖6中，所得值的均值1±標準差)匯總在下表Ⅲ中表Ⅲ
可以看出通過在啟動子上游共價結(jié)合三螺旋進行修飾后，轉(zhuǎn)基因的表達提高了。
這些結(jié)果清楚地表明三螺旋的形成不影響轉(zhuǎn)基因的體外表達。相反，由于連接了靶向序列NLS，質(zhì)?？蛇M行核定位，更多的質(zhì)粒達到了細胞核內(nèi)，從而導致轉(zhuǎn)染效率提高。實施例4本實施例的目的是驗證以三螺旋形式結(jié)合于質(zhì)粒上的靶向信號的存在不會抑制體內(nèi)表達。
實驗包括，按專利申請WO 99／01157和WO 99／01158中描述的電轉(zhuǎn)移技術(shù)在人肺腫瘤H1299中轉(zhuǎn)染pXL2813和pXL2813-Pso-GA19-NLS。實驗在18-20g的雌性小鼠中進行。
給小鼠單側(cè)移植20mm3的H1299腫瘤塊。讓腫瘤生長達到200-300mm3的體積。按腫瘤大小挑選小鼠并分成均勻的組。然后用氯胺酮／賽拉嗪混合物(有商業(yè)供應(yīng))將小鼠麻醉。用Hamilton注射器在腫瘤周圍縱向注射質(zhì)粒溶液(8μgDNA／40μl150mM氯化鈉)。
在腫瘤側(cè)面涂上導電凝膠，將腫瘤置于距離0．45-0．7cm的兩塊不銹鋼電極板之間。在注射后20-30秒用商業(yè)方波脈沖發(fā)生器(Electro-pulsateur PSl5，Jouan，法國)施加電脈沖。用示波儀控制脈沖強度(伏)、持續(xù)時間(毫升)和頻率(赫茲)，其應(yīng)以500V／cm、20毫秒和1赫茲發(fā)射。
為了評價腫瘤的轉(zhuǎn)染，在注射質(zhì)粒2天后將分別注射質(zhì)粒pXL2813和pXL2813-Pso-GA19-NLS的10只和7只小鼠無痛苦處死。取出腫瘤、稱重并在加有抗蛋白酶(Complete，Boehringer)的裂解緩沖液(Promega)中研磨。將所得懸液離心以獲得清澈的上清液。10μl該上清液與250μl反應(yīng)緩沖液(Clontech)反應(yīng)1小時至渾濁后，用商業(yè)發(fā)光計測定β-半乳糖苷酶活性。結(jié)果以每個腫瘤的總RLU(“相對光單位”)表示。
發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pXL2813-Pso-GA19-NLS體內(nèi)表達轉(zhuǎn)基因的水平高于或等于用未修飾的質(zhì)粒pXL2813所獲得的水平(見圖13)。實施例5本實施例闡明綴合物Pso-GA19-NLS肽部分的鑒定，即驗證本發(fā)明構(gòu)建物中結(jié)合的NLS肽的靶向特性。
所用的肽序列SV40 T抗原的NLS信號被α核周蛋白(karyopherin)家族的受體識別。其鼠等價物(稱為輸入蛋白60)以與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合形式已用于鑒定寡核苷酸-肽綴合物。按“材料和方法”部分“與輸入蛋白的相互作用”一節(jié)中所述進行操作。
研究了包被輸入蛋白60的小珠-谷胱甘肽與寡核苷酸GA19-NLS或Pso-GA19-NLS間的相互作用。室溫保溫30分鐘后，分離小珠沉淀(含與輸入蛋白相作用的成分)和上清液。
該鑒定的結(jié)果報告在圖7中。該圖表明，寡核苷酸Pso-GA19-NLS被結(jié)合在谷胱甘肽小珠上，而寡核苷酸Pso-GA19保持在上清液中。
這清楚地表明了寡核苷酸PSo-GA19-NLS與α輸入蛋白間相作用的能力。因此寡核苷酸-肽嵌合體的肽部分可被其受體很好地識別，這表明肽有效地發(fā)揮了其靶向作用。實施例6本實施例證明了寡核苷酸GA19-SH與肽馬來酰亞胺-NLS偶連的可能性。與實施例1不同，嵌合體沒有經(jīng)可光活化烷化劑修飾。
在與寡核苷酸Pso-GA19-SH相同的條件下(見實施例1)，將序列為5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID No．4)、5’-端有巰基的寡核苷酸GA19-SH與在N-末端具有馬來酰亞胺基團的肽馬來酰亞胺-NLS偶連。
用反相高壓液相色譜(HPLC)跟蹤該偶連。反應(yīng)以等摩爾化學計量法進行，2小時內(nèi)偶連完全。然后經(jīng)HPLC純化嵌合體。
按“材料和方法”部分所述經(jīng)胰蛋白酶的蛋白水解作用分析寡核苷酸-肽嵌合體。
結(jié)果示于圖8中，與用寡核苷酸Pso-GA19-SH獲得的結(jié)果相似。實施例7本實施例證明了在無烷化劑存在下質(zhì)粒pXL2813和嵌合體GA19-NLS間形成三螺旋的可能性。
按“材料和方法”部分“與嵌合體形成三螺旋”一節(jié)所述的技術(shù)，進行了質(zhì)粒pXL2813和嵌合體GA19-NLS(如實施例5中所述獲得)間三螺旋的形成和其動力學研究。
圖9顯示了三螺旋形成的動力學。
看來在40nM質(zhì)粒和20nM寡核苷酸的濃度條件下，形成了穩(wěn)定的三螺旋。實施例8本實施例說明嵌合體GA19-NLS肽部分的鑒定。
所用的肽序列SV40 T抗原的NLS信號被α核周蛋白家族的受體識別，實施例4中已提到了這一點。其鼠等價物稱為輸入蛋白60，后者以與谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合的形式已用于鑒定寡核苷酸-肽綴合物。如“材料和方法”部分“與輸入蛋白的相互作用”一節(jié)中所述進行操作。
研究了包被有輸入蛋白60的小珠-谷胱甘肽和寡核苷酸GA19或GA19-NLS間的相互作用。在常溫保溫30分鐘后，分離小珠沉淀(包括與輸入蛋白相作用的成分)和上清液。
結(jié)果如圖10中所示?？梢钥闯?，寡核苷酸GA19-NLS與谷胱甘肽的小珠結(jié)合，而寡核苷酸GA19保留在上清液中。
這清楚地表明了寡核苷酸GA19-NLS與α輸入蛋白相作用的能力。因而寡核苷酸-肽嵌合體的肽部分被其受體很好地識別，發(fā)揮了其靶向信號的作用。實施例9本實施例證明寡核苷酸pim-SH與肽馬來酰亞胺-NLS偶連的可能性。
