一種抗缺氧藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗缺氧藥物組合物，其特征在于該組合物的活性成分由化合物I和化合物II組成，該組合物中化合物I和化合物II的質(zhì)量百分數(shù)分別為70％和30％，所述化合物I為Clathridine A，化合物II為Naamidine G，本發(fā)明通過整體及細胞水平缺氧模型，觀察藥物組合物的抗缺氧作用，結(jié)果表明藥物組合物可顯著提高窒息性缺氧和急性減壓缺氧小鼠的存活率和存活時間，減輕藥物特異性缺氧小鼠的心肌損傷，對體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞和神經(jīng)細胞缺氧損傷亦具有顯著的保護作用，提供了藥物組合物在制備抗缺氧藥物中的用途。
【專利說明】
一種抗缺氧藥物組合物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種化合物組合物的新用途，尤其涉及一種抗缺氧藥物組合物及其制 備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 氧是人類及許多生物賴以生存的重要條件。低氧(Hypoxia)是指機體生命活動所 需的氧不能得到充足的供給。氧和低氧是生命活動最重要的關(guān)鍵因素，是生命科學(xué)基本理 論的重要課題。低氧的形成可分為三類:第一類是外界環(huán)境氧含量降低，使正常生理活動過 程不能攝取足夠氧，如高原和航空缺氧;第二類是指因疾病等導(dǎo)致外界正常氧量不能充分 到達機體內(nèi)，造成心、腦和呼吸系統(tǒng)等的缺氧;第三類是機體活動所需氧消耗量，超過了生 理動員能力，造成相對氧供給不足，常見于劇烈運動和超限量勞動。長期低氧是危害人體健 康的重要隱患，嚴重者可危及生命。因此，低氧造成心、腦和呼吸系統(tǒng)等損傷已成為21世紀 醫(yī)學(xué)界急待解決的主要問題之一。
[0003]本發(fā)明涉及的化合物Clathridine A和Naamidine G是2012年發(fā)表(Jayanta Das, et al.，Total Syntheses of Kealiinines A-C.Org Lett·，14(24)6210-6213.)的新化合 物，這兩種化合物擁有全新的骨架類型，對于本發(fā)明涉及的化合物組合物在制備抗缺氧藥 物中的用途屬于首次公開，由于屬于全新的結(jié)構(gòu)類型，而且其對于抗缺氧活性強得意想不 到，不存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實質(zhì)性特點，同時用于抗缺氧顯 然具有顯著的進步。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于發(fā)現(xiàn)了Clathridine A和Naamidine G的組 合物具有顯著的抗缺氧作用，可用于防治缺氧損傷疾病，從而增加了Clathridine A和 Naamidine G的組合物的應(yīng)用領(lǐng)域。
[0005] -種抗缺氧藥物組合物，該組合物的活性成分由化合物I和化合物II組成，該組合 物中化合物I和化合物Π 的質(zhì)量百分數(shù)分別為70%和30%，所述化合物I為Clathridine A， 結(jié)構(gòu)如式(I)所示，所述化合物Π 為Naamidine G，結(jié)構(gòu)如式(II)所示：
[0007] 所述抗缺氧藥物組合物，制備方法為將化合物I的粉末和化合物II的粉末按照質(zhì) 量百分數(shù)分別為70 %和30 %充分混合，添加輔料。制成制劑。
[0008] 所述抗缺氧藥物組合物，缺氧指心肌細胞缺氧。
[0009] 所述抗缺氧藥物組合物在制備氧藥物中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明涉及的Clathridine A和Naamidine G的組合物在制備抗缺氧藥物中的用 途屬于首次公開，由于骨架類型屬于全新的骨架類型，而且其抗缺氧活性強得意想不到，不 存在由其他化合物給出任何啟示的可能，具備突出的實質(zhì)性特點，同時用于抗缺氧顯然具 有顯著的進步。
