抗豬圓環(huán)病毒2型的疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種包含豬圓環(huán)病毒2型的非復(fù)制性免疫原的疫苗，用于預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒2型循環(huán)抗體的動物，通過施用單劑量的疫苗到動物真皮內(nèi)而對抗致病性豬圓環(huán)病毒2型的感染。
【專利說明】抗豬圓環(huán)病毒2型的疫苗 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及抗豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)的疫苗以及使用該疫苗保護動物對抗這種 感染的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] PCV-2是與在幼豬中觀察到的斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)相關(guān)聯(lián)的。這種疾 病于1991年在加拿大第一次出現(xiàn)。臨床癥狀和病理發(fā)表于1996年，包括漸進性消瘦，呼吸困 難，呼吸急促，以及偶爾黃疸(icterus)和黃疸(jaundice)。
[0003] Nayar等人，Can.Vet.J.Volum 38，1997年6月檢測了在具有?]\^臨床癥狀的豬內(nèi) 的豬圓環(huán)病毒并且得出結(jié)論，除了已知PCV公認作為PK-15細胞的天然居住者之外，PCV還可 能與PMWS相關(guān)。后期的出版物(Hamel等人，J.Virol.，72(6) ,5262-5267,1998;Meehan等人， J.gen.Virol.，79,2171-2179，1998)證實了這些結(jié)果，并且提出了（16611&11等人，同上）新的 致病性PCV作為PCV-2,而原始的PK-15細胞培養(yǎng)物分離物(Tischer等人，Nature 295,64-66，1982年），應(yīng)該稱為PCV-l。PCV-2是一個含有環(huán)狀單鏈DNA基因組的小的（17-22nm)二十 面體無包膜病毒。該PCV-2基因組的長度是約1768堿基對。源自世界不同地區(qū)的PCV-2分離 株似乎是彼此密切相關(guān)的并且顯示出95%至99%的核苷酸序列同一性（Fenaux等人， J.Clin.Micorbiol.，38(7) ,2494-2503，2000年hPCV的0RF-2編碼了病毒的衣殼蛋白。PCV2 的0RF 2編碼了233個氨基酸的蛋白質(zhì)。所有PCV-2分離株的0RF 2共享91-100%的核苷酸序 列同一性和90 % -100 %推導(dǎo)的氨基酸序列同一性。
[0004] 預(yù)防性治療動物，尤其是豬，的傳統(tǒng)疫苗抗致病性豬圓環(huán)病毒2型的感染，可能是 基于整個PCV-2病毒作為(非復(fù)制性)免疫原。然而，在PCV-2的情況下，事情是復(fù)雜的，通過 PCV-2在細胞培養(yǎng)中不能復(fù)制成高滴度的事實。從實際(經(jīng)濟)的觀點而言，基于全病毒作為 免疫原的疫苗因此是不太理想的。在現(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)表明，0RF2編碼的衣殼蛋白（即使當 重組表達時)適合作為豬圓環(huán)病毒2型的亞單位免疫原，以用于在適宜的疫苗中使用?？梢?理解的是，因為這個亞單位，在循環(huán)系統(tǒng)中，顯示出與病毒本身相同的方式，基本上不同的 事實在于，DNA和非結(jié)構(gòu)蛋白不存在于衣殼內(nèi)。
[0005] 抗PCV2的幾種疫苗是本領(lǐng)域中已知的和市售的。
[0006] p〇rcilis㊣PCV(購自MSD Animal Health，Boxmeer，The Netherlands)是一種抗豬 圓環(huán)病毒2型的用于豬防護的疫苗，用于從三周和更大的豬中使用。當作為兩次注射(雙劑 量)疫苗施用時，免疫期(D0I)為22周，幾乎完全覆蓋豬的育肥期。該疫苗可能導(dǎo)致高熱和其 它全身反應(yīng)。
[0007] IngelvacCicroFlex? (購自 Boehringer Ingelheim，Ingelheim)是一種抗豬圓環(huán) 病毒2型的用于豬防護的疫苗，用于在從兩周和更大的豬中使用。當作為單次注射(單劑量） 疫苗施用時，免疫期為17周。該疫苗可能導(dǎo)致高熱和極少發(fā)生的過敏性反應(yīng)。(:ircovac?(購 自梅里亞，法國里昂）是一種抗豬圓環(huán)病毒2型的用于豬防護的疫苗，用于在從三周和更大 的豬中使用。當作為兩次注射施用疫苗時，免疫期僅為14周。該疫苗可能導(dǎo)致高熱和其它全 身反應(yīng)，如減少的食物攝入。
[0008] Suvaxyn?PCV(購自Zoeitis，Capelle a/d IJssel，荷蘭）是一種抗豬圓環(huán)病毒2 型的用于豬防護的疫苗，用于在從三周和更大的豬中使用。當作為單次注射疫苗施用時，免 疫期為19周。該疫苗可能導(dǎo)致高熱和其它全身反應(yīng)，如嘔吐。
[0009] 其他疫苗是例如被描述于W02007/028823，W02007/094893和W02008/076915中。它 們中沒有顯示出比作為已知的來自市售疫苗更長的免疫期。
[0010] 本發(fā)明的目的
