抑制酪氨酸酶表達(dá)的雙鏈rna寡核苷酸的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及包含抑制酪氨酸酶表達(dá)的雙鏈RNA寡核苷酸的組合物。本發(fā)明還涉及雙鏈RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表達(dá)中的用途以及用于預(yù)防形成和/或消除色素形成斑，和/或老年斑，和/或用于增亮和/或漂白褐色皮膚和/或使褐色皮膚顏色均勻的用途。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
抑制酪氨酸酶表達(dá)的雙鏈RNA寡核苷酸
[0001 ] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年9月20日的申請(qǐng)?zhí)枮?01210065389.9的題為"抑制酪氨 酸酶表達(dá)的雙鏈RNA寡核苷酸"的發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及新的用于降低酪氨酸酶表達(dá)的雙鏈RNA寡核苷酸，其在化妝和/或藥學(xué) 目的上的用途，以及它與大小小于或等于lMiZ電勢(shì)為10-80mV的陽(yáng)離子型顆粒的締合。
【背景技術(shù)】
[0003] 酪氨酸酶(單苯酚二羥基苯丙氨酸:氧氧化還原酶EC 1.14.18.1)是參與皮膚色素 形成機(jī)制的必需酶。它具體催化以下反應(yīng):依靠其羥化酶活性催化酪氨酸轉(zhuǎn)變成多巴(二羥 基苯丙氨酸)并且依靠其氧化酶活性將多巴轉(zhuǎn)化成多巴醌(dopaquinone)。酪氨酸酶只有在 某些生物因子的作用下處于成熟狀態(tài)時(shí)才起作用。
[0004] 該酶在治療如黑色素瘤（Riley等，J.Immunother. 2001，21，212-220)或者Vogt-Koyanagi-Harada?。≧ead等，Curr.Opin.Ophthalmol ?，2000，11，437_442)的疾病中也是有 利的。
[0005] 皮膚色素形成的形成機(jī)制，也就是黑色素的形成，是特別復(fù)雜的，且示意性地包括 下面的主要步驟：
[0006] 酪氨酸-多巴-多巴醌-多巴色素-黑色素
[0007] 因此，人類(lèi)皮膚的色素形成是由樹(shù)突細(xì)胞、黑色素細(xì)胞合成黑色素而導(dǎo)致的。后者 含有被稱為黑素體的細(xì)胞器，其是黑色素生物合成的部位。黑素體在沿著樹(shù)突迀移后，從黑 素細(xì)胞轉(zhuǎn)移到角質(zhì)形成細(xì)胞。然后在表皮分化過(guò)程中，角質(zhì)形成細(xì)胞被轉(zhuǎn)運(yùn)到皮膚表面 (Gilchrest BA,Park HY,Eller MS,Yaar M,Mechanisms of ultraviolet light-induced pigmentation.Photochem Photobiol 1996;63:1-10;Hearing VJ,Tsukamodo K， Enzymatic control of pigmentation in mammals.FASEB J 1991;5:2902-2909) 〇在黑素 原生成酶中，酪氨酸酶是催化黑色素合成前兩個(gè)步驟的關(guān)鍵酶。酪氨酸酶的純合突變導(dǎo)致I 型眼皮膚白化病，所述I型眼皮膚白化病特征是黑色素合成的完全喪失（Toyofuku K，Wada I,Spritz RA,Hearing VJ,The molecular basis of oculocutaneous albinism type 1 (0CA1)：sorting failure and degradation of mutant tyrosinases results in a lack of pigmentation.Biochem J.2001；355:259-269)〇
[0008] 由于著色過(guò)度紊亂是由黑色素生產(chǎn)的增加導(dǎo)致的，所以人們發(fā)現(xiàn)開(kāi)發(fā)新的治療方 法很重要，其原理是基于抑制酪氨酸酶的活性。
[0009] 大多數(shù)已知的亮膚(skin-lightening)化合物是酸類(lèi)/兒茶酸類(lèi)。這些化合物抑制 酪氨酸酶，但是這些化合物的絕大多數(shù)對(duì)黑色素細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，這會(huì)導(dǎo)致皮膚的永久 性褪色。
[0010] 因此，看起來(lái)既高效又表現(xiàn)出好的耐受性的新的酪氨酸酶抑制化合物應(yīng)用于人類(lèi) 是有利的。
[0011] 最近，雙鏈RNA dsRNA寡核苷酸，且更具體是siRNA寡核苷酸（12至40個(gè)核苷酸的） 的應(yīng)用，使得在如皮膚護(hù)理或頭發(fā)護(hù)理的化妝領(lǐng)域，以及皮膚病學(xué)領(lǐng)域和藥學(xué)領(lǐng)域獲得特 別的活性成為可能。
[0012] 然而，已知siRNA在體內(nèi)應(yīng)用存在各種困難。
[0013] 除了在局部應(yīng)用這些SiRNA時(shí)，為使其到達(dá)靶細(xì)胞的這些SiRNA的穿透問(wèn)題之外， 特別是由于穿過(guò)角質(zhì)層的困難，經(jīng)驗(yàn)已顯示施用siRNA，如很多出版物報(bào)道的會(huì)觸發(fā)干擾素 應(yīng)答（Sledz CA等，Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biol.2003;9:834_9.Katalin Karik6等，Small Interfering RNAs Mediate Sequence-Independent Gene Suppression and Induce Immune Activation by Signaling through Toll-Like Receptor 31.J.Immunol.2004；172:6545-6549.Judge AD 等，Sequence-dependent stimulation of the mammalian innate immune response by synthetic siRNA.Nat Biotechnol .2005;23:457-62)，而且還會(huì)誘導(dǎo)或抑制非siRNA革巴向 的基因的表達(dá)（Jackson等，Expr ession profiling reveals off-target gene regulation by RNAi.Nat Biotechnol.2003;21:635-7)，這兩種現(xiàn)象都是非常不合需要 的。
[0014] 專(zhuān)利申請(qǐng)US 2004/0215006描述了有抗酪氨酸酶活性的雙鏈的和反義單鏈的RNA 寡核苷酸;所用的實(shí)施例只涉及反義單鏈RNA寡核苷酸。具體地，它沒(méi)有證明與這些反義RNA 同源的siRNA是否有效。
[0015] 一些作者已強(qiáng)調(diào)，如siRNA的雙鏈RNA寡核苷酸和反義單鏈RNA寡核苷酸具有不同 的革E1，且反義RNA的活性不能外推到相同序列的s iRNA (Xu等，Effective smal 1 interfering RNAs and phosphorothioate antisense DNAs have different preferences for target sites in the luciferase mRNAs.BBRC 2003;306:712-717)。
[0016] 此外，在該文獻(xiàn)US 2004/0215006中，提出的siRNA的濃度是50-200nM。如上所指出 的，Jackson等已經(jīng)描述了未被在濃度為100nM時(shí)使用的siRNA革E1向的基因的強(qiáng)的正調(diào)節(jié)和 負(fù)調(diào)節(jié)。
[0017] 類(lèi)似地，在W0 2005/060536中，描述了特異性抑制酪氨酸酶的siRNA，其所提出的 濃度范圍非常寬，且可能導(dǎo)致組合物中包含了非常大量的siRNA，由此會(huì)觀察到非siRNA靶 向的基因的正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié)。
[0018] 在化妝或治療用途的范圍內(nèi)，這種非靶向基因的調(diào)節(jié)是不能接受的，特別是由于 它不可預(yù)見(jiàn)的特性。
[0019] 本
【申請(qǐng)人】已開(kāi)發(fā)了特異性抑制酪氨酸酶表達(dá)的新的siRNA，從所述siRNA中選擇展 示一定活性的siRNA，從而所述siRNA可在小于或等于InM的劑量下使用。
[0020] 除了解決涉及誘導(dǎo)非特異基因的問(wèn)題之外，本
【申請(qǐng)人】已證實(shí)了這些siRNAs序列不 會(huì)誘導(dǎo)干擾素應(yīng)答。
[0021 ]為此，按照Invitrogen公司銷(xiāo)售的 "BLOCK-iT? RNAi Stress Response Control Kit(Human)for monitoring interferon-mediated stress response to double-stranded RNA in human cells"的手冊(cè)中描述的方案，測(cè)量了已知受干擾素誘導(dǎo)的0AS-1 和IFIT-1 (干擾素誘導(dǎo)的三十四肽（tetratricopeptide)重復(fù)結(jié)構(gòu)域)基因的表達(dá)（Stefan F.Wieland等，Searching for Interferon-Induced Genes that inhibit Hepatitis B Virus Replication in Transgenic Mouse Hepatocytes,J.of Virology 2003,77:1227-1236)。
[0022] 此外，這些酪氨酸酶特異性siRNA與大小小于或等于lwnZ電勢(shì)為10-80mV的陽(yáng)離 子型顆粒締合，使得可能非常顯著地提高所述siRNA向如皮膚的三維模型的靶細(xì)胞的穿透。 一旦穿透，酪氨酸酶特異性siRNA就變得有活性。
[0023] 穿透可通過(guò)與siRNA附著的熒光標(biāo)記進(jìn)行評(píng)價(jià)，且其活性可通過(guò)定量PCR對(duì)靶信使 進(jìn)行定量或通過(guò)測(cè)定對(duì)應(yīng)于靶信使的蛋白而進(jìn)行評(píng)價(jià)。
[0024] 本發(fā)明的陽(yáng)離子型顆粒可以是表面活性劑膠束、嵌段或非嵌段聚合物膠束、陽(yáng)離 子脂質(zhì)體和非離子表面活性劑微囊（niosome)、陽(yáng)離子油質(zhì)體、陽(yáng)離子毫微乳劑 (nanoemulsion)、以及陽(yáng)離子有機(jī)或無(wú)機(jī)顆粒和毫微膠囊(nanocapsule)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0025]這樣，本發(fā)明的第一個(gè)主題涉及一種選自寡核苷酸序列SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48，任選地經(jīng)過(guò)修飾的雙鏈1?祖寡核 苷酸(也稱作dsRNA或siRNA)。
