專利名稱：生物可降解的緩釋藻酸酯凝膠的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用生物可降解的藻酸酯凝膠珠和/或緩釋凝膠的緩釋制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著基因和細胞工程技術(shù)的進展，在使用蛋白作為治療藥物的領(lǐng)域內(nèi)，重組蛋白的可用性已有了很大發(fā)展。用藥物蛋白治療的許多疾病或病癥需要緩釋的蛋白水平來獲得最有效治療效果。然而，因為大多數(shù)蛋白藥物通常具有短的生物半衰期，所以需要頻繁給藥。這些反復(fù)注射是以不同時間間隔進行的，造成了波動的藥物水平，給患者帶來了嚴重的身體和經(jīng)濟負擔(dān)。因為許多病癥對控制水平的藥物有更好反應(yīng)，所以需要控制藥物的釋放以提供更長時間的持續(xù)釋放。這種緩釋藥物不僅能給患者提供增強的預(yù)防、治療或診斷作用，而且還能降低給藥頻率以及整個成本。
在給藥之間維持人或動物中藥物水平的通常嘗試包括使用生物可降解的聚合物作為基質(zhì)來控制藥物釋放。例如，第1388580號英國專利公開了水凝膠在緩釋胰島素中的應(yīng)用。US4789550公開了多熔素包衣的藻酸酯微膠囊在遞送蛋白中的應(yīng)用，其中是通過將活細胞封入膠囊而實現(xiàn)的。緩釋嘗試還使用了以具有相反電荷的離子聚合物環(huán)繞的陰離子或陽離子組合物來包封能產(chǎn)生生物活性組分的細胞；US4,744,933。同樣，還有人公開了使用多包衣陰離子或陽離子交聯(lián)聚合物來實現(xiàn)控釋；US4690682和US4789516。此外，其它嘗試公開了單獨使用藻酸酯、或使用用生物可降解聚合物包衣的藻酸酯來控制多肽組合物或其陽離子沉淀物的釋放；PCT WO96/00081、PCT WO95/29664和PCT WO96/03116。
然而，這些嘗試所提供的手段不足以實現(xiàn)所需蛋白藥物的持續(xù)釋放。人們普遍知道，一些生物可降解聚合物例如聚丙交酯-乙交酯共聚物(polylactide co-glycolide)在體內(nèi)條件下使用時會表現(xiàn)出高的初始爆發(fā)性藥物釋放；Johnson,O.等人，Nature Med.,2(7):795(1996)。此外，人們普遍知道，當(dāng)暴露于包封劑時，以常規(guī)緩釋劑型使用的蛋白可能會變性并失去其生物活性。這種制劑使用了對所選蛋白可能有有害作用的有機溶劑。再者，如下所述，單獨使用藻酸酯不能提供有效治療結(jié)果所需的理想的蛋白控制釋放。
一般來說，藻酸酯是眾所周知的、天然的陰離子多糖，它由1,4-相連的-β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸組成；Smidsrod,O.等人，Trends in Biotechnol.,8:71-78(1990)；Aslani,P.等人，J.Microencapsulation,13(5):601-614(1996)。藻酸酯的組成通常從70％甘露糖醛酸和30％古洛糖醛酸到30％甘露糖醛酸和70％古洛糖醛酸變化；上述Smidsrod的文獻，藻酸不溶于水，然而其與單價離子形成的鹽例如鈉鹽、鉀鹽和銨鹽是溶于水的；McDowell,R.H.,“藻酸鹽特征”(London,Alginate Industries Ltd,4th edition 1977)。已知多價陽離子能與藻酸鹽反應(yīng)并自發(fā)形成凝膠。
藻酸酯具有很廣的應(yīng)用，例如用作食品添加劑、粘合劑、藥物片劑和傷口敷料。還有人建議將藻酸鹽用于蛋白分離技術(shù)。例如，Gray,C.J.等人在Biotechnology and Bioengineering,31:607-612(1988)中提出，在藻酸鋅/藻酸鈣凝膠中截留胰島素來將胰島素與其它血清蛋白分離開。
藻酸酯基質(zhì)已被充分證實可用作藥物遞送系統(tǒng)；參見例如US4695463，其中公開了以藻酸酯為基質(zhì)的口香糖遞送系統(tǒng)和藥物制劑。藻酸酯珠已用于多種蛋白的控制釋放，例如在用聚陽離子包衣的陽離子藻酸酯珠中的腫瘤壞死因子受體；Wee,S.F,Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.,21:730-31(1994)；包封在藻酸酯珠中的轉(zhuǎn)化生長因子；Puolakkainen,P.A.等人，Gastroenterology,107:1319-1326(1994)；包封在藻酸鈣珠中的血管生成因子；Downs,E.C.等人，J.of Cellular Physiology,152:422-429(1992)；包封在脫乙酰殼多糖-藻酸酯微膠囊中的白蛋白；Polk,A.等人，J.Pharmaceutical Sciences,83(2):178-185(1994)；用聚合物包衣的脫乙酰殼多糖-藻酸鈣珠；Okhamafe,A.O.等人，J.Microencapsul.,13(5):497-508(1996)；包封在脫乙酰殼多糖-藻酸鈣珠中的血紅蛋白；Huguet,M.L.等人，J.Applled Polymer Science,51:1427-1432(1994),Huguet,M.L.等人，Process Biochemistry,31:745-751(1996)；和包封在藻酸酯-脫乙酰殼多糖微球中的白細胞介素-2；Liu,L.S.等人，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater,22:542-543(1995)。
使用藻酸酯凝膠珠或藻酸酯/鈣凝膠珠來包封蛋白的系統(tǒng)的缺點是缺乏任何緩釋效果，這是由于蛋白迅速地從藻酸酯珠中釋放所致；Liu,L.等人，J.Control.Rel.,43:65-74(1997)。為了防止這種迅速釋放，有多種上述系統(tǒng)嘗試使用聚陽離子聚合物包衣(例如多熔素、脫乙酰殼多糖)來延遲蛋白藻酸酯珠的釋放；參見例如Wheatley,M.A.等人，J.Applied Polymer Science,43:2123-2135(1991)；上文中Wee,S.F.等人的文獻；上文中Liu,L.S.等人的文獻；Wee,S.F.等人，Controlled Release Society,22:566-567(1995)和上文中Lim，等人的文獻。
聚陽離子例如多熔素是攜帶正電荷的聚電解質(zhì)，其與攜帶負電荷的藻酸酯分子相互作用以形成在珠表面上起擴散屏障的聚電解質(zhì)復(fù)合物。使用聚陽離子可能會帶來問題，這是因為(1)這種制劑可能由于聚陽離子而具有細胞毒性；上文中Huguet,M.L.等人的文獻；Zimmermann,Ulrich,Electrophoresis,13:269(1992)；Bergmann,P.等人，ClincialScience,67:35(1984)；(2)聚陽離子易于氧化；(3)具有聚陽離子包衣的珠在體內(nèi)不易于被侵蝕和增大；(4)這種制劑是通過包括用聚陽離子多熔素多次包衣的費力包衣操作制得的；Padol,等人，Proceed.Intern.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater,2:216(1986)；和(5)蛋白和聚陽離子之間的離子相互作用可導(dǎo)致蛋白活性損失或使蛋白不穩(wěn)定。
Francesco等人的US533668(及其引用文獻)中描述了通過不同方法制得的藻酸的全酯和偏酯，以及它們所具有藥用特性。其中描述了如何將藻酸酯在醫(yī)療-外科應(yīng)用中用作生物可降解塑性材料；用作多種聚合材料的添加劑；或在多種藥物的制備中使用。其中沒有描述藻酸酯和藻酸酯水凝膠在緩釋制劑中的潛在應(yīng)用。
Nightlinger等人的Proceed.Inter.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.,22:738-739(1995)中描述了具有控釋能力的酯化透明質(zhì)酸(NA)微球。該文獻提出HA衍生物具有不同降解速度，并描述了透明質(zhì)酸酯是如何“折斷”以釋放出醇和HA部分。其中沒有描述HA自身骨架是如何或者是否分解成小分子量聚合物單元。
