Psd-95的二聚抑制劑的脂肪酸衍生物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了能夠結(jié)合PSD?95的PDZ域的脂肪酸衍生的化合物，及其作為PSD?95介導(dǎo)的蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑的醫(yī)藥用途。
【專利說明】
PSD-95的二聚抑制劑的脂肪酸衍生物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及能夠與PSD-95的roz域結(jié)合的化合物，以及其作為PSD-95介導(dǎo)的蛋白 質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的抑制劑的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 突觸后密度蛋白質(zhì)-95(PSD-95)是人類中由DLG4(大盤狀同系物4(disks large homolog 4))基因編碼的蛋白質(zhì)。PSD-95是膜相關(guān)鳥苷酸激酶(MAGUK)家族成員并且與PSD- 93-起募集為相同NMDA受體和鉀通道組。
[0003] PSD-95是含PDZ域的蛋白質(zhì)的MAGUK家族的最佳研究成員。類似于所有MA⑶K家族 蛋白質(zhì)，其包括三個(gè)roz域、一個(gè)SH3域和一個(gè)經(jīng)連接子區(qū)域連接的鳥苷酸激酶樣域(GK)。其 幾乎僅位于神經(jīng)元的突觸后密度，并且涉及錨定突觸蛋白質(zhì)。其直接和間接結(jié)合配偶體 (partner)包括神經(jīng)連接蛋白質(zhì)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶（nNOS)、N-甲基-d-天冬氨酸 (NMDA)受體、AMPA受體和鉀通道。
[0004] PDZ域是各種有機(jī)體包括人的支架蛋白質(zhì)中主要發(fā)現(xiàn)的具有80-90個(gè)氨基酸的常 見結(jié)構(gòu)域。PDZ是三種蛋白質(zhì)一PSD-95、果繩大盤狀腫瘤抑制基因 （Drosophila disc large tumor suppressor，Dlgl)和閉鎖小帶蛋白質(zhì)-1(Z0-1)-的第一個(gè)英文字母的縮寫詞，所述 三種蛋白質(zhì)是最先發(fā)現(xiàn)的包含所述域的蛋白質(zhì)。
[0005] 通常，PDZ域通過與其C末端結(jié)合而與其他蛋白質(zhì)相互作用。這通過β折疊增加(β- sheet augmentation)實(shí)現(xiàn)，這是指FOZ域中的β折疊通過加入結(jié)合配偶體蛋白質(zhì)的C末端延 長(zhǎng)并由此形成延長(zhǎng)的β折疊樣結(jié)構(gòu)。
[0006] PDZ域發(fā)現(xiàn)于真核和真細(xì)菌界中均有的大量蛋白質(zhì)中，而它們?cè)诠派鞍踪|(zhì)中 僅存在極少實(shí)例。PSD-95的三個(gè)PDZ域，即PDZ1-3,與具有類似共有序列例如Ser/Thr-X- Val/Ile/Leu-C00H的肽配體結(jié)合。
[0007] PDZ域與C-末端肽的相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)首先由與天然肽配體CRIPT(序列： YKQTSV)絡(luò)合的PSD-95的Η)Ζ3的X-射線晶體結(jié)構(gòu)闡明。PDZ3包含六個(gè)反平行的β-鏈() 和兩個(gè)α-螺旋(αΑ和αΒ)，并且C-末端肽配體結(jié)合于邱鏈和αΒ螺旋之間的凹槽中。肽配體的 兩個(gè)殘基被認(rèn)為對(duì)于親和性和特異性是特別重要的，其為從C-末端開始數(shù)的第一個(gè)(Ρ，和 第三個(gè)(Ρ，氨基酸。PQ位的氨基酸側(cè)鏈伸出至疏水口袋中并且需要具有脂族側(cè)鏈的氨基酸 (Val、Ile和Leu)。在PDZ3-CRIPT X-射線晶體結(jié)構(gòu)中，Ser或Thr(P-2)的羥基氧與His372的咪 唑側(cè)鏈的氮形成氫鍵，并且該相互作用已顯示為roz域/配體相互作用的親和性的重要決定 因素。PDZ域的保守的Gly-Leu-Gly-Phe(PDZ3中的322-325位)基序和帶正電荷的殘基(PSD- 95TOZ3中的Arg318)介導(dǎo)與C末端羧酸酯基團(tuán)的結(jié)合。
[0008] PSD-95的PDZ1和PDZ2域與若干蛋白質(zhì)相互作用，包括同時(shí)結(jié)合NMDA-型親離子谷 氨酸受體和一氧化氮(N0)合酶nNOSaNMDA受體是興奮性毒性的主要介導(dǎo)物，即，谷氨酸介導(dǎo) 的神經(jīng)毒性，其涉及神經(jīng)變性疾病和急性腦損傷，并且雖然NMDA受體的拮抗劑通過防止谷 氨酸介導(dǎo)的離子流有效降低興奮性毒性，但是它們還阻止生理學(xué)重要過程。因此，NMDA受體 拮抗劑不能用于例如中風(fēng)的臨床試驗(yàn)，這是由于低耐受性和缺乏效力。相反，興奮性毒性的 特異性抑制可以通過使用PSD-95抑制劑擾亂細(xì)胞內(nèi)nNOS/PSD-95/NMDA受體絡(luò)合物而獲得。
[0009] PSD-95分別通過rozi和roZ2同時(shí)結(jié)合NMDA受體，主要為GluN2A和GluN2B亞單位， 和nNOS。激活匪DA受體引起鈣離子流入，其激活nNOS，由此導(dǎo)致N0產(chǎn)生。因此，PSD-95介導(dǎo) NMDA受體激活和N0產(chǎn)生之間的特定締合(association)，其如果持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間則對(duì)細(xì)胞是 有害的，并且是谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性的關(guān)鍵促進(jìn)劑。通過靶標(biāo)PSD-95抑制nN0S/PSD-95/ NMDA受體相互作用的三元絡(luò)合物，其已知為通過損害鈣離子進(jìn)入和NO產(chǎn)生之間的功能連接 而防止小鼠中的缺血性腦損傷，同時(shí)生理功能例如離子流和NMDA受體的促生存信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑仍保持完整。W02010/004003公開了通過由聚乙二醇接頭(PEG)連接的二聚肽配體抑制 PSD-95的概念。這些二聚體同時(shí)結(jié)合PSD-95的PDZ1和PDZ2域。
[0010] 靶向PSD-95的二聚化配體作為慢性疼痛治療處于臨床前評(píng)價(jià)中（Andreasen等人， Neuropharmacol，2013，67,193-200;Bach等人，PNAS USA，2012,109,3317-3322)。然而，治 療肽通常易受從血液中除去以及通過腎清除和肝代謝而降解的影響。因此，需要改善藥代 動(dòng)力學(xué)性質(zhì)并且因此增加二聚肽配體的穩(wěn)定性和半衰期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 為了解決關(guān)于提供改善的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)和增加 PSD-95二聚肽配體的體內(nèi)穩(wěn)定 性的所述問題，本發(fā)明描述了一類新的化合物，其中兩個(gè)肽配體通過接頭例如NPEG接頭連 接，其中一種或多種脂肪酸或脂肪酸衍生物已直接結(jié)合NPEG接頭或通過其他接頭結(jié)合。
[0012] 本發(fā)明人由此開發(fā)了二聚PSD-95配體的衍生物，其與未連接脂肪酸的化合物，例 如TO2010/004003公開的化合物相比，具有改善的體外血漿半衰期。此外，該化合物顯示出 皮下給藥時(shí)在皮下儲(chǔ)庫(kù)(depot)中增加的保留時(shí)間(residence time)。
[0013] 在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含第一肽(Pi)和第二肽(p2)的化合物，其中pjpp2各自 包含至少兩個(gè)蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)氨基酸殘基，并且其中P#PP2均通過其N-末端與第一接頭 U連接，并且其中U包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的至少一個(gè)氧原子被氮原子替換以得 到NPEG，并且其中白蛋白結(jié)合部分通過酰胺鍵或者通過任選的接頭L2與NPEG的氮原子連 接。
[0014]已經(jīng)證明了本發(fā)明的化合物與PSD-95的PDZ1-2結(jié)合（當(dāng)選擇如本文所定義的PjP P2時(shí)）。由于PSD-95是治療的重要靶標(biāo)，因此本發(fā)明一方面涉及用作藥物的本文定義的化合 物。