[0026] 利用dsRNA，且更具體是siRNA(短干擾RNA)，使得通過(guò)降解編碼靶蛋白的mRNA而獲 得特異性抑制該蛋白合成的活性成為可能。祀mRNA的降解通過(guò)RISC復(fù)合體(RNA誘導(dǎo)的沉默 復(fù)合體）的活化而實(shí)現(xiàn)，所述RISC復(fù)合體通過(guò)dsRNA的反義鏈與mRNA的結(jié)合而發(fā)揮其作用 (參見(jiàn)Tuschl T.Chem.Biochem.2001;2:239-245;Nykanen A&al，Cell 2001;107:309-321; Dorsett Y?和Tuschl T.Nat Rev Drug Discov.2004;3:318_329;Downward J.BMJ.2004; 328:1245-1248; Shanker P?等，JAMA 2005;293:1367-1373)。
[0027]實(shí)現(xiàn)的分子結(jié)構(gòu)包括由12-40個(gè)核苷酸，優(yōu)選23-27個(gè)核苷酸組成的雙鏈RNA片段。 [0028] 這些雙鏈RNA寡核苷酸可優(yōu)選地由同源的有義鏈以及與人酪氨酸酶mRNA(GenBank 登記號(hào)NM_000372)序列互補(bǔ)的反義鏈組成。該雙鏈RNA寡核苷酸具有平頭末端或者有2-6個(gè) 核苷酸的不配對(duì)末端。
[0029] 雙鏈RNA寡核苷酸可通過(guò)多種手動(dòng)的或自動(dòng)的、體內(nèi)的或體外的方法合成。
[0030] 體外合成方法可以是化學(xué)方法或者酶法，例如利用RNA聚合酶(例如通過(guò)，T3、T7或 者SP6)，其會(huì)對(duì)選定的DNA(或者cDNA)序列模型進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。
[0031] 下列文獻(xiàn)中描述了許多種體內(nèi)合成雙鏈RNA的方法;它們可在各種細(xì)菌細(xì)胞類(lèi)型， 或者高等生物細(xì)胞類(lèi)型中進(jìn)行（Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual， 第二版（1989)，DNA cloning，第I卷和第II卷，D.N.Glover(1985版），Oligonucleotide Synthesis，M.J.Gaits(1984版），Nucleic Acid Hybridation，B.D?Hames和S?J?Higgins (1984版），Transcription and Translation B.D.Hames和S.J.Higgins(1984版），Animal Cell Culture，R.I?Freshney(1986版），Immobilized Cells and Enzymes,IRL Press (1986)，B.Pertal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)，Gene Transfer Vectors for Mammalian Ce11s，J?H?Mi 11er和M?P?Calos，Co Id Spring Harbor Laboratory(1987版），Methods in Enzymology，154卷，Wu和Grossman，以及155卷，Wu， Mayer和Walker(1987)，Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press，London，Scopes(1987)，Protein Purification：Principle and y Practice，第二版，Springer-Verlag，N.-Y?以及Handbook of Experimental Immunology, 第1-17卷，(：.0.如化和0：.813〇1^611(1986))。還可參考專(zhuān)利申請(qǐng)而01/36646、而01/ 75164以及US 2003/0088087中描述的合成方法。
[0032]優(yōu)選地，本發(fā)明的雙鏈RNA寡核苷酸通過(guò)在2 位置添加-0-甲基基團(tuán)進(jìn)行修飾。 [0033] 雙鏈RNA寡核苷酸可進(jìn)行各種修飾，所述修飾具體是如文獻(xiàn)US 2004/014956中所 述的修飾。
[0034] 有利地，修飾會(huì)導(dǎo)致雙鏈RNA寡核苷酸更為穩(wěn)定，而且更優(yōu)選地，導(dǎo)致雙鏈RNA寡核 苷酸不會(huì)引起干擾素應(yīng)答，這種性質(zhì)對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用是必需的。這些雙鏈RNA寡核苷酸還可對(duì) 有義鏈進(jìn)行修飾，從而使得其不能被整合入RISC，并從而不會(huì)引起副作用。
[0035] 優(yōu)選地，將使用SEQ ID ^)3.1、2、4、13、16、35、37、40和42的雙鏈1?祖寡核苷酸，按 照下文實(shí)施例2的方案所測(cè)量的，其在0.016nM時(shí)具有的酪氨酸酶mRNA降解效率大于50 %。 [0036] 本發(fā)明的主題還涉及包含至少一種選自寡核苷酸序列SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、6、 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的雙鏈1?熟寡核苷酸的組合物。
[0037] 在該組合物中，雙鏈RNA寡核苷酸的存在濃度是小于或等于100iiM，優(yōu)選小于或等 于10yM，且更優(yōu)選小于或等于lyM。
[0038] 本發(fā)明的組合物優(yōu)選適于局部施用于身體表面，也就是皮膚、體被、粘膜以及眼 睛。
[0039] 在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈RNA寡核苷酸與大小小于或等于ImiZ電 勢(shì)為10-80mV的陽(yáng)離子型顆粒締合。
[0040] 在該實(shí)施方案中，雙鏈RNA寡核苷酸會(huì)粘附到顆粒的表面，后者用作為載體以使其 穿透進(jìn)入皮膚結(jié)構(gòu)和進(jìn)入皮膚、粘膜或眼睛的靶細(xì)胞而用于化妝、皮膚病學(xué)和/或眼的應(yīng) 用。
[0041] 本發(fā)明的陽(yáng)離子型顆粒是這樣的顆粒，其大小小于或等于1M1，優(yōu)選小于或等于 500nm，更為優(yōu)選小于或等于300nm，可能采用，例如Brookhaven公司的激光顆粒分級(jí)器的 BI90plus型測(cè)量所述大小，且G電勢(shì)為10_80mV，所述電勢(shì)可用Coultronics公司的（儀DELSA 440型進(jìn)行測(cè)量。
[0042] 陽(yáng)離子型顆?？蛇x自表面活性劑膠束，具體是非離子兩親型表面活性劑和陽(yáng)離子 表面活性劑膠束，嵌段聚合物膠束，具體是陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物膠束、非離子兩親型嵌 段聚合物和陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物膠束和非離子兩親型嵌段聚合物和陽(yáng)離子表面活性 劑膠束，非離子和陽(yáng)離子表面活性劑脂質(zhì)體，非離子表面活性劑微囊，油質(zhì)體，毫微乳劑顆 粒，毫微膠囊，有機(jī)顆?；驘o(wú)機(jī)顆粒。
【具體實(shí)施方式】
[0043]下面且以未窮盡的方式列舉根據(jù)本發(fā)明可用的陽(yáng)離子型顆粒。
[0044] 表面活性劑膠束
[0045]我們回想一下，膠束是當(dāng)兩親型分子溶于水中或油中，在超過(guò)某一特定的稱為臨 界的:CMC濃度時(shí)自發(fā)形成的聚集體。
[0046] 可用于本發(fā)明范圍內(nèi)的膠束由至少一種陽(yáng)離子表面活性劑組成。該陽(yáng)離子表面活 性劑可與一種或多種非離子兩親型表面活性劑締合。
[0047] 本領(lǐng)域技術(shù)人員可以從McCutcheons的 "emulsifiers and detergents" 1998版以 及其后的版本中方便地選擇非離子和陽(yáng)離子的表面活性劑。
[0048] 作為非限制性的例子，下面列出了本發(fā)明范圍內(nèi)可用的陽(yáng)離子表面活性劑。
[0049]非限制地，可用的非離子表面活性劑是:PE0、甘油和聚甘油、氧乙烯化或未氧乙烯 化的山梨聚糖、蔗糖、氧乙烯化或未氧乙烯化的葡萄糖、麥芽糖、PP0-PEQ的烷基和聚烷基 (C6至C30，飽和的或未飽和的，分支的或未分支的)酯或醚。
[0050] 就非離子表面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑的混合物來(lái)說(shuō)，其各自的重量比將為 99/1至1/99。
[0051] 形成膠束的表面活性劑的量將取決于后者的CMC。然而，在本發(fā)明中，膠束表面活 性劑的濃度以其重量計(jì)算相對(duì)于組合物總重量為0.1-10%，且優(yōu)選為0.2-5%。
[0052] 嵌段聚合物膠束
[0053]兩親型嵌段聚合物膠束可按照文獻(xiàn)W0 04/035013中描述的方法進(jìn)行制備。
[0054]用于制備與根據(jù)本發(fā)明的dsRNAs締合的膠束的嵌段共聚物具體是兩親型嵌段聚 合物，其優(yōu)選為非離子的，二嵌段或三嵌段，且其與水接觸能形成膠束。它們具體是二嵌段 (A-B)或三嵌段(A-B-A)的類(lèi)型，A對(duì)應(yīng)于非離子親水聚合物嵌段而B(niǎo)對(duì)應(yīng)于疏水聚合物嵌 段。該聚合物的分子量可為1000至100 000,而A/B的比率可為1/100至50/1。
[0055]在本發(fā)明中，可用到三種類(lèi)型的膠束：
[0056]-陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物膠束；
[0057]-非離子兩親型嵌段聚合物與陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物締合的混合膠束;和 [0058]-非離子兩親型嵌段聚合物與陽(yáng)離子表面活性劑締合的膠束。
[0059] 非離子親水聚合物嵌段可選自聚環(huán)氧乙烷(PE0)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
[0060]疏水聚合物嵌段可選自聚苯乙烯、聚（叔丁基苯乙烯）、聚（甲基丙烯酸甲酯）、聚 (丙烯酸乙酯）、聚（丙烯酸丁酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（乙酸乙烯酯）、聚己酸內(nèi)酯、聚己 內(nèi)酰胺、聚二甲基硅氧烷、聚(C 3_C6環(huán)氧烷）、聚(天冬氨酸）、聚(乳酸）、聚（乙醇酸）、聚亮氨 酸、聚丁二烯、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯。
[0061] 嵌段共聚物優(yōu)選選自下列嵌段共聚物：
[0062] -聚環(huán)氧丙烷/聚環(huán)氧乙烷 [0063]-聚苯乙烯/聚氧乙烯
[0064]-聚（甲基丙烯酸甲酯)/聚氧乙烯
[0065]-聚（甲基丙烯酸丁酯)/聚氧乙烯
[0066]-聚氧化丁烯/聚氧乙烯
[0067]-聚己酸內(nèi)酯/聚氧乙烯
[0068]-聚乙烯/聚氧乙烯
[0069]-聚氧乙烯/聚氧化丁烯/聚氧乙烯。
[0070] 在本發(fā)明中，有必要向膠束組合物中添加：
[0071] -陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物，所述嵌段中的一種是陽(yáng)離子的且舉例來(lái)說(shuō)可選自： [0072]-聚(聚甲基丙烯酸三甲基乙銨）；
[0073] -季銨化的聚（甲基丙烯酸二甲氨基乙酯）；
[0074] -聚甲基乙烯基咪唑:饑 (polymethyvinylimidazolium);