【具體實施方式】
[0011] 本發(fā)明所涉及化合物Clathridine A和Naamidine G的組合物的制備方法參見文 南犬(Jayanta Das，et al.,Total Syntheses of Kealiinines A-C.Org Lett·2012，14(24) 6210-6213.)〇
[0012] 以下通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的保護范圍不受具體實 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
[0013] 實施例1:本發(fā)明所涉及化合物組合物片劑的制備：
[0014] 取7克化合物Clathridine A和3克化合物Naamidine G，加入糊精190克，混勻，常 規(guī)壓片機制成1000片。
[0015] 實施例2:本發(fā)明所涉及化合物組合物膠囊劑的制備：
[0016] 取7克化合物Clathridine A和3克化合物Naamidine G，加入淀粉190克，混勻，裝 膠囊制成1000粒。
[0017] 下面通過藥效學(xué)實驗來進一步說明其藥物活性。
[0018] 實驗例1:小鼠特異性心肌缺氧實驗
[0019] 1、方法：75只昆明小鼠，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重（20 ± 2)g。隨機分為7 組，灌胃給藥。前2組給予0.3%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液，后3組分別給予實施例1方法 制備的本發(fā)明組合物〇.〇 15、0.03g · Kg<、單獨化合物I制備的對照品，單獨化合物II制備的 對照品，鹽酸普萘洛爾0.03g ?Kg'SOmin后，除第1組外，均腹腔注射異丙腎上腺素（ISO) 15mg · Kg'15min后，將小鼠放入常壓缺氧裝置中，記錄小鼠死亡時間及耗氧量。
[0020] 2、結(jié)果：
[0021] 異丙腎上腺素可通過興奮心臟β受體，使心肌耗氧量增加。本實驗顯示，與溶媒對 照組相比，實施例1制備的本發(fā)明組合物0.015、0.(^*￥ 1能顯著對抗異丙腎上腺素（150) 導(dǎo)致的心肌耗氧量增加(Ρ〈〇. 01)，同時延長小鼠缺氧密閉狀態(tài)下的存活時間（Ρ〈〇. 01)，結(jié) 果見表1。
[0022] 表1本發(fā)明組合物對異丙腎上腺素致特異性缺氧小鼠的影響(X土s，n = 15)
[0023]
[0024] 與對照組比較，*P〈0 · 01，與異丙腎上腺素組比較，#P〈0 · 01
[0025] 實驗例2:小鼠常壓室息性缺氧實驗
[0026] 1、方法：
[0027] 60只昆明小鼠，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重(20±2)g。隨機分為6組，灌胃給 藥。第1組給予0.3%羧甲基纖維素鈉(01(：-似)溶液，第2組給予鹽酸普萘洛爾0.038·!^^1， pro組。第3、4組分別給予含實施例1方法制備的本發(fā)明組合物的CMC-Na溶液，濃度分別為 0.015、0.03g· Kg<。第5、6組分別給予單獨化合物I制備的對照品，單獨化合物II制備的對 照品，濃度分別為0.02、0.01 g · Kg'給藥50min后，置于廣口瓶中并蓋緊瓶塞(瓶內(nèi)放置5g 鈉石灰）。以呼吸停止為標志，記錄小鼠存活時間。
[0028] 2、結(jié)果：
[0029] 與溶媒對照組相比，實施例1方法制備的本發(fā)明組合物0.015、0.038*1^1使小鼠 在常壓密閉條件下的存活時間分別延長了 28.12%和40.14%，差異具有顯著性(P〈0.01，P〈 0.05)，而單獨化合物I制備的對照品，單獨化合物II制備的對照品使小鼠在常壓密閉條件 下的存活時間分別延長了 11.52 %和12.64 %。
[0030] 實驗三小鼠減壓缺氧實驗