[0015] 更具體地，本發(fā)明的化合物可以一方面用于治療或預(yù)防興奮性毒性相關(guān)疾病，或 者預(yù)防和/或治療疼痛。
[0016] 本發(fā)明化合物可以通過包括下述步驟的方法按計(jì)劃合成：
[0017] a)制備 NS-NPEG 二酸接頭，
[00?8] b)使用基于Fmoc的固相肽合成制備肽，
[0019] C)使Fmoc-脫保護(hù)的肽與Ns-NPEG二酸接頭二聚化，
[0020] d)任選通過中間體接頭，例如氨基酸接頭(L2)，使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶 聯(lián)。
【附圖說明】
[0021] 圖1:參比配體UCCB01-125和UCCB01-144的結(jié)構(gòu)。首字母表示L-氨基酸，除了'Ν' (氮）、'〇'（氧）。
[0022] 圖2:FA-連接的二聚化配體（1-12)和UCCB01-125和UCCB01-144的HSA的親和性。數(shù) 據(jù)顯示為平均值土 SEM，n = 3。
[0023] 圖3:如經(jīng)FP測(cè)定的FA-連接的二聚化配體（1-12)和UCCB01-125和UCCB01-144與 PSD-95TOZ1-2的親和性。A)在TBS中測(cè)量；B)在TBS+HSA中測(cè)量；C)在TBS+HSA中測(cè)量，fu校 正。數(shù)據(jù)顯示為平均值土 SEM，n2 3。
[0024] ?4 :化合物（UCCBO1 -125、1、4、7、13)的體外血漿穩(wěn)定性。計(jì)算的半衰期為： 1]〇^01-125:1.711;1:23.611;4、7和13 :>2411。
[0025]圖5:大鼠皮下給藥后二聚化配體UCCB01-125(兩個(gè)劑量)和化合物1、4、7和13的血 衆(zhòng)分布。
[0026] _: FA-連接的二聚化配體(1 -12)的合成。該圖的方案1中例示的合成的反應(yīng)條件 如下：（a)Fmoc-GABA-〇H/Fmoc-(l)-Glu-〇tBu/Fmoc-5-Ava，HATU，三甲基吡啶，DMF(lh x2)， 然后 20% 哌啶/DMF;(b)FAl/FA2/FA3/FA4，HBTU，DIPEA，DMF/DCM，45min，然后 TFA/TIPS/H2O (90/5/5); (c)0 · 5M LiOH，H20/ACN(75/25)，30min，然后TFA至pH〈2。三角形表示E和T為經(jīng)側(cè) 鏈保護(hù)的（叔丁基）。
[0027] 圖7:十八烷二酸二甲酯的單皂化。反應(yīng)條件：（a)Na0H(leq.)，Me0H，45°C，0/N。
【具體實(shí)施方式】
[0028] I.定義
[0029] 酰胺鍵:本文使用的術(shù)語(yǔ)'酰胺鍵'是通過羧酸和胺之間的反應(yīng)(并且伴隨消除水) 形成的化學(xué)鍵。當(dāng)反應(yīng)是在兩個(gè)氨基酸殘基之間進(jìn)行時(shí)，作為反應(yīng)結(jié)果形成的鍵稱為肽鍵 (peptide linkage,peptide bond)；
[0030] 金:本文使用的術(shù)語(yǔ)'包含'應(yīng)以包括方式理解。因此，例如，包含化合物X的組合 物可以包含化合物X和任選其他化合物。
[0031] 二聚體:本文使用的術(shù)語(yǔ)二聚體是指經(jīng)化學(xué)或物理相互作用締合的兩個(gè)相同或不 相同的化學(xué)部分。例如，二聚體可以是同源二聚體，例如經(jīng)接頭連接的兩個(gè)相同肽。二聚體 也可以是異源二聚體，例如經(jīng)接頭連接的兩個(gè)不同肽。二聚體的實(shí)例是本發(fā)明的PSD-95抑 制劑，其是包含通過接頭的方式共價(jià)連接的兩個(gè)肽或肽類似物的化合物，其中所述肽或肽 類似物能夠同時(shí)與PSD-95的rozi和roZ2結(jié)合或相互作用。
[0032] 二肽:本文使用的術(shù)語(yǔ)'二肽'是指經(jīng)肽鍵連接的兩個(gè)天然或非天然氨基酸。
[0033]乙二醇部分:本文使用的術(shù)語(yǔ)'乙二醇部分'是指組成PEG或NPEG接頭的結(jié)構(gòu)單元。 '乙二醇部分'的另一個(gè)名字是'氧乙稀(oxyethyleneZ，并且單體單元的化學(xué)式是：
[0034]
[0035] 脂肪酸:本文使用的術(shù)語(yǔ)脂肪酸(縮寫為FA)通常是指具有長(zhǎng)脂族碳鏈的羧酸，其 可以為飽和或不飽和的。脂肪酸可以選自短鏈脂肪酸(SCFA)、中鏈脂肪酸(MCFA)、長(zhǎng)鏈脂肪 酸(LCFA)和極長(zhǎng)鏈脂肪酸(VLCFA)。短鏈脂肪酸(SCFA)是具有少于六個(gè)碳的脂族尾部的脂 肪酸（即，丁酸）。中鏈脂肪酸(MCFA)是具有6-12個(gè)碳的脂族尾部的脂肪酸，其可以形成中鏈 甘油三酯。長(zhǎng)鏈脂肪酸（LCFA)是具有13-21個(gè)碳的脂族尾部的脂肪酸。極長(zhǎng)鏈脂肪酸 (VLCFA)是具有長(zhǎng)于22個(gè)碳的脂族尾部的脂肪酸。本發(fā)明的脂肪酸可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員 已知的任何合適的脂肪酸或者脂肪酸衍生物。
[0036] 接頭:本文使用的術(shù)語(yǔ)'接頭'是指形成從一個(gè)化學(xué)實(shí)體到另一個(gè)的連接的一個(gè)或 多個(gè)原子。例如，'第一接頭'在本文是指PEG或NPEG，其通過與其各個(gè)N-末端形成連接而將 兩個(gè)roz-域結(jié)合肽連接在一起。
[0037] 非蛋白質(zhì)氨基酸:非蛋白質(zhì)氨基酸還稱為非編碼的、非標(biāo)準(zhǔn)的或非天然氨基酸，其 不由遺傳密碼編碼。非蛋白質(zhì)氨基酸的非窮盡列舉包括氨基-正丁酸、正纈氨酸、正亮氨 酸、異亮氨酸、別異亮氨酸、叔亮氨酸、氨基-正庚酸、哌啶羧酸(pipecolic acid)、aj-二 氨基丙酸、α，γ_二氨基丁酸、鳥氨酸、別蘇氨酸、高半胱氨酸、高絲氨酸、β_丙氨酸、β-氨基- 正丁酸、氨基異丁酸、γ_氨基丁酸、氨基異丁酸、異纈氨酸、肌氨酸、Ν-乙基甘氨酸、Ν- 丙基甘氨酸、N-異丙基甘氨酸、N-甲基丙氨酸、N-乙基丙氨酸、N-甲基β-丙氨酸、N-乙基β-丙 氨酸、異絲氨酸和a-羥基-γ -氨基丁酸。
[0038] NPEG:本文使用的術(shù)語(yǔ)NPEG是PEG接頭的接頭衍生物，但是其中一個(gè)或多個(gè)骨架氧 原子被氮原子替換。
[0039] Ns-NPEG二酸接頭:'Ns-NPEG二酸接頭'是這樣的結(jié)構(gòu)，其中在接頭氮上NPEG接頭 的氮被鄰-硝基苯磺酰基(Ns)保護(hù)基保護(hù)，并且其中NPEG接頭的末端包含羧酸。這種化學(xué)試 劑或構(gòu)造塊(building block)用于使兩個(gè)肽部分Pi和P2二聚。
[0040]四運(yùn):本文使用的術(shù)語(yǔ)'PDZ'是指突觸后密度蛋白質(zhì)_95(^ostsynaptic density protein-95，PSD_95)、果繩大盤狀腫瘤抑制基因 （Qrosophila homologue discs large tumor suppressor，DlgA)和閉鎖小帶蛋白質(zhì)-1 (名onula occludens-lprotein，zo_l) 〇 [00411 PEG:本文使用的術(shù)語(yǔ)' PEG '是指上文討論的乙二醇部分的聚合物。PEG具有化學(xué)式 C2n+2H4n+60n+2，并且重復(fù)結(jié)構(gòu)為：
[0042]
[0043] 其中例如12個(gè)PEG部分或PEG12相當(dāng)于12個(gè)乙二醇部分的聚合物。
[0044] 藥代動(dòng)力學(xué)分布:本文使用的術(shù)語(yǔ)'藥代動(dòng)力學(xué)分布'是指本文所述化合物的吸收 于血流中、分布于組織中、代謝和排泄的體內(nèi)特征。藥代動(dòng)力學(xué)分布包括的參數(shù)的實(shí)例是體 外血漿半衰期，其模擬血漿蛋白酶代謝化合物。
[0045] 蛋白質(zhì)氨基酸:還稱為天然氨基酸的蛋白質(zhì)氨基酸包括丙氨酸、半胱氨酸、硒代半 胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨 酸、天冬酰胺、脯氨酸、吡咯賴氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和酪 氨酸。
[0046] PSD-95:本文使用的術(shù)語(yǔ)'PSD-95'是指突觸后密度蛋白質(zhì)-95。
[0047] PSD-95抑制劑:本文使用的術(shù)語(yǔ)'PSD-95抑制劑'是指與PSD95的PDZUPDZ2或PDZ1 和PDZ2二者結(jié)合并且抑制由細(xì)胞中這些PDZ域促進(jìn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的化合物。 PSD-95抑制劑抑制的相互作用的實(shí)例是nN0S、PSD-95和NMDA受體之間的三元絡(luò)合物形成。