為了使基于多糖的緩釋系統(tǒng)能夠適用，多糖必須能生物降解成無毒產(chǎn)物。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些藻酸酯凝膠系統(tǒng)，雖然能有效地提供藥物緩釋效果，但是會由于凝膠的消散速度非常慢而在注射位點產(chǎn)生“腫塊”(或小結(jié))。在涉及低劑量藥物和注射頻率很小的治療中，這可能不是嚴重問題。但是，在涉及高劑量藥物和注射頻率較高的治療中，這種影響是必須禁止的。必須找到能提高藻酸酯凝膠從注射位點消散的速度的手段。
對于臨床應(yīng)用，還需要開發(fā)能獲得更通用和更有效緩釋手段的藥物制劑。多種重組或天然蛋白可受益于恒定的長期釋放，并因此提供更有效的臨床效果。
本發(fā)明提供了這樣的進步。本發(fā)明使用生物可降解藻酸酯凝膠顆粒或凝膠的藥物組合物能提供提高的生物利用度、蛋白保護、降解降低和緩釋以及蛋白穩(wěn)定性和效力提高。本發(fā)明藥物組合物還提供了控制重組蛋白釋放的簡單、迅速和低廉的手段，以提供有效的預(yù)防、治療或診斷效果。
發(fā)明簡述本發(fā)明產(chǎn)生自在蛋白緩釋方面使用未修飾藻酸酯(一類陰離子多糖)水凝膠的研究。這些含有蛋白的未修飾藻酸酯水凝膠(參見未結(jié)案的美國專利申請08/857913和08/912902)是以延時方式形成的，因此這些材料可填充在注射器中，并且在同一注射器中放置形成隨后的凝膠；我們發(fā)現(xiàn)這些凝膠是可注射的。在嚙齒動物模型中進行一次皮下注射后，觀察到了蛋白在很多天內(nèi)的持續(xù)釋放；然而，注射位點長時間保持著可察覺的腫塊或小結(jié)，腫塊或小結(jié)的大小在長時間內(nèi)變化很小。該腫塊由填充水的藻酸酯水凝膠組成，并且腫塊的大小是注射凝膠體積的函數(shù)。凝膠珠也保留在注射位點。
因此，本發(fā)明涉及一類新的生物可降解的生物可相容多糖水凝膠例如藻酸酯水凝膠在治療蛋白緩釋中的應(yīng)用。出乎意料的是，藻酸酯水凝膠除了具有凝膠化作用以外，還具有未修飾藻酸酯所具有的可注射性和緩釋特性，在注射位點不會留下腫塊，也就是說，藻酸酯水凝膠是生物可降解或可侵蝕的，并且能逐步被再吸收到周圍組織內(nèi)，注射位點反應(yīng)很小。
本發(fā)明組合物包含在含有治療劑例如蛋白的水凝膠(含水)基質(zhì)中離子交聯(lián)的藻酸酯或其衍生物。
本發(fā)明還涉及制備生物可降解緩釋組合物的方法。
本發(fā)明還涉及液體混合物中的藻酸酯材料在體內(nèi)延遲凝膠化中的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及組合物，其中藻酸酯水凝膠以珠或微球形式用于活性劑、優(yōu)選治療蛋白的緩釋。
在本發(fā)明一個實施方案中，藻酸酯水凝膠提供了用于在患者體內(nèi)靶位點施用的組合物。這些組合物可用于阻止或抑制手術(shù)或創(chuàng)傷后形成組織粘連；補充組織來尤其是填充軟和硬組織；用可再吸收的材料填充局部間隙；用作組織生長的框架；和用作傷口敷料。
在另一實施方案中，藻酸酯水凝膠提供了含有活性劑的用于植入到體內(nèi)的裝置，其中活性劑結(jié)合或未結(jié)合到藻酸酯聚合物上。
在另一實施方案中，本發(fā)明藻酸酯水凝膠組合物提供了改善組合物中活性劑的生物利用度的方法。
最后，本發(fā)明藻酸酯水凝膠組合物還提供了在患者中獲得隨時間流逝基本上恒定的血液水平的方法。
發(fā)明詳述組合物包括藻酸酯及其衍生物的親水性聚合物可通過本領(lǐng)域眾所周知的商業(yè)、天然或合成來源獲得。在本說明書中使用的術(shù)語親水性聚合物是指水溶性聚合物或具有吸水親合力的聚合物。親水性聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。它們包括但不限于聚陰離子，包括陰離子多糖例如藻酸酯、羧甲基直鏈淀粉、聚丙烯酸鹽、聚甲基丙烯酸鹽、乙烯馬來酸酐共聚物(半酯)、羧甲基纖維素、葡聚糖硫酸酯、肝素、羧甲基葡聚糖、羧基纖維素、2,3-二羧基纖維素、三羧基纖維素、羧基阿拉伯樹膠、羧基角叉菜膠、果膠、羧基果膠、羧基黃蓍膠、羧基黃原膠、戊聚糖多硫酸酯、羧基淀粉、羧甲基甲殼質(zhì)/脫乙酰殼多糖、凝膠多糖、肌醇六硫酸酯、β-環(huán)糊精硫酸酯、透明質(zhì)酸、軟骨素-6-硫酸酯、硫酸皮膚素、肝素硫酸酯、羧甲基淀粉、角叉菜膠、聚半乳糖醛酸酯(或鹽)、羧基瓜爾膠、縮聚磷酸鹽(或酯)、聚醛碳酸、聚-1-羥基-1-磺酸酯丙烯-2、共聚苯乙烯馬來酸、瓊脂糖、中聚糖(mesoglycan)、磺基丙基化聚乙烯醇、硫酸纖維素、硫酸魚精蛋白、磷酸瓜爾膠、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、聚氨基酸、它們的衍生物或混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知道在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它各種親水性聚合物。
同樣，結(jié)合的多價金屬離子可通過本領(lǐng)域眾所周知的商業(yè)、天然或合成來源獲得。尤其是，金屬離子可包括但不限于鋁離子、鋇離子、鈣離子、鐵離子、錳離子、鎂離子、鍶離子和鋅離子。優(yōu)選的金屬離子是鈣離子和鋅離子或其鹽例如乙酸鋅、乙酸鈣或鹽酸鹽。也可使用水溶性小分子和鹽例如硫酸銨、丙酮、乙醇和甘油。
用作本發(fā)明藻酸羧基的酯化部分的脂肪醇是例如具有最多34個碳原子的脂肪醇，所述醇可以是飽和或不飽和醇，并且也可以被其它游離基團或官能化修飾的基團取代，所述基團有例如氨基、羥基、醛基、酮基、巰基、羧基，或衍生自它們的基團例如烴基或二烴基氨基(在下文中術(shù)語“烴基”不僅表示單價烴基例如CnH2n+1，還表示二價基團或三價基團例如“亞烷基”-CnH2n-或“亞烷基”=CnH2n)、醚基或酯基、縮醛或縮酮基、硫醚或硫酯基以及酯化的羧基或脲基或被1個或2個羥基、被腈基或被鹵素取代的脲基。
在上述包含烴基的基團當(dāng)中，低級脂族基團是優(yōu)選的，例如雜原子例如氧、氮和硫。被1個或2個上述官能團取代的醇是優(yōu)選的。
依據(jù)本發(fā)明優(yōu)選使用的上述醇是這樣的醇它們具有最多12個碳原子、尤其是最多6個碳原子，并且在上述氨基、醚基、酯基、硫醚基、硫酯基、縮醛基、縮酮基中的烴基代表具有最多4個碳原子的烷基，并且在酯化羧基或取代脲基中烴基是具有相同數(shù)目碳原子的烷基，以及氨基或脲基可以是具有最多8個碳原子的亞烷基氨基或亞烷基脲基。在這些醇中，首先和主要提及的是飽和未取代醇，例如甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇、異丁醇、叔丁醇、戊醇、己醇、辛醇、壬醇和十二醇，以及具有直鏈的所有上述醇例如正辛醇和正十二醇。在取代的醇中，應(yīng)包括二元醇例如乙二醇、丙二醇或丁二醇，三元醇例如甘油，醛醇例如羥基丙二醇(tartronic alcohol)，羧基醇例如乳酸，例如α-羥基丙酸、乙醇酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸，氨基醇例如氨基乙醇、氨基丙醇、氨基正丁醇及其在氨基官能團中的二甲基和二乙基衍生物、膽堿、吡咯烷基乙醇、哌啶基乙醇、哌嗪基乙醇、及正丙醇或正丁醇的相應(yīng)衍生物、一硫代乙二醇或其烷基衍生物，例如在巰基官能團中的乙基衍生物。
在高級飽和脂肪醇中，可特別提及的是例如鯨蠟醇和肉豆蔻醇，但是對于本發(fā)明目的尤其重要的是具有1個或2個雙鍵的高級不飽和醇，例如在許多精油中含有的并具有類似于萜烯結(jié)構(gòu)的醇，例如香茅醇、香葉醇、橙花醇、橙花叔醇、里哪醇、法尼醇、葉綠醇。
在低級不飽和醇當(dāng)中，可提及的有炔丙醇。