[0011] 本發(fā)明的目的是提供一種疫苗，其可以提供至少與現(xiàn)有疫苗長度相當?shù)目怪虏⌒?豬圓環(huán)病毒2型感染的免疫期，即使當動物在接種疫苗時已經(jīng)具有針對豬圓環(huán)病毒2型的循 環(huán)抗體，所述疫苗同時是使用方便和對動物安全的，尤其是誘導(dǎo)很少或沒有全身性的副作 用，如高熱。
[0012] 發(fā)明概述
[0013] 為了滿足本發(fā)明的目的，已經(jīng)設(shè)計了新的疫苗，所述疫苗包括豬圓環(huán)病毒2型的非 復(fù)制性的免疫原，特別是豬圓環(huán)病毒2型的重組表達的0RF2蛋白，其用于預(yù)防性治療動物， 所述動物具有針對豬圓環(huán)病毒2型的循環(huán)抗體，特別是母體來源的抗體，通過施用單劑量的 疫苗施用至動物的真皮內(nèi)，對抗致病性豬圓環(huán)病毒2型的感染。
[0014] 令人驚奇的是，發(fā)現(xiàn)當僅用一個劑量的含有豬圓環(huán)病毒2型的非復(fù)制性免疫原疫 苗接種到動物真皮內(nèi)時，可以得到抗致病性豬圓環(huán)病毒2型感染的23周的一個很長的免疫 期，即使當動物具有抗豬圓環(huán)病毒2型的中等到高的循環(huán)抗體，而沒有任何或幾乎沒有任何 全身性副作用。以這種方式，可以獲得甚至是基本上長于任何現(xiàn)有的一個劑量疫苗的免疫 期。這是特別令人驚訝的，因為發(fā)現(xiàn)這些抗體可能是母體來源的抗體。
[0015] 本發(fā)明還提供預(yù)防性治療具有針對致病性豬圓環(huán)病毒2型的循環(huán)抗體的動物的方 法，所述方法通過單劑量的包括豬圓環(huán)病毒的非復(fù)制性免疫原的疫苗施用到動物真皮內(nèi)而 對抗致病性豬圓環(huán)病毒2型的感染，所述非復(fù)制性免疫原特別是豬圓環(huán)病毒2型的重組表達 的0RF2蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的其它方法是：其中額外包含豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae)非活性免疫原的疫苗治療動物而對抗致病性豬肺炎支原體細菌的感染的 方法;和其中額外包含胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis)非活性免疫原的疫苗治療 動物而對抗致病性胞內(nèi)勞森菌細菌的感染的另一種方法;預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒 2型循環(huán)抗體的動物來抗豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體感染的方法，其中所述方法包括給 動物施用單劑量的包含豬圓環(huán)病毒2型非復(fù)制性免疫原(特別是豬圓環(huán)病毒2型的重組表達 的0RF2蛋白質(zhì)）的疫苗到真皮內(nèi)，并且給動物同時施用單劑量的包含豬肺炎支原體的非活 性免疫原的疫苗到真皮內(nèi)；和一種方法，預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒2型循環(huán)抗體的動 物來抗豬圓環(huán)病毒2型和胞內(nèi)勞森菌感染，其中所述方法包括給動物施用單劑量的包含豬 圓環(huán)病毒2型非復(fù)制性免疫原(特別是豬圓環(huán)病毒2型的重組表達的0RF2蛋白質(zhì)）的疫苗到 真皮內(nèi)，并且給動物同時施用單劑量的包含胞內(nèi)勞森菌非活性免疫原的疫苗到真皮內(nèi)。
[0016] 注意到Opriessnig等人，在獸醫(yī)微生物（Veterinary Microbiology) 131 (2008) 103-114,報道了關(guān)于旨在建立是否在皮內(nèi)和肌內(nèi)PCV2接種之間存在差異的研究方案。由 Opriessnig得出的結(jié)論是"沒有發(fā)現(xiàn)疫苗施用在皮內(nèi)和肌內(nèi)途徑之間的差異"。鑒于這個文 獻的情況，看起來更加令人驚奇的是
【申請人】發(fā)現(xiàn)在皮內(nèi)和肌內(nèi)接種之間的顯著差異，特別 是顯著不同的抗體應(yīng)答。考慮到本發(fā)明現(xiàn)有的知識，對于該事實的一個可能解釋是 Opriessnig沒有發(fā)現(xiàn)任何差異可能是，在不知道的情況下，這兩個疫苗被簡單地肌內(nèi)應(yīng)用。 這可以被理解如下：<^146 8811丨8使用了脈沖2501￥無針注射系統(tǒng)（？11186如6(116?^6 Systems Inc. Lenexa，KS，USA)以應(yīng)用疫苗。該裝置，雖然是無針的，沒有被特別的配置用于 皮內(nèi)應(yīng)用。該系統(tǒng)的生產(chǎn)商在這個裝置的小冊子上表示(參見http://www.pulse-nfs.com/ pdfs/250 swine.pdf)，該裝置已經(jīng)被設(shè)計"通過皮膚和進入肌肉組織"而施用。通過 Opriessnig使用的注射體積，即2毫升，是相當高的并且典型的用于肌內(nèi)接種。世界衛(wèi)生組 織在其2009年8月27日被稱為"疫苗的皮內(nèi)遞送;在低收入和中等收入國家中應(yīng)用的文獻回 顧和發(fā)展?jié)摿Γ↖ntradermal Delivery of Vaccines;A review of literature and the potential for development for use in low-and middle-income countries)''的論文 中也指出"無針"疫苗接種不一定意味著"皮內(nèi)"接種(見表1，回顧第3頁）。