[0048] II.具有改善的血漿半衰期的二聚化合物
[0049] 靶向PSD-95的二聚化配體作為慢性疼痛和缺血性中風(fēng)的治療處于臨床前評(píng)價(jià)中 (Andreasen等人，Neuropharmacol，2013，67，193-200 ; Bach等人，PNAS USA，2012，109， 3317-3322)。然而，治療肽通常易受蛋白酶降解和腎過濾和/或肝代謝消除的影響(Tang等 人，J Pharm Sci，2004，93，2184-204)。由于二聚化配體的有限大小，它們可能通過腎過濾 從血液中清除，這是因?yàn)槟I通常過濾出分子量低于60kDa的化合物（Dennis等人，J Bi〇lChem2002,277,35035-43)。為了制備更適合慢性疾病例如神經(jīng)性疼痛的臨床應(yīng)用的二 聚肽配體，給藥方案應(yīng)該盡可能簡(jiǎn)單，優(yōu)選每日一次，以增加順應(yīng)性（Claxton等人， ClinTher 2001，23，1296-310)。此外，患者通過適當(dāng)途徑的自我給藥，例如皮下（8.〇.)給 藥，優(yōu)于i.v.(靜脈內(nèi)）注射。皮下給藥的主要限制是需要藥物高度有效、高度濃縮、可溶并 從循環(huán)緩慢降解和排泄的低注射體積的要求(Dychter等人，J InfusNurs 2012,35,154- 60)。此外，藥物應(yīng)該在注射儲(chǔ)庫(kù)中穩(wěn)定并且緩慢吸收于循環(huán)中以延長(zhǎng)藥物作用(Havelund 等人，Pharm Res 2004,21，1498-504)。因此，二聚肽配體的藥代動(dòng)力學(xué)分布和體內(nèi)半衰期 應(yīng)該進(jìn)一步優(yōu)化以解決這些問題。
[0050] 白蛋白結(jié)合
[00511人血清白蛋白（HSA)是人血清中最豐富的蛋白質(zhì)，占55%的總血清蛋白質(zhì) (Elsadek等人，J Control Release 2012,157,4-28)，其提供解決這些問題的機(jī)會(huì)。HSA的 平均血液濃度為520_830μΜ，并且分子量為約66.5kDa(Kragh_Hansen等人，Biol Pharm Bull 2002,25,695-704 ) dSA在血液、肌肉組織和皮膚中是豐富的（Sleep等人， BiochimBiophysActa 2013，1830,5526_34)，但是在正常條件下不存在于神經(jīng)元內(nèi)。然而， 在其中血腦屏障（BBB)受損的疾病狀態(tài)例如中風(fēng)中，其可能進(jìn)入神經(jīng)元（L0berg，APMIS 1993，101，777-83)。批4充當(dāng)許多內(nèi)源性配體例如脂肪酸$48)、血紅素、膽紅素和色氨酸 (Simard等人，PNAS USA，2005,102,17958-63;Kragh-Hansen等人，Biol Pharm Bull 2002， 25,695-704)和藥物例如華法林和地西泮以及金屬離子的運(yùn)輸和儲(chǔ)庫(kù)蛋白（Yamasaki等人， BiochimBiophysActa 2013，1830，5435-43)。
[0052]已經(jīng)廣泛研究了 HSA的結(jié)構(gòu)，并且HSA的多于90個(gè)不同X-射線結(jié)構(gòu)儲(chǔ)存在具有71個(gè) 不同配體的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank,Η)Β，26/09/2013存入hHSA是具有80x80x 30 A的合適尺寸的心型分子，并且由三個(gè)類似域（Ι、Π 和III)組成，其被進(jìn)一步分為兩個(gè) 亞域(a和b) (Sugio等人，Protein Eng 1999,12,439_46)。大部分藥物在Sudlow' s位點(diǎn) 1(還 稱為華法林位點(diǎn)）和II(還稱為地西泮位點(diǎn)）結(jié)合(Elsadek等人，J Control Release 2012， 157，4-28; Yamasaki等人，BiochimBiophysActa 2013，1830，5435-43)，由在1975年通過熒 光光譜鑒定位點(diǎn)的Sudlow和同事的創(chuàng)舉工作命名（Sudlow等人，MolPharmacol 1975，11， 824-32)。已經(jīng)繪制了兩個(gè)藥物結(jié)合位點(diǎn)，并且分別在亞域Ila(來自亞域Ilia和lib中的殘 基）和IIla內(nèi)發(fā)現(xiàn)（Yamasaki等人，BiochimBiophysActa 2013，1830，5435-43)。Sudlow' s位 點(diǎn)I和Π 的一般結(jié)合的一個(gè)重要例外是脂肪酸(FAs)。
[0053]從1970開始已知藥物的高HSA結(jié)合增加藥物半衰期的概念。然而，使用HSA增加治 療肽和蛋白質(zhì)的半衰期的具體概念發(fā)展得更緩慢，從2002(約250個(gè)出版物/年）至2010(約 500個(gè)出版物/年)每年出版物數(shù)目加倍(Elsadek等人，J Control Release 2012,157，4_ 28)。已經(jīng)描述了若干基于肽的HSA結(jié)合部分，包括HSA結(jié)合序列，其由噬菌體展示鑒定 (Dennis等人，J BiolChem2002，277，35035-43)，從天然來源（Jonsson等人，Protein Eng Des Sel 2008,21，515_27)和所謂的adnectins(Lipovsek等人，Protein Eng Des Sel 2011，24,3-9)分離。然而，這些可能易受蛋白酶降解的影響，其在目前的皮下給藥的情況下 可能特別成問題，其中假設(shè)開發(fā)的化合物于皮下儲(chǔ)庫(kù)中保留若干小時(shí)。
[0054] 總體結(jié)構(gòu)
[0055]為了改善藥代動(dòng)力學(xué)分布，本發(fā)明人研究了脂肪酸和接頭類型對(duì)HSA親和性、PSD- 95親和性和產(chǎn)生的化合物的疏水性的影響。在這種情況下，已經(jīng)鑒定了提供所需HSA-結(jié)合 分布和人血漿中增強(qiáng)的穩(wěn)定性的新化合物。
[0056]因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含第一肽(P〇和第二肽(P2)的化合物，其中PjP P2各自包含至少兩個(gè)蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)氨基酸殘基，并且其中P#PP2均通過其N-末端與第 一接頭Li連接，并且其中U包含聚乙二醇(PEG)，其中所述PEG的至少一個(gè)氧原子被氮原子替 換以得到NPEG，并且其中白蛋白結(jié)合部分通過酰胺鍵或者通過任選的接頭L2與NPEG的氮原 子連接。
[0057]在某些實(shí)施方案中，所述化合物具有通式（I):
[0058]
[0059]白蛋白結(jié)合部分可以是任何合適的結(jié)合白蛋白的化學(xué)基團(tuán)，優(yōu)選的白蛋白結(jié)合部 分是脂肪酸(FA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述化合物因此具有通式(II):
[0060]
[0061] 脂肪酸可以是任何合適的脂肪酸，例如飽和或不飽和脂肪酸。如上面式(I)和（II) 所例示的，白蛋白結(jié)合部分例如脂肪酸可以通過第二接頭L2任選與NPEG接頭(U)的氮原子 連接。在其中包括第二接頭1^的實(shí)施方案中，該接頭包含氮原子。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有式(III)或（IV)的一般結(jié)構(gòu)：
[0063]
[0064] 其中
[0065] RjPR2各自選自Η和 C00H，
[0066] η為0-48的整數(shù)，
[0067] m為1-48的整數(shù)，
[0068] p為0-28的整數(shù)，
[0069] q為0-28的整數(shù)，
[0070] i為0-12的整數(shù)，
[0071] j為0-12的整數(shù)，
[0072]并且其中丹和內(nèi)各自選自肽，其包含至少兩個(gè)蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)氨基酸殘基。 [0073]第一接頭(U)
[0074]脂肪酸在活性上顯示的性質(zhì)依賴于這些部分連接的方式。通過第一接頭 L!和第二接頭L2實(shí)現(xiàn)連接。W0 2012/156308在某種程度上描述了第一接頭1^，其由形成聚乙 二醇的許多乙二醇部分組成，其中一個(gè)氧原子已被氮原子替換以形成NPEG接頭。NPEG接頭 可例示為在氮原子兩側(cè)的每側(cè)上為一定數(shù)目（P，q)的乙二醇部分。