[0031] 1、方法：
[0032] 60只昆明小鼠，南京醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，體重(20±2)g。隨機分為6組，灌胃給 藥。給藥組給予實施例1方法制備的本發(fā)明組合物，濃度分別為0.015、0.03g · Kg<，含實施 例1方法制備的本發(fā)明組合物的CMC-Na溶液，濃度分別為0.015、0.03g · Kg'空白對照組給 予0.3%CMC-Na溶液，灌胃體積均為2ml · Kg"1。單獨化合物I制備的對照品，單獨化合物II制 備的對照品，濃度分別為0.02、0.0 lg · Kg<，50min后，給藥組和對照組各取5只，放入減壓裝 置中，在26.7Kpa(相當(dāng)于海拔約10000m)時停止減壓，保持此壓力不變，待動物死亡50%時， 立即停止減壓，緩緩放入空氣，取出動物，記錄各組死亡及存活數(shù)目，重復(fù)操作至實驗完成。
[0033] 2、結(jié)果：
[0034]含實施例1方法制備的本發(fā)明組合物0.015、0.03(^*1^4使小鼠在減壓缺氧條件 下的存活率由對照組的30%、20%提高至80%、90%，差異具有顯著性(P〈0.05)。單獨化合 物I制備的對照品，單獨化合物II制備的對照品使小鼠在減壓缺氧條件下的存活率由對照 組的30%、20%提高至20%、30%。
[0035] 實驗四對心肌細胞缺氧損傷的保護作用
[0036] 1、方法：
[0037] (1)大鼠原代心肌細胞培養(yǎng):新生l-3d的SD乳鼠取心室肌剪成約1mm 3大小組織 塊，加入0.25%胰蛋白酶-0.02 %EDTA，與37°C下消化。除首次消化上清液棄去外，收集各次 上清液中止消化，離心收集心肌細胞沉淀，加入含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基和Brdu (終濃度0. lmmol/L)，輕輕吹打混勻，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，于37°C、5%⑶2培養(yǎng) 箱中孵育70min，使絕大部分非心肌細胞貼壁。
[0038] 吸取瓶內(nèi)細胞懸液計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1 X 105個/ml，接種到24孔板，每孔lml; 96孔板，每孔200ul。48h細胞貼壁后，更換含10 %胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基(不含Brdu)， 以后每2天換液1次。
[0039] (2)心肌細胞缺氧模型建立:取培養(yǎng)4d的心肌細胞，換無血清DMEM/F-12培養(yǎng)基連 續(xù)培養(yǎng)12h后，用無糖D-Hanks液(預(yù)先充入95%N2-5%⑶2混合氣飽和30min)替代正常培養(yǎng) 基，而后迅速將培養(yǎng)板移入通有95%N2-5%C02混合氣的缺氧裝置中，用測氧儀檢測排氣口 氧濃度(〈1 % )，37 °C缺氧培養(yǎng)6h。
[0040] (3)實驗分組:實驗設(shè)空白對照組、缺氧模型組、缺氧+實施例1制備的本發(fā)明組合 物A組(濃度0.024mg/ml)、B組(濃度0.012mg/ml)、C組(濃度0.006mg/ml)，共5組，每組6孔。 除空白對照組外，其他各組均缺氧處理6h，正常對照組則于37°C、5%⑶ 2培養(yǎng)箱中同步孵育 6h〇
[0041] (4)缺氧損傷心肌細胞MTT實驗：取出各組樣本，每孔加入20ul MTT(5g/L)，于37 °C、5 %⑶艄箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，倒板。加入150ul DMS0振搖15min，使結(jié)晶充分溶 解，于測定波長570nm、參考波長630nm處，測定各孔吸光度(0D)值。
[0042] MTT代謝率（％ )=實驗組0D值/正常對照組0D值X 100%