[0075] -聚（乙烯基苯甲基三甲基氯化銨）（po ly (viny lbenzy 1 tr imethy lammonium chloride))〇
[0076] 非離子兩親型嵌段聚合物與陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物的締合為使兩者之間的比 率為99/1至1/99;
[0077] 和/或
[0078] -如下面所列的至少一種陽(yáng)離子表面活性劑。
[0079] 在這種情況下，非離子兩親型嵌段聚合物與陽(yáng)離子表面活性劑的各自比率將為 50/50至99/1。
[0080] 在本發(fā)明中，與陽(yáng)離子表面活性劑締合或未締合的膠束嵌段聚合物的濃度，以其 重量計(jì)算相對(duì)于組合物的總重量將為0.1-10%，且優(yōu)選0.2-5 %。
[0081] 在本明的一個(gè)變形中，也可能形成由如上所述的陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物組成的 膠束。
[0082] 脂質(zhì)體和非離子表面活性劑微囊
[0083]能夠形成非離子脂質(zhì)體的非離子兩親型脂質(zhì)具體是專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 582 503中描 述的那些。
[0084] 具體地，非離子兩親型脂質(zhì)可由至少一種多元醇和至少一種脂肪酸的酯混合物組 成，其中所述多元醇選自含有1-60個(gè)環(huán)氧乙烷單元的聚乙二醇、山梨聚糖、具有2-60個(gè)環(huán)氧 乙烷單元的山梨聚糖、具有2-30個(gè)環(huán)氧乙烷單元的甘油、含有2-15個(gè)甘油單元的聚甘油、蔗 糖、具有2-30個(gè)環(huán)氧乙烷單元的葡萄糖，所述脂肪酸含有線性或分支的、飽和或不飽和的 C 5-Cn烷基鏈，每個(gè)多元醇基團(tuán)的烷基鏈數(shù)目為1 -10。
[0085] 術(shù)語(yǔ)"酯混合物"不但包括不同化學(xué)族的純酯的混合物，也包括以各種比例含有相 同族的多元醇的幾種化學(xué)純酯的任何產(chǎn)品。具體地，在其親水部分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)化學(xué)式的產(chǎn) 品就是這樣，例如化學(xué)式C0-(0CH 2-CH0H_CH2)n-OH的聚甘油酯，其中n是統(tǒng)計(jì)學(xué)值，且其可含 有n=l，11 = 2，11 = 3，11 = 4等的各種比例的酯;在其親脂部分含有幾種烷基鏈的酯也是這樣， 例如椰油酸酯，其含有(：5-& 7烷基鏈，或異硬脂酸酯，其中C17烷基鏈?zhǔn)峭之悩?gòu)形式的復(fù)雜 混合物；由相同多元醇的單_、二_、三-或聚酯的混合物組成的產(chǎn)品也是這樣。需注意的是， 只含有能夠形成小泡的單酯和另一種類(lèi)型雜質(zhì)的產(chǎn)品不能用于本發(fā)明。
[0086] 商品酯可單獨(dú)地用于本發(fā)明，因?yàn)樗鼈儗?shí)際上是酯的混合物，它們?yōu)槔缦率龅模?br>[0087] - "ICI"公司出售的商品名為"SFAN 20，40，60和80"的山梨聚糖(或山梨糖醇酐)和 脂肪酸的偏酯；
[0088] -"NIKK0"公司出售的商品名為"SI 10 R NIKK0L"的異硬脂酸山梨聚糖酯；
[0089] -"ICI"公司出售的名為"TWEEN 61"的、具有4個(gè)環(huán)氧乙烷單元的硬脂酸山梨聚糖 酯；
[0090] -"ICI"公司出售的名為"MYR J 45"的、含有8個(gè)環(huán)氧乙烷單元的硬脂酸聚乙二醇 醋；
[0091] -"NIKK0"公司出售的名為"MYS 4"的化學(xué)式為EMI6.1的單硬脂酸聚乙二醇酯，其 中化學(xué)式n等于4;
[0092] -"UNICHEMA"公司出售的化學(xué)等級(jí)或生物技術(shù)生產(chǎn)的等級(jí)的分子量為400的硬脂 酸聚乙二醇酯；
[0093] - "H0ECHST"公司出售的名為"HOSTACERINE DGS"的、具有4個(gè)環(huán)氧乙烷單元的硬脂 酸二甘油酯；
[0094] -"NIKK0"公司出售的名為"TETRAGLYN 1S"的硬脂酸四甘油酯；
[0095] -"S0LVAY"公司出售的異硬脂酸二甘油酯；
[0096] -"NIHON"公司出售的名為"EMALEX DSG 2"的二硬脂酸二甘油酯；
[0097] -"CR0DA"公司出售的名為卞50小70^110和？1600?00￡51六"的單-、二-和三硬脂酸 棕櫚酸蔗糖酯；
[0098] -"GRILL0"公司出售的名為"GRILLOTEN PSE 141G"的單硬脂酸棕櫚酸蔗糖酯和二 硬脂酸棕櫚酸蔗糖酯的混合物；
[0099] -"ICI"公司出售的名為"ARLAT0NE 2121"的硬脂酸蔗糖酯和椰油酸蔗糖酯的混合 物；
[0100] -"AMERCH0L"公司出售的名為"GLUCAM E 20DISTEARATE"的、具有20個(gè)環(huán)氧乙烷單 元的二硬脂酸甲基葡萄糖酯。
[0101] 當(dāng)然，可以使用以上已經(jīng)是混合物的產(chǎn)品相互之間的混合物，或者這些產(chǎn)品與純 的廣品的混合物。
[0102] 陽(yáng)離子表面活性劑選自下文所列的，且從而它們賦予分散體的pH為5-8;在脂質(zhì)相 中，非尚子兩未型脂質(zhì)的量與陽(yáng)尚子表面活性劑的量的重量比為50/1到50/25，且分散體的 脂質(zhì)相與水相的重量比為1/1000到300/1000。
[0103] 油質(zhì)體
[0104]本發(fā)明涉及的油質(zhì)體在專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 705 593中有描述。它們包括一種水包油類(lèi) 型的乳劑，其由帶有層狀液晶包被的油質(zhì)小球構(gòu)成，分散在水相中，其特征是每個(gè)油質(zhì)小球 作為一個(gè)單位，包被著單層的或多層的層(經(jīng)冷凍斷裂(cryofracture)后利用透射電子顯 微鏡術(shù)可以觀測(cè)到1-10個(gè)薄片），所述層由至少一種親脂表面活性劑、至少一種親水的表面 活性劑以及至少一種陽(yáng)離子表面活性劑得到，賦予乳劑的pH為5-8,所述被包被的油質(zhì)小球 的平均直徑小于500納米。
[0105]親脂表面活性劑和親水表面活性劑各含有至少一種具有超過(guò)約12個(gè)碳原子的飽 和脂肪鏈。更為優(yōu)選的是，該脂肪鏈含有16至22個(gè)碳原子。
[0106] 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，親脂表面活性劑的HLB為約2至約5。為大家 所熟知的是，術(shù)語(yǔ)HLB(親水-親脂平衡)用于指表面活性劑的親水基團(tuán)的大小和強(qiáng)度與親脂 基團(tuán)的大小和強(qiáng)度之間的平衡。
[0107] 這樣的親脂表面活性劑的例子是二硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸二甘油酯、三硬脂酸 四甘油酯、十硬脂酸十甘油酯、單硬脂酸二甘油酯、三硬脂酸六甘油酯、五硬脂酸十甘油酯、 單硬脂酸山梨聚糖酯、三硬脂酸山梨聚糖酯、單硬脂酸二甘醇酯、棕櫚酸和硬脂酸的甘油 酯、聚氧乙烯化的單硬脂酸酯20E(包含2個(gè)氧乙烯單元）、單山崳酸甘油酯和二山崳酸甘油 酯以及四硬脂酸季戊四醇酯。
[0108] 親水表面活性劑優(yōu)選具有約8至約12的HLB。
[0109] 作為這樣的親水表面活性劑例子，可提及下列化合物:聚氧乙烯化的山梨糖醇酐 單硬脂酸酯40E、聚氧乙烯化的山梨糖醇酐三硬脂酸酯200E、聚氧乙烯化的單硬脂酸酯80E、 單硬脂酸六甘油酯、聚氧乙烯化的單硬脂酸酯100E、聚氧乙烯化的二硬脂酸酯120E以及聚 氧乙烯化的二硬脂酸甲基葡萄糖酯200E。
[0110] 陽(yáng)離子表面活性劑可選自下文中描述的化合物。
[0111] 毫微乳劑
[0112] 陽(yáng)離子型顆粒還可以選自水包油的毫微乳劑，其包含在水相中分散的油相，其油 質(zhì)小球的數(shù)均大小小于l〇〇nm，特征是它們包含至少一種兩親型脂質(zhì)，所述兩親型脂質(zhì)含有 至少一種非離子兩親型脂質(zhì)和一種陽(yáng)離子兩親型脂質(zhì)，油相和兩親型脂質(zhì)存在的含量使得 油相/兩親型脂質(zhì)的重量比為3到10。
[0113] 毫微乳劑一般具有透明至淺藍(lán)色的外觀。所述毫微乳劑的透明度通過(guò)在600nm下 處于10-90%的透射系數(shù)，或者通過(guò)濁度進(jìn)行測(cè)量。本發(fā)明的組合物的濁度是60到400NTU， 且優(yōu)選70到300NTU，所述濁度是利用型號(hào)為2100P的HACH便攜式濁度儀在約25°C下測(cè)量的。
[0114] 本發(fā)明的毫微乳劑的油質(zhì)小球的數(shù)均大小小于100nm，且優(yōu)選20-80nm，且更優(yōu)選 40-60nm。小球大小的降低使得可能促進(jìn)活性劑穿透進(jìn)入皮膚表面層(載體效應(yīng)）。
[0115] 根據(jù)本發(fā)明的毫微乳劑優(yōu)選在4-45°C的溫度制備，且因此與熱敏活性劑相容。
[0116] 這些分散體在下列申請(qǐng)中有具體的描述:EP 0728 460、EP 0 879 589、EP 1 010 413、EP 1 010 414、EP 1 010 416、EP 1 013 338、EP 1 016 453、EP 1 018 363、EP 1 025 898以及EP 1 120 102。在所有這些申請(qǐng)中都指明，為了提高顆粒的穩(wěn)定性，可向非離子表 面活性劑(或混合物）中加入離子表面活性劑。
[0117] 在本發(fā)明的情況中，一種或多種陽(yáng)離子表面活性劑將專(zhuān)門(mén)用作離子表面活性劑。
[0118] 上述參考文獻(xiàn)中指出的比例予以保留，且以陽(yáng)離子表面活性劑為例，選擇列表中 對(duì)所有顆粒通用的。
[0119] 非離子表面活性劑，優(yōu)選水溶性的或在水分散性的，含有至少一種疏水的嵌段和 至少一種親水的嵌段。
[0120] 本發(fā)明的非離子兩親型脂質(zhì)優(yōu)選選自：
[0121] 1/硅氧烷表面活性劑，
[0122] 2/在溫度低于或等于45°C時(shí)為液體的兩親型脂質(zhì)，其選自至少一個(gè)多元醇或至少 一個(gè)脂肪酸的酯，其中脂肪酸含有至少一個(gè)線性或分支的、飽和或不飽和的，且具體是不飽 和的或分支的、C 8_C22烷基鏈，所述多元醇選自含有1至60個(gè)環(huán)氧乙烷單元的聚乙二醇、山梨 聚糖、含有2-30個(gè)環(huán)氧乙烷單元的甘油和含有2-15個(gè)甘油單元的聚甘油，
[0123] 3/脂肪酸和糖的酯以及脂肪醇和糖的醚，
[0124] 4/在溫度等于45°C時(shí)為固體的表面活性劑，其選自脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨聚 糖酯以及氧乙烯化的脂肪酸山梨聚糖酯、乙氧基化的脂肪醚以及乙氧基化的脂肪酸酯，
[0125] 5/環(huán)氧乙烷(A)和環(huán)氧丙烷(B)的嵌段共聚物，以及這些表面活性劑的混合物。
[0126] 1/可根據(jù)本發(fā)明使用的硅氧烷表面活性劑是含有至少一個(gè)氧乙烯化的鏈-OCH2CH 2-和/或氧丙烯化的鏈-〇CH2CH2CH2-的硅氧烷化合物；可提及文獻(xiàn)US-A-5，364，633和 US-A-5,411，744中描述的那些。
[0127] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的硅氧烷表面表面活性劑是式(II)的化合物：
[0129] 其中：