[0075] 在本發(fā)明的不同實(shí)施方案中在氮原子兩側(cè)的乙二醇部分的數(shù)目是可變的。在一個(gè) 實(shí)施方案中，一側(cè)乙二醇部分的數(shù)目（P)與另一側(cè)乙二醇部分的數(shù)目相同，即，P = q。在其他 實(shí)施方案中p>q或p〈q。
[0076] 在一個(gè)實(shí)施方案中，p和q的總和是0-28的整數(shù)，例如其中乙二醇部分的數(shù)目p選自 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或 28 〇
[0077] 在一個(gè)實(shí)施方案中，乙二醇部分的數(shù)目p為1-4，因?yàn)樵摲秶膒提供了對(duì)PSD-95的 最高親和性。
[0078] 在一個(gè)實(shí)施方案中，乙二醇部分的數(shù)目q選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 個(gè)乙二醇部分。
[0079]在一個(gè)實(shí)施方案中，乙二醇部分的數(shù)目q為1 _4，因?yàn)樵摲秶膓提供了對(duì)PSD-95的 最高親和性。
[0080] 在一個(gè)實(shí)施方案中，乙二醇部分的總數(shù)p+q為2-12,因?yàn)樵摲秶鷥?nèi)的接頭長(zhǎng)度提供 了對(duì)PSD-95的最高親和性。
[0081] 在一個(gè)實(shí)施方案中，乙二醇部分的數(shù)目p+q為4,因?yàn)樵摲秶慕宇^長(zhǎng)度提供了對(duì) PSD-95的極最高親和性。
[0082] 在另一實(shí)施方案中，乙二醇部分的數(shù)目p+q為6,因?yàn)樵摲秶慕宇^長(zhǎng)度提供了對(duì) PSD-95的極高親和性。
[0083] 第二接頭(L2)
[0084] 第二接頭1^2是任選的并且取決于特定目的所需的物理或化學(xué)性質(zhì)可以被包括或 排除。若存在，第二接頭L2包含氮原子。第二接頭L2可以例如選自γ-Glu、γ-丁酸(GABA)、5- 氨基戊酸（5-Ava)、蛋白質(zhì)氨基酸、非蛋白質(zhì)氨基酸和具有通SH2N-[Q]-C00H的任何化合 物，其中Q是任何合適的一個(gè)或多個(gè)原子或分子。
[0085] 如上文所述，第二接頭可以包含重復(fù)碳部分，由此形成例如烷基或烯基鏈。重復(fù)單 元（i)和/或(m)的數(shù)目可以取決于所需性質(zhì)而變化。因此，i和/或m是各自選自0、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數(shù)。
[0086] 在一個(gè)實(shí)施方案中，η是1-3的整數(shù)，例如在其中n = l或n = 2或n = 3的實(shí)施方案中。 [0087] 在某些實(shí)施方案中，i和/或j是0-12的整數(shù)，例如選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、 11和12的整數(shù)。
[0088] 在某些實(shí)施方案中，選擇接頭LjPL2使得本發(fā)明的化合物選自：
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，選擇接頭使得本發(fā)明的化合物選自：
[0093]
[0094]
[0095]
υ
[0096] 脂肪酸(FA)
[0097] 脂肪酸是飽和或不飽和的具有脂族尾部(鏈)的羧酸。大部分天然發(fā)現(xiàn)的脂肪酸具 有4-28的偶數(shù)個(gè)碳原子的鏈。脂肪酸通常源自甘油三酯或磷脂。當(dāng)它們不與其他分子連接 時(shí)，它們稱為游離脂肪酸。
[0098] 具有碳碳雙鍵的脂肪酸稱為不飽和脂肪酸，而沒有雙鍵的脂肪酸稱為飽和脂肪 酸。不飽和脂肪酸在碳原子之間具有一個(gè)或多個(gè)雙鍵。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物 包含不飽和脂肪酸。在這種實(shí)施方案中，通式(III)、（IV)、(V)或(VI)的指示物(i)和/或(j) 是各自選自0-12的整數(shù)，例如選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的整數(shù)。
[0099] 不飽和脂肪酸可以順式或反式構(gòu)型，或者二者的混合物獲得。
[0100] 順式構(gòu)型是指相鄰氫原子在雙鍵同側(cè)上。雙鍵的剛性固定其構(gòu)象并且在順式異構(gòu) 體的情況下，引起鏈彎曲并且限制脂肪酸的構(gòu)象自由。鏈具有的順式構(gòu)型的雙鍵越多，柔性 越小。當(dāng)鏈具有許多順式構(gòu)型的雙鍵時(shí)，其以其最易獲得的構(gòu)象變得完全彎曲。例如，具有 一個(gè)雙鍵的油酸在其中具有〃扭結(jié)(kink)"，而具有兩個(gè)雙鍵的亞油酸具有更顯著的彎曲。 具有三個(gè)雙鍵的亞麻酸具有鉤狀形狀。在受限環(huán)境中，其效果為例如當(dāng)脂肪酸為脂質(zhì)雙 分子層的一部分磷脂或脂質(zhì)液滴的甘油三酯時(shí)，順式雙鍵限制脂肪酸緊密包裹的能力并且 因此可能影響膜或脂肪的熔化溫度。
[0101] 相反，反式構(gòu)型是指兩個(gè)相鄰氫原子結(jié)合于雙鍵的相對(duì)兩側(cè)。因此，它們不引起鏈 過度彎曲，并且它們的形狀類似于直鏈飽和脂肪酸。
[0102] 選擇任何適合預(yù)定目的的脂肪酸，包括順式、反式或混合脂肪酸，均在本發(fā)明的范 圍內(nèi)。
[0103] 本發(fā)明的化合物可以包含任何合適的脂肪酸或脂肪酸衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案 中，脂肪酸是通式(ΠΙ)或（IV)定義的脂肪酸，其中m是選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數(shù)，例如其中111是10-16的整數(shù)，例如其中111=10 或其中m= 16,其毫無疑問地確定高度HSA相互作用(表1)。
[0104] 本發(fā)明的脂肪酸可以為C4-C22脂肪酸或選自辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕櫚 酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、二十四烷酸、蠟酸、肉豆蔻烯酸、棕櫚油酸、十六碳烯酸、油酸、 反油酸、異油酸、亞油酸、反式亞麻酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、芥酸和二十二 碳六烯酸的脂肪酸。
[0105] 肽沾釉^)
[0106] 本發(fā)明的化合物包含兩個(gè)肽PdPP2 UPP2可各自為任何肽，各自包含至少兩個(gè)氨 基酸殘基，并且本發(fā)明的二聚化合物因此可以適合預(yù)定目的。
[0107] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物為PSD-95抑制劑，其中兩個(gè)肽與PSD-95的 rozi-2結(jié)合。因此，在某些實(shí)施方案中，化合物為通式(I)、（π)、（in)或（iv)中任一者限定 的化合物，其中：
[0108] ?!包含氨基酸序列X4X3X2XKSEQ ID N0:1)，和
[0109] P2包含氨基酸序列Z4Z3Z2ZKSEQ ID N0:2)，
[0110] 其中
[0111] aWdP/SZl·為選自I、L和V的氨基酸殘基，
[0112] b)X2 和/或 Z2 為選自 A、D、E、Q、N、S、V、N-Me-A、N-Me-D、N-Me-E、N-Me-Q、N-Me-N、N- Me-S和N-Me-V的氨基酸殘基，
[0113] c)X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0114] d)X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0115]其中XjPZi均各自表示包含游離羧酸的最終C-末端氨基酸殘基。
[0116]因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有式(V)或(VI)的一般結(jié)構(gòu)：
[0117]
[0118]
[0119] RjPR2各自選自Η和 C00H，
[0120] η為0-48的整數(shù)，
[0121] m為1-48的整數(shù)，和
[0122] p為0-28的整數(shù)，
[0123] q為0-28的整數(shù)，
[0124] i為0-12的整數(shù)，
[0125] j為0-12的整數(shù)，
[0126] Χ5和/或Z5為任選的氨基酸殘基、肽或多肽，
[0127] X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0128] X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0129] X2 和/或 Z2 為選自 A、D、E、Q、N、S、V、N-Me-A、N-Me-D、N-Me-E、N-Me-Q、N-Me-N、N-Me-S 和N-Me-V的氨基酸殘基，