在與寡核苷酸GA19-SH相同的條件下(見實施例5)，將序列為5’-GGGGAGGGGGAGG-3’(SEQ ID No．15)、5’端有巰基的寡核苷酸pim-SH與在N-末端帶馬來酰亞胺基團的肽馬來酰亞胺-NLS偶連。
用反相高壓液相色譜(HPLC)跟蹤該偶連反應(yīng)。該反應(yīng)以等摩爾化學計量法進行，2小時內(nèi)偶連完全。然后經(jīng)HPLC純化嵌合體。實施例10本實施例證明無烷化劑時質(zhì)粒pXL2997和嵌合體pim-NLS間形成三螺旋的可能性。
按“材料和方法”部分“與嵌合體形成三螺旋”一節(jié)中所述技術(shù)進行并研究質(zhì)粒pXL2997和嵌合體pim-NLS(如實施例8所述獲得)間三螺旋形成的動力學。
圖12顯示了三螺旋形成的動力學。
可見在40nM質(zhì)粒和20nM寡核苷酸的濃度條件下形成了穩(wěn)定的三螺旋。
雖然以上對本發(fā)明進行了完全的描述，但顯然可對本發(fā)明進行許多修改而不偏離本發(fā)明的精神和以下權(quán)利要求書的范圍。
序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人(A)名稱RHONE POULENC RORER(B)街道Raymond Aron大街20號(C)城市安東尼CEDEX(E)國家法國(F)郵編92165(G)電話0155717326(H)傳真0155717291(ⅱ)發(fā)明名稱轉(zhuǎn)移核酸的載體、含有它們的組合物及其應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)15(ⅳ)計算機可讀形式(A)載體軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentIn Release＃1．0，＃1．30版(EPO)(2)SEQ ID No．1的信息(ⅰ)序列特征(A)長度25堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．1GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25(2)SEQ ID No．2的信息
(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．2CTTCTTCTTC TTCTTCTTCTT 21(2)SEQ ID No．3的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．3AAGGGAGGGA GGAGAGGAA 19(2)SEQ ID No．4的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．4AAGGAGAGGA GGGAGGGAA 19(2)SEQ ID No．5的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．5TTGGTGTGGT GGGTGGGTT 19(2)SEQ ID No．6的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．6CTTCCCGAAG GGAGAAAGG 19(2)SEQ ID No．7的信息(ⅰ)序列特征(A)長度21堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．7GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C 21(2)SEQ ID No．8的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．8GAAAAAGGAA GAG13(2)SEQ ID No．9的信息(ⅰ)序列特征(A)長度14堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．9AAGAAAAAAA AGAA14(2)SEQ ID No．10的信息(ⅰ)序列特征(A)長度17堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．10AAAAAAGGGA ATAAGGG 17(2)SEQ ID No．11的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．11Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val15(2)SEQ ID No．12的信息(ⅰ)序列特征(A)長度19個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．12Lys Arg Pro Ala Ala Thr Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys15 10 15Leu Asp Lys(2)SEQ ID No．13的信息(ⅰ)序列特征(A)長度38個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性
(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．13Asn Gln Ser Ser Asn Phe Gly Pro Met Lys Gly Gly Asn Phe Gly Gly1 5 10 15Arg Ser Ser Gly Pro Tyr Gly Gly Gly Gly Gln Tyr Phe Ala Lys Pro20 25 30Arg Asn Gln Gly Gly Tyr35(2)SEQ ID No．14的信息(ⅰ)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型肽(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．14Pro Lys Asn Lys Arg Lys Val1 5(2)SEQ ID No．15的信息(ⅰ)序列特征(A)長度13堿基對(B)類型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID No．15GGGGAGGGGG AGG 1權(quán)利要求