尤其要提及的脂肪醇是這樣的醇它們僅具有一個苯基，脂族鏈具有最多4個碳原子，該苯基可被1-3個甲基或羥基、或被鹵素原子尤其是氯、溴或碘取代，并且脂族鏈可被一個或多個選自游離氨基或一甲基氨基或二甲基氨基的官能團或被吡咯烷基或哌啶基取代。在這些醇當(dāng)中，苯甲醇和苯乙醇是特別優(yōu)選的。環(huán)脂肪醇或脂族環(huán)脂肪醇可衍生自單環(huán)或多環(huán)烴，并且可具有最多34個碳原子。在衍生自單環(huán)烴的醇中，可特別提及的是具有最多12個碳原子、并且環(huán)優(yōu)選包含5-7個碳原子、以及可能被例如1-3個低級烷基例如甲基、乙基、丙基或異丙基取代的醇。具體的這類醇有環(huán)己醇、環(huán)己二醇、1,2,3-環(huán)己三醇、1,3,5-環(huán)己三醇(間環(huán)己烷三醇)、肌醇，衍生自對烷的醇例如香芹醇、醇、稱為“松油醇”的α-松油醇和γ-松油醇以及1-松油醇、1,4-萜二醇和1,8-萜二醇。衍生自具有稠合環(huán)的烴的醇是例如苧烷、蒎烷、莰烷類醇，尤其是苧醇、檜萜醇、蒎醇水合物、D-冰片、L-冰片、D-異冰片和L-異冰片。
還包括的醇是衍生自環(huán)氧化合物與藻酸酯的酯化反應(yīng)的醇(參見例如US2463824和US2426125)。
本發(fā)明含有聚陰離子的全酯或偏酯通常是酸性多糖，其中配糖氧連接到酯的羰基碳β位上。雖然不受縛于任何具體機制，但是各部分的排列使得聚合物鏈在生理條件下通過β-消除機制斷裂。
本發(fā)明藻酸酯由通過式Ⅰ所示配糖醚氧鍵合連接在一起的甘露糖醛酸殘基(m-COOH或m-COO陰離子)和古洛糖醛酸(g-COOH或g-COO陰離子)組成-(M)n1-(M＇)n2-(G)n3-(G＇)n4-(A)n5-Ⅰ其中M是甘露糖醛酸殘基、m-COOH或m-COO陰離子；M＇是甘露糖醛酸酯殘基、m-COOR1；G是古洛糖醛酸殘基、g-COOH或g-COO陰離子；
G＇是古洛糖醛酸酯殘基、g-COOR2；A代表非-g或非-m鏈單元，例如糖，糖氧化產(chǎn)物，或可被連接在鏈內(nèi)或鏈末端的雜原子取代和間隔的脂族、芳族、芳脂族、脂芳族、環(huán)狀脂族基團；n1、n2、n3、n4和n5是代表合并單元平均相對數(shù)目的整數(shù)；R1和R2獨立地為可被雜原子取代和間隔的脂族、芳族、芳脂族、脂芳族、環(huán)狀脂族基團；和它們的衍生物(例如其中羥基被乙酰化和與異氰酸酯反應(yīng))及其可藥用鹽。
在本發(fā)明酯中，可取的是，R1=R2=脂族或脂芳族基團，并且100(n2+n4)/(n1+n2+n3+n4)為1-99mol％、優(yōu)選為5-50mol％、更優(yōu)選為6-30mol％、還更優(yōu)選為6-15mol％、最優(yōu)選為7-12mol％，以及100n5/(n1+n2+n3+n4+n5)優(yōu)選低于10mol％。
在本發(fā)明偏酯中，未酯化羧基可以是游離的或成鹽。用于形成鹽的堿是依據(jù)產(chǎn)物的最終應(yīng)用來選取的。無機鹽可由堿金屬例如鉀和尤其是鈉與銨形成，或衍生自堿土金屬例如鈣或鎂或鋁鹽。
特別適用的是與有機堿、尤其是氮化堿如脂肪胺、芳族脂肪胺、環(huán)狀脂肪胺或雜環(huán)胺形成的鹽。這些銨鹽可衍生自可治療用胺或無毒但是無治療活性的胺，或衍生自具有治療作用的胺。在第一類胺中，優(yōu)選脂肪胺，例如其中烷基具有最多8個碳原子的一烷基胺、二烷基胺和三烷基胺，或芳基烷基胺，其中烷基部分具有最多8個碳原子，并且當(dāng)芳基表示苯基時，其可被1-3個甲基或鹵素原子或羥基取代。用于形成鹽的無生物活性的堿可以是環(huán)狀胺，例如具有4-6個環(huán)碳原子的單環(huán)亞烷基胺，環(huán)狀胺的環(huán)中可具有選自氮、氧和硫的雜原子，例如哌嗪或嗎啉，或者胺可被取代、例如被氨基或羥基取代，例如氨基乙醇、乙二胺醇(ethylenediamol)、乙二胺、麻黃堿或膽堿。
可通過本領(lǐng)域已知合成方法控制酯化的程度和類型。優(yōu)選在非質(zhì)子有機溶劑例如二甲亞砜中用常規(guī)烷化劑處理藻酸的季銨鹽來制備藻酸酯。所得酯優(yōu)選為一元醇酯，例如低級烷基酯例如乙基酯或芳烷基酯例如芐基酯或它們的混合物。還可通過將藻酸與環(huán)氧乙烷或環(huán)氧化合物例如環(huán)氧乙烷或環(huán)氧乙烷反應(yīng)來形成酯。
還可以形成偏酯的季銨鹽，例如具有上述數(shù)目碳原子的四烷基銨鹽，優(yōu)選為其中第4個烷基具有1-4個碳原子例如甲基的這類鹽。
藻酸酯的酯化度(以mol％)表示與凝膠在患者組織中的消除速度有關(guān)。凝膠的消除速度一般與活性劑從凝膠中的所需釋放速度有關(guān)，活性劑從凝膠中的所需釋放速度通常為5年或5年以下、通常2天-270天、更通常2天-180天、更通常2天-90天釋放完。酯化度(DE)一般為1mol％-99mol％、優(yōu)選為5mol％-50mol％、更優(yōu)選為6mol％-30mol％、更優(yōu)選為6mol％-15mol％、更優(yōu)選為7mol％-12mol％。
在本說明書中使用的術(shù)語緩沖液或緩沖溶液是指使用無機酸或有機酸或它們的混合物制得的本領(lǐng)域已知的緩沖溶液。在本發(fā)明范圍內(nèi)的無機酸包括氫鹵酸(例如鹽酸)、磷酸、硝酸或硫酸。其它無機酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，在這兒是這樣認為。在本發(fā)明范圍內(nèi)有機酸包括脂族羧酸和芳香酸例如甲酸、碳酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、丙烯酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、己二酸、馬來酸、富馬酸、甘氨酸或苯酚磺酸。其它有機酸是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
在本說明書中使用的生物活性劑是指用于預(yù)防、治療或診斷疾病的重組或天然人或動物蛋白、以及非蛋白類活性劑例如小分子。生物活性劑可以是天然、合成、半合成活性劑或其衍生物。本發(fā)明活性劑必須是可沉淀的。本發(fā)明適用于多種生物活性劑。其包括但不限于激素、細胞因子、造血因子、生長因子、抗肥胖因子、營養(yǎng)因子、抗炎因子、和酶(參見US4695463中適用的生物活性劑的其它實例)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地將所需生物活性劑加到本發(fā)明組合物中。
所述蛋白包括但不限于干擾素(參見US5372808、US5541293、US4897471和US4695623，將這些專利及其附圖
引入本發(fā)明以作參考)、白細胞介素(參見US5075222，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、促紅細胞生成素(參見US4703008、US5441868、US5618698、US5547933和US5621080，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、粒細胞集落刺激因子(參見US4810643、US4999291、US5581476、US5582823和第94/17185號PCT公開，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、干細胞因子(第91/05795、92/17505和95/17206號PCT公開，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、和OB蛋白(參見第96/40912、96/05309、97/00128、97/01010和97/06816號PCT公開，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)。