[0130] XjP/^Zi為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0131 ]如果χ5為單一氨基酸殘基，則其選自蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)氨基酸殘基。
[0132] 在一個(gè)實(shí)施方案中，Χ5為選自I、A、L和V的氨基酸殘基。
[0133] X5也可以為具有由2-100個(gè)氨基酸殘基組成的氨基酸序列的肽或多肽，其中所述 肽或多肽的C末端是選自I、A、L和V的氨基酸殘基。
[0134] 在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，X5為包含2-100個(gè)殘基的肽，例如2-90個(gè)氨基酸殘 基，例如2-80個(gè)氨基酸殘基，例如2-70個(gè)氨基酸殘基，例如2-60個(gè)氨基酸殘基，例如2-50個(gè) 氨基酸殘基，例如2-40個(gè)氨基酸殘基，例如2-30個(gè)氨基酸殘基，例如2-20個(gè)氨基酸殘基，例 如2-10個(gè)氨基酸殘基，例如2-9個(gè)氨基酸殘基，例如2-8個(gè)氨基酸殘基，例如2-7個(gè)氨基酸殘 基，例如2-6個(gè)氨基酸殘基，例如2-5個(gè)氨基酸殘基，例如2-4個(gè)氨基酸殘基，例如2-3個(gè)氨基 酸殘基，其中C末端是選自I、A、L和V的氨基酸。
[0135] 本發(fā)明的概念通常是可得的，如通式（1)、（11)、（111)、（1￥)、（￥)和以)例示的，本 發(fā)明人已經(jīng)制備了本發(fā)明內(nèi)的許多化合物，包括適合與PSD-95的PDZ1-2結(jié)合的PjPP2的肽 基序。
[0136] 閔此，亦一個(gè)窀施方鎣中，木發(fā)明的化合物詵白，
[0137]
[0138]
[0139]
[0140] 聯(lián)。
[0154] 在一個(gè)實(shí)施方案中，可以如下所定義來合成本發(fā)明的化合物。
[0155] Ns-NPEG二酸接頭：在固相上或在溶液中制備鄰硝基苯磺酰基(Ns)-保護(hù)的NPEG接 頭。
[0156] 固相操作通常由用Fm〇c-NH-PEG-CH2CHKOOH裝載可用于固相肽合成的固體載體 (例如2-氯三苯甲基氯樹脂)開始，該操作使用針對(duì)具體樹脂的合適的有機(jī)溶劑(例如DCM、 DMF、ACN、THF)和堿(例如DI PEA、DBU、三甲基吡啶、NMM)。
[0157] Fmoc基團(tuán)可以通過堿(例如哌啶、二甲基胺、嗎啉、哌嗪、二環(huán)己基胺、DMAP)在適當(dāng) 溶齊丨J (例如DMF、DCM、ACN、THF)中移去。
[0158] 可使用堿(例如DIPEA、DBU、三甲基吡啶、NMM)和適當(dāng)溶劑(例如THF、DCM)使鄰硝基 苯磺酰氯與游離胺偶聯(lián)以得到Ns-nh-peg-ch2ch2coo-樹脂。
[0159] 可通過使用Mi tsunobu-化學(xué)將接頭產(chǎn)物的第二部分與樹脂連接的接頭部分連接。 用三苯基膦、H0-PEG_CH2CH2C00tBu、溶劑和偶氮二羧酸的酯或酰胺試劑(例如偶氮二羧酸二 異丙酯，DIAD;偶氮二羧酸二乙酯，DEAD;1，1'_(偶氮二羰基)-二哌啶，ADDP)處理樹脂。
[0160] 通過用酸例如三氟乙酸(TFA)處理樹脂獲得最終的Ns-NPEG二酸接頭。
[0161] 固相操作可以通過如下進(jìn)行：用Ns保護(hù)NH2-PEG-CH2CH 2COOtBu的氨基，隨后使用三 苯基膦和DI AD、DEAD或ADDP或類似試劑、H0-PEG_CH2CH2C00tBu和適當(dāng)溶劑(THF、DCM)進(jìn)行在 溶液中的Mitsunobu化學(xué)。然后通過用酸例如TFA處理獲得最終的Ns-保護(hù)的NPEG-接頭。
[0162] 肽合成:通過基于Fmoc的固相肽合成使用固體載體(例如2-氯三苯甲基氯樹脂或 Wang樹脂）、Fmoc-保護(hù)的氨基酸、堿、偶聯(lián)試劑(例如HBTU [N，N，Y，Μ -四甲基-0-(1H-苯并 三唑-1-基)脲鑰六氟磷酸鹽]、0-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-Ν，Ν，ΥΥ -四甲基脲鑰六氟磷 酸鹽[HATU]、PyB0B、DIC/H0Bt)和溶劑合成肽序列。除了偶聯(lián)試劑，還可以使用Fmoc-保護(hù)的 氨基酸的活化酯(例如五氟苯基酯、琥珀酰亞胺酯）。
[0163] 二聚化:經(jīng)樹脂上二聚化(on-resin dimerization)方法通過在堿、偶聯(lián)試劑和適 當(dāng)溶劑(例如DMF、DCM、THF)中用亞化學(xué)計(jì)量的量(例如1/6)的Ns-NPEG二酸接頭反復(fù)處理樹 月旨，使Fmoc-脫保護(hù)的樹脂連接肽與Ns-NPEG二酸接頭二聚化。除了偶聯(lián)試劑外，還可以使用 Ns-NPEG接頭的活化酯。
[0164] 還可以使用Ns-NPEG接頭的活化酯（例如五氟苯基酯、琥珀酰亞胺酯）以及1-羥基_ 7_氮雜苯并三唑(HOAt)或羥基苯并三唑(HOBt)和適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)的肽(例如叔丁基)在溶 劑(例如ACN、DMF、DCM、THF)中而在溶液中形成二聚化的方法。而且，溶液中的二聚化可以使 用Ns-NPEG二酸接頭、偶聯(lián)試劑(例如HBTU、HATU等）、堿和溶劑來進(jìn)行。
[0165] Ns-基團(tuán)通過巰基乙醇和1，8_二氮雜二環(huán)[5.4.0]^碳_7_烯(DBU)或者通過苯 硫酸納移去。
[0166 ] 接頭和脂肪酸綴合:可以通過Fmo c -保護(hù)的接頭（例如Fmo c -G1 u-01 Bu、Fmo c -GABA、 Fmoc-5-Ava-OH)的連續(xù)偶聯(lián)使用偶聯(lián)試劑和用于活化的堿，使氨基酸接頭與NPEG-二聚化 的且樹脂連接的肽的游離氮偶聯(lián)。除了偶聯(lián)試劑外，還可以使用Fmoc-保護(hù)的氨基酸接頭的 活化酯。隨后通過脫保護(hù)方法移去Fmoc基團(tuán)。
[0167]使用偶聯(lián)試劑和用于活化的堿使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶聯(lián)?；蛘撸鳛榛?化酯偶聯(lián)。如果脂肪酸含有羧基，除了與接頭-二聚體綴合物的胺反應(yīng)的羧基外，這些還可 以作為酯例如甲酯保護(hù)。
[0168] 可將脂肪酸-連接的二聚化配體與樹脂分離并伴隨使用酸例如TFA或HC1的側(cè)鏈脫 保護(hù)。
[0169] 可通過在含水堿(例如NaOH、LiOH)和乙腈中攪拌分離的產(chǎn)物，隨后用TFA或HC1酸 化來移去酯保護(hù)基團(tuán)。
[0170]通過凍干和HPLC純化或者類似色譜方法獲得本發(fā)明的化合物。
[0171]在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物的合成如實(shí)施例1所定義來進(jìn)行。
[0172] 實(shí)施例
[0173] 實(shí)施例1:合成
[0174] 如先前所述合成樹脂連接的NPEG4IETAV(SEQIDN0:3)二聚化配體（Il)(Bach等 人，PNAS USA，2012,109,3317-3322)。由此，通過兩個(gè)連續(xù)偶聯(lián)使用HATU作為偶聯(lián)試劑、隨 后用哌啶/DMF脫保護(hù)，使適當(dāng)保護(hù)的接頭（分別為Fm〇C-GABA-OH、Fm〇C-(l)-Glu-0tBu和 Fmoc-5-Ava)與NPEG4接頭中的氮連接，得到中間體12-4(圖6)。使用固相肽合成條件容易得 使脂肪酸(FA1-4,圖6)與接頭中釋放的氮連接，并與樹脂分離，同時(shí)伴隨側(cè)鏈保護(hù)基的脫保 護(hù)。然后通過皂化分離的產(chǎn)物、隨后酸化，移去單保護(hù)的FA構(gòu)造塊(十二烷二酸甲酯和十八 烷二酸甲酯，F(xiàn)A2和FA4)的末端甲基保護(hù)基（圖6)。凍干后，將粗產(chǎn)物溶于100%DMS0并通過 大規(guī)模C18RP-HPLC純化。凍干半純的餾分(50-90%純度），再次溶于DMS0/ACN/U0并通過制 備C4RP-HPLC純化(>95 % 純度）。
[0175] 圖6例示了 FA-連接的二聚化配體(1-12)的合成。方案1的反應(yīng)條件如下：（&奸!11〇(3- GABA-〇H/Fmoc-(1)-Glu-〇tBu/Fmoc-5-Ava，HATU，三甲基吡啶，DMF( lh x2)，然后20 %哌啶/ DMF; (b)FAl/FA2/FA3/FA4，HBTU，DIPEA，DMF/DCM，45min，然后TFA/TIPS/H20(90/5/5) ;(c) 0.5M Li0H，H20/ACN(75/25)，30min，然后TFA至pH〈2。三角形表示E和T是經(jīng)側(cè)鏈保護(hù)的（叔 丁基）。