[0130] {^、心和心彼此獨(dú)立地代表^-以烷基自由基或者-"出^-⑶⑶:^出）^ (OCH 2CH2CH2)Z-0R4自由基，至少一個(gè)自由基Ri、R 2或R3不是烷基自由基;R4是氫、烷基自由基 或者?；杂苫?br>[0131] A是0至200的整數(shù)；
[0132] B是0至50的整數(shù);限定條件是A和B不同時(shí)等于零；
[0133] x是1至6的整數(shù)；
[0134] y是1至30的整數(shù)；
[0135] z是0至5的整數(shù)。
[0136] 根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，在式(X)的化合物中，烷基自由基是甲基自由 基，x是2-6的整數(shù)，且y是4-30的整數(shù)。
[0137] 作為式(II)的硅氧烷表面活性劑的例子，可以提及式(III)的化合物：
[0139] 其中A是20至105的整數(shù)，B是2至10的整數(shù)，并且y是10至20的整數(shù)。
[0140] 作為式(II)的硅氧烷表面活性劑的例子，還可以提及式(IV)的化合物：
[0141] H- ( OCH2CH2 ) y- ( CH2 ) 3- [ ( CH3 ) 2 S i 0 ] A- (cH2) 3- (OCH2CH2) y-OH (IV)
[0142] 其中A'和y是10至20的整數(shù)。
[0143] 作為硅氧烷表面活性劑，可具體使用由Dow Corning公司出售的名為DC 5329、DC 7439-146、DC 2-5695和Q4-3667的產(chǎn)品?；衔顳C 5329、DC 7439-146和DC 2-5695是式 (XI)的化合物，其中分別地，A是22，B是2并且y是12 4是103,8是10并且7是12 4是27,8是3 并且y是12。
[0144] 化合物Q4-3667是式（IV)的化合物，其中A是15并且y是13。
[0145] 2/在溫度低于或等于45°C時(shí)為液體的兩親型脂質(zhì)具體地可選自：
[0146] -UNICHEMA公司出售的名為Prisorine 3644的、分子量為400的異硬脂酸聚乙二醇 酯（CTFA名：PEG_8Isostearate);
[0147] -S0LVAY公司出售的異硬脂酸二甘油酯；
[0148] -S0LVAY公司出售的名為單月桂酸二甘油酯(Diglycerin-mono laurate)的、含有 兩個(gè)甘油單元的月桂酸聚甘油酯（月桂酸聚甘油-2酯）；
[0149] -ICI公司出售的名為SPAN 80的油酸山梨聚糖酯；
[0150] -NIKK0公司出售的名為NIKK0L SI 10R的異硬脂酸山梨聚糖酯；
[0151] -ULICE公司出售的a-丁基葡糖苷椰油酸酯或者a-丁基葡糖苷癸酸酯。
[0152] 3/根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質(zhì)的脂肪酸和糖的酯，優(yōu)選 在溫度低于或等于45°C時(shí)為固體，并且具體地選自C 8_C22脂肪酸與蔗糖、麥芽糖、葡萄糖或 者果糖形成的酯或酯的混合物，以及C14-C22脂肪酸與甲基葡萄糖形成的酯或酯的混合物。
[0153] 形成用于本發(fā)明的毫微乳劑的酯的脂肪單元的C8-C22SC14_C 22脂肪酸含有飽和或 不飽和的線性烷基鏈，其分別具有8-22或14-22個(gè)碳原子。酯的脂肪單元具體地可選自硬脂 酸、山崳酸、花生四烯酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸、月桂酸、癸酸及其混合物。優(yōu)選使用硬脂酸。
[0154] 作為脂肪酸與蔗糖、麥芽糖、葡萄糖或者果糖的酯或酯的混合物的例子，可以提及 單硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸蔗糖酯、三硬脂酸蔗糖酯及其混合物，例如Croda公司出售的名 為Crodesta ?50^70^110和？160的產(chǎn)品，其111^(親水-親脂平衡)分別是5、7、11和16;且作 為脂肪酸和甲基葡萄糖的酯或酯的混合物的例子，可以提及Goldschmidt公司出售的名為 Tego-care 450的二硬脂酸聚甘油-3甲基葡萄糖酯。還可以提及葡萄糖或麥芽糖的單酯，例 如〇-十六烷酰-6-D-葡糖苷甲酯和〇-十六烷酰-6-D-麥芽糖苷甲酯。
[0155] 根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質(zhì)的脂肪醇和糖的醚，在溫度 低于或等于45°C時(shí)為固體，且具體地選自C8_C 22脂肪酸與蔗糖、麥芽糖、葡萄糖或者果糖形 成的醚或醚的混合物，以及〇14_(：22脂肪酸與甲基葡萄糖形成的醚或醚的混合物。具體地是 烷基聚葡糖苷。
[0156] 形成用于本發(fā)明的毫微乳劑的醚的脂肪單元的C8_C22或者014_(： 22脂肪醇含有飽和 或不飽和的線性烷基鏈，其分別具有8-22或14-22個(gè)碳原子。醚的脂肪單元具體地可選自癸 基、鯨蠟基、二十二烷基、二十烷基、硬脂基、棕櫚基、肉豆蔻基、月桂基、辛基和十六烷酰單 元，以及它們的混合物，例如鯨錯(cuò)硬脂基(cetearyl)。
[0157] 作為脂肪醇和糖形成的醚的例子，可以提及如癸基葡糖苷和月桂基葡糖苷的烷基 聚葡糖苷，其例如由Henkel公司分別以商品名Plantaren 2000和Plantaren 1200出售的產(chǎn) 品，任選作為與十六醇十八醇混合物的混合物的鯨錯(cuò)硬脂基葡糖苷，其例如由Seppic公司 出售的Montanov 68、Goldschmidt公司出售的Tego-care CG90以及Henkel公司出售的 Emulgade KE3302,以及二十烷基葡糖苷，例如Seppic公司出售的名為Montanov 202的花生 醇和山崳醇與二十烷基葡糖苷的混合物的形式。
[0158] 作為這種類(lèi)型的非離子兩親型脂質(zhì)，更具體地使用單硬脂酸蔗糖酯、二硬脂酸蔗 糖酯、三硬脂酸蔗糖酯及其混合物、二硬脂酸聚甘油-3甲基葡萄糖酯和烷基聚葡糖苷。
[0159] 4/根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質(zhì)的甘油脂肪酸酯，在溫度 低于或等于45°C時(shí)為固體，具體地可選自由至少一種含有16-22個(gè)碳原子的飽和線性烷基 鏈的酸和1-10個(gè)甘油單元形成的酯。一種或多種這樣的甘油脂肪酸酯可用于本發(fā)明的毫微 乳劑。
[0160] 這些酯具體地選自硬脂酸酯、山崳酸酯、花生酸酯、棕櫚酸酯及其混合物。優(yōu)選使 用硬脂酸酯和棕櫚酸酯。
[0161] 作為可用于本發(fā)明的毫微乳劑的表面活性劑的例子，可以提及單硬脂酸十甘油 (10個(gè)甘油單元)酯、二硬脂酸十甘油（10個(gè)甘油單元)酯、三硬脂酸十甘油（10個(gè)甘油單元） 酯和五硬脂酸十甘油（10個(gè)甘油單元）酯（CTFA名：Polyglyceryl-lOstearate、 Polyglyceryl-10distearate、Polyglyceryl_10tristearate、Polyglyceryl-lOpentastearate)，例如Nikko公司分別以名稱Nikkol Decaglyn 1-S、2_S、3_S和5-S出售 的產(chǎn)品，以及單硬脂酸二甘油酯(CTFA名：Polyglyceryl_2stearate)，例如Nikkol公司以名 Nikkol DGMS出售的產(chǎn)品。
[0162] 根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質(zhì)的山梨聚糖脂肪酸酯，在溫 度低于或等于45°C時(shí)為固體，具體地可選自由C 16_C22脂肪酸和山梨聚糖形成的酯以及由 C16_C22脂肪酸和山梨聚糖形成的氧乙烯化的酯。它們是由至少一種含有至少一條分別具有 16-22個(gè)碳原子的飽和線性烷基鏈的脂肪酸和山梨糖醇或乙氧基化的山梨糖醇形成的。氧 乙烯化的酯一般含有1-100個(gè)環(huán)氧乙烷單元，且優(yōu)選2-40個(gè)環(huán)氧乙烷(E0)單元。
[0163] 這些酯可具體地選自硬脂酸酯、山崳酸酯、花生酸酯、棕櫚酸酯及其混合物。優(yōu)選 使用硬脂酸酯和棕櫚酸酯。
[0164] 作為可用于本發(fā)明的毫微乳劑的山梨聚糖脂肪酸酯以及氧乙烯化的山梨聚糖脂 肪酸酯的例子，可以提及ICI公司以名Span 60出售的單硬脂酸山梨聚糖酯（CTFA名： Sorbitan stearate)，ICI公司以名Span 40出售的單棕櫚酸山梨聚糖酯（CTFA名：Sorbitan palmitate)，以及ICI公司以名Tween 65出售的三硬脂酸山梨聚糖酯20E0(CTFA名： Polysorbate 65)。
[0165] 根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質(zhì)的乙氧基化的脂肪族醚，在 溫度低于或等于45°C時(shí)為固體，優(yōu)選為由1-100個(gè)環(huán)氧乙烷單元和至少一個(gè)具有16-22個(gè)碳 原子的脂肪醇鏈形成的醚。醚的脂肪族鏈具體選自二十二烷基、二十烷基、硬脂基和鯨蠟基 單元及其混合物，如鯨蠟硬脂基。作為乙氧基化的脂肪族醚的例子，可以提及含有5、10、20 和30個(gè)環(huán)氧乙燒單元的山箭醇釀（CTFA名：Beheneth-5、Beheneth-10、Beheneth_20、 Beheneth-30)，例如Nikko公司以名Nikkol BB5、BB10、BB20和BB30出售的產(chǎn)品，以及含有兩 個(gè)環(huán)氧乙烷單元的硬脂醇醚(CTFA名：Steareth-2)，例如ICI公司以名Brij 72出售的產(chǎn)品。
[0166] 根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑中的非離子兩親型脂質(zhì)的乙氧基化的脂肪酸酯，在 溫度低于或等于45°C時(shí)為固體，是由1-100個(gè)環(huán)氧乙烷單元和至少一個(gè)具有16-22個(gè)碳原子 的脂肪酸鏈形成的酯。酯的脂肪族鏈具體選自硬脂基、二十二烷基、二十烷基和棕櫚基單元 及其混合物。作為乙氧基化的脂肪酸酯的例子，可以提及含有40個(gè)環(huán)氧乙烷單元的硬脂酸 酯，例如ICI公司以名Myrj 52(CTFA名:PEG-40stearate)出售的產(chǎn)品以及含有8個(gè)環(huán)氧乙烷 單元的山箭酸酯（CTFA名：PEG_8behenate)，例如Gattefosse公司以名Compritol HD5AT0出 售的產(chǎn)品。
[0167] 5/根據(jù)本發(fā)明，可用作毫微乳劑的非離子兩親型脂質(zhì)的環(huán)氧乙烷和環(huán)氧丙烷的嵌 段共聚物，具體地可選自式(V)的嵌段共聚物：
[0168] M0 (C2H4O) x (C3H60) y (C2H4O) zH (V)
[0169] 其中x、y和z是整數(shù)，從而x+z的范圍為2-100，y的范圍為14-60,以及它們的混合 物，且更具體選自HLB為2-16的式(V)的嵌段共聚物。
[0170] 這些嵌段共聚物可具體選自泊洛沙姆，且具體選自泊洛沙姆231，如ICI公司以名 Pluronic L81出售的式(V)(其中x = z = 6，y = 39)(HLB 2)的產(chǎn)品；泊洛沙姆282,如ICI公司 以名Pluronic L92出售的式(V)(其中x = z = 10，y = 47)(HLB 6)的產(chǎn)品；以及泊洛沙姆124， 如ICI公司以名Pluronic L44出售的式(V)(其中x = z = ll，y = 21)(HLB 16)的產(chǎn)品。
[0171] 作為非離子兩親型脂質(zhì)，還可提及文獻(xiàn)EP-A-705593中所述的非離子表面活性劑 的混合物，此處將所述文獻(xiàn)引入作為參考。
[0172] 在非離子兩親型脂質(zhì)中，可具體使用：
