一種賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因治療中基因載體制備領域。
【背景技術】
[0002]基因治療是一種將外源基因導入目的細胞并有效表達，從而達到治療目的的方法，優(yōu)良的基因傳遞系統(tǒng)要能包裹和保護核酸物質，避免內涵體降解，并能專一靶向腫瘤部位，因此開發(fā)高效、安全的基因傳遞系統(tǒng)是癌癥基因治療中最具挑戰(zhàn)性的課題之一。載體問題一直是基因治療研宄領域的核心技術之一，基因載體主要分為病毒載體和非病毒載體兩類:(I)病毒載體有逆轉錄病毒、腺病毒、皰瘆病毒、慢病毒等，其優(yōu)點是病原性低、轉染率高，但作為一種改造的病毒，其價格昂貴，容易引發(fā)機體強烈的免疫反應并可能致癌，其安全性低等缺點在臨床應用還較困難；(2)非病毒載體如陽離子聚合物、陽離子多肽和陽離子脂質體等，具有價格低、操作簡單、安全、有效、無免疫原性等優(yōu)點，已漸成為病毒類基因載體最有希望的替代者。
[0003]磁性靶向基因治療為近幾年迅速發(fā)展起來的癌癥治療手段，在外加磁場下，磁性載體可攜帶基因定位于靶部位，增強基因的轉染效率。通常殼聚糖由于其可生物降解性和低細胞毒性及獨特的跨細胞膜能力而被作為磁性基因載體殼層材料，但由于其在中性和生理PH值不溶限制了其應用。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種生理條件下水溶的賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體的制備方法。
[0005]本發(fā)明通過以下技術方案予以實現(xiàn):一種賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體的制備方法，包括賴氨酸修飾殼聚糖的合成和超微載體的制備兩步驟；
所述賴氨酸修飾殼聚糖的合成步驟為，將0.1g殼聚糖溶于40mL 0.1M的醋酸溶液中，用15mL0.3M氫氧化鈉沉淀，收集白色沉淀，用水洗至中性，真空烘干后溶于pH=5值的乙酸溶液中，同時將0.2g賴氨酸與0.1g碳二亞胺(EDC)分別溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和水中，反應油相/水相(DMF/H20)配比為1:1逐滴加入到反應體系中，反應溫度20°C，攪拌速度1200rpm，攪拌6h后收集產物并用無水乙醇洗滌多次，最后將產品透析48h凍干保存；所述超微載體的制備步驟為，用共沉淀法制備Fe3O4磁流體，并將其超聲分散在去離子水中，在持續(xù)機械攪拌下，緩慢滴加賴氨酸修飾殼聚糖水溶液，通氬氣保護，升溫至75V反應Ih即制得賴氨酸修飾殼聚糖超微磁性載體粒子。
[0006]本發(fā)明具有如下有益效果:
該制備方法在殼聚糖主鏈上引入了賴氨酸分子，增加了分子中氨基(-NH2)含量，從而很大程度上增強了磁性超微載體的正電性，便于攜帶更多的基因，在基因治療方面將有很大的應用前景。。
【具體實施方式】
[0007]下面結合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。
[0008]具體實施例:本發(fā)明所述制備過程包括賴氨酸修飾殼聚糖的合成和超微載體的制備兩步驟；
所述賴氨酸修飾殼聚糖的合成步驟為，將0.1g殼聚糖溶于40mL 0.1M的醋酸溶液中，用15mL0.3M氫氧化鈉沉淀，收集白色沉淀，用水洗至中性，真空烘干后溶于pH=5值的乙酸溶液中，同時將0.2g賴氨酸與0.1g碳二亞胺(EDC)分別溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和水中，反應油相/水相(DMF/H20)配比為1:1逐滴加入到反應體系中，反應溫度20°C，攪拌速度1200rpm，攪拌6h后收集產物并用無水乙醇洗滌多次，最后將產品透析48h凍干保存；所述超微載體的制備步驟為，用共沉淀法制備Fe3O4磁流體，并將其超聲分散在去離子水中，在持續(xù)機械攪拌下，緩慢滴加賴氨酸修飾殼聚糖水溶液，通氬氣保護，升溫至75V反應Ih即制得賴氨酸修飾殼聚糖超微磁性載體粒子。
[0009]對賴氨酸修飾殼聚糖進行核磁共振譜圖測定，其脫乙度為81.5%，賴氨酸的取代度為 32.78%ο
[0010]對制備的超微載體進行X射線光電子能譜分析，得出載體粒子表面的N元素大部分已氨基形式存在，載體具有很強的正電性，進行TEM觀察，載體粒子具有良好的外觀，表面光滑，粒徑分布均勻，有大量粒子的粒徑在10nm左右
以上內容是結合具體的實施方式對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
【主權項】
1.一種賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體的制備方法，其特征在于:包括賴氨酸修飾殼聚糖的合成和超微載體的制備兩步驟； 所述賴氨酸修飾殼聚糖的合成步驟為，將0.1g殼聚糖溶于40mL 0.1M的醋酸溶液中，用15mL0.3M氫氧化鈉沉淀，收集白色沉淀，用水洗至中性，真空烘干后溶于pH=5值的乙酸溶液中，同時將0.2g賴氨酸與0.1g碳二亞胺(EDC)分別溶于N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)和水中，反應油相/水相(DMF/H20)配比為1:1逐滴加入到反應體系中，反應溫度20°C，攪拌速度1200rpm，攪拌6h后收集產物并用無水乙醇洗滌多次，最后將產品透析48h凍干保存；所述超微載體的制備步驟為，用共沉淀法制備Fe3O4磁流體，并將其超聲分散在去離子水中，在持續(xù)機械攪拌下，緩慢滴加賴氨酸修飾殼聚糖水溶液，通氬氣保護，升溫至75V反應Ih即制得賴氨酸修飾殼聚糖超微磁性載體粒子。
【專利摘要】一種賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體的制備方法，屬于基因治療中基因載體制備領域。提供一種生理條件下水溶的賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體的制備方法。所述方法通過賴氨酸對殼聚糖進行修飾，制備了水溶性好，氨基含量高的賴氨酸修飾殼聚糖，并將所制得的賴氨酸修飾殼聚糖作為殼層材料制備磁性超微載體。該方法制備的賴氨酸修飾殼聚糖磁性超微載體，其表面帶有大量的氨基(-NH2)，粒徑分布較為均一，形貌較為規(guī)則，并具有良好的超順磁性，可以作為一種優(yōu)良的基因載體。
【IPC分類】A61K48-00, A61K47-36, A61K9-14, C08B37-08, A61K47-04
【公開號】CN104645350
【申請?zhí)枴緾N201410754301
【發(fā)明人】張立榮
【申請人】張立榮
【公開日】2015年5月27日
【申請日】2014年12月11日