[0176] 十八烷二酸單甲酯(FA4)不是可商購(gòu)得到的，而是通過用一當(dāng)量的NaOH單皂化相 應(yīng)的二甲酯來合成，如先前所述(Jonassen等人，Pharm Res，2012,29,2104-2114)(圖7)〇
[0177] 總之，實(shí)施例1證明了本發(fā)明化合物可以合成并以純的形式獲得。
[0178] 實(shí)施例2:測(cè)定對(duì)HSA的親和性的方法
[0179] 使用TransilXL HAS結(jié)合測(cè)定試劑盒(Sovicell GMBH，Leipzig，Germany)評(píng)價(jià)合成 的FA-連接的二聚化配體（1 -12)的HSA親和性。還針對(duì)比較測(cè)試了二聚化配體UCCB01 -125 (Bach等人，Angew· Chem，Int ·Ed，2009，48，9685-9689)和UCCB01-144(Bach等人，PNAS USA， 2012,109,3317-3322)(表1，圖1)。
[0180] 測(cè)定試劑盒由具有增加濃度的固定HSA的預(yù)填充的孔以及兩個(gè)無 HSA的對(duì)照孔組 成。已經(jīng)以隨機(jī)模式固定HSA以確保HSA上的所有結(jié)合位點(diǎn)是可用的。為了進(jìn)行測(cè)定，用已知 濃度的測(cè)試化合物孵育孔，并且使用分析RP-HPLC (C8柱）量化化合物的未結(jié)合量。由RP- HPLC數(shù)據(jù)通過與無 HSA的對(duì)照樣品比較來計(jì)算每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的未結(jié)合藥物的分?jǐn)?shù)(fu)。然后 針對(duì)孔中總HSA濃度(CHSA)繪制每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的HSA-結(jié)合藥物(f b = 1 -f u)與未結(jié)合藥物的比 例，并擬合為線性模型，如方程1所給出，從而得到作為擬合曲線的斜率的1/Kd。
[0181]
[0182] 在方程1中，假定藥物結(jié)合HSA的濃度（[HSA-D])遠(yuǎn)低于孔中HSA的總濃度（[HSA-D] 〈〈CHSA)。已經(jīng)設(shè)計(jì)了測(cè)定試劑盒，使得該假定對(duì)于其中fU>l %的化合物是有效的。
[0183] 使用計(jì)算的KD-值，使用方程2計(jì)算在HAS的生理濃度(588μΜ)的fb。
[0184] 方程 2
[0185] 總之，實(shí)施例2證明了可以測(cè)定以及如何測(cè)定本發(fā)明化合物與人血清白蛋白（HSA) 的結(jié)合。
[0186] 實(shí)施例3:對(duì)HSA的親和性
[0187] 不含F(xiàn)As的二聚化配體UCCB01-125和UCCB01-144顯示HSA親和性分別為154.3μΜ和 317.5μΜ，其相對(duì)于HSA結(jié)合分?jǐn)?shù)(fb)分別為75 %和65 % (表1)。然而，所有FA-連接的二聚化 配體（1-12)顯示與無 FA的配體相比，對(duì)HSA的親和性明顯更高，且相應(yīng)的fb值更高(表1)。因 此，這清楚地證明了作為將FA與二聚化配體綴合的結(jié)果，HSA結(jié)合得到了顯著增強(qiáng)。
[0188] 與具有較短接頭(GABA，yGlu)的化合物相比，含有較長(zhǎng)5-Ava接頭的化合物通常 具有略低的對(duì)HAS的親和性(表1，圖2)。γ Glu接頭(R1)中的其他酸部分似乎對(duì)此處合成的 FA-連接的二聚化配體的HSA親和性沒有任何影響(表1，圖2)。這與其他蛋白質(zhì)-配體體系中 觀察到的相反（Hackett等人，Adv Drug Deliv 1^￥，2013,65，1331_1339)，并且表明丫6111 接頭的游離羧酸酯不是本發(fā)明化合物與HSA連接的必需特征。
[0189] 與連接較短FAs (m = 10)的二聚化配體相比，與長(zhǎng)FAs (m = 16)連接的二聚化配體顯 示更好的HSA親和性(表1);并且末端羧基(R2)對(duì)HSA親和性具有負(fù)面影響(表1和圖2)。 [0190] 表1:針對(duì)FA-連接的二聚化配體（1-12)和二聚化配體UCCB01-125和UCCB01-144的 HAS結(jié)合以及結(jié)合化合物的計(jì)算分?jǐn)?shù)a
[0191
[0192]
[0193] a數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM，n = 3
[0194] 總之，實(shí)施例3證明了與非FA-衍生的二聚化參比肽相比，本發(fā)明化合物具有增加 的HSA親和性。
[0195] 實(shí)施例4:測(cè)定對(duì)PSD-95的Η)Ζ1-2親和性的方法：
[0196] 使用體外熒光偏振（FP)測(cè)定測(cè)量對(duì)PSD-95的親和性，如Bach等人（PNAS USA， 2012，109,3317-3322)所述。首先，獲得飽和結(jié)合曲線以確定二聚化熒光探針和PSD- 95TOZ1-2之間的相互作用的KD值。于恒定濃度(0.5nM)的探針中加入增加濃度的Η)Ζ1-2。在 激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)635/670nm測(cè)量樣品的熒光偏振，并使用程序GraphPad Prism將FP值擬合至 一個(gè)位點(diǎn)結(jié)合模型。然后，在異種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定中確定非熒光二聚化配體和PDZ1-2之間的 親和性，其中向固定濃度的二聚化探針(〇.5nM)和Η)Ζ1-2(4ηΜ)中加入增加濃度的配體。在 GraphPad Prism中將FP值擬合至一個(gè)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)(可變斜率)模型。將所得IC5Q轉(zhuǎn)換為競(jìng)爭(zhēng)抑 制常數(shù)，1^值，如附1?)1〇￥81^-&31681^等人，八11&113;[0(31161]1，2004,332,261-273所述。如上所 述用1 % HSA在該測(cè)定中進(jìn)行改良的FP測(cè)定。
[0197] 總之，實(shí)施例4證明了如何測(cè)試本發(fā)明化合物與PSD-95的Η)Ζ1-2的結(jié)合。
[0198] 實(shí)施例5:對(duì)PSD-95的Η)Ζ1-2的親和性：
[0199] 在FP測(cè)定中評(píng)價(jià)合成的FA-連接的二聚化配體對(duì)PSD-95 PDZ1-2的親和性。使用 UCCB01-125和UCCB01-144作為參比化合物（Bach等人，PNAS USA，2012,109,3317-3322)(表 2,圖3)。
【申請(qǐng)人】首先使用簡(jiǎn)單的tris-緩沖鹽水(TBS)緩沖劑測(cè)量親和性(表2,圖3A);但是， 此外，
【申請(qǐng)人】通過進(jìn)行FP測(cè)定用存在于測(cè)定緩沖劑中的HSA研究HSA是否影響FA-連接的二 聚體結(jié)合PSD95 PDZ1-2的能力（表2，圖3B)。由于探針與較高濃度HSA的結(jié)合，此處將HSA濃 度設(shè)定為1% (~150μΜ)，其約為估計(jì)的生理學(xué)血液濃度（520-830μΜ)的四分之一(Kragh- Hansen等人，Biol Pharm Bull 2002,25,695_704)〇
[0200] 對(duì)于傳統(tǒng)小分子藥物，普遍接受的是藥物的未結(jié)合部分自由擴(kuò)散穿過膜并且通過 與其革E標(biāo)相互作用發(fā)揮生理學(xué)效應(yīng)(Berezhkovskiy等人，J Pharm Sci2007,96,249-257)。 即，如果藥物與另一分子結(jié)合，則其不能同時(shí)與靶標(biāo)相互作用。為了說明這一點(diǎn)，在150μΜ的 HSA濃度由方程2(fu=l-fb)計(jì)算未結(jié)合藥物分?jǐn)?shù)(fu)，并且針對(duì)計(jì)算的fu校正FP測(cè)定數(shù)據(jù) (TBS+HSA)(表2,圖 3C)。
[0201] 表2:如經(jīng)FPa測(cè)定的FA-連接的二聚化配體（1-12)和二聚化配體（UCCB01-125和 UCCB01-144)的對(duì)PSD-95PDZ1-2的親和性、未結(jié)合藥物的計(jì)算分?jǐn)?shù)(fu)b、f u-校正的FP數(shù)據(jù)a以及如經(jīng)RP-HPLC(C8柱)e測(cè)定的化合物的保留時(shí)間(Rt)。
[0204] ^TBS和含1%HSA的TBS中記錄FP數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示為平均值土SEM，n 2 3.
[0205] 噴據(jù)方程 2計(jì)算的 Fu，f b = 1 _f u，cn = 1.