僅當無針裝置被 "配置用于皮內(nèi)接種"時，那么疫苗可能確實被遞送到真皮層。否則它可能會被遞送到皮下 或肌肉。所以考慮到Opriessnig使用未特別配置用于皮內(nèi)接種的裝置，她使用了一個大注 射體積以及更重要的是，她沒有發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)接種和肌內(nèi)接種之間的差異，而本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了 顯著性差異(特別是關(guān)于IgM滴度），只能推斷Opriessnig簡單地把在她的論文中所報告的 "皮內(nèi)遞送"的疫苗應(yīng)用到了動物的肌肉內(nèi)。
[0017] 還注意到最近報道母體來源抗體(MDA)對接種效力的影響還沒有被很好地研究， 雖然整體的影響被認為是次要的（見APVS Vietnam，23-25 2013年9月；Brad Tacker等人： 豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎支原體的母體來源抗體的實驗室診斷（Diagnostic Laboratory Survey of Porcine Circovirus Type 2and Mycoplasma Hyopneumoniae Maternally derived Antibodies))。盡管如此，在同一時間有報道說當在中等至高抗體水平的情況下 接種時，使用兩次接種以確保母體來源的抗體對PCV2疫苗效力沒有影響。
[0018] W0 2008/076915(Fachinger等人）描述了使用CircoFLEX?的以獲得抗豬圓環(huán)病 毒2型的活性免疫的單劑量PCV2疫苗方式，其中所述疫苗是通過肌肉內(nèi)施用的。所獲得的免 疫是在接種9周后進行測試的。W0 2009/126356(R〇〇f等人)描述了使用CircoFLEX?的單 劑量PCV2疫苗方式，其中所述疫苗是通過肌內(nèi)施用的。該疫苗在MDA陰性動物中施用并且在 接種4個半星期后進行攻擊。
[0019] WO 2005/009462(Parisot等人）中描述了基于滅活PCV2病毒的幾種抗PCV2的接種 方式。首先是，在MDA陰性動物中單次注射的IM接種方式(實施例5)。其中所述疫苗是在MDA 陰性動物中肌內(nèi)施用并且在接種5周后進行攻擊的兩次注射的PCV2接種方式(實施例6)。具 有循環(huán)抗體的母豬中單次注射Μ接種方式，導(dǎo)致仔豬受到保護對抗PCV2 (例7)。沒有公開包 含重組表達0RF2蛋白質(zhì)的疫苗用于在具有抗PCV2循環(huán)抗體(特別是母體來源的抗體）的動 物中通過皮內(nèi)施用單次注射施用的方式。更何況，根本沒有預(yù)期這可能會導(dǎo)致一個很長的 免疫期。雖然幾個無針施用裝置在第19頁上提及，這不表示它們可以被用于皮內(nèi)施用。如通 常已知的，例如，所提到的Bio jector被設(shè)計特別用于頂和SC施用。
[0020] W0 00/01409實施例17中提到包含滅活PCV2病毒的疫苗的制備，其可以是通過皮 內(nèi)途徑而施用的。然而該文獻未能顯示包含重組表達0RF2蛋白質(zhì)的疫苗用于通過皮內(nèi)施用 用于在具有抗PCV2循環(huán)抗體(特別是母體來源的抗體)的動物中單次注射施用方式。
[0021] Gamage在疫苗(Vaccine)27(2009年)6595-6604中提到用顯示PVC衣殼蛋白的噬菌 體接種豬血清三次能夠中和PCV2病毒。在Gamage中沒有顯示出在第一次接種后有保護性反 應(yīng)，從Gamage中也不清楚所使用的注射槍是否確實能夠皮內(nèi)施用。如關(guān)于Opriessnig如上 所示，在本領(lǐng)域中經(jīng)常宣稱無針槍注入到真皮內(nèi)，但是只有少數(shù)注射器能夠?qū)嶋H遞送疫苗 到真皮內(nèi)。
[0022] EP 1958644中提到本發(fā)明的特征作為其整個說明書中分離的特征，但是沒有表現(xiàn) 出本發(fā)明所有特征的組合。
[0023] 定義
[0024] 病毒的非復(fù)制性免疫原是對應(yīng)于病毒的任何物質(zhì)或化合物，不同于作為整體的復(fù) 制性（"活的"）病毒，針對其引發(fā)免疫應(yīng)答，使得相應(yīng)的強毒病毒或其一種或多種毒力因子 將被宿主的免疫系統(tǒng)識別作為免疫應(yīng)答的結(jié)果，并且最終被中和。非復(fù)制性免疫原的典型 實例是滅活的全病毒和這些病毒的亞單位，如衣殼和表面表達蛋白，例如重組表達的。含有 病毒的非復(fù)制性免疫原的疫苗不僅是不同于"活"病毒疫苗的，也不同于DNA疫苗，其中所述 DNA不是免疫原本身，但是摻入到宿主細胞中后表達相應(yīng)免疫原。
[0025] 抗病毒感染的預(yù)防性治療是旨在預(yù)防或改善由致病性病毒攻擊處理后所產(chǎn)生的 感染，特別是減少在這樣的攻擊后宿主的病毒載量。
[0026] 對由病毒感染所產(chǎn)生疾病的預(yù)防性治療是旨在預(yù)防或改善由該病毒感染處理后 所產(chǎn)生的一種或多種臨床表現(xiàn)。