[0173] -PEG 400異硬脂酸酯或PEG-8異硬脂酸酯(含8mol環(huán)氧乙烷），
[0174] -異硬脂酸二甘油酯，
[0175] -含有2單元甘油的單月桂酸聚甘油酯和含10單元甘油的硬脂酸聚甘油酯，
[0176] -油酸山梨聚糖酯，
[0177] -異硬脂酸山梨聚糖酯及其混合物。
[0178] 根據(jù)本發(fā)明，非離子兩親型脂質(zhì)在毫微乳劑中的含量相對(duì)于組合物的總重量為 0.2重量％至12重量％，且優(yōu)選為0.2重量％至8重量％，且更優(yōu)選為0.2重量％至6重量％。
[0179] 陽(yáng)離子兩親型脂質(zhì)選自下文所列的那些。
[0180] 它們?cè)诒景l(fā)明的毫微乳劑中存在的濃度，優(yōu)選為相對(duì)于毫微乳劑的總重量的0.01 至6重量％，且更優(yōu)選為0.2至4重量％。
[0181] 油：
[0182] 根據(jù)本發(fā)明的毫微乳劑的油相中含有至少一種油?？捎糜诒景l(fā)明的毫微乳劑中的 油優(yōu)選自：
[0183] -動(dòng)物或植物來(lái)源的油，其由脂肪酸和多元醇的酯構(gòu)成，具體是液態(tài)的甘油三酯， 例如葵花油、玉米油、大豆油、鱷梨油、霍霍巴油、骨髓油、葡萄子油、芝麻油、榛子油、魚(yú)油和 glyceryl tricaprocaprylate，或式為Rg⑶ORio的植物或動(dòng)物油，其中R9代表含有7至29個(gè) 碳原子的高級(jí)脂肪酸殘基，并且R 1Q代表含有3至30個(gè)碳原子的線性的或分支的基于烴的鏈， 具體是烷基或鏈烯基，例如puree 11 in油或液體霍霍巴木蠟；
[0184] -天然的或合成的精油，例如桉葉油、雜熏衣草油、熏衣草油、韋惕蔚油、山蒼子油、 檸檬油、檀香油(sandlewood oil)、迷迭香油、春黃菊油、香薄荷油、肉豆蔻油、肉桂油、海索 草油(hyssop oil)、f蒿子油、橙油、香葉醇油、杜松油和香檸檬油；
[0185] -合成油，例如parleam油、聚稀經(jīng)和液體羧酸酯；
[0186] -礦物油，例如十六烷、異十六烷和石蠟油；
[0187] -鹵代油，具體是碳氟化合物，例如氟代胺(f luoroamine)，如全氟三丁胺，氟代烴， 例如全氟代十氫化萘(perfluorodecahydro-naphthalene)、氟代酯和氟代醚；
[0188] _揮發(fā)性或非揮發(fā)性的硅油。
[0189] 可用作合成油的聚烯烴具體是聚a-烯烴，且更具體是那些氫化的或未氫化的聚丁 烯類(lèi)型，且優(yōu)選氫化的或未氫化的聚異丁烯類(lèi)型。
[0190] 可用作合成油的液體羧酸酯可以是單羧酸酯、二羧酸酯、三羧酸酯或四羧酸酯。酯 的總碳數(shù)目一般大于或等于10,且優(yōu)選小于100,且更優(yōu)選小于80。它們具體是飽和或不飽 和的、線性的或分支的Q-C26脂族酸與飽和或不飽和的、線性的或分支的&-C26脂族醇形成 的單酯，酯的總碳數(shù)目一般大于或等于10。也可以使用C 4-C22二羧酸或三羧酸與Q-C22醇形 成的酯，以及一羧酸、二羧酸或三羧酸與C2-C 26二羥基、三羥基、四羥基或五羥基醇形成的 酯。
[0191] 在上面所述的酯中，優(yōu)選使用棕櫚酸烷基酯，例如棕櫚酸乙酯、棕櫚酸異丙酯、棕 櫚酸2-乙基己酯、棕櫚酸2-辛基癸酯；肉豆蔻酸烷基酯，例如肉豆蔻酸異丙酯、肉豆蔻酸丁 酯、肉豆蔻酸鯨蠟酯、肉豆蔻酸2-辛基十二醇酯;硬脂酸烷基酯，例如硬脂酸己酯、硬脂酸丁 酯、硬脂酸異丁酯;蘋(píng)果酸烷基酯，例如蘋(píng)果酸二辛酯；月桂酸烷基酯，例如月桂酸己酯和月 桂酸2-己基癸酯;異壬酸異壬酯；辛酸鯨蠟酯。
[0192] 有利地，根據(jù)本發(fā)明的毫微乳劑含有至少一種分子量大于或等于400的油，具體是 400至10 000，更好地是400至5000，或甚至為400至2500。分子量大于或等于400的油可選自 動(dòng)物或植物來(lái)源的油、礦物油、合成油和硅油，以及它們的混合物。作為這種類(lèi)型的油，舉例 來(lái)說(shuō)，可以提及棕櫚酸異鯨蠟酯、硬脂酸異鯨蠟酯、鱷梨油和霍霍巴油。
[0193] 根據(jù)本發(fā)明的毫微乳劑包含一定量的油相(除兩親型脂質(zhì)之外的油和其它脂肪物 質(zhì)），所述量?jī)?yōu)選相對(duì)于毫微乳劑的總重量為2-40重量％，且更具體是4-30重量％，且更優(yōu) 選是4-20重量％。
[0194] 油相和兩親型脂質(zhì)（非離子和離子的兩親型脂質(zhì)）優(yōu)選在根據(jù)本發(fā)明的毫微乳劑 中按照油相的量和兩親型脂質(zhì)的量的重量比為3至10存在，且更為優(yōu)選的范圍是3至6。術(shù)語(yǔ) "油相的量"在本文中指的是這種油相的成分的總量，不包括兩親型脂質(zhì)的量。根據(jù)本發(fā)明 的毫微乳劑除了上述式（I)的尿素衍生物之外，如果必要的話，還可含有溶劑，具體用于提 高組合物的透明度。
[0195] 這些溶劑優(yōu)先選自：
[0196] -CrCs低級(jí)醇，例如乙醇；
[0197] -二元醇，例如甘油、丙二醇、1，3-丁二醇、一縮二丙二醇或者含有4至16個(gè)，且優(yōu)選 8至12個(gè)環(huán)氧乙烷單元的聚乙二醇；
[0198] -糖類(lèi)，例如葡萄糖、果糖、麥芽糖、乳糖或者蔗糖。
[0199] 這些溶劑可作為混合物使用。當(dāng)它們存在于本發(fā)明的毫微乳劑中時(shí)，可使用的濃 度優(yōu)選相對(duì)于毫微乳劑的總重量為0.01-30重量％，且更好地為相對(duì)于毫微乳劑的總重量 的5-20重量％。醇和/或糖的量相對(duì)于毫微乳劑的總重量?jī)?yōu)選為5-20重量％，并且二元醇的 量相對(duì)于暈微乳劑的總重量?jī)?yōu)選為5_15重量％。
[0200] 制備方法：
[0201] 制備上面所限定的毫微乳劑的方法是，將含有尿素衍生物的水相和油相在溫度范 圍10°C-8(TC下通過(guò)強(qiáng)烈攪拌進(jìn)行混合，在大于5X10 7Pa的壓力下進(jìn)行高壓勻漿步驟，且任 選地加入所用的聚合物。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，隨后在大于5X10 7Pa的壓力下再進(jìn) 行另外一個(gè)高壓勻漿步驟。高壓勻漿優(yōu)選在壓力為6X107Pa至18X10 7Pa下進(jìn)行。剪切優(yōu)選 為2 X 106s-1至5 X 108s-1，且更好地是1 X 108s-1至3 X 108s-Hs-1表示秒-4。該方法使得可能 生產(chǎn)出與熱敏的活性化合物相容的毫微乳劑，它可以含有油和具體的香料，其中含有脂肪 物質(zhì)，而不會(huì)使其變性。
[0202] 毫微膠囊
[0203] 本發(fā)明的毫微膠囊是專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 447 318、EP 0 557 489、EP 0 780 115、EP 1 025 901、EP 1 029 587、EP 1 034 839、EP 1 414 390、FR2 830 776、EP 1 342 471、FR 2 848 879和FR 04/50057所描述的那些。
[0204] 毫微膠囊是具有油質(zhì)芯和聚合物殼的芯-殼顆粒。上述的各個(gè)申請(qǐng)涉及各族聚合 物以及各種獲得它們的方法。膠囊的大小總是小于lMi，且其可能具有小于80nm的大小。這 些顆?？捎脤訝钜壕喟?，所述液晶相最常見(jiàn)由卵磷脂或聚二甲基硅氧烷共聚醇組成。 包被必須由在與水接觸時(shí)能夠自發(fā)形成層狀液晶相的兩親型脂質(zhì)組成。向這種能夠形成層 狀相的兩親型脂質(zhì)加入能夠賦予顆粒(毫微膠囊)正G電勢(shì)的陽(yáng)離子表面活性劑。形成層狀 相的兩親型脂質(zhì)與陽(yáng)離子表面活性劑的重量比為99/1-75/25。
[0205]可用的陽(yáng)離子表面活性劑如下文中所列。
[0206] 有機(jī)顆粒
[0207] 本發(fā)明的有機(jī)顆粒是固體毫微球體(nanosphere)，其不具有內(nèi)腔，可通過(guò)各種方 法形成(在水中分散、毫微沉淀(仙11(^^(^口；^31：；[011)、微乳劑等），并且由至少一種聚合物 或者至少一種共聚物，或者它們的混合物組成。由于聚合物或共聚物是陽(yáng)離子的，或者由于 它(們)是非離子的且使用了如下文所述的陽(yáng)離子表面活性劑，所以顆粒是陽(yáng)離子的，具有 上文限定的G電勢(shì)。陽(yáng)離子表面活性劑的量相對(duì)于聚合物為0-25%。
[0208] 無(wú)機(jī)顆粒
[0209 ]本發(fā)明的陽(yáng)離子無(wú)機(jī)顆粒舉例來(lái)說(shuō)，可以基于硅石、T i02、ZnO、氧化鋁等。例如，可 以提及如Nalco公司的Nanomer 2顆粒的水中膠體分散體中的氧化錯(cuò)顆粒。Clariant和 Grace也提供這種類(lèi)型的顆粒。
[0210] 可用于制備本發(fā)明的陽(yáng)離子型顆粒的陽(yáng)離子表面活性劑
[0211] 可根據(jù)本發(fā)明使用的陽(yáng)離子表面活性劑在下文列舉，該列舉是非限制性的。
[0212] 陽(yáng)離子兩親型脂質(zhì)優(yōu)選選自季銨鹽和脂肪族胺及其鹽。
[0213]季銨鹽舉例來(lái)說(shuō)為：
[0214]-具有如下式（IV)的那些：
[0216]其中自由基RlSR4,可以是相同的或不同的，代表線性的或分支的含有1至30個(gè)碳 原子的脂族自由基，或者芳族自由基，例如芳基或烷基芳基。脂族自由基可以含有雜原子， 例如具體是氧、氮、硫或鹵素。例如，脂族自由基選自下列自由基:烷基、烷氧基、聚氧化(C2-C 6)烯、烷基酰胺、（C12-C22)烷基酰胺_(C2_C 6)烷基、乙酸(C12-C22)烷基酯、羥烷基，其含有約1 至30個(gè)碳原子;X是選自鹵化物、磷酸根、乙酸根、乳酸根、（C 2-C6)烷基硫酸根以及烷基-或烷 基芳基磺酸根的陰離子，
[0217]-咪唑啉懲鹽的季銨鹽，例如，具有如下式(V)的那些：
[0219] 其中他代表含有8至30個(gè)碳原子的鏈烯基或烷基自由基，例如衍生自動(dòng)物脂肪酸 的自由基，R6代表氫原子、Q-C4烷基自由基或者含有8至30個(gè)碳原子的鏈烯基或烷基自由 基，R7代表Q-C4烷基自由基，Rs代表氫原子或者(^-〇4烷基自由基，且X是選自鹵化物、磷酸 根、乙酸根、乳酸根、烷基硫酸根以及烷基-或烷基芳基磺酸根的陰離子。優(yōu)選地，R#PR 6代表 含有12至21個(gè)碳原子的鏈烯基或烷基自由基的混合物，例如由動(dòng)物脂肪酸衍生而來(lái)的那 些，R7表示甲基，且Rs表示氫原子。舉個(gè)例子來(lái)說(shuō)，所述產(chǎn)品是由REW0公司以名"REWOQUAT W 75"出售的產(chǎn)品。
[0220] -具有式(VI)的季二銨鹽（quaternary diammonium):
[0222] 其中R9代表含有約16到30個(gè)碳原子的脂族自由基，-、如幾^如和心^可以相同 或不同，選自氫或含有1至4個(gè)碳原子的烷基自由基，且X是陰離子，其選自鹵化物、乙酸根、 磷酸根、硝酸根以及甲基磺酸根。這樣的季二銨鹽具體包括丙烷動(dòng)物脂聯(lián)銨二氯化物 (propanetallowdiammonium dichloride)；
[0223]-包含至少一種酯功能的季銨鹽
[0224]可根據(jù)本發(fā)明使用的包含至少一種酯功能的季銨鹽是，例如，具有下式(VII)的那 些：
[0226] 其中：
[0227] -R15選自&-C6烷基自由基和&-C6輕烷基或二羥烷基自由基；
[0228] -R16選自：
[0229] -自由基
[0231 ]-基于線性或分支的、飽和或不飽和的C1-C22經(jīng)的自由基R20，