此外，生物活性劑還可包括但不限于與抗肥胖相關(guān)的產(chǎn)品、胰島素、胃泌素、促乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促甲狀腺激素(TSH)、促黃體激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、能動素、干擾素(α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素)、白細胞介素(IL-1-IL-12)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白(TNF-bp)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NT3)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(NGF)、骨生長因子例如osteoprotegerin(OPG)、胰島素樣生長因子(IGFs)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨角質(zhì)形成細胞衍生生長因子(MGDF)、血小板生成素、血小板衍生生長因子(PGDF)、集落刺激生長因子(CSFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、過氧化物歧化酶(SOD)、組織纖維蛋白溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、鏈激酶和激肽釋放酶。本說明書中使用的術(shù)語蛋白包括肽、多肽、其共有序列分子、類似物、衍生物或組合物。
生物活性劑衍生物可包括在蛋白部分上附加上一個或多個化學(xué)部分。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在某些情況下，將生物活性劑進行化學(xué)修飾可提供另外的優(yōu)點，例如提高治療蛋白的穩(wěn)定性和循環(huán)時間以及降低免疫原性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)能根據(jù)所需劑量、循環(huán)時間、對蛋白水解抗性、治療應(yīng)用和其它考慮選擇所需的化學(xué)修飾。
本說明書使用的生物可降解性是指特定聚合物的分子量分解成在鏈中具有較少數(shù)目的單元，即分解成分子量較小的單元。生物可降解凝膠是指凝膠在使用環(huán)境中的消散，其中消散依導(dǎo)致聚合物鏈中有產(chǎn)生較少單元的聚合物的分解而定。
復(fù)合物蛋白、類似物或衍生物可復(fù)合于結(jié)合組分。這種結(jié)合組分可延長蛋白、類似物或衍生物循環(huán)時間、或增強生物活性劑的活性。這種組分可以是蛋白(或肽)、衍生物、類似物或它們的組合。例如，OB蛋白的結(jié)合蛋白是OB蛋白受體或其部分例如其可溶性部分?？赏ㄟ^檢查OB蛋白來確定其它結(jié)合蛋白，或在血清中選擇蛋白，或憑經(jīng)驗選擇來篩選是否結(jié)合。這種結(jié)合通常不妨礙OB蛋白或類似物或衍生物結(jié)合內(nèi)源性O(shè)B蛋白受體和/或影響信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力。除了OB蛋白以外，結(jié)合復(fù)合物還可用于本發(fā)明其它治療蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員能確定合適的結(jié)合蛋白來依據(jù)本發(fā)明使用。
同樣，用于沉淀生物活性劑的沉淀劑可得自本領(lǐng)域眾所周知的各種商業(yè)、天然或合成來源。沉淀劑包括但不限于多價金屬離子或它們的鹽例如其乙酸鹽、檸檬酸鹽、鹽酸鹽、碳酸鹽、氫氧化物、草酸鹽、酒石酸鹽或氫氧化物、酸或水溶性聚合物。特別是金屬離子可包括但不限于鋁離子、鋇離子、鈣離子、鐵離子、錳離子、鎂離子、鍶離子和鋅離子。金屬離子優(yōu)選為鋅離子或其鹽例如乙酸鹽和鹽酸鹽。也可使用水溶性小分子和鹽例如硫酸鋁、丙酮、乙醇和甘油。
水溶性聚合物包括但不限于聚乙二醇、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三氧雜環(huán)己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚氨基酸、葡聚糖、聚(正乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇琥珀酸酯、甘油、環(huán)氧乙烷、氧化丙烯、泊咯沙姆(poloxamers)、烷氧基化共聚物、水溶性聚陰離子、其衍生物或混合物。水溶性聚合物可具有任意分子量，并且可以是支鏈或非支鏈的。例如，為了易于控制沉淀的效力，聚乙二醇優(yōu)選的分子量為約700Da-約100Da。
根據(jù)所需治療情況(例如所需緩釋持續(xù)時間、對生物活性的影響(若有的話)、便于控制、抗原性程度或缺乏抗原性、以及所需沉淀劑對治療蛋白或類似物的其它已知作用)，可使用其它大小和種類的沉淀劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它合適沉淀劑。
此外，本發(fā)明組合物還可包含用于穩(wěn)定生物活性劑和/親水性聚合物的外加賦形劑。賦形劑可包含在緩沖液中，并可包括但不限于防腐劑。
藥物組合物本發(fā)明緩釋藥物組合物可以是口服制劑(例如膠囊劑如硬膠囊劑和軟膠囊劑，固體制劑例如粒劑、片劑、丸劑、錠劑或糖錠劑、扁囊劑、小丸劑、粉劑和冷凍干燥制劑，液體制劑例如懸浮劑)和非口服制劑(例如肌內(nèi)給藥制劑、皮下給藥制劑、經(jīng)皮給藥制劑、內(nèi)臟用制劑、IV(靜脈內(nèi))給藥制劑、IP(腹膜內(nèi))給藥制劑、動脈內(nèi)給藥制劑、鞘內(nèi)給藥制劑、囊內(nèi)給藥制劑、眼眶內(nèi)給藥制劑、注射劑、肺給藥制劑、鼻內(nèi)給藥制劑、直腸給藥制劑、和子宮透粘膜給藥制劑)。
本發(fā)明一般包括緩釋藥物組合物，其中包含有效量的蛋白或衍生物、本發(fā)明緩釋組分以及可藥用稀釋劑、防腐劑、助溶劑、乳化劑、輔料和/或給藥所需載體。參見PCT97/01331，該專利引入本發(fā)明以作參考。對于所需的生物活性劑，最佳藥物制劑由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)給藥途徑和所需劑量來決定。Remington＇s Pharmaceutical Science(MackPublishing Co.,18th Ed.,Easton,PA,pgs.1435-1712(1990))中公開了藥物組合物的實例。
由于緩釋凝膠制劑具有觸變性，因此可使用注射器來將其皮下給藥。可將組合物在注射器中凝膠化以隨后進行注射。可以以延時方式進行凝膠化。如果需要的話，通過正確調(diào)節(jié)混合物中膠凝劑和質(zhì)子給體的量來控制凝膠化時間。這種制劑可用于注射后在體內(nèi)的再凝膠化。本說明書所用術(shù)語觸變性是指凝膠混合物的粘度在壓力下減小，例如在混合物可流動的點經(jīng)由例如注射器針頭從注射器活塞中注射出來，然后在注射位點再形成凝膠。
延遲凝膠化的概念也可適用于填充注射器，將緩釋凝膠組合物填充在注射器中，事先調(diào)整在注射器中的凝膠化時間，例如在填充后幾分鐘到數(shù)小時凝膠化。這防止了在填充時注射器包含已經(jīng)凝膠化的材料-這一問題?？蓪⑦@些預(yù)填充的注射器貯存，以后再注射到患者體內(nèi)。