[0027] 疫苗施用到真皮內(nèi)意味著足夠量的疫苗沉積于真皮內(nèi)，導(dǎo)致與用相同的疫苗和體 積的肌內(nèi)施用的免疫應(yīng)答顯著不同(特別是：當在設(shè)置如在實施例3中所概述的測試中使用 Wilcoxon秩和檢驗時，p值應(yīng)小于0.10,優(yōu)選小于0.05)。幾個裝置是可以商購用于皮內(nèi)注射 的，例如，在 Vaccine，2012年1月11 日；30 (3) :523-38中描述的 IDAL? vaccinator (MSD Animal Health)，Pulse 50 MicroDose(脈沖無針系統(tǒng)（Pulse Needle Free Systems))或 其他裝置(具體見表1，第525頁："用于液體和固體制劑施用的不同裝置概述(An overview of different devices for liquid and solid formulation administration)''）。
[0028] 在預(yù)防性治療中應(yīng)用的疫苗的單劑量施用意味著為了獲得保護性免疫，接種并不 需要第二次施用加強。在一個兩次注射方案中，第一(初始的）疫苗免疫典型是從第一次施 用6周內(nèi)加強的，通常是從第一次施用3周內(nèi)或甚至2周內(nèi)，而只有在第二(加強)施用后可能 獲得保護性免疫。
[0029]發(fā)明的實施方案
[0030] 在一個實施方案中，單劑量施用包括小于0.5毫升的疫苗，優(yōu)選0.2毫升的疫苗。低 于0.5毫升的劑量似乎是適合于皮內(nèi)接種的。在如此低的劑量真皮保持至少到足夠程度的 完整并且可以用于接受疫苗，而在一個相當高的劑量，真皮有破裂的風(fēng)險，導(dǎo)致真皮不可用 于接受疫苗的風(fēng)險。
[0031] 在下一個實施例中，疫苗是用無針接種裝置施用的，使用疫苗的射流通過動物的 皮膚到達真皮。在這個實施方案中，接種到真皮是通過使用疫苗的液體射流（高加壓流體 流)的無針接種裝置而提供的，所述裝置典型地使用在〇. 05至0.2ml范圍內(nèi)的非常低體積的 疫苗。這進一步提高了疫苗和施用方法的安全性。
[0032]在另一個實施方案中，非復(fù)制性免疫原是豬圓環(huán)病毒2型的重組表達的0RF2蛋白 質(zhì)，例如如本領(lǐng)域中已知的由桿狀病毒表達的，或者在PCV1-PCV2嵌合病毒中表達。這個重 組蛋白已經(jīng)被證明適用于在本發(fā)明中應(yīng)用。特別的是，0RF2蛋白可以在桿狀病毒表達系統(tǒng) 中被表達，例如在 W02007/028823，W02007/094893或 W02008/076915 中所述。
[0033]在還另一個實施方案中施用時的動物已經(jīng)具有Hog2(7單位的21og)或以上的滴 度的循環(huán)抗體(根據(jù)在此下文實施例1"血清學(xué)"中描述的方法所建立的）。發(fā)現(xiàn)即使在這個 中等至高的抗體滴度下，本發(fā)明仍然是有效的。
[0034] 在一個實施方案中，疫苗的單劑量包含低于5000AU的免疫原（最小量是仍然導(dǎo)致 有效的免疫應(yīng)答的量）。發(fā)現(xiàn)在這個劑量在僅僅一次接種后仍然可以獲得超過23周的免疫 期，其比現(xiàn)有疫苗Porcilis PCV(用兩次注射接種方案許可以達到22周的免疫期）的劑量 低。在一個實施方案中，疫苗的單劑量包含約2〇〇〇的AU的免疫原。這個量看來足以獲得本發(fā) 明的優(yōu)點。
[0035] 在另一個實施方案中，疫苗包含豬肺炎支原體的非活性免疫原以治療動物對抗致 病性豬肺炎支原體細菌的感染，和/或疫苗包含胞內(nèi)勞森菌的非活性免疫原以治療動物對 抗致病性胞內(nèi)勞森菌細菌的感染。
[0036] 在還另一個實施方案中，疫苗包含含有礦物油的佐劑，其特征在于疫苗中礦物油 的量是在1和1〇%v/v之間（油體積比疫苗總體積）。眾所周知的，礦物油是免疫應(yīng)答的一個 很好的增強劑(也被稱為"佐劑"）。然而，在豬中它經(jīng)常導(dǎo)致嚴重的局部反應(yīng)(具有大于5cm 平均直徑的腫脹），特別是如果是皮內(nèi)施用時。令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，用當前的皮內(nèi)途徑接種疫 苗，可能完全不會出現(xiàn)這樣的嚴重局部反應(yīng)，并且腫脹的平均直徑甚至可以保持低于3厘 米，這被發(fā)現(xiàn)是可接受的。在進一步的實施方案中，礦物油的量是在2.5至5 % v/v之間。發(fā)現(xiàn) 即使在這個非常低的礦物油濃度下，免疫應(yīng)答也是有效的。
[0037] 在根據(jù)本發(fā)明一個實施方案的方法，動物接受包括豬圓環(huán)病毒2型非復(fù)制性免疫 原疫苗單劑量施用到真皮內(nèi)，并且同時（即在一天之內(nèi)，優(yōu)選在幾個小時，分鐘或秒)接受包 括豬肺炎支原體(Mhyo)的非活性免疫原疫苗單劑量施用到真皮內(nèi)以同時治療豬圓環(huán)病毒2 型和豬肺炎支原體感染。在本發(fā)明的這個或任何其它實施方案中使用的幾個豬肺炎支原體 非活性免疫原是本領(lǐng)域中所已知的，如菌苗（豬健康與生產(chǎn)（Swine Health and Production) · 1998;6(3): 107-112)，重組表達的Mhyo抗原（感染和免疫（Infection and Immunity)，1997年6月第65卷第6期2502-2507)，Mhyo培養(yǎng)物的可溶性部分（W0 2013/ 152083)等。