[0206] 對(duì)于所有FA-連接的二聚化配體而言，其在TBS中對(duì)PSD-95 PDZ1-2的親和性與 UCCB01-125的親和性是可比的（表2,圖3A)，這表明PSD-95PDZ1-2親和性不受FA-衍生化影 響。
[0207] 含1%HSA的TBS中的PSD-95 PDZ1-2親和性在化合物之間顯著并且系統(tǒng)地變化(表 2，圖3B)。與較長(zhǎng)FAs(C18:0或C17:0-C00H)連接的二聚化配體所具有的PSD-95 Η)Ζ1-2親和 性通常明顯小于與較短FAs(C12:0或Cll: 0-C00H)連接的二聚化配體的親和性的1/50。 [0208] 當(dāng)針對(duì)fu校正FP數(shù)據(jù)時(shí)(表2,圖3C)，顯示每個(gè)接頭系列內(nèi)PSD-95H)Zl-2親和性的 系統(tǒng)排序。C12:0-連接的二聚化配體（1、5、9)具有最高親和性，隨后是Cll:〇-⑶0H(2、6、 10)、C18:0(3、7、11#PC17:0-C00H(4、8、12)。
[0209] Fu-校正的FP數(shù)據(jù)還顯示當(dāng)在TBS+HSA中進(jìn)行FP測(cè)量時(shí)，觀察到的C18:0-連接的二 聚化配體3、7和11的50-倍親和性損失主要由化合物與HSA的高度結(jié)合導(dǎo)致，盡管與TBS中記 錄的FP數(shù)據(jù)相比3和7觀察到4-5倍的PSD-95親和性降低(3:Ki = 57.2nM vs ll.lnM;7:Ki = 59. InM vs 17. OnM，表2)，但是在目前的情況下，親和性降低是HSA-依賴性的，這是因?yàn)樵?TBS中未觀察到親和性下降。
[0210] 兩個(gè)5-Ava-連接的二聚化配體11和12與相應(yīng)的GABA和γ Glu-連接的二聚化配體 (3、4、7和8)相比，受HAS的影響較少。
[0211 ]總之，實(shí)施例5證明了本發(fā)明的化合物與PSD-95的Η)Ζ卜2結(jié)合。
[0212] 實(shí)施例6 :FA-連接的二聚化配體的疏水性
[0213] 具有對(duì)HSA最高親和性的化合物(3、7、11)也是最具疏水性的合成化合物，如通過 分析性RP-HPLC測(cè)定的保留時(shí)間(Rt)判斷(表2)。為了增加親水性并由此增加這些化合物的 溶解度，制備3和7的類似物，其中用IETDV(SEQ ID N0:4)而非IETAV(SEQ ID N0:3)替換肽 序列（13，15;表3)，這是因?yàn)橛葾sp(D)部分引入的額外電荷可以增加二聚體的親水性。也合 成了含有末端酸部分的最高HSA親和性化合物的IETDV類似物(4)并測(cè)試（14)用于比較。使 用適當(dāng)?shù)碾男蛄校↖ETDV)作為起始點(diǎn)與1-12類似地合成這些FA連接的二聚體(圖6)。
[0214] 相對(duì)于基于IETAV的化合物(3、4、7)而言，HPLC分析顯示對(duì)于基于IETDV的化合物 (13-15)的Rt值較小地減少或沒有減少，并且因此疏水性較小地降低或沒有降低;但是觀察 到HSA親和性系統(tǒng)地降低(表3)。例如，在分析性RP-HPLC上13比IETAV類似物早3分鐘洗脫出 (13:58111丨11，3:61111丨11，表3)，但是批厶親和性降低（13:& = 83.(^]\1，3:& = 4.84]\1，表3)。
[0215] 表3 :具有不同肽序列的FA-連接的二聚類似物的比較。3、4和7肽序列IETAV(SEQ ID N0:3);13、14和 15肽序列IETDV(SEQ ID N0:4)。
[0216]
[0218]總之，實(shí)施例6證明了 HSA親和性不僅依賴于選擇的脂肪酸，而且依賴于選擇的肽 序列。
[0219] 實(shí)施例7:化合物1、4、7和13的血漿穩(wěn)定性
[0220] 在改良版本的體外血漿穩(wěn)定性測(cè)定中評(píng)價(jià)1、4、7和13的血漿穩(wěn)定性(Bach等人， Angew. Chem，Int. Ed，2009，48，9685-9689)。在原始操作中，在人血漿中孵育研究的化合物。 然后在合適的時(shí)間點(diǎn)將樣品取出并通過用三氯乙酸(TCA)沉淀除去血清蛋白，然后通過RP- HPLC分析上清液。將獲得的峰面積標(biāo)準(zhǔn)化為To的量并擬合至一階衰減模型以計(jì)算半衰期。 當(dāng)將該方法應(yīng)用于FA-連接的二聚化配體時(shí)，樣品回收率低（〈5%)。這是由在TCA沉淀期間 除去作為HSA-結(jié)合的復(fù)合物的FA-連接的二聚化配體導(dǎo)致。因此，在TCA沉淀之前，進(jìn)行樣品 在固體鹽酸胍(GnHCl)中的溶解至6M最終濃度。其目的是呈現(xiàn)樣品中的HSA，由此釋放FA-連 接的二聚化配體。
[0221] 在體外血漿穩(wěn)定性測(cè)定中所有FA-連接的二聚化配體比UCCB01-125更穩(wěn)定（圖4)。 不受理論限制，預(yù)期這是由于化合物的更高HSA結(jié)合，由此降低了酶消化可得的游離化合物 濃度。含有較短C12:0FA的化合物（1)比高度穩(wěn)定的含有更長(zhǎng)C18:0或C17:0-C00H FA的化合 物降解更快(4、7、13)。延長(zhǎng)的穩(wěn)定性可解釋為增加的HSA親和性(其防止蛋白酶使基于二聚 肽的化合物分裂)以及經(jīng)FA介導(dǎo)的位阻。
[0222] 總之，實(shí)施例7證明了體外評(píng)價(jià)血漿穩(wěn)定性的方法，且與非FA-連接的參比化合物 相比，本發(fā)明的FA連接的二聚化合物具有增加的血漿穩(wěn)定性和半衰期。
[0223] 實(shí)施例8:體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究
[0224] 為了測(cè)定FA-連接的化合物的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，
【申請(qǐng)人】在雄性Wistar大鼠中單次 皮下（s.c.)推注后通過LC-MS/MS測(cè)量血液中所選化合物的濃度（圖5)。由此，顯而易見的是 所有FA-連接的二聚化配體與無 FA的二聚化配體(UCCB01-125)相比具有較長(zhǎng)的T1/2和更大 的Tmax(表4和圖5)。1的效果最小，但是4、7和13非常顯著，其顯示Τ1/2大于8小時(shí)，相當(dāng)于與 UCCB01-125相比>16-倍增加。增加的Tmax可解釋為由注射位點(diǎn)的延長(zhǎng)的吸收?？傊@些性 質(zhì)能夠通過皮下儲(chǔ)庫(kù)注射給藥并且由此緩慢和持續(xù)釋放化合物進(jìn)入血液，由此需要較少給 藥即可保持藥物相關(guān)血液濃度。
[0225] 表4:大鼠中皮下注射后FA-連接的二聚化配體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)
[0226]
[0227] a數(shù)據(jù)表示為平均值土 SEM，n = 3。
[0228] 實(shí)施例9:序列
[0229] SEQ ID N0:1
[0230] X4X3X2X1
[0231] 其中
[0232] X4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0233] X3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0234] Χ2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-厶、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0235] h為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0236] SEQ ID NO:2
[0237] Z4Z3Z2Z1
[0238] 其中
[0239] Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0240] Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0241] Z2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-八、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0242] Z!為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0243] SEQ ID NO:3
[0244] IETAV
[0245] SEQ ID NO :4
[0246] IETDV
[0247] SEQ ID NO :5
[0248] X5X4X3X2X1
[0249] 其中
[0250] X5為任意氨基酸殘基，
[0251] X4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0252] X3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0253] Χ2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-八、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0254] 心為選自I、L和V的氨基酸殘基。
[0255] SEQ ID NO:6
[0256] Z5Z4Z3Z2Z1
[0257] 其中
[0258] Z5為任意氨基酸殘基，
[0259] Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基，
[0260] Z3為選自S和T的氨基酸殘基，
[0261] Z2 為選自△、04、〇、15、￥、^]\^-厶、^]\^-〇、^]\^^-]\^^-]\^-^]\^-5和1 Me-V的氨基酸殘基，
[0262] &為選自I、L和V的氨基酸殘基。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 化合物，其包含第一肽(Pi)和第二肽(p2)，其中PdPP2各自包含至少兩個(gè)蛋白質(zhì)或非 蛋白質(zhì)氨基酸殘基，并且其中PdPP 2均通過其N-末端與第一接頭1^綴合，并且其中U包含聚 乙二醇(PEG)，其中所述PEG的至少一個(gè)氧原子被氮原子替換以得到NPEG，并且其中白蛋白 結(jié)合部分通過酰胺鍵或者通過任選的接頭L 2與NPEG的氮原子連接。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中所述化合物具有式(I)的一般結(jié)構(gòu)：α3. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述白蛋白結(jié)合部分是脂肪酸(FA)。4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物具有式(II)的一般結(jié)構(gòu)：5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述脂肪酸是飽和或不飽和脂肪酸。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中通過第二接頭。將所述脂肪酸與NPEG接 頭(U)的氮原子連接，其中L2包含氮原子。7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中第二接頭1^2包含一個(gè)或多個(gè)部分，其選自 γ -Glu、γ -丁酸(GABA)、5-氨基戊酸(5-Ava)、蛋白質(zhì)氨基酸、非蛋白質(zhì)氨基酸，和具有通式 H2N-[Q]-COOH的任何化合物，其中Q為任何合適的一個(gè)或多個(gè)原子。8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物具有式（III)或（IV)的一般 結(jié)構(gòu)：其中 Ri和R2各自選自Η和COOH， η為0-48的整數(shù)， m為1-48的整數(shù)， P為0-28的整數(shù)， q為0-28的整數(shù)， i為0-12的整數(shù)， j為0-12的整數(shù)， P!和P2各自選自肽，其包含至少兩個(gè)蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)氨基酸殘基。9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中p = q。10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中P>q。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中P〈q。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中p和q的總和是1-28的整數(shù)。13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的數(shù)目p選自0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28。14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的數(shù)目p為0-4。15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的數(shù)目q選自0、1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27 或 28 個(gè)乙二醇部 分。16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的數(shù)目q為0-4。17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的總數(shù)p+q為2-12。18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的總數(shù)p+q為4。 