給藥所需的組分包括具有不同緩沖組分(例如Tris-HCl、乙酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑例如表面活性劑和助溶劑(例如吐溫80、HCO-60、聚山梨醇酯80)、抗氧化劑(例如抗壞血酸、谷胱甘肽、偏亞硫酸氫鈉)、其它多糖(例如羧甲基纖維素、藻酸鈉、透明質(zhì)酸鈉、硫酸魚精蛋白、聚乙二醇)、防腐劑(例如硫柳汞、苯甲醇、尼泊金甲酯、尼泊金丙酯)、和填充劑(例如乳糖、甘露醇)；加到聚合化合物顆粒制劑中的材料，聚合化合物例如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物或共聚物等，或者加入脂質(zhì)體。透明質(zhì)酸也可用作給藥組分，并且透明質(zhì)酸可進一步提高在循環(huán)中的持續(xù)時間。此外，也可用油(例如芝麻油、玉米油、植物油)、或油與磷脂(例如卵磷脂)的混合物、或中鏈脂肪酸甘油三酯(例如Miglyol812)來分散本發(fā)明緩釋組合物，以提供油懸浮液。還可用分散劑例如水溶性多糖(例如甘露醇、乳糖、葡萄糖、淀粉)、透明質(zhì)酸、甘氨酸、纖維蛋白、膠原和無機鹽(例如氯化鈉)來分散本發(fā)明組合物。
此外，還可使用設(shè)計用來給肺遞送治療藥物的機械裝置將本發(fā)明緩釋組合物給藥，包括但不限于噴霧器、計量吸入器、和粉末吸入器，所有這些裝置都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。
給藥組分可影響這些蛋白和衍生物的物理狀態(tài)、穩(wěn)定性、體內(nèi)釋放速度、和體內(nèi)清除速度。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道根據(jù)治療應(yīng)用、給藥途徑、所需劑量、循環(huán)時間、對蛋白水解抗性、蛋白穩(wěn)定性以及其它考慮來使用合適的給藥組分和/或適當(dāng)機械裝置。
使用方法治療。治療應(yīng)用取決于所用的生物活性劑。為了實現(xiàn)治療應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員能很容易地使所需生物活性劑適應(yīng)本發(fā)明。下述出版物中更詳細地列出了這些生物活性劑的治療應(yīng)用，這些出版物包括附圖引入本發(fā)明以作參考。治療應(yīng)用包括但不限于使用干擾素(參見US5372808、US5541293、US4897471和US4695623，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、白細胞介素(參見US5075222，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、促紅細胞生成素(參見US4703008、US5441868、US5618698、US5547933和US5621080，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、粒細胞集落刺激因子(參見US4,999,291、US4999291、US5581476、US5582823和第94/17185號PCT公開，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、干細胞因子(第91/05795、92/17505和95/17206號PCT公開，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)、和OB蛋白(參見第96/40912、96/05309、97/00128、97/01010和97/06816號PCT公開，將這些專利及其附圖引入本發(fā)明以作參考)作為蛋白。
此外，本發(fā)明治療應(yīng)用包括使用生物活性劑，包括但不限于與抗肥胖相關(guān)的產(chǎn)品、胰島素、胃泌素、促乳素、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、促甲狀腺激素(TSH)、促黃體激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、人絨毛膜促性腺激素(HCG)、能動素、干擾素(α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素)、白細胞介素(IL-1-IL-12)、腫瘤壞死因子(TNF)、腫瘤壞死因子結(jié)合蛋白(TNF-bp)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子3(NF3)、成纖維細胞生長因子(FGF)、神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(NGF)、骨生長因子例如osteoprotegerin(OPG)、胰島素樣生長因子(IGFs)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨角質(zhì)形成細胞衍生生長因子(MGDF)、血小板生成素、血小板衍生生長因子(PGDF)、集落刺激生長因子(CSFs)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、過氧化物歧化酶(SOD)、組織纖維蛋白溶酶原激活物(TPA)、尿激酶、鏈激酶和激肽釋放酶。本說明書中使用的術(shù)語蛋白包括肽、多肽、其共有序列分子、類似物、衍生物或混合物。另外，本發(fā)明組合物還可用于制備一種或多種用于治療或改善可用所述生物活性劑治療的病癥的藥物。
例如，治療應(yīng)用是可在不減輕體重的情況下實現(xiàn)在血液中的氧合和減輕骨再吸收或骨質(zhì)疏松。
聯(lián)合治療.本發(fā)明組合物和方法可以與其它治療例如調(diào)節(jié)飲食和鍛煉聯(lián)合采用。其它藥物，例如用于治療糖尿病的藥物(例如胰島素和可能是支鏈淀粉)、降低膽固醇和血壓的藥物(例如降低血液脂質(zhì)水平的藥物或其它心血管藥物)、活性提高藥物(例如安非他明)、利尿劑(用于液體清除)、和食欲抑制劑。這種聯(lián)合給藥可同時進行或依次進行。此外，本發(fā)明方法可以與手術(shù)、例如設(shè)計用來改變身體外觀的整容手術(shù)(例如用來減少身體物質(zhì)的抽脂術(shù)和激光手術(shù)，或用來增加身體物質(zhì)外觀的植入手術(shù))聯(lián)合使用。心臟手術(shù)例如旁路手術(shù)或其它用來解除由于血管被脂肪沉積物阻塞的有害病癥例如動脈斑的手術(shù)的健康效果可由于和本發(fā)明組合物以及方法聯(lián)合采用而得到提高。可在實施本發(fā)明方法之前、期間或之后使用消除膽結(jié)石的方法例如超聲法或激光法。此外，本發(fā)明方法可以作為用于骨折、肌肉損傷的手術(shù)或治療、或可通過增加肌肉組織質(zhì)量而改善其他治療的附屬治療。
劑量本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過給藥和觀察所需治療效果來確定有效劑量。緩釋制劑的劑量是需要在給定期間內(nèi)達到生物活性劑有效體內(nèi)濃度的量。緩釋制劑的劑量和優(yōu)選的給藥頻率隨生物活性劑種類、所需的釋放持續(xù)時間、靶疾病、所需給藥頻率、受治療的動物種類以及其它因素的不同而不同。為了達到所需治療效果，制劑的劑量(按活性分子計)優(yōu)選為約0.10μg/kg/天-100mg/kg/天。
可用診斷手段隨時間確定有效劑量。例如，本發(fā)明提供了OB蛋白的劑量。例如，可首先使用診斷手段來測定血液(血漿或血清)中OB蛋白的量，以確定出OB蛋白的內(nèi)源水平。這種診斷手段可以是抗體分析，例如抗體夾層分析。首先定量測定內(nèi)源性O(shè)B蛋白的量，確定基準(zhǔn)。當(dāng)內(nèi)源性和外源性O(shè)B蛋白(體內(nèi)存在的自身產(chǎn)生或給予的蛋白、類似物或衍生物)的定量比率在治療期間延續(xù)時確定治療劑量。例如，起初可能需要相對高的劑量，直至觀察到治療效果，然后采用較低的劑量來維持治療效果。
材料和方法材料.藻酸鈉形式的藻酸鹽可得自本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的來源。OB蛋白和GCSF得自Amgen Inc.。其它化學(xué)藥品得自本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的來源。
制備藻酸酯水凝膠顆粒/珠.