[0038] 在另一個實施方案中，動物接受包括豬圓環(huán)病毒2型非復(fù)制性免疫原疫苗單劑量 施用到真皮內(nèi)，并且同時接受包括胞內(nèi)羅森菌的非活性免疫原疫苗單劑量施用到真皮內(nèi)以 同時治療豬圓環(huán)病毒2型和胞內(nèi)羅森菌感染。關(guān)于在本發(fā)明的這個或任何其它實施方案中 使用的胞內(nèi)羅森菌免疫原，幾種類型的非活性免疫原在本領(lǐng)域中是已知的，并且被描述在 例如W02009/144088(滅活的全細胞免疫原），W02005/070958(亞單位）和W097/20050(滅活 的全細胞免疫原）102009/144088描述了這樣的PCV和Mhyo抗原組合。 實施例
[0039] 實施例1是一個實驗，其表明單劑量的皮內(nèi)接種可以提供抗豬圓環(huán)病毒2型感染的 23周免疫。
[0040] 實施例2是另一個實驗，用PCV2 ID-次接種方式表明接種是安全的并且導(dǎo)致保護 性滴度。
[0041 ]實施例3是在皮內(nèi)和肌內(nèi)接種之間的直接比較。
[0042] 實施例4描述了組合的皮內(nèi)疫苗接種的實驗。
[0043] 實施例5描述了組合疫苗，各種抗原劑量和各種佐劑的實驗。
[0044] 圖1在免疫期研究中的血清
[0045] 圖2在血清，糞便和器官中的病毒載量
[0046] 圖3平均體溫
[0047] 圖4平均總PCV2 IgAb結(jié)果
[0048] 圖5平均PCV2 IgMAb結(jié)果
[0049] 圖6在持續(xù)研究中抗體的滴度 [0050]圖7在器官中的病毒載量 [0051]圖8在器官中的病毒載量 [0052] 實施例1
[0053]實驗設(shè)計
[0054]具有抗PCV2抗體的10頭母豬的后代被用于這項研究。一窩仔豬被劃分為2組，每組 15頭動物。在3周齡，組1的仔豬在頸部的右側(cè)用0.2ml包括豬圓環(huán)病毒2型的重組表達的 0RF2蛋白疫苗進行皮內(nèi)接種(見W0 2007/028823,用于提供蛋白質(zhì)），使用市售的皮內(nèi)注射 裝置IDAL?(售自MSD Animal Health，Boxmeer，荷蘭），而組2未被接種并且充當對照組。 每天觀察所有研究動物的臨床癥狀。在疫苗接種時，9，17，19和21周后的時間，收集所有動 物的血液樣品。在接種23周后，使用鼻內(nèi)施用野生型PCV2攻擊病毒株感染攻擊每頭動物。 [0055]在攻擊前1天和攻擊1，2和3周后，收集血清樣品和糞便拭子并且通過定量PCR檢查 PCV2病毒核酸。另外的，檢查血清樣本的PCV2抗體。攻擊3周后，所有動物進行尸檢并且腹股 溝淋巴結(jié)，扁桃體和肺組織被取樣用于測定PCV2病毒抗原和核酸。
[0056]使用的疫苗是作為水包油型乳液提供的，其包含5 % v / v的礦物油Marcd? 5 2 (Exxon)，0.30%w/v的乙酸維生素 E和0.32%的吐溫80(吐溫80;Sigma Aldrich)，注射用水 和每0.2毫升的2000 AU PCV2蛋白。該AU單位是基于PerkinElmer的AlphaLISA測試而計算 的。對于這個測試，聚苯乙烯微量滴定板的孔中填充有含有PCV2 0RF2抗原和連續(xù)稀釋的參 照標準的測試樣品的連續(xù)稀釋液。這些稀釋液孵育受體珠(包被有針對PCV2 0RF2的單克隆 抗體），和生物素標記的針對PCV2 0RF2的第二抗體。然后通過用鏈霉親和素包被的供體珠 孵育和化學(xué)發(fā)光檢測定量結(jié)合的第二抗體的量。參照標準使得可以商購的疫苗Porcilis? PCV被設(shè)置為每(2毫升)劑量包含5000AU。
[0057] 實驗步驟
[0058] 每日觀察
[0059] 所有豬每天觀察疾病的臨床癥狀。觀察結(jié)果包括全身反應(yīng)，其包括食欲不振，傾向 躺下，精神萎靡或嗜睡，發(fā)抖，毛發(fā)直立，水腫(特別是眼睛周圍），嘔吐，腹瀉和呼吸困難。
[0060] 血液采樣
[0061 ]在接種疫苗前，9，17，19和21周后收集血液樣品。在攻擊前1天，和攻擊7，13和19天 后收集血液樣品。這是在所有豬的個體上進行的。
[0062]糞便擦拭
[0063] 在攻擊前1天，和攻擊7,13和18天后，從所有動物收集糞拭子，每個動物使用一個 干燥的拭子。使用標準程序收集拭子到含有抗生素的培養(yǎng)基中。在培養(yǎng)基中擦拭材料的懸 浮液通過離心而澄清，等分并且儲存在<_18°C下直至進一步的應(yīng)用。
[0064] 血清學(xué)
[0065]使用標準ELISA程序，檢測所有血清樣本的抗PCV2抗體。簡而言之，連續(xù)稀釋的血 清樣品在包被有桿狀病毒表達PCV2 0RF2抗原的微量滴定板中孵育。除去血清后，將所有孔 用固定量的生物素標記的PCV2特異性單克隆抗體孵育。然后用過氧化物酶綴合的鏈霉親核 素孵育結(jié)合的MoAb，隨后進行發(fā)色檢測。滴度表示為log2滴度。
[0066] 尸檢檢查
[0067] 在實驗結(jié)束時，所有動物通過擊暈后放血而被安樂死。在尸檢期間，打開動物，原 位檢查內(nèi)臟，要特別注意以下器官:肺，腹股溝和腸系膜淋巴結(jié)，扁桃體、胸腺、脾臟，肝臟和 腎臟。在此之后，來自扁桃體、肺(肺葉附件），和腹股溝淋巴結(jié)的樣品被移除而用于快速冷 凍并且用于后期的通過定量PCR(qPCR)的分析。
[0068] 定量 PCR
[0069]在所有血清和糞便拭子，和在扁桃體，肺和腹股溝淋巴結(jié)的10%組織勻漿上實施 定量PCR(qPCR)。簡而言之，使用商業(yè)試劑盒從樣品中提取DNA。通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)定 量每個樣品中的PCV2基因組DNA，所述PCR反應(yīng)使用引物和一個PCV2特異性的雙重標記的水 解探針。特定熒光超過閾值的循環(huán)數(shù)是與一組含有已知量的包含PCV2質(zhì)粒的樣品的循環(huán)數(shù) 相關(guān)。結(jié)果表示為loglO拷貝AU反應(yīng)混合物(loglOc/yl)。