1．核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于它含有一種雙鏈DNA分子和至少一種與靶向信號偶連并能夠與存在于所述雙鏈DNA分子上的特定序列形成三螺旋的寡核苷酸。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于雙鏈DNA載體是一種質(zhì)?；蚋郊芋w。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于雙鏈DNA分子是一種環(huán)狀形式和超纏繞狀態(tài)的質(zhì)粒。
4．根據(jù)權(quán)利要求1-3的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于雙鏈DNA分子含有一種表達盒，該表達盒由一個或多個啟動子及一個在哺乳動物細胞中有活性的轉(zhuǎn)錄終止子控制下的一個或多個目的基因構(gòu)成。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于目的基因是編碼一種治療性產(chǎn)物的核酸。
6．根據(jù)權(quán)利要求1-5之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于存在于雙鏈DNA分子上的特定序列是全嘌呤-全嘧啶序列。
7．根據(jù)權(quán)利要求1-6之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于存在于雙鏈DNA分子上的特定序列是天然存在于雙鏈DNA上的一種序列或人工引入雙鏈DNA中的天然或合成序列。
8．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸包含多聚-CTT序列，存在于雙鏈DNA分子上的特定序列為一種多聚-GAA序列。
9．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸包含序列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQ ID No．1)或序列(CTT)7(SEQ ID No．2)。
10．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于存在于雙鏈DNA分子上的特定序列包含序列5’-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3’(SEQ ID No．3)，寡核苷酸包含序列5’-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3’(SEQ ID No．4)或5’-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3’(SEQID No．5)。
11．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于存在于雙鏈DNA分子上的特定序列包含大腸桿菌ColE1復制起點中存在的序列5’-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3’(SEQ ID No．6)的全部或部分，寡核苷酸具有序列5’-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3’(SEQ IDNo．7)。
12．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于存在于雙鏈DNA分子上的特定序列包含分別存在于質(zhì)粒pBR322中的和大腸桿菌中的β-內(nèi)酰胺酶基因中的序列5’-GAAAAAGGAAGAG-3’(SEQID No．8)或序列5’-AAAAAAGGGAATAAGGG-3’(SEQ ID No．10)。
13．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于存在于雙鏈DNA分子上的特定序列包含存在于具有條件性復制起點的質(zhì)粒如pCOR的γ復制起點中的序列5’-AAGAAAAAAAAGAA-3’(SEQ IDNo．9)。
14．根據(jù)權(quán)利要求1-7之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸包含至少3個堿基。
15．根據(jù)權(quán)利要求14的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸包含5-30個堿基。
16．根據(jù)權(quán)利要求1-15之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸帶有至少一種化學修飾，這種修飾使其對核酶有抗性或受保護、或提高其對雙鏈DNA分子上存在的特定序列的親和性。
17．根據(jù)權(quán)利要求1-16之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸是一種骨架經(jīng)過修飾的核苷鏈。
18．根據(jù)權(quán)利要求1-16之一的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于寡核苷酸與一種烷化劑相連，該烷化劑可與雙鏈DNA的堿基形成共價連接。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于所述烷化劑是可光活化的。