[0043] (5)生化指標檢測:取培養(yǎng)于24孔板的各組細胞培養(yǎng)上清液，用比色法測定LDH、CK 活性，用黃嘌呤氧化酶法測定細胞內(nèi)SOD活性;用硫代巴比妥酸比色法測定細胞內(nèi)MDA含量， 具體檢測過程及操作方法按試劑盒說明書進行。
[0044] 2、結(jié)果：
[0045] 當(dāng)心肌細胞因缺氧受到損傷時，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈受損，電子傳遞阻 斷，ATP產(chǎn)生減少。琥珀酸脫氫酶是琥珀酸氧化呼吸鏈里重要的復(fù)合酶之一，可催化琥珀酸 脫氫生成延胡索酸，從而使FAD接受兩個氫原子生成FADH 2,然后再將氫傳遞給CoQ，生成 CoQH2,繼續(xù)呼吸鏈的電子傳遞過程。所以，琥珀酸脫氫酶的活性，可以反映心肌細胞缺氧損 傷的程度。MTT實驗原理，就是利用琥珀酸脫氫酶可以催化噻唑蘭(MTT)生成紫紅色不溶性 有色產(chǎn)物的特性，通過吸光度的測定來反映各組的細胞活性。本實驗結(jié)果顯示:濃度分別為 0.024mg/ml、0.012mg/ml、0.006mg/ml實施例1制備的本發(fā)明組合物，MTT測得0D值顯著高于 模型組，表明均可顯著增加細胞活性(P〈〇.01)，說明實施例1制備的本發(fā)明組合物能對抗缺 氧對心肌細胞琥珀酸脫氫酶活性的損害，維持缺氧損害細胞的呼吸功能;缺氧導(dǎo)致細胞膜 損傷時，細胞內(nèi)LDH、CK將外漏，導(dǎo)致培養(yǎng)基中LDH、CK活性升高，本試驗顯示3個劑量組與模 型組相比培養(yǎng)基中LDH、CK活性均明顯降低，表明實施例1制備的本發(fā)明組合物可在急性缺 氧條件下，保持心肌細胞膜的完整性，上述結(jié)果見表2。
[0046] S0D反映了細胞清除自由基的能力，MDA反映了細胞膜脂質(zhì)過氧化損害程度，本試 驗的3個劑量組與模型組相比細胞內(nèi)S0D活性升高，MDA水平產(chǎn)生下降，見表3,表明實施例1 制備的本發(fā)明組合物可通過增強心肌細胞清除自由基的能力對抗缺氧導(dǎo)致的細胞膜氧化 損傷。
[0047] 表2本發(fā)明組合物對缺氧心肌細胞LDH、CK外漏量的影響(X 土 s，η = 6)
[0048]
[0049] 與模型組比較，#Ρ〈〇 · 01，*Ρ〈〇 · 05
[0050] 表3本發(fā)明組合物對缺氧心肌細胞活力、SOD活性和MDA含量的影響(χ 土 s，η = 8)
[0051]
[0052] 與模型組比較，林P〈0 · 01，*P〈0 · 05
[0053] 結(jié)論:實施例1制備的本發(fā)明組合物可顯著提高室息性缺氧和急性減壓缺氧小鼠 的存活率和存活時間，減輕藥物特異性缺氧小鼠的心肌損傷，對體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞 和神經(jīng)細胞缺氧損傷亦具有顯著的保護作用，提供了實施例1制備的本發(fā)明組合物在制備 抗缺氧藥物中的用途。
【主權(quán)項】
1. 一種抗缺氧藥物組合物，其特征在于該組合物的活性成分由化合物I和化合物II組 成，該組合物中化合物I和化合物II的質(zhì)量百分數(shù)分別為70%和30%，所述化合物I的結(jié)構(gòu) 如式(I)所示，所述化合物II的結(jié)構(gòu)如式(II)所示：2. 如權(quán)利要求1所述抗缺氧藥物組合物，其特征在于：制備方法為將化合物I的粉末和 化合物II的粉末按照質(zhì)量百分數(shù)分別為70 %和30 %充分混合，添加輔料，制成制劑。3. 如權(quán)利要求1所述抗缺氧藥物組合物，其特征在于:缺氧指屯、肌細胞缺氧。4. 如權(quán)利要求1所述抗缺氧藥物組合物在抗缺氧藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P9/00GK105832725SQ201610247989
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年4月19日
【發(fā)明人】馬蘇州
【申請人】馬蘇州