[0070] 結(jié)果
[0071 ]在實驗開始時，發(fā)現(xiàn)所有的動物是健康的。在對照組中，發(fā)現(xiàn)一只動物在接種6周 后(wpv)死亡。兩只接種疫苗的動物有輕微的局部問題，即輕微的動感功能障礙(一條腿僵 硬）?？紤]到是小問題，沒有治療這些動物。在接種的動物中沒有顯示出任何疾病或全身反 應(yīng)，如高熱，減少的食物攝入，過敏性休克或嘔吐。
[0072]血清學(xué)的結(jié)果顯示在圖1中。很顯然，接種疫苗的動物似乎維持到約4.01og2水平 的抗-PCV2滴度，而在對照動物中滴度降低到檢測限以下。在攻擊后（23wpv，在26周齡），在 接種組中滴度小幅上漲。在對照組中滴度上升到相同的水平。
[0073] qPCR的結(jié)果顯示在圖2A，2B和2C("dpc"=攻擊后的天數(shù)）中。似乎接種的動物，在 接種疫苗23周后保護免于PCV2感染的攻擊，如在血清，淋巴器官和肺中PCV2核酸的顯著減 少所示。此外，該疫苗能減少病毒脫落，如通過在糞便拭子上抗至少23周PCV2的病毒載量的 顯著減少所證明。這是在具有大約71og2的循環(huán)抗體滴度的野外動物中進行，所述滴度被認 為是中等的水平。
[0074] 實施例2
[0075] 實驗設(shè)計
[0076]來自一個產(chǎn)仔批次的一批共46個仔豬被分配到4個治療組:2個接種組每組13頭仔 豬和2個對照組每組10頭仔豬。當仔豬是大約2周齡時，組1按照上述實施例1所示被接種，當 仔豬是大約3周齡時，組2被接種。用單劑量疫苗在頸部的右側(cè)皮內(nèi)接種仔豬。組3(對照組2 周齡的動物)和組4(對照組3周齡的動物)未被接種。在接種疫苗當天，接種2,3和4周后收集 所有動物的血清樣品。在接種前1天，接種當天和接種后4小時以及接種1，2,3,4天后測量溫 度。
[0077] 實驗步驟
[0078] 在接種前，觀察仔豬的一般健康。在天數(shù)Τ = _1，天數(shù)T = 0的接種后0和4小時，和在 接種后天數(shù)Τ = 1，2，3，4，測量所有仔豬的體溫。
[0079] 在接種當天和接種2,3和4周后收集血液樣品。根據(jù)標準程序，對所有豬分別進行。 不加入抗凝血劑收集血液樣品。血清從凝結(jié)的血液樣品中制備并且等分試樣裝填并且保存 于-20°C下直至分析。
[0080] 根據(jù)在上文實施例1( "血清學(xué)"）所示，測試總PCV2的Ig抗體和PCV2的IgM抗體 ELISA，除了在IgM抗體ELISA的情況下，用IgM抗體包被該平板，然后用PCV2 0RF2抗原孵育， 在用固定量的生物素標記的PCV2特異性單克隆抗體孵育之前。
[0081 ] 結(jié)果
[0082] 在實驗開始時，發(fā)現(xiàn)所有的動物是健康的。體溫的平均結(jié)果顯示在圖3中。在2和3 周齡動物之間的體溫平均增加沒有看到差異(最大平均增加是在〇.〇_〇.3°C之間）。另外，在 1組和2組中動物個體體溫的最大增加與在兩個對照組中動物個體的最大溫度增加相當。
[0083] 總PCV2 Ig抗體ELISA
[0084] 總PCV2 Ig抗體應(yīng)答的平均結(jié)果概述在圖4中。在接種時，2周齡的接種仔豬相比于 3周齡的接種仔豬具有較高的（最可能的母體來源性)PCV2抗體滴度。接種的動物表現(xiàn)出比 對照動物顯著較高的滴度增加。
[0085] PCV2 IgM抗體ELISA
[0086] PCV2 IgM抗體應(yīng)答的平均結(jié)果顯示在圖5中。在接種時所有動物呈現(xiàn)出IgM抗體陰 性。接種后，3周齡的動物相比于2周齡的動物具有相當更快和更高的IgM抗體應(yīng)答。對照動 物在整個研究中保持陰性。
[0087] 基于這些結(jié)果，可以得出結(jié)論，在2和3周齡仔豬的單一劑量皮內(nèi)接種導(dǎo)致了可接 受的安全性和良好的血清學(xué)反應(yīng)。另一個實驗獲得了可比的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示），其中循環(huán) 抗體滴度的起始水平甚至更高，即高達9.41og2，這被認為是在中等范圍的高端。
[0088] 實施例3 [0089]實驗設(shè)計
[0090]總共40頭仔豬被分配到4個治療組，每組10頭。按照上文實施例1所述用單一劑量 疫苗皮內(nèi)接種組1和組2的仔豬。組1和組2之間的區(qū)別是組2的IDAL疫苗接種器具有稍高的 壓力積聚（125%的用于組1的IDAL接種器的值）。在相同位置(在頸部）以相同劑量，用單一 劑量的相同疫苗肌內(nèi)接種組3的仔豬，并且組4的仔豬未經(jīng)處理。在接種當天，接種3和4周后 收集所有動物的血清樣本。
[0091] 實驗步驟
[0092] 在接種前，根據(jù)標準程序，觀察仔豬的一般健康。根據(jù)按照上文實施例2所述的程 序進行總抗PCV2抗體和PCV2 0RF2特異性IgM抗體的血液以及血清學(xué)取樣。
[0093] 結(jié)果
[0094]在研究開始發(fā)現(xiàn)所有的動物是健康的。血清學(xué)的結(jié)果概述在表1(滴度表示為 log2)中。在接種疫苗時，平均抗體滴度相對高。接種疫苗之后，沒有動物表現(xiàn)出PCV2抗體滴 度的增加。在接種3和5周后，可以觀察到ID組比頂組具有更高的平均PCV2抗體滴度。