[0232] -氫原子，
[0233] -R18選自：
[0234] -自由基
[0236] -基于線性或分支的、飽和或不飽和的Ci_C6烴的基團(tuán)R22，
[0237] -氫原子，
[0238] _Rl7、Rl9和R21，可以相同或不同，選自基于線性或分支的、飽和或不飽和的C7-C21烴 的自由基；
[0239] -n、p和r，可以相同或不同，是2至6的整數(shù)；
[0240] -y是1至10的整數(shù)；
[0241] -x和z，可以相同或不同，是0至10的整數(shù)；
[0242] -X-是簡(jiǎn)單或復(fù)雜的有機(jī)或無(wú)機(jī)陰離子；限制條件是x+y+z的和是1至15,當(dāng)x是0 時(shí)，Rl6代表R2Q，且當(dāng)Z是0時(shí)，R18代表R22。
[0243] 烷基自由基R15可以是線性或分支的，且更具體是線性的。
[0244] 優(yōu)選地，R15代表甲基、乙基、羥乙基或二羥丙基自由基，且更具體是甲基或乙基自 由基。有利地，x+y+z的和是1至10。
[0245] 當(dāng)R16是基于烴的自由基R2Q時(shí)，它可以是長(zhǎng)的且含有12至22個(gè)碳原子，或者是短的 且含有1至3個(gè)碳原子。
[0246] 當(dāng)R18是基于烴的基團(tuán)R22時(shí)，它優(yōu)選含有1至3個(gè)碳原子。
[0247] 有利的是，R17、R19和R21，可以相同或不同地，選自基于線性或分支的、飽和或不飽 和的Cn_C21經(jīng)類(lèi)的自由基，且更具體是選自線性或分支的、飽和或不飽和的Cn_C2^基或鏈 烯基自由基。
[0248] 優(yōu)選地，x和z，可以相同或不同地，是0或1。
[0249] 有利地，y等于1。
[0250] 優(yōu)選地，n、p和r，可以相同或不同地，是2或3,且更具體等于2。
[0251 ]陰離子優(yōu)選地是鹵化物(氯化物、溴化物或碘化物)或者烷基硫酸根，更具體是甲 基硫酸根。然而，可以使用甲磺酸根、磷酸根、硝酸根、甲苯磺酸根、衍生自如乙酸根或乳酸 根的有機(jī)酸的陰離子，或者任何其它與包含酯功能的銨相容的陰離子。
[0252 ]陰離子)T更具體地是氯化物或甲基硫酸根。
[0253]更具體地使用具有式(VII)的銨鹽，其中：
[0254] -R15代表甲基或乙基自由基，
[0255] -x 和 y 等于 1;
[0256] -z 等于〇或 1;
[0257] n、p和r 等于2;
[0258] -R16選自：
[0259] -自由基
[0261] -甲基、乙基或基于&4-C22經(jīng)的自由基；
[0262] -氫原子；
[0263] -R18選自：
[0264] -自由基
[0266] -氫原子：
[0267] Rl7、Rl9和R21，可以相同或不同，選自基于線性或分支的、飽和或不飽和的C13-C17烴 的自由基，且更具體選自線性或分支的、飽和或不飽和&3-&7烷基或鏈烯基自由基。
[0268] 有利地，基于烴的自由基是線性的。
[0269] 例如，可以提及具有式(VII)的化合物，如二?；已趸卒@、二?；已趸u 基乙基甲基胺、單酰基乙氧基二羥乙基甲基胺、三?；已趸卒@和單?；已趸u基乙 基二甲胺鹽(具體是氯化物或甲基硫酸鹽)及其混合物。?；杂苫鶅?yōu)選含有14至18個(gè)碳原 子，且更優(yōu)選衍生自如棕櫚油或葵花油的植物油。
[0270] 當(dāng)化合物中含有幾個(gè)酰基自由基時(shí)，后者可以是相同或不同的。
[0271] 這些產(chǎn)品可通過(guò)以下方式獲得，例如，通過(guò)三乙醇胺、三異丙醇胺、烷基二乙醇胺 或烷基異丙醇胺在動(dòng)物或植物來(lái)源的脂肪酸或脂肪酸的混合物中進(jìn)行的直接酯化，任選地 進(jìn)行烷氧基化，或通過(guò)對(duì)它們的甲酯進(jìn)行酯交換作用。酯化后使用烷化劑，例如鹵代烷(優(yōu) 選甲基或乙基鹵）、硫酸二烷基酯（優(yōu)選硫酸甲酯或硫酸乙酯）、甲磺酸甲酯、對(duì)甲苯磺酸甲 酯、氯乙二醇(glycol chlorohydrin)或氯甘油(glycerol chlorohydrin)進(jìn)行的季銨化作 用。
[0272] 這些化合物舉例來(lái)說(shuō)，為HENKEL公司出售的DEHYQUART、STEPAN公司出售的 STEPANQUAT、CECA公司出售的N0XAMIUM以及REW0WITC0公司出售的REWOQUAT WE 18。
[0273] 根據(jù)本發(fā)明的組合物優(yōu)選含有季銨單酯、二酯和三酯鹽的混合物，其中按重量計(jì) 大部分是二酯鹽。
[0274] 作為銨鹽的混合物，例如，可以使用含有按重量計(jì)15-30 %的酰基乙氧基乙基二羥 基乙基甲基銨硫酸甲酯，45-60 %的二酰基乙氧基羥基乙基甲基銨硫酸甲酯和15-30 %的三 ?；已趸谆@硫酸甲酯的混合物，其中酰基自由基含有14至18個(gè)碳原子并且衍生自任 選部分氫化的棕櫚油。也可使用專(zhuān)利US-A-4 874 554和US-A-4 137 180中所述的包含至少 一種酯功能的銨鹽。
[0275] 在具有式（IV)的季銨鹽中，優(yōu)選的是，首先，四烷基氯化銨，例如，二烷基二甲基氯 化銨或烷基三甲基氯化銨，其中烷基自由基含有約12至22個(gè)碳原子，具體是二十二烷基三 甲基氯化銨、二硬脂基二甲基氯化銨、鯨蠟基三甲基氯化銨或者芐基二甲基硬脂基氯化銨， 或者其次，VAN DYK公司以名"CERAPHYL 70"出售的硬脂酰胺丙基二甲基（乙酸肉豆蔻酯)氯 化銨。
[0276] 根據(jù)本發(fā)明，二十二烷基三甲基氯化銨或者二十二烷基三甲基溴化銨以及CTAB (鯨蠟基三甲基溴化銨)是最優(yōu)選的季銨鹽。
[0277] 本發(fā)明的脂肪族胺符合式：
[0279] -心是基于分支或不分支的、飽和或不飽和的烴的鏈，含有8至30個(gè)碳原子，且優(yōu)選 10至24個(gè)碳原子。
[0280] -辦和辦獨(dú)立地選自分支或不分支的、飽和或不飽和的烴，含有1至10個(gè)碳原子，且 優(yōu)選1至4個(gè)碳原子。
[0281] -R#PR3還可以相互獨(dú)立地對(duì)應(yīng)于氫原子H。
[0282] -M為1至10,并且優(yōu)選為1至5。
[0283]作為非限制性的例子，可提及:硬脂胺、硬脂氨基乙基乙醇酰胺、硬脂基二乙醇酰 胺、硬脂二亞乙基三胺、硬脂酰胺丙基二甲胺、硬脂酰胺丙基二乙胺、硬脂酰胺乙基二乙胺、 硬脂酰胺乙基二甲胺、棕櫚酰胺丙基二甲胺、棕櫚酰胺丙基二乙胺、棕櫚酰胺乙基二乙胺、 棕櫚酰胺乙基二甲胺、山崳酸酰胺丙基二甲胺、山崳酸酰胺丙基二乙胺、山崳酸酰胺乙基二 乙胺、山崳酸酰胺乙基二甲胺、花生酸酰胺丙基二甲胺、花生酸酰胺丙基二乙胺、花生酸酰 胺乙基二乙胺和花生酸酰胺乙基二甲胺。
[0284] 作為商購(gòu)可得的脂肪族胺，可提及Croda所售的Incromine BB、Nikkol所售的 Amidoamine MSP以及Inolex所售的Lexamine。
[0285] 至于其它的脂肪族胺，可提及例如硬脂胺、硬脂氨基乙基乙醇酰胺、硬脂基二乙醇 酰胺以及硬脂二亞乙基三胺，其中尤其是Sabo公司銷(xiāo)售的Sabomina系列。
[0286] 還可以提及如Kao Corp.的Acetamine系列的脂肪族胺乙酸鹽。
[0287] 這些脂肪族胺也可以被乙氧基化，如Berol 380、390、453和455，Akzo Nobel的 Ethomeens或者Condea Chemie的Marlazin L10、0L2、0L20、T15/2、T50〇
[0288] 本發(fā)明的顆粒還可以為了化妝、皮膚病學(xué)或眼的目的而引入到任何藥學(xué)載體中。 可提及例如洗劑、血清、凝膠和所有類(lèi)型的乳劑。
[0289] 根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是通常用于局部施用的任何藥學(xué)形式，例如溶液，凝膠， 洗劑或血清類(lèi)型的分散體，具有液體或半液體乳型稠度的乳劑，其由脂相分散于水相中（0/ W)或反過(guò)來(lái)(W/0)而得到，或者具有軟的半固體的或固體的乳膏或凝膠類(lèi)型稠度的懸浮液 或乳劑，或者微乳劑，微膠囊，微?；蛘唠x子和/或非離子類(lèi)型的泡狀分散體。這些組合物通 過(guò)常規(guī)的方法制備。
[0290] 根據(jù)本發(fā)明的組合物也可以包含任何正常用于化妝或藥學(xué)領(lǐng)域的添加劑。
[0291] 當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)注意這樣選擇這種或這些任選的額外的化合物，和/或其 量，從而使根據(jù)本發(fā)明的組合物的有利的特性不會(huì)或基本上不會(huì)被削弱。
[0292] 具體地，人們會(huì)注意保證這種引入不會(huì)損害與siRNA締合的陽(yáng)離子型顆粒的穩(wěn)定 性。
[0293] 根據(jù)本發(fā)明的組合物具體地可以包含化妝的或藥學(xué)活性的試劑。優(yōu)選包括脫色 劑、防曬劑。
[0294] 可摻入該組合物的脫色劑包括，例如下列化合物：曲酸;鞣花酸；熊果苷及其衍生 物，如申請(qǐng)EP-895 779和EP-524 109中所描述的那些;氫醌;氨基苯酚衍生物，例如申請(qǐng)TO 99/10318和W0 99/32077所描述的那些，且具體是N-膽留醇基氧羰基-對(duì)-氨基苯酚和N-乙 基氧羰基-對(duì)-氨基苯酚;亞氨基苯酚衍生物，具體是在申請(qǐng)W0 99/22707中所描述的那些； L-2-氧代四氫噻唑-4-羧酸或前半胱氨酸，及其鹽或酯;抗壞血酸及其衍生物，具體是抗壞 血酸葡糖苷；以及植物提取物，具體是甘草、桑樹(shù)和黃芩的提取物，該列舉不具有限制性。
[0295] 防紫外線輻射劑可選自有機(jī)的防UV劑或無(wú)機(jī)的防UV輻射劑。
[0296] 根據(jù)本發(fā)明的有機(jī)的防UV劑可以是水溶性的、脂溶性的或者在平常的化妝溶劑中 不溶的。它們可具體選自鄰氨基苯甲酸鹽；肉桂衍生物;二苯甲酰甲烷衍生物;水楊酸衍生 物，樟腦衍生物；如在專(zhuān)利申請(qǐng)US 4,367,390、EP 863 145、EP 517 104、EP 570 838、EP 796 851、EP 775 698、EP 878 469和EP 933 376中所描述的三嗪衍生物；二苯甲酮衍生物， 具體是在申請(qǐng)EP 1 046 391和DE 10012408中所描述的那些；丙烯酸0，0'_二苯基酯衍生 物，苯并三唑衍生物，苯并咪唑衍生物；imadazolines ;bisbenzoazolyl衍生物，例如在專(zhuān)利 EP 669 323和US 2,463,264中所描述的那些;對(duì)氨基苯甲酸(PABA)衍生物;如在申請(qǐng)US 5， 237,071、US 5，166,355、GB 2303549、DE 19726184和EP 893 119所描述的亞甲基雙（羥苯 基苯并三唑）衍生物;遮蔽聚合物和遮蔽硅氧烷，具體是在申請(qǐng)W0 93/04665中所描述的那 些;如在專(zhuān)利申請(qǐng)DE 19855649中描述的a-烷基苯乙烯衍生的二聚體;和如在專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 967 200和DE 19755649中所描述的4,4_二芳基丁二烯衍生物。
[0297] 無(wú)機(jī)遮蔽劑一般是有涂層或無(wú)涂層的金屬氧化物的色素或毫微色素 (nanopigment)(初級(jí)顆粒的平均大?。阂话銥?nm至100nm，優(yōu)選10nm至50nm)，例如，氧化鈦 毫微色素(非晶態(tài)或晶態(tài)的金紅石和/或銳鈦礦形式）、氧化鐵毫微色素、氧化鋅毫微色素、 氧化鋯毫微色素或者氧化鈰毫微色素，它們本身都是廣為人知的UV光保護(hù)劑。另外，常規(guī)的 涂層劑是氧化鋁和/或硬脂酸鋁。具體地，這些有涂層或無(wú)涂層的金屬氧化物毫微色素可見(jiàn) 于專(zhuān)利申請(qǐng)EP 0 518 772和EP 0 518 773的描述。