20．根據(jù)權(quán)利要求18或19的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于所述烷化劑是補骨脂素。
21．根據(jù)權(quán)利要求1-20的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于靶向信號與細胞外基質(zhì)成分、漿膜的受體相作用、靶向細胞內(nèi)的腔室、和／或改善雙鏈DNA的分子內(nèi)途徑。
22．根據(jù)權(quán)利要求21的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于所述靶向信號包括生長因子(EGF、PDGF、TGFb、NGF、IGF I、FGF)、細胞因子(IL-1、IL-2、TNF、干擾素、CSF)、激素(胰島素、生長激素、催乳素、胰高血糖素、甲狀腺激素、類固醇激素)、識別凝集素的糖、免疫球蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、脂蛋白、維生素如維生素B12、肽激素或神經(jīng)肽(速激肽、神經(jīng)降壓素、VIP、內(nèi)皮素、CGRP、CCK等)、或被整聯(lián)蛋白識別的任何基元，例如RGD肽，或由細胞膜非固有的其他蛋白識別的基元。
23．根據(jù)權(quán)利要求21的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于靶向信號是一種細胞內(nèi)靶向信號，如核定位信號(NLS)。
24．根據(jù)權(quán)利要求23的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于所述核定位信號是SV40T抗原的NLS序列。
25．根據(jù)權(quán)利要求21的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于所述靶向信號同時具有細胞外靶向作用和細胞內(nèi)靶向作用。
26．根據(jù)權(quán)利要求1-25的核酸轉(zhuǎn)移載體，其特征在于靶向信號與寡核苷酸的偶連是通過固相或液相合成獲得的，特別是通過建立二硫鍵、硫醚、酯、酰胺或胺而實現(xiàn)的。
27．一種組合物，其特征在于它含有權(quán)利要求1-26之一中定義的至少一種載體。
28．根據(jù)權(quán)利要求27的組合物，其特征在于它另外含有一種或多種轉(zhuǎn)染試劑。
29．根據(jù)權(quán)利要求28的組合物，其特征在于轉(zhuǎn)染試劑是一種陽離子脂、脂多胺或陽離子聚合物。
30．根據(jù)權(quán)利要求27-29的組合物，其特征在于它還含有能夠與如權(quán)利要求1-25之一所定義載體／轉(zhuǎn)染試劑復合物結(jié)合的一種或多種添加劑。
31．根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其特征在于所述添加劑是選自在生理條件下為兩性離子或不帶離子電荷的天然或合成脂類的一種或多種中性脂。
32．根據(jù)權(quán)利要求30或31的組合物，其特征在于所述中性脂選自具有兩條脂肪鏈的脂類。
33．根據(jù)權(quán)利要求30-32的組合物，其特征在于所述中性脂選自二油?；字Ｒ掖及?DOPE)、油?；貦磅；字Ｒ掖及?POPE)、二硬脂酰基-、二棕櫚酰基-、二肉豆蔻?；?磷脂酰乙醇胺以及它們的1-3次N-甲基化衍生物、磷脂?；视汀⒍；视汀⑻腔；视汀⒛X苷脂(具體如半乳糖腦苷脂)、鞘脂(具體如鞘磷脂)，或脫唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(具體如脫唾液酸GM1和GM2)。
34．根據(jù)權(quán)利要求30的組合物，其特征在于所述添加劑包含參與DNA濃集的化合物。
35．根據(jù)權(quán)利要求34的組合物，其特征在于所述化合物全部或部分來自組蛋白、核仁蛋白、和／或魚精蛋白，或全部或部分由連續(xù)或非連續(xù)重復肽基元(KTPKKAKKP)和／或(ATPAKKAA)構(gòu)成，基元數(shù)目可在2-10之間變化。
36．根據(jù)權(quán)利要求27-35任一項的組合物，其特征在于含有適于注射制劑的藥物載體。
37．根據(jù)權(quán)利要求27-35任一項的組合物，其特征在于含有適于皮膚和／或粘膜施用的藥物載體。
38．如權(quán)利要求1-26之一中所定義的核酸轉(zhuǎn)移載體在制備用于治療疾病的藥中的用途。
39．在細胞中轉(zhuǎn)染核酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)合成寡核苷酸-靶向信號嵌合體，(2)將(1)中合成的嵌合體與雙鏈DNA接觸以形成三螺旋，(3)必要時，將(2)中獲得的載體與一種或多種轉(zhuǎn)染試劑和／或一種或多種添加劑復合，及(4)將細胞與(2)或(3)中形成的復合物接觸。
40．一種治療疾病的方法，包括給予含有適于治療該疾病的雙鏈DNA的權(quán)利要求1-26之一定義的核酸轉(zhuǎn)移載體。
41．含有如權(quán)利要求1-26之一定義的核酸轉(zhuǎn)移載體的重組細胞。
42．根據(jù)權(quán)利要求41的重組細胞，其特征在于它是一種真核細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的載體和其轉(zhuǎn)移核酸的用途。更具體地講,本發(fā)明涉及能夠引導核酸至特定細胞或細胞腔室的新載體。
文檔編號A61P37/00GK1292827SQ9980393
公開日2001年4月25日 申請日期1999年3月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月24日
發(fā)明者C·喬里納, D·舍爾曼, P·威爾斯 申請人:阿文蒂斯藥物股份有限公司