[0095]表1:平均抗體的結(jié)果
[0097] 抗PCV2的IgM血清學(xué)的結(jié)果概述在表2(滴度表示為log2)中。在接種3周后，兩個ID 組的抗PCV2的I gM抗體滴度顯著高于頂組和對照組。
[0098] 表2:抗PCV2 IgM抗體的平均結(jié)果
[0100] 當應(yīng)用Wilcoxon秩和檢驗，對每個ID組（1和2)相比于IM組(3)的IgM應(yīng)答差異的p 值是低于〇. 05的，即分別是0.0001和0.0329。
[0101] 實施例4
[0102] 具有抗PCV2抗體的幾頭母豬的后代可以用于這項研究。一窩仔豬18頭動物被劃分 為3組。在3周齡，根據(jù)上文實施例1所述皮內(nèi)接種組1和組2的仔豬。根據(jù)制造商的說明在頸 部的另一側(cè)，組2的動物在相同的時間用市售疫苗P 〇rcilis?M Hyo ID Once(包含Mhyo菌苗） 進行肌內(nèi)接種。組3(對照組）的動物保持未處理。每日觀察所有的研究動物。在接種疫苗時 和每隔一周的時間直至動物被送去屠宰（23-25周齡)收集血清樣品。檢查這些樣品的PCV2 抗體。
[0103] 實驗程序是按照上文實施例1所述的。獲得的血清學(xué)顯示在圖6中。從該圖中可以 清楚地看到抗PCV2滴度在根據(jù)實施例1所述的實驗中確定的41og2水平以上維持的很好，并 且被發(fā)現(xiàn)是保護性的。在疫苗之間沒有負干擾的指示。
[0104] 重復(fù)這個實驗以檢查抗致命性豬肺炎支原體的保護。對于這個重復(fù)實驗，使用了 60頭仔豬。40頭動物在18-24天齡接種Mhyo疫苗并且這些動物中的20頭也接種PCV疫苗。20 頭動物未接種疫苗并且作為攻擊對照。接種后3周，用致命性豬肺炎支原體菌株感染所有動 物，并且攻擊3周后所有動物都進行尸檢研究肺損傷。在各組之間比較肺損傷評分(LLS)。
[0105] 用porcilis?M Hyo ID Once接種的組的LLS是顯著低于那些對照組（p<0.05， Dunr/s檢驗）。在已經(jīng)用pordlis?M Hyo ID Once單獨或與PCV疫苗聯(lián)用接種的組之間沒有 顯著差異。因此可以得出結(jié)論，將組合的疫苗接種對用P〇rci!is?M Hy0 ID Once獲得的免疫 沒有負面影響。
[0106] 實施例5
[0107]總共八支疫苗配制成含有PCV2(250至6000AU/0.2毫升），豬肺炎支原體（與 P〇rcilis?M Hyo ID Once具有相同的水平）和胞內(nèi)勞森菌抗原（參見W020089/127684,實施 例2的滅活全細胞抗原：以每0.2毫升大約IX 109個細胞的水平）。該疫苗含有不同的佐劑。 一些疫苗使用現(xiàn)有的佐劑Diluvac Forte(MSD Animal Health，Boxmeer，荷蘭；所謂的 "0廣）。其它使用的佐劑制劑是如上文實施例1所述(被稱為1-8〇1代12"），或用與乂- 8〇^ 12相同成分配制成的佐劑，但是以X-so 1 ve 12的一半的濃度(被稱為"X-so 1 ve 6"）或2.5倍 濃度(被稱為"X-solve 30"）。所得疫苗分別如下(Mhyo和胞內(nèi)勞森菌抗原沒有被列舉;每劑 量的含量）：
[0108] 第1組：2000AU PCV2/X_solve 30
[0109] 第2組：250AU PCV2/X-solve 12
[0110] 第3組：500AU PCV2/X-solve 12
[0111] 第4組：2000AU PCV2/X-solve 12
[0112] 第5組：2000AU PCV2/X_solve 6
[0113] 第6組：500AUPCV2/DF
[0114] 第7組：2000AU PCV2/DF
[0115] 第8組：6000AUPCV2/DF
[0116] 8頭母豬的后代被用于本研究。仔豬具有抗PCV2的中等（中級)母體來源抗體(MDA) (平均:6.71og2)。在3/4周齡，使用IDAL?疫苗接種器，單一劑量皮內(nèi)接種組1至8的仔豬。 組9的仔豬維持未接種。接種7周后，所有動物被運送到攻擊設(shè)施。一天后用PCV2攻擊菌株感 染攻擊所有的動物。所有仔豬每天觀察臨床癥狀。
[0117] 通過觸診監(jiān)測局部反應(yīng)，在接種當天開始并且在接種后每兩天直到接種20天后。
[0118] 在接種當天和接種后3周，攻擊前1天，攻擊1和2周后以及尸檢時，收集所有動物的 血液樣品。從每只動物取的血清樣品用于抗PCV2和豬肺炎支原體抗體測試。在尸檢期間，腸 系膜和腹股溝淋巴結(jié)，扁桃體和肺被取樣用于PCV2核酸定量。
[0119] 實驗程序與上文實施例2所述相同。在接種時PCV2 IgM抗體應(yīng)答低于所有組的檢 測水平(低于2.01og2)。接種3周后，對于2000AU PCV2/X-slove 30疫苗的PVC抗體的滴度最 高，8卩201(^2<^-8〇1￥6 12組，包括每劑量250-，500-和200(^1]?(^2抗原分別具有9，16和 191og2的滴度。接受2000AU/X-sl 〇Ve6疫苗的組具有151og2的滴度。每劑量包含500-，2000_ 和6000AU PCV2抗原的DF組分別具有8，14和161 og2的滴度。對照具有低于檢測水平的滴度。