[0298] 根據(jù)本發(fā)明的防輻射劑在根據(jù)本發(fā)明的組合物中存在的比例一般是相對(duì)于組合 物總重量的0.1-20重量％，且優(yōu)選為相對(duì)于組合物總重量的0.2-15重量％。
[0299] 根據(jù)另一個(gè)目的，本發(fā)明還涉及至少一種選自SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的序列的雙鏈8祖寡核苷酸在抑制酪氨酸 酶表達(dá)中的用途。
[0300] 具體地，根據(jù)本發(fā)明的寡核苷酸可用作皮膚的漂白劑和/或抗褐變劑。
[0301] 根據(jù)本發(fā)明的雙鏈RNA寡核苷酸還可以用于制備局部的、化妝品的或者皮膚病學(xué) 的組合物，以用于降低黑色素合成，具體是以治療著色過(guò)度、色素形成斑以及皮膚變色為目 的，或者用于毛囊漂白，由于黑色素細(xì)胞機(jī)能亢進(jìn)而導(dǎo)致的局部著色過(guò)度，例如特發(fā)性黑斑 病，發(fā)生于妊娠期間（"孕斑(pregnancy mask)"或者褐黃斑)或者oestro-progestin避孕期 間，由于良性黑色素細(xì)胞機(jī)能亢進(jìn)和增殖而導(dǎo)致的局限性著色過(guò)度，例如稱為光化性著色 斑的老年色素形成斑，可能由于損傷后傷口愈合或者光敏作用而造成的偶發(fā)性著色過(guò)度， 以及白斑病的特定形式，例如白癜風(fēng)。對(duì)于后者(傷口愈合可能導(dǎo)致疤痕，這使皮膚呈現(xiàn)淺 色外觀），由于不可能使損傷的皮膚再次著色，那么通過(guò)使剩余的正常皮膚區(qū)進(jìn)行脫色而完 成所述方法，從而使皮膚整體呈現(xiàn)均一的白色。
[0302] 本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及化妝方法，其用于使膚色漂白和/或增亮和/或使褐色皮 膚顏色均勻，其包括局部施用至少一種選自SEQ ID N0S.1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47和48的序列的雙鏈1?熟寡核苷酸。
[0303]優(yōu)選地，寡核苷酸在局部組合物中以小于或等于InM的濃度配制。
[0304] 更優(yōu)選地，寡核苷酸與大小小于或等于lMi"電勢(shì)為10-80mV的陽(yáng)離子型顆粒締 合，所述顆粒選自上面所述的表面活性劑膠束、嵌段聚合物膠束、非離子和陽(yáng)離子表面活性 劑脂質(zhì)體、非離子表面活性劑微囊、油質(zhì)體、毫微乳劑顆粒、毫微膠囊、有機(jī)顆?；驘o(wú)機(jī)顆 粒。
[0305]為了化妝、皮膚病學(xué)、眼或藥物護(hù)理的目的，要避免侵入性方法，例如皮下或眼注 射。與根據(jù)本發(fā)明的siRNA締合的陽(yáng)離子型顆粒可以以懸浮液形式或摻合到化妝上可接受 的載體，例如洗劑、血清、乳化的或非乳化的凝膠、油/水型乳劑、水/油型乳劑或多重型乳 劑、微乳劑等形成，局部施用于皮膚或粘膜或眼內(nèi)。
[0306]為促進(jìn)與siRNA締合的顆粒的穿透，可修改水的滲透性；這樣，就有可能通過(guò)用 〇31^61七6(：1111〇1〇87的16￥&1116七61'1]\1210或〇61'1]1&1&13測(cè)量1￥]^(不顯性失水)來(lái)控制水的滲透 性。
[0307] 舉例來(lái)說(shuō)，可使用以下方法：
[0308] -在施用根據(jù)本發(fā)明的組合物之前進(jìn)行剝離(corneodisc，"涂劑"）、化學(xué)去皮或機(jī) 械皮膚磨擦術(shù)；
[0309]-用一種或多種具有脫脂效果的溶劑混合物預(yù)處理；
[0310]-用去污劑發(fā)泡產(chǎn)品清潔皮膚；
[0311] -例如，通過(guò)用不透水的合成膜(例如，Blenderm)覆蓋要處理的皮膚表面或者通過(guò) 應(yīng)用一層凡士林進(jìn)行封閉預(yù)處理和/或封閉后處理。其作用是阻斷皮膚天然的IWL并導(dǎo)致表 皮脂質(zhì)的水合過(guò)度而變得更加可通透。
[0312] 在施用本發(fā)明的組合物之后，還可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，所述方法促 進(jìn)皮膚中分子的穿透，例如，離子電滲療法或電穿孔法。
[0313]在體外皮膚模型的情況中，可應(yīng)用下述處理：
[0314] -在沉積根據(jù)本發(fā)明的組合物之前，可通過(guò)改變介質(zhì)(0.10-0.75mM代替1.5mM)或 通過(guò)加入螯合劑而降低Ca2+含量。其效果是降低膜間的粘附，這樣就提高了皮膚的滲透性 (Effects of extra-and intracellular calcium concentration on DNA replication， lateral growth ? and differentiation of human epidermal cells in culture.Virchows Arch B Cell Pathol Incl Mol Pathol.1990；59(1)：17-25)；
[0315] -利用離子電滲療法、電穿孔法以及公知的任何方法來(lái)改變?cè)撃Ｐ偷臐B透性。
[0316] 實(shí)施例1-配方
[0317] 陽(yáng)離子膠束
[0318] -實(shí)施例1:辛基-0-葡糖苷/十六烷基三銨溴化物按摩爾比5/1
[0319] El:100mM溶于蒸餾水中
[0320] E2:50mM溶于蒸餾水中
[0321] E3:25mM溶于蒸餾水中
[0322] E4:12.5mM溶于蒸餾水中
[0323] 將2種表面活性劑(非離子+陽(yáng)離子)溶于蒸餾水中。將SEQ ID N0.1的siRNA的懸浮 液(20yM)以體積比（siRNA:膠束)1:1至1:9加入，從而按比例降低膠束濃度。
[0324] -實(shí)施例2:把癸基-0-葡糖苷/二十二烷基三銨氯化物膠束按摩爾比5/1溶于蒸餾 水中。按前面實(shí)施例中的相同濃度制備。
[0325] 這兩種懸浮液可應(yīng)用于皮膚來(lái)治療色素形成斑和皮膚變色或者用于漂白毛囊。
[0326] 陽(yáng)離子脂質(zhì)體
[0327] -實(shí)施例1:"液體"小泡
[0328] PEG 400異硬脂酸酯 5.5%
[0329] 二十二烷基三銨氯化物0.5%
[0330] 蒸餾水 qs 100
[0331] -實(shí)施例2:"剛性"小泡 棕櫚酸山梨聚糖酯 2.75%
[0332] 膽固醇 2.75% 二十二烷基三銨氯化物 0.5%
[0333] 蒸餾水 qslOO
[0334] 這些脂質(zhì)體懸浮液的例子是通過(guò)透析而實(shí)現(xiàn)的。把構(gòu)成小泡的脂質(zhì)溶于辛基-0-葡糖苷的水溶液中。然后使該溶液對(duì)水透析72小時(shí)。
[0335] 然后加入SEQ ID N0.4的siRNA懸浮液，使?jié)舛认鄬?duì)于小泡約為3%的脂質(zhì)。該非離 子脂質(zhì)體懸浮液可以施用于皮膚以用于治療色素形成斑和皮膚變色或者用于漂白毛囊。
[0336] 陽(yáng)離子油質(zhì)體
[0337] -油相 St6amineries Dubois所售的單硬脂酸鹿糖醋 0.45% 硬脂酸山梨聚糖醋 4EO (Tween 61 Uniquema.) 0.30% 二十二烷基三銨氯化物 0.21 % 乙酸維生素 E 0.5% 霍霍巴油 0.5%
[0338] 庚酸十八酯 1% 揮發(fā)性桂油 1% 維生素 E甘油酯 0.5% 防腐劑 0.02% BHT 0.01%
[0339] -水相
[0340] 蒸餾水 qs 100
[0341] 防腐劑 0.1%
[0342] 該分散體通過(guò)高壓勻漿實(shí)現(xiàn)，目的是使顆粒大小約170nm。然后以1:1至1:20 (siRNA/油質(zhì)體)的比例加入SEQ ID N0.16的siRNA懸浮液UOyMhsiRNA就會(huì)與顆粒的表面 復(fù)合。
[0343] 陽(yáng)離子毫微膠囊
[0344] -有機(jī)相 聚己酸內(nèi)酯（MW: 50000) 1% 維生素 E 1%
[0345] 聚二甲基硅氧烷共聚醇DC2 5695 (Dow Coming) 0.5% 二十二烷基三銨氯化物 0.21%
[0346] 丙酮 200 ml
[0347] -水相
[0348] Pluronic F68 0.5%
[0349] 蒸餾水 200ml
[0350]把有機(jī)相在攪拌下引入水相中。然后使丙酮和100ml水相蒸發(fā)掉，從而得到毫微膠 囊的懸浮液，其大小是220nm。然后以1:1至1: 20 (s iRNA/毫微膠囊）的比例加入SEQ ID 奶.37的811?嫩懸浮液(2〇1^)。于是811?嫩就會(huì)與顆粒的表面復(fù)合。
[0351 ] 有機(jī)納米顆粒(nanoparticle)
[0352] -有機(jī)相 聚己二酸亞乙基酯（ScientificPolymer產(chǎn)品） 2% 聚二甲基硅氧烷共聚醇DC25695 (DowComing) 0.5%
[0353] 二十二烷基三銨氯化物 0.21% 丙酮 200 ml
[0354] -水相
[0355] Pluronic F68 0.5%
[0356] 蒸餾水 200ml
[0357] 把有機(jī)相在攪拌下引入水相。然后使丙酮和100ml水相蒸發(fā)掉，從而得到納米顆粒 的懸浮液，所述納米顆粒的大小是180nm。然后以1:1至1: 20(siRNA/納米顆粒）的比例加入 SEQ ID從).40的8丨1?熟懸浮液(2(^]\〇。于是811?熟就會(huì)與顆粒的表面復(fù)合。
[0358] 陽(yáng)離子毫微乳劑
[0359] -油相 Uniqema所售PEG 400異硬脂酸酯 1 % 二十二烷基三銨氯化物 1%
[0360] 鱷梨油 1% 霍霍巴油 3% 環(huán)五甲基桂氧烷 2%
[0361] -水相
[0362] 蒸餾水 30%
[0363] -縮二丙二醇 10%
[0364] -稀釋相
[0365] 蒸餾水 qs 100%
[0366] 防腐劑 0.1%
[0367] 乳劑通過(guò)將油相在非常強(qiáng)烈的攪拌下分散在水相中制備。然后將得到的懸浮液使 用非常高壓力的勻漿器在壓力約1200b下勻漿幾次。顆粒的大小達(dá)到50nm量級(jí)并且懸浮液 是透明的。然后加入稀釋相。
[0368] 如前面的例子一樣，然后以1 : 1至1 : 20 (s iRNA/毫微乳劑）的比例加入SEQ ID 奶.42的811?嫩懸浮液(2〇1^)。于是811?嫩就會(huì)與顆粒的表面復(fù)合。
[0369] 實(shí)施例2-根據(jù)本發(fā)明的s iRNA的活性測(cè)量
[0370] 根據(jù)本發(fā)明的序列為SEQ ID N0S 1-47的47種siRNA的有效性利用Invitrogen開(kāi) 發(fā)的"pSCREEN-iT?系統(tǒng)"測(cè)試進(jìn)行評(píng)價(jià)，該系統(tǒng)用于評(píng)價(jià)對(duì)酪氨酸激酶抑制的有效性 (GenBank登記號(hào)M27160)。
[0371] 測(cè)試的實(shí)驗(yàn)方案：
[0372] ?在48孔板中接種2X104A549細(xì)胞/孔并培養(yǎng)過(guò)夜。
[0373] ?用2ug/ml的Lipofectamine 2000(Invitrogen)與下面的三種試劑復(fù)合一式三 份地進(jìn)行共轉(zhuǎn)染5小時(shí)：
[0374] ?與LacZ基因偶聯(lián)的酪氨酸酶pScreen-iT?載體-10ng/孔