未結(jié)案的美國專利申請08/842756中詳細描述了含有或不含有蛋白的藻酸酯水凝膠顆粒和珠的制備，該專利引入本發(fā)明以作參考。
制備緩釋凝膠.
未結(jié)案的美國專利申請08/857913和08/912902詳細描述了含有或不合有蛋白的緩釋藻酸酯水凝膠的制備，這兩篇專利引入本發(fā)明以作參考。
下述實施例是為了更充分地說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明范圍的限制。根據(jù)上面的公開和下面的實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能將公開方案作必要改變以大規(guī)模生產(chǎn)。
實施例1下述實施例描述了用于本發(fā)明的藻酸酯的制備。
制備A藻酸四丁基銨(TBA)在室溫采用分批處理方法，通過用氫氧化四丁基銨(Aldrich)處理將磺酸樹脂(Bio-Rad,AG MP-50)轉(zhuǎn)化成四丁基銨型。向10g藻酸鈉在800ml蒸餾水中的溶液內(nèi)加入60ml四丁基銨鹽形式的60ml磺酸樹脂(Bio-Rad,AG MP-50)。將該混合物在室溫攪拌0.5小時。通過過濾除去樹脂，并用蒸餾水洗滌。通過冷凍干燥分離出濾液中的TBA藻酸鹽(產(chǎn)量為16.8g)，通過1H NMR證實。
制備B藻酸的偏乙酯，酯化度(DE)=30mol％。
在室溫將TBA藻酸鹽(6g,14.4mol TBA單位)溶于500ml二甲亞砜(DMSO)中。然后加入碘乙烷(Aldrich,673mg,4.3mmol)。將該混合物在30℃攪拌15小時，然后冷卻至室溫。向該溶液中緩慢地加入2g NaCl在20ml水中的溶液，以將TBA完全轉(zhuǎn)化成鈉鹽。攪拌15-30分鐘后，將該溶液緩慢地倒入1500ml乙酸乙酯中。通過過濾收集沉淀，用丙酮/水(8∶1v/v)洗滌3次，用丙酮洗滌3次，然后真空干燥。在0℃，將該化合物再溶于蒸餾水(約100ml)中，用0.2％碳酸氫鈉將pH調(diào)節(jié)至約6.5。然后用蒸餾水在4℃將該溶液透析(截留分子量為8000)過夜，之后冷凍干燥。獲得了2.8g該偏酯，酯化度為30+/-1％(1H NMR，以馬來酰亞胺作為內(nèi)標(biāo))。
制備C藻酸的全乙酯和偏乙酯，DE=100％、50％、20％、10％和5％。
這些化合物的制備與制備B類似，只是調(diào)節(jié)碘乙烷的用量以達到所需的酯化度。
制備D藻酸的偏丙酯、己酯、辛酯和十二烷基酯。
這些化合物的制備與上面制備B和C類似，只是分別用1-碘丙烷、1-碘己烷、1-碘辛酯或1-碘十二烷來代替碘乙烷。
制備E藻酸的偏芐酯，DE=30％。
在室溫將TBA藻酸鹽(2.5g,5.99mmol TBA單位)溶于約200mlDMSO中。加入芐基溴(Aldrich,307mg,1.8mmol)和TBA碘化物(Aldrich,30mg)。將該混合物在30℃攪拌15小時，然后冷卻至室溫。向該溶液中緩慢地加入0.6g NaCl在10ml水中的溶液，以將TBA完全轉(zhuǎn)化成鈉鹽。攪拌15-30分鐘后，將該溶液緩慢地倒入500ml乙酸乙酯中。通過過濾收集沉淀，用丙酮/水(8∶1v/v)洗滌3次，用丙酮洗滌3次，然后真空干燥。在0℃，將該化合物再溶于蒸餾水(約60ml)中，用0.2％碳酸氫鈉將pH調(diào)節(jié)至約6.5。然后用蒸餾水在4℃將該溶液透析(截留分子量為8000)過夜。獲得了1.3g該偏酯，酯化度為30+/-1％(1H NMR，以馬來酰亞胺作為內(nèi)標(biāo))。
制備F藻酸的全芐酯和具有不同DE的偏芐酯。
這些化合物的制備與制備E類似，只是調(diào)節(jié)芐基溴和TBA碘化物的用量以達到所需的酯化度。
實施例2下述實施例表明了含有蛋白藥物(Leptin)的藻酸乙酯(DE=15mol％和10mol％)凝膠的制備以及在體外藥物從該凝膠中的緩釋。
將Leptin(100mg/ml；10mM Tris HCl,pH8.8；用1M NaOH將pH調(diào)節(jié)至8.0-8.8)和6％藻酸乙酯(15mol％,10mM Tris HCl,pH8.6)在冰浴上冷卻。將Leptin(0.5ml)加到該6％藻酸乙酯(0.18ml)中，將該混合物在冰浴上攪拌10-15分鐘；最終pH為8.6-8.8。向該混合物中加入1M碳酸鈣懸浮液(16μL)，將所得懸浮液充分混合。在攪拌下向該懸浮液中滴加0.1M ZnCl2溶液(100μL)；然后加入水以使體積為1ml。將該混合物充分混合，并在冰浴上放置10-20分鐘。然后將1.68M δ-葡萄糖酸內(nèi)酯(Aldrich,56μL)溶液充分攪拌到該混合物中。將最終的混合物(50mg/ml 1eptin,1％藻酸乙酯；0.1ml)置于微量離心管(eppendorf tube)內(nèi)，在4℃放置過夜以使其凝膠化。貯存過夜后，在pH為7.4的10mM組氨酸緩沖液中進行體外釋放。酯化度為15％的凝膠表現(xiàn)出極微的爆發(fā)性釋放，并且表現(xiàn)出相當(dāng)恒定的Leptin釋放，在6天內(nèi)釋放了60％。酯化度為10mol％的凝膠表現(xiàn)出極微的爆發(fā)性釋放，并且表現(xiàn)出相當(dāng)恒定的leptin釋放，在6天內(nèi)釋放了55％。
實施例3下述實施例表明了含有蛋白藥物(Leptin)的藻酸己酯(DE=15mol％和10mol％)凝膠的制備以及在體外藥物從該凝膠中的緩釋。
以類似于實施例2所述的方式進行本實施例，只是不使用藻酸乙酯。
酯化度為15mol％和10mol％的藻酸己酯凝膠表現(xiàn)出極微的爆發(fā)性釋放，并且表現(xiàn)出緩釋效果，在6天內(nèi)釋放了50％。
實施例4下述實施例表明了含有蛋白藥物(Zn-Leptin)的藻酸乙酯(DE=15mol％)凝膠的制備以及在體外從該凝膠中的緩釋。
向4％(w/v)藻酸乙酯(15mol％,0.75ml)溶液中加入1M TrisHCl,pH8.0(7.5μL)、0.5M PIPES pH6.8(33μL)和0.1M ZnCl2(8.5μL)。將該混合物充分攪拌。向該溶液中加入Zn-Leptin懸浮液(100mg/ml,675μL)，將該混合物充分攪拌。然后將1M碳酸鈣懸浮液(24μL)和1.68M d-葡萄糖酸內(nèi)酯(70μL)充分攪拌到該混合物中。將最終的混合物(0.1ml)置于微量離心管內(nèi)，在4℃放置過夜以使其凝膠化。貯存過夜后，在pH為7.4的10mM組氨酸緩沖液中進行體外釋放。酯化度為15mol％的該藻酸乙酯凝膠表現(xiàn)出很小的爆發(fā)性釋放，和持續(xù)的leptin釋放，在4天內(nèi)釋放了65％。
實施例5下述實施例表明了含有蛋白藥物(GCSF)的藻酸乙酯(DE=30mol％)凝膠的制備以及在體外藥物從該凝膠中的緩釋。