19 .根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中乙二醇部分的總數(shù)p+q為6。20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η為選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數(shù)。21. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η為1-3的整數(shù)。22. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η = 1。23. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η = 2。24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中η = 3。25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中m為選自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、 37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的整數(shù)。26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中m為10-16的整數(shù)。27. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中m= 10。28. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中m= 16。29. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述脂肪酸為(：4-&2脂肪酸。30. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述脂肪酸選自辛酸、癸酸、月桂酸、肉 豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、花生酸、山崳酸、二十四烷酸和蠟酸。31. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述脂肪酸選自肉豆蔻烯酸、棕櫚油 酸、十六碳烯酸、油酸、反油酸、異油酸、亞油酸、反式亞麻酸、亞麻酸、花生四烯酸、二十碳 五烯酸、芥酸和二十二碳六烯酸。32. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中 Pi包含氨基酸序列X4X3X2Xi(SEQ ID ΝΟ:1)，和 Ρ2包含氨基酸序列Z4Z3Z2ZKSEQ ID ΝΟ:2)， 其中 aWdP/SZi為選自I、L和V的氨基酸殘基， b)X2 和/或 Z2 為選自 N-Me-V的氨基酸殘基， c )X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基， d)X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基， 其中XjPZi均各自表示最終的包含游離羧酸的C-末端氨基酸殘基。33. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物具有式(V)或(VI)的一般結(jié) 構(gòu)：其中 Ri和R2各自選自Η和COOH， η為0-48的整數(shù)， m為1-48的整數(shù)，和 P為0-28的整數(shù)， q為0-28的整數(shù)， i為0-12的整數(shù)， j為0-12的整數(shù)， X5和/或Z5為任選氨基酸殘基、肽或多肽， X4和/或Z4為選自E、Q、A、N和S的氨基酸殘基， X3和/或Z3為選自S和T的氨基酸殘基， X2和/或Z2 為選自 A、D、E、Q、N、S、V、N-Me-A、N-Me-D、N-Me-E、N-Me-Q、N-Me-N、N-Me-S^PN-Me-V的氨基酸殘基， Χι和/或叾:為選自I、L和V的氨基酸殘基。34. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中X5為蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)氨基酸殘基。35. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中Χ5為選自I、A、L和V的氨基酸殘基。36. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中X5為肽或多肽，其具有由2-100個(gè)氨基酸 殘基組成的氨基酸序列，其中所述肽或多肽的C末端是選自I、A、L和V的氨基酸殘基。37. 根據(jù)權(quán)利要求2和3中任一項(xiàng)的化合物，其中X5為肽，其包含2至100個(gè)殘基，例如2至 90個(gè)氨基酸殘基，例如2至80個(gè)氨基酸殘基，例如2至70個(gè)氨基酸殘基，例如2至60個(gè)氨基酸 殘基，例如2至50個(gè)氨基酸殘基，例如2至40個(gè)氨基酸殘基，例如2至30個(gè)氨基酸殘基，例如2 至20個(gè)氨基酸殘基，例如2至10個(gè)氨基酸殘基，例如2至9個(gè)氨基酸殘基，例如2至8個(gè)氨基酸 殘基，例如2至7個(gè)氨基酸殘基，例如2至6個(gè)氨基酸殘基，例如2至5個(gè)氨基酸殘基，例如2至4 個(gè)氨基酸殘基，例如2至3個(gè)氨基酸殘基，其中C末端是選自I、A、L和V的氨基酸。38.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物選自：39.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物選自：40.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其中所述化合物選自：41. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其為所述化合物的藥用鹽或前藥形式。42. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的化合物，其用作藥物。43. 根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的化合物，其用于治療或預(yù)防疼痛。44. 根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的化合物，其用于治療或預(yù)防興奮性毒性相關(guān)疾病。45. 根據(jù)權(quán)利要求44的化合物，其中所述疾病為對(duì)CNS的缺血性或外傷性損傷/CNS中的 缺血性或外傷性損傷/CNS的缺血性或外傷性損傷。46. 制備根據(jù)權(quán)利要求1-41中任一項(xiàng)的化合物的方法，所述方法包括下列步驟： a) 制備Ns-NPEG二酸接頭， b) 使用基于Fmoc的固相肽合成來制備肽， c) 用Ns-NPEG二酸接頭使Fmoc-脫保護(hù)的肽二聚化， d) 任選通過中間體接頭，例如氨基酸接頭(L2)，使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶聯(lián)。47. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法（步驟a )，其中鄰硝基苯磺?；?Ns)-保護(hù)的NPEG接頭在固 相上或溶液中制備。48. 根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中固相操作通過如下進(jìn)行：用Fmoc-NH-PEG-CH2CH2⑶0H 裝載適合固相肽合成的固體載體，例如2-氯三苯甲基氯樹脂，所述操作使用有機(jī)溶劑例如 DCM、DMF、ACN或THF;和堿例如DI PEA、DBU、三甲基吡啶或NMM。49. 根據(jù)權(quán)利要求47-48中任一項(xiàng)的方法，其中Fmoc基團(tuán)通過堿例如哌啶、二甲基胺、嗎 啉、哌嗪、二環(huán)己基胺或DMAP在適當(dāng)溶劑例如DMF、DCM、ACN、THF中移去。50. 根據(jù)權(quán)利要求47-49中任一項(xiàng)的方法，其中使用合適的堿例如DIPEA和合適的溶劑 例如THF、DCM將鄰硝基苯磺酰氯與游離胺偶聯(lián)，由此獲得Ns-NH-PEG-CH 2CH2C00-樹脂。51. 根據(jù)權(quán)利要求47-50中任一項(xiàng)的方法，其中使用Mitsunobu化學(xué)將接頭產(chǎn)物的第二 部分與樹脂連接的接頭部分連接，且其中隨后用三苯基膦、H0-PEG_CH 2CH2C00tBu、溶劑和偶 氮二羧酸的酯或酰胺試劑例如偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD)、偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)或1， 1'-(偶氮二羰基)_二哌啶(ADDP)處理樹脂，隨后用酸例如三氟乙酸(TFA)處理樹脂，由此得 到最終的Ns-NPEG二酸接頭。52. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法(步驟a)，其中溶液相操作通過如下進(jìn)行：用Ns保護(hù)NH2-PEG-CH2CH 2COOtBu的氨基，然后使用三苯基膦和DIAD、DEAD或ADDP或類似試劑、H0-PEG-CH2CH 2COOtBu以及適當(dāng)溶劑(THF、DCM)進(jìn)行溶液中的Mi t sunobu化學(xué)，并用酸例如TFA處理， 由此得到Ns-保護(hù)的NPEG-接頭。53. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法(步驟b)，其中使用基于Fmoc的固相肽合成來合成肽，該合 成使用固體載體例如2-氯三苯甲基氯樹脂或Wang樹脂，F(xiàn)moc-保護(hù)的氨基酸，堿，偶聯(lián)試劑 例如ΗΒΤΙ^Ν,Ν,Υ-四甲基-0-(1Η-苯并三唑-1-基)脲鑰六氟磷酸鹽]、0-(7-氮雜苯并三 唑-1 -基）-N，N，YY -四甲基脲鑰六氟磷酸鹽[HATU]、PyBOB、DIC/HOBt，和溶劑;或者通過 使用Fmoc-保護(hù)的氨基酸的活化酯，例如五氟苯基酯、琥珀酰亞胺酯來合成肽。54. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法（步驟c)，其中用Ns-NPEG二酸接頭使用樹脂上二聚化方法 使Fmoc-脫保護(hù)的樹脂連接的肽二聚化，所述樹脂上二聚化方法包括用亞化學(xué)計(jì)量量例如 1/6的Ns-NPEG二酸接頭、堿、偶聯(lián)試劑和適當(dāng)溶劑例如DMF、DCM或者THF反復(fù)處理樹脂;或者 通過使用Ns-NPEG接頭的活化酯例如五氟苯基酯或琥珀酰亞胺酯。55. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法（步驟c)，其中所述二聚化方法在溶液中進(jìn)行，其使用Ns-NPEG接頭的活化酯例如五氟苯基酯或琥珀酰亞胺酯以及1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAt)或 羥基苯并三唑(HOBt)和適當(dāng)?shù)膫?cè)鏈保護(hù)肽例如叔丁基;在溶劑例如ACN、DMF、DCM或THF中。56. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法（步驟c)，其中所述二聚化方法在溶液中進(jìn)行，其使用Ns-NPEG二酸接頭、偶聯(lián)試劑(例如HBTU、HATU等）、堿和溶劑。57. 根據(jù)權(quán)利要求54-56中任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟:通過硫醇例如巰基 乙醇和1，8-二氮雜二環(huán)[5.4.0]^碳-7-烯(DBU)或者通過苯硫酚鈉移去Ns-基團(tuán)。58. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法(步驟d)，其還包括使用偶聯(lián)試劑和活化用堿或者使用活化 酯使脂肪酸與接頭-二聚體綴合物偶聯(lián)。59. 根據(jù)權(quán)利要求46的方法(步驟d)，其還包括使氨基酸接頭與NPEG-二聚的且樹脂結(jié) 合的肽的游離氮偶聯(lián)，其通過連續(xù)偶聯(lián)Fmoc-保護(hù)的接頭例如Fmoc-Glu-〇tBu、Fmoc-GABA或 Fmoc-5-Ava-OH進(jìn)行;通過使用偶聯(lián)試劑和活化用堿或者通過Fmoc-保護(hù)的氨基酸接頭的活 化酯進(jìn)行。60. 根據(jù)權(quán)利要求58-59中任一項(xiàng)的方法，其中脂肪酸的羧基任選作為酯例如甲酯保 護(hù)。61. 根據(jù)權(quán)利要求46-60中任一項(xiàng)的方法，其中任選從樹脂切割脂肪酸連接的二聚化配 體，使用伴隨的通過酸例如TFA或HC1進(jìn)行的側(cè)鏈脫保護(hù)。62. 根據(jù)權(quán)利要求46-61中任一項(xiàng)的方法，其中酯保護(hù)基團(tuán)通過如下移去：在含水堿例 如NaOH或LiOH中攪拌切割的產(chǎn)物;然后使用TFA或HC1酸化。63. 根據(jù)權(quán)利要求46-62中任一項(xiàng)的方法，其中通過凍干和使用色譜方法的純化獲得最 終產(chǎn)物。64. 根據(jù)權(quán)利要求63的方法，其中使用HPLC進(jìn)行純化。
【文檔編號(hào)】A61K38/17GK105828832SQ201480065303
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2014年11月26日
【發(fā)明人】K·斯特羅姆加德, A·巴赫, K·B·尼森
【申請(qǐng)人】哥本哈根大學(xué)