[0375] ?螢光素酶報(bào)告質(zhì)粒_20ng/孔
[0376] ? InM Stealth? RNA(表1中給出的序列）
[0377] ?將細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)進(jìn)行裂解，并測(cè)量半乳糖苷酶（P-Gal)和螢光素酶 (Luc)的活性。P-Gal/Luc的比率決定了酪氨酸酶抑制的百分比。
[0378] 表1I給出了得到的結(jié)果。
[0379] 表1I:對(duì)47種雙鏈RNA寡核苷酸降解酪氨酸酶mRNA(GenBank登記號(hào)M27160)的有效 性的測(cè)定。
[0381] 其次，對(duì)于20種最有效的序列，也就是其在InM下有效性大于91 %的序列測(cè)定了劑 量效應(yīng)。結(jié)果在表1II中給出。
[0382] Table III:用0.0016nM至InM的劑量通過(guò)劑量效應(yīng)對(duì)20種選擇的序列的有效性的 測(cè)定。
[0384] 本發(fā)明的siRNAs中20種最有效的序列在InM時(shí)表現(xiàn)出的有效性超過(guò)94% ^測(cè)試的 最低劑量是〇.〇16nM，其對(duì)應(yīng)于降解編碼酪氨酸酶的mRNA的有效性為72%。
[0385] 實(shí)施例3-對(duì)根據(jù)本發(fā)明的siRNA引發(fā)的可能干擾素類(lèi)型應(yīng)答進(jìn)行的評(píng)價(jià)
[0386] 本發(fā)明主題的siRNAs經(jīng)證實(shí)不會(huì)引發(fā)干擾素類(lèi)型的應(yīng)答。為此，利用定量PCR (qPCR)測(cè)量了 0AS-1和IFIT-1(干擾素誘導(dǎo)型三十四肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域)基因的表達(dá)，它們是公 知的由干擾素誘導(dǎo)的（Wieland SE等，Searching for Interferon-Induced Genes That Inhibit Hepatitis B Virus Replication in Transgenic Mouse Hepatocytes，J.of Virology 2003；77：1227-1236〇Persengiev SP^ ? Nonspec if ic ? concentration-dependent stimulation and repression of maminalian gene expression by small interfering RNAs(siRNAs).RNA 2004;10:12_18〇Bridge AJ等，Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.Nature Genet.2003；34： 263_264〇Scacheri PC等，Short interfering RNAs can induce unexpected and divergent changes in the levels of untargeted proteins in mammalian cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2004，101:1892_1897〇Sledz CA等，Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biol?2003;9:834-9〇 Patzwahl R等，Enhanced expression of interferon-regulated genes in the liver of patients with chronic hepatitis C virus infect ion:detection by suppression-subtractive hybridization. J.Virol .2001 ;75:1332-1338。），測(cè)量的方法 按照由 Invitrogen銷(xiāo)售的 "BLOCK-iT? RNAi Stress Response Control Kit(human)for monitoring interferon-mediated stress response to double-stranded RNA in human cells"中所描述的方案。
[0387] hOAS-1基因表達(dá)水平的測(cè)量:
[0388] hOAS-1基因的表達(dá)水平與GAPDH參考基因表達(dá)水平相關(guān)。
[0390]~結(jié)果：只有陽(yáng)性對(duì)照（lkb的長(zhǎng)dsRNA)誘導(dǎo)了hOAS-1基因表達(dá)的明顯提高。測(cè)試的-序列（SEQ ID N0S.1、2、4、13和46)都沒(méi)有明顯地提高h(yuǎn)OAS-1基因的表達(dá)。
[0391] hIFIT-1基因表達(dá)水平的測(cè)量

[0393] 結(jié)果：只有陽(yáng)性對(duì)照（lkb的長(zhǎng)dsRNA)明顯誘導(dǎo)了hIFIT-1基因的表達(dá)，其在約25的 閾周期值檢測(cè)到。測(cè)試的序列（SEQ ID NOS. 1、2、4、13和46)誘導(dǎo)hIFIT-1基因表達(dá)的閾周期 值只有約32-36,也就是說(shuō)7-11個(gè)周期的差異對(duì)應(yīng)于信使的量低了 102-103倍。
[0394]這些測(cè)定使得可能推斷，根據(jù)本發(fā)明的dsRNA不會(huì)誘導(dǎo)干擾素類(lèi)型的應(yīng)答。
【主權(quán)項(xiàng)】
1·組合物，其包含至少一種選自SEQIDN0S·1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、 16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、 41、42、43、44、45、46或47的序列的雙鏈1?祖寡核苷酸，所述寡核苷酸與大小小于或等于以111、 ζ電勢(shì)為10_80mV的陽(yáng)離子型顆粒締合。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其特征在于該雙鏈RNA寡核苷酸存在的濃度小于或等于 100μΜ〇3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的組合物，其特征在于該陽(yáng)離子型顆粒選自表面活性劑膠束、嵌 段聚合物膠束、非離子和陽(yáng)離子表面活性劑脂質(zhì)體、非離子表面活性劑微囊、油質(zhì)體、毫微 乳劑顆粒、毫微膠囊、有機(jī)顆?；驘o(wú)機(jī)顆粒。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)的組合物，其特征在于該陽(yáng)離子型顆粒的大小小于或等于 500nm〇5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的組合物，其特征在于該陽(yáng)離子型顆粒的大小小于或等于 300nm〇6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的組合物，其特征在于該陽(yáng)離子型顆粒是非離子兩親型表 面活性劑和陽(yáng)離子表面活性劑形成的膠束。7. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)的組合物，其特征在于該嵌段聚合物膠束選自陽(yáng)離子兩親 型嵌段聚合物膠束、非離子兩親型嵌段聚合物和陽(yáng)離子兩親型嵌段聚合物形成的膠束以及 非離子兩親型嵌段聚合物和陽(yáng)離子表面活性劑形成的膠束。8·至少一種選自SEQIDN0S·3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46 或47的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表達(dá)中的用途。9·至少一種選自SEQIDN0S·1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46或47的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在抑制酪氨酸酶表達(dá)中的用途，其特征在于所述的寡 核苷酸與大小小于或等于1μπι、ζ電勢(shì)為10-80mV的陽(yáng)離子型顆粒締合。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9的用途，作為用于皮膚的漂白劑和/或作為抗褐變劑。11. 根據(jù)權(quán)利要求8-10任一項(xiàng)的用途，用于預(yù)防形成和/或消除色素形成斑，和/或老年 斑，和/或用于增亮和/或漂白褐色皮膚和/或使褐色皮膚顏色均勻。12. 至少一種選自 SEQ ID N0S.3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46 或47的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在制備用于皮膚脫色的組合物中的用途。13·至少一種選自SEQIDN0S·1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46或47的序列的雙鏈RNA寡核苷酸在制備用于皮膚脫色的組合物中的用途，其特征在于 所述的寡核苷酸與大小小于或等于1μπι、ζ電勢(shì)為10-80mV的陽(yáng)離子型顆粒締合。14. 根據(jù)權(quán)利要求13的用途，其特征在于該組合物用于治療特發(fā)性黑斑病、妊娠或者 oestro-progestin避孕相關(guān)的著色過(guò)度、偶發(fā)性著色過(guò)度、由白斑病和/或白癜風(fēng)引起的著 色過(guò)度。15. 用于漂白和/或增亮膚色和/或使褐色皮膚顏色均勻的化妝方法，其包括局部施用 至少一種選自 SEQ ID N0S.3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或47的 序列的雙鏈RNA寡核苷酸。16. 用于漂白和/或增亮膚色和/或使褐色皮膚顏色均勻的化妝方法，其包括局部施用 至少一種選自 SEQ ID N0S.1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46或 47的序列的雙鏈RNA寡核苷酸，其特征在于所述的寡核苷酸與大小小于或等于1μπι、ζ電勢(shì)為 10-80mV的陽(yáng)離子型顆粒締合。17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16的方法，其特征在于所述的寡核苷酸以小于或等于100μΜ的濃 度配制在局部組合物中。18. 根據(jù)權(quán)利要求15-17任一項(xiàng)的方法，其特征在于局部施用前進(jìn)行選自剝離、化學(xué)去 皮、機(jī)械皮膚磨擦術(shù)、施用一種或多種具有脫脂效果的溶劑以及用去污劑發(fā)泡產(chǎn)品清潔皮 膚的皮膚預(yù)處理。19. 根據(jù)權(quán)利要求15-18任一項(xiàng)的方法，其特征在于局部施用后進(jìn)行封閉的后處理。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK105854028SQ201610183232
【公開(kāi)日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2006年9月20日
【發(fā)明人】C.科林－迪詹戈恩, J.-T.斯蒙納特
【申請(qǐng)人】萊雅公司