向2.39％藻酸乙酯(30mol％,0.50ml)溶液中加入0.1M乙酸鹽緩沖液(pH4.5,100μL)、GCSF(104μL,48.2mg/ml,HCl pH3)和蒸餾水(246ml)。將該混合物充分攪拌。將1M CaHPO4(10μL)和1.68Mδ-葡萄糖酸內(nèi)酯(40μL)充分攪拌到該混合物中。將最終的混合物(0.2ml)置于微量離心管內(nèi)，在4℃放置過夜以使其凝膠化。凝膠貯存過夜后，在pH為7.5的10mM Tris緩沖液中進行體外釋放。酯化度為30mol％的該藻酸乙酯凝膠表現(xiàn)出低于5％的爆發(fā)性釋放，并表現(xiàn)出緩釋，在1天內(nèi)釋放了20％，在2天內(nèi)釋放了40％。
實施例6下述實施例表明了含有蛋白藥物(GCSF)的藻酸芐酯(DE=30mol％)凝膠的制備以及在體外藥物從該凝膠中的緩釋。
以類似于實施例5所述的方式進行本實施例，只是使用藻酸芐酯來代替藻酸己酯。藻酸酯在過夜貯存中凝膠化。酯化度為30mol％的藻酸芐酯凝膠表現(xiàn)出低于5％的爆發(fā)性釋放，并表現(xiàn)出緩釋，在1天內(nèi)釋放了40％，在2天內(nèi)釋放了80％。
實施例7該實施例表明了藻酸乙酯珠的制備。
該凝膠珠是通過將2％藻酸乙酯溶液滴加到100mM氯化鈣溶液(蒸餾水或1M Tris HCl pH7.0緩沖液)中制得的。用蒸餾水或緩沖液洗滌形成的珠子。采用30％或50％酯化度制備珠子。
實施例8該實施例表明了含有Leptin的藻酸酯珠的制備。
該珠子是通過將25mg/ml的Leptin在2％藻酸乙酯(Tris HCl,pH8.7)中的溶液滴加到100mM氯化鈣和25mM氯化鋅溶液中制得的。采用30％酯化度制備珠子。所得珠子在體外表現(xiàn)出持續(xù)的Leptin釋放。
實施例9該實施例表明了藻酸酯在緩沖液中于中性生理pH下的分子量分解(或降解)。
將藻酸酯(1％溶液)溶于磷酸鹽緩沖液(0.1M磷酸鈉，pH6.8)或0.1M Tris緩沖液(pH7.0)中，并在37℃培養(yǎng)。通過在選擇的時間間隔下測定溶液粘度的下降(Brookfield,25℃)來測定分子量分解。結(jié)果發(fā)現(xiàn)未修飾的藻酸鈉相當(dāng)穩(wěn)定，因為其粘度在8天內(nèi)僅下降了5％(磷酸鹽緩沖液)。然而，藻酸乙酯和藻酸芐酯(DE=30％)在8天內(nèi)在相同緩沖液中下降了35％。藻酸酯的降解量還取決于酯化度，例如具有較低酯化度(DE=15％)的藻酸乙酯，其粘度在8天內(nèi)下降了25％。因此分子量分解與酯化度直接相關(guān)。
實施例10該實施例表明了不含有蛋白的藻酸酯水凝膠和含有蛋白的藻酸酯水凝膠在體內(nèi)的降解(或逐漸消失)。
按照類似于實施例3所述的方式制備藻酸酯凝膠，但是將最終的混合物置于注射器中，并在注射器中于4℃過夜凝膠化。然后將100μL凝膠皮下注射到小鼠(Charles River,12周大小的雌性小鼠，BDF1,20g，每組5只)的頸背部，并且定期通過手術(shù)檢查每組的不同小鼠的注射位點。
使用DE=30％的藻酸乙酯和藻酸芐酯，該單次注射位點試驗的結(jié)果表明，藻酸酯水凝膠在2周內(nèi)消失。使用DE=15％的藻酸乙酯凝膠，在第30和61天仍存在凝膠，但是尺寸減小了。使用DE=5％的藻酸乙酯材料，在30和61天凝膠還存在，尺寸減小很少。使用未取代的藻酸鈉材料，在整個61天期間凝膠保持相對不變。
含有或未含有蛋白的藻酸酯凝膠的消失速度相似。
實施例11該實施例提供了關(guān)于藻酸酯水凝膠在大鼠中的體重減輕和藥動學(xué)數(shù)據(jù)。
按照類似于實施例4所述的方式制備藻酸乙酯凝膠，但是將最終的混合物置于注射器中，并在注射器中于4℃過夜凝膠化。給大鼠提供0mg/kg(對照)和100mg/kg的快速濃注劑量(bolus dose)，然后監(jiān)測7天血液水平和體重減輕情況。
結(jié)果表明DE=5mol％的藻酸乙酯在3天內(nèi)表現(xiàn)出約2000ng/mL的穩(wěn)定血液水平，在3-4天后降至2-3ng/ml；DE=15mol％的藻酸乙酯在2天內(nèi)表現(xiàn)出約2000ng/mL的穩(wěn)定血液水平，在第5天下降至2-3ng/ml；DE=30mol％的藻酸乙酯在1天內(nèi)表現(xiàn)出約2000ng/mL的穩(wěn)定血液水平，在第4天下降至2-3ng/ml；Zn-leptin懸浮液的血液水平在12個小時達到峰值，在第6天下降至1-2ng/ml。所有動物都表現(xiàn)出體重減輕，表明Zn-leptin是有活性的。結(jié)果還表明，在藻酸乙酯凝膠(DE=5mol％和15mol％)中摻入Zn-leptin幾乎使Zn-leptin曲線下面積(AUC)翻倍(因數(shù)(factor)為1.8-1.9)，這意味著生物利用度翻倍；使用藻酸乙酯凝膠(DE=30mol％)表現(xiàn)出類似于Zn-leptin的生物利用度(基于AUC)。
權(quán)利要求
1．緩釋凝膠組合物，包含a)親水性聚合物；b)生物活性劑；和c)至少一種結(jié)合的多價金屬離子，其中所述凝膠是生物可降解的。
2．權(quán)利要求1的緩釋組合物，其中所述結(jié)合的多價金屬離子是結(jié)合和未結(jié)合多價金屬離子的混合物。
3．權(quán)利要求1的緩釋凝膠，所述凝膠還包含用于穩(wěn)定生物活性劑或親水性聚合物的賦形劑。
4．權(quán)利要求1的組合物，其中所述結(jié)合的多價金屬離子是選自其乙酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、檸檬酸鹽、氯化物、碳酸鹽或氫氧化物的鹽。
5．權(quán)利要求4的組合物，其中所述金屬離子選自錳離子、鍶離子、鐵離子、鎂離子、鈣離子、鋇離子、銅離子、鋁離子或鋅離子。
6．權(quán)利要求5的組合物，其中所述金屬離子是鈣離子。
7．權(quán)利要求1的組合物，其中所述質(zhì)子供給體是得自酸來源。
8．權(quán)利要求7的組合物，其中所述酸來源選自緩沖液、酯、溶解緩慢的酸或內(nèi)酯。
9．權(quán)利要求1的組合物，其中所述親水性聚合物是聚陰離子。
10．權(quán)利要求1的組合物，其中所述親水性聚合物是多糖。
11．權(quán)利要求10的組合物，其中所述多糖是酸性多糖。
12．權(quán)利要求11的組合物，其中所述多糖是藻酸酯。
13．權(quán)利要求12的組合物，其中所述藻酸酯包含至少30％的古洛糖醛酸。
14．權(quán)利要求12的組合物，其中所述藻酸酯占至少0.05％重量。
15．權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物活性劑包括蛋白，并且所述組合物改善了生物利用度。
16．權(quán)利要求15的組合物，其中蛋白占至少0.001mg/ml。
17．權(quán)利要求15的組合物，其中所述蛋白選自造血因子、集落刺激因子、抗肥胖因子、生長因子、營養(yǎng)因子、和抗炎因子。