[0120] 在這項研究中，對全身和局部反應(yīng)進行了評估。沒有觀察到歸因于疫苗接種的全 身反應(yīng)。至于局部效應(yīng)而言，不多于3頭接種疫苗的動物(已經(jīng)分別接受每劑量疫苗X-solve 12 500和2000AU，或DF 6000AU PCV2)具有輕微運動的問題，同樣的數(shù)字如在對照動物中。 為此，這些反應(yīng)可能合理地被認為是與疫苗接種不相關(guān)的。對于其他局部反應(yīng)，用X-solve 接種的許多動物(約60-100%之間）顯示出局部反應(yīng)，腫脹的平均尺寸是小于3厘米，即在1-2厘米之間，并且腫脹在2-6天內(nèi)消失。使用DF，只有約30%的動物表現(xiàn)為局部腫脹，平均大 小是小于0.5厘米，和它們在一天內(nèi)消失。
[0121] 在圖7和8中，器官的病毒載量(平均)對于不同的疫苗進行描繪。似乎所有疫苗都 能夠?qū)嵸|(zhì)性(在這些情況下至少3個數(shù)量級)降低在相關(guān)的器官中的病毒載量。
[0122] 在這項研究中似乎使用的所有佐劑均是安全的，誘導(dǎo)抗PCV2 IgM應(yīng)答，并且能治 療動物對抗致病性豬圓環(huán)病毒2型的感染。在不同抗原之間沒有發(fā)現(xiàn)負干擾。
【主權(quán)項】
1. 包含重組表達的豬圓環(huán)病毒2型的0RF2蛋白的疫苗，用于預(yù)防性治療具有針對豬圓 環(huán)病毒2型的循環(huán)抗體的動物，通過施用單劑量的疫苗至動物的真皮內(nèi)對抗致病性豬圓環(huán) 病毒2型的感染。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的疫苗，其特征在于所述單劑量施用包含小于0.5毫升的疫苗，優(yōu)選 0.2毫升的疫苗。3. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的疫苗，其特征在于所述疫苗是用無針接種裝置施用的。4. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的疫苗，其特征在于在施用時動物具有Hog2或更高滴度 的循環(huán)抗體。5. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的疫苗，其特征在于根據(jù)實施例1中所述的測試，所述單劑 量的疫苗包含小于5000AU的免疫原。6. 根據(jù)權(quán)利要求7的疫苗，其特征在于根據(jù)實施例1中所述的測試，所述單劑量的疫苗 包含約2000AU的免疫原。7. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的疫苗，其特征在于所述疫苗包含豬肺炎支原體 (Mycoplasma hyopneumoniae)的非活性免疫原，以治療動物對抗致病性豬肺炎支原體細菌 的感染。8. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的疫苗，其特征在于所述疫苗包含胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis)的非活性免疫原，以治療動物對抗致病性胞內(nèi)勞森菌細菌的感染。9. 根據(jù)前述任一項權(quán)利要求的疫苗，其特征在于所述疫苗包含含有礦物油的佐劑，其 特征在于疫苗中礦物油的量是在1和10 % v/v之間。10. 根據(jù)權(quán)利要求11的疫苗，其特征在于礦物油的量是在2.5至5 % v/v之間。11. 預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒2型循環(huán)抗體的動物的方法，通過施用單劑量的包 括重組表達的豬圓環(huán)病毒2型的0RF2蛋白的疫苗到動物真皮內(nèi)而對抗致病性豬圓環(huán)病毒2 型的感染。12. 預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒2型循環(huán)抗體的動物的方法，通過施用單劑量的包 括重組表達的豬圓環(huán)病毒2型的0RF2蛋白的疫苗到動物真皮內(nèi)而對抗由致病性豬圓環(huán)病毒 2型感染導(dǎo)致的疾病。13. 根據(jù)權(quán)利要求11或12的方法，其特征在于所述疫苗額外包含豬肺炎支原體非活性 免疫原，以治療動物而對抗致病性豬肺炎支原體細菌的感染。14. 根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項的方法，其特征在于所述疫苗額外包含胞內(nèi)勞森菌 非活性免疫原，以治療動物而對抗致病性胞內(nèi)勞森菌細菌的感染。15. 預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒2型循環(huán)抗體的動物，抗豬圓環(huán)病毒2型和豬肺炎 支原體感染的方法，其特征在于所述方法包括施用動物單劑量的包含重組表達的豬圓環(huán)病 毒2型的0RF2蛋白的疫苗到真皮內(nèi)，并且同時施用動物單劑量的包含豬肺炎支原體的非活 性免疫原的疫苗到真皮內(nèi)。16. 預(yù)防性治療具有針對豬圓環(huán)病毒2型循環(huán)抗體的動物，抗豬圓環(huán)病毒2型和胞內(nèi)勞 森菌感染的方法，其特征在于所述方法包括施用動物單劑量的包含豬圓環(huán)病毒2型的重組 表達的0RF2蛋白的疫苗到真皮內(nèi)，并且同時施用動物單劑量的包含胞內(nèi)勞森菌非活性免疫 原的疫苗到真皮內(nèi)。
【文檔編號】A61P31/04GK105848675SQ201480066507
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月2日
【發(fā)明人】V·發(fā)欽格, M·斯諾, M·H·維特韋里伊特
【申請人】英特維特國際股份有限公司