18．權(quán)利要求15的組合物，其中所述蛋白選自leptin、G-CSF、SCF、BDNF、GDNF、NT3、GM-CSF、IL-1ra、IL2、TNF-bp、MGDF、OPG、干擾素、促紅細胞生成素、KGF、胰島素和它們的類似物或衍生物。
19．權(quán)利要求1的組合物，其中所述生物活性劑是復(fù)合生物活性劑。
20．權(quán)利要求19的組合物，其中所述復(fù)合生物活性劑是沉淀蛋白。
21．權(quán)利要求20的組合物，其中所述沉淀蛋白是Zn-leptin沉淀。
22．制備緩釋凝膠組合物的方法，其中所述凝膠是生物可降解的，所述方法包括下述步驟a)將生物活性劑與親水性聚合物在溶劑中混合以形成第一個混合物；b)將第一個混合物與至少一種結(jié)合的多價金屬離子混合以形成第二個混合物。
23．權(quán)利要求22的方法，其中還包括步驟c)將第二個混合物與至少一種能釋放結(jié)合的多價金屬離子的質(zhì)子供給體混合。
24．權(quán)利要求22的方法，其中在與質(zhì)子給體或結(jié)合的多價金屬離子混合前將第一個混合物濃縮。
25．權(quán)利要求22的方法，其中所述結(jié)合的多價金屬離子是選自其乙酸鹽、磷酸鹽、乳酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、氯化物、碳酸鹽或氫氧化物的鹽。
26．權(quán)利要求22的方法，其中所述方法給患者提供了在一定時間內(nèi)基本上恒定的所述生物活性劑的血液水平。
27．權(quán)利要求24的組合物，其中所述金屬離子選自錳離子、鍶離子、鐵離子、鎂離子、鈣離子、鋇離子、銅離子、鋁離子或鋅離子。
28．權(quán)利要求26的組合物，其中所述金屬離子是鈣離子。
29．權(quán)利要求23的組合物，其中所述質(zhì)子供給體是得自酸來源。
30．權(quán)利要求28的組合物，其中所述溶解緩慢的酸選自緩沖液、酯、溶解緩慢的酸或內(nèi)酯。
31．權(quán)利要求29的組合物，其中所述酸來源是δ-葡萄糖酸內(nèi)酯。
32．權(quán)利要求22的組合物，其中所述親水性聚合物是聚陰離子。
33．權(quán)利要求22的組合物，其中所述親水性聚合物是多糖。
34．權(quán)利要求32的組合物，其中所述多糖是酸性多糖。
35．權(quán)利要求33的組合物，其中所述多糖是藻酸酯。
36．權(quán)利要求34的組合物，其中所述藻酸酯包含至少30％的古洛糖醛酸。
37．權(quán)利要求34的組合物，其中所述藻酸酯占至少0.05％重量。
38．權(quán)利要求22的組合物，其中所述生物活性劑包括蛋白。
39．權(quán)利要求37的組合物，其中蛋白占至少0.001mg/ml。
40．權(quán)利要求37的組合物，其中所述蛋白選自造血因子、集落刺激因子、抗肥胖因子、生長因子、營養(yǎng)因子、和抗炎因子。
41．權(quán)利要求37的組合物，其中所述蛋白選自leptin、G-CSF、SCF、BDNF、GDNF、NT3、GM-CSF、IL-1ra、IL2、TNF-bp、MGDF、OPG、干擾素、促紅細胞生成素、KGF和它們的類似物或衍生物。
42．權(quán)利要求22的組合物，其中所述生物活性劑是復(fù)合生物活性劑。
43．權(quán)利要求41的組合物，其中所述復(fù)合生物活性劑是沉淀蛋白。
44．權(quán)利要求42的組合物，其中所述沉淀蛋白是Zn-leptin沉淀。
45．權(quán)利要求22的方法，該方法還包括分離緩釋組合物的步驟。
46．通過權(quán)利要求22或44的方法制得的緩釋產(chǎn)品。
47．在可藥用載體、稀釋劑或輔料中包含權(quán)利要求1、2、3或45的緩釋組合物的藥物制劑。
48．權(quán)利要求46的藥物制劑，其中，制成制劑是在注射器中進行。
49．以在可藥用載體、稀釋劑或輔料中的權(quán)利要求1,2,3或45的緩釋組合物治療適應(yīng)癥的方法。
50．用在可藥用載體、稀釋劑或輔料中的權(quán)利要求1、2、3或45的緩釋組合物治療選自肥胖、糖尿病、高血脂、動脈硬化、動脈斑的疾?。粶p輕或防止生成膽結(jié)石、肌肉組織質(zhì)量不足、對胰島素敏感性不足、和中風(fēng)的方法，其中所述生物活性劑是leptin、其類似物或衍生物。
51．用在可藥用載體、稀釋劑或輔料中的權(quán)利要求1、2、3或45的緩釋組合物治療選自造血細胞不足、感染、和嗜中性白細胞減少癥的方法，其中所述生物活性劑是G-CSF、其類似物或衍生物。
52．用在可藥用載體、稀釋劑或輔料中的權(quán)利要求1、2、3或45的緩釋組合物治療炎癥的方法，其中所述生物活性劑是IL-1ra、其類似物或衍生物。
53．緩釋組合物，包含a)親水性聚合物；b)生物活性劑；和c)至少一種沉淀劑；其特征在于，所述生物活性劑在親水性聚合物內(nèi)共沉淀，其中所述組合物是凝膠顆粒形式，并且所述凝膠顆粒是生物可降解的。
54．權(quán)利要求52的組合物，其中所述沉淀劑選自多價金屬離子或其鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽、氯化物、碳酸鹽或氫氧化物。
55．權(quán)利要求53的組合物，其中所述金屬離子選自錳離子、鍶離子、鐵離子、鎂離子、鈣離子、鋇離子、銅離子、鋁離子或鋅離子。
56．權(quán)利要求54的組合物，其中所述沉淀劑是選自鋅離子、鈣離子或它們的組合的多價離子。
57．權(quán)利要求52的組合物，其中所述親水性聚合物是多糖。
58．權(quán)利要求56的組合物，其中所述多糖是藻酸酯。
59．制備緩釋組合物的方法，該方法包括下述步驟a)用溶劑將生物活性劑和親水性聚合物溶解以形成第一個混合物；b)將至少一種沉淀劑溶于溶劑中以形成第二個混合物；c)將第一個混合物與第二個混合物混合；和d)將生物活性劑與親水性聚合物共沉淀以形成共沉淀的凝膠顆粒，其中所述顆粒是生物可降解的。
60．權(quán)利要求58的方法，該方法還包括分離共沉淀的顆粒的步驟。
61．通過權(quán)利要求59的方法制得的緩釋產(chǎn)品。
62．在可藥用載體、稀釋劑或輔料中的權(quán)利要求52的藥物制劑。
63．用在可藥用載體、稀釋劑或輔料中的權(quán)利要求52的緩釋組合物治療適應(yīng)征的方法。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用生物可降解藻酸酯緩釋凝膠或顆粒的緩釋制劑及其制備方法。
文檔編號A61P3/06GK1309556SQ99808802
公開日2001年8月22日 申請日期1999年5月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年5月18日
發(fā)明者M·S·戈爾登博格, J·H·古 申請人:安姆根有限公司