靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法：建立恒河猴PD動物模型：給恒河猴肌肉注射MPTP，每天一次，根據(jù)個體敏感性差異，劑量為0.2?0.5mg/kg，直至出現(xiàn)典型、穩(wěn)定的PD臨床癥狀；在注射MPTP期間，每天于2個固定時間段對恒河猴進行行為學(xué)評價，將一周的評分均值作為該周的最后得分。本發(fā)明提供了一套完善的靈長類PD模型行為學(xué)評價方法，可用于新藥藥效評估，各新藥的橫向、縱向?qū)Ρ妊芯?。該評價方法吸收、摒棄了各個評分量表的優(yōu)缺點，并結(jié)合實踐經(jīng)驗、自身獼猴臨床表現(xiàn)特征，能夠全方位、準確反映個體臨床差異性，如個體敏感性差異、發(fā)病嚴重程度差異、發(fā)病先后順序差異、個體PD特征差異。
【專利說明】
靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生命科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方 法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一種老年神經(jīng)退行性疾病，發(fā)病率僅次于 阿爾茨海默病的，主要臨床癥狀為震顫、肌肉強直、運動遲緩和姿勢平衡異常，主要病理特 點為黑質(zhì)多己胺(dopamine，DA)能神經(jīng)元嚴重變性缺失和出現(xiàn)路易小體（lewy body, LB)。 PD主要發(fā)生于60歲W上的老齡人群，發(fā)病率達1%-2%，40歲W上人群發(fā)病率超過0.1%，呈 現(xiàn)一種年輕化發(fā)病趨勢。隨著人口平均壽命的延長和老齡化的出現(xiàn)，ro的發(fā)病率出現(xiàn)上升 趨勢，預(yù)計到2030年，中國帕金森病人數(shù)將占全球一半W，運引起了各國學(xué)者的高度重視。
[0003] 目前對PD病因?qū)W和發(fā)病機理的研究都依賴于動物模型。到目前為止，已知的動物 模型有大鼠、小鼠、貓、非人靈長類模型等，但無論從遺傳學(xué)、基因同源性、生理生化特點、病 理特征等方面來看，非人靈長類動物模型有著其他動物模型無法比擬的優(yōu)勢，能夠真正模 擬人類PD發(fā)病機制及進程。至今，選用靈長類動物制作PD模型的方法多種多樣，有急性偏側(cè) 損毀模型、急性雙側(cè)損毀模型（如腹腔、肌肉注射造模試劑)和亞急性或慢性系統(tǒng)性損毀模 型(如肌肉注射、鼻內(nèi)噴霧造模試劑)等，每種造模方式優(yōu)缺點各異，動物臨床表現(xiàn)也差距較 大。由于帕金森病及其模型的的診斷主要依靠行為學(xué)評價，但目前行為學(xué)評分標準參差不 齊，側(cè)重點各異，如Kurlan更適合造模階段的評價，而化nadian評分量表則更適合藥效的評 價，沒有一套完善的、綜合的、通用的靈長類PD模型評分標準?；诖?，本發(fā)明擬在建立一種 靈長類帕金森恒河猴模型基礎(chǔ)上，將前人研究結(jié)果與自身實驗相結(jié)合，歸納總結(jié)出一套完 整的PD靈長類模型綜合評價標準，W期為各靈長類模型的行為學(xué)評價、藥效評價提供橫向、 縱向?qū)Ρ确治龌A(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案提供了一種靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，為建模 階段及藥效評價階段靈長類帕金森病模型的行為學(xué)評價提供一種可靠的、靈敏的評價方 法。
[0005] 靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，包括W下步驟:建立恒河猴PD動物模 型:給恒河猴肌肉注射MPTP，每天一次，根據(jù)個體敏感性差異，劑量為0.2-0.5mg/kg，直至出 現(xiàn)典型、穩(wěn)定的PD臨床癥狀;在注射MPTP期間，每天于2個固定時間段對恒河猴進行行為學(xué) 評價，將一周的評分均值作為該周的最后得分。
[0006] 所述的行為學(xué)評價方法，包括綜合行為學(xué)評分量表即化Q評分量表，見表4，通過動 態(tài)監(jiān)測模型進展，結(jié)合動物發(fā)病實際情況，對比化Q評分量表，綜合分析。
[0007] 所述的行為學(xué)評價方法，采用全天攝像、人工描計、人為刺激的方式。
[000引所述的在陽性藥效評價期間，每天于2個固定時間段對恒河猴進行行為學(xué)評價，統(tǒng) 計分析每2天的行為學(xué)得分均值，連續(xù)動態(tài)評價治療效果。
[0009] 所述的行為學(xué)評價方法，需3人在互不影響的環(huán)境下獨立完成，且Ξ人評價結(jié)果吻 合度需^90%。
[0010] 本發(fā)明提供的靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，適用對象為:靈長類系 統(tǒng)性PD模型，靈長類偏側(cè)PD模型，圈養(yǎng)靈長類PD模型，放養(yǎng)靈長類PD模型。
[0011] 本發(fā)明提供了一套完善的靈長類PD模型行為學(xué)評價方法，可用于新藥藥效評估， 各新藥的橫向、縱向?qū)Ρ妊芯?。該評價方法吸收、擬棄了各個評分量表的優(yōu)缺點，并結(jié)合實 踐經(jīng)驗、自身雜猴臨床表現(xiàn)特征，能夠全方位、準確反映個體臨床差異性，如個體敏感性差 異、發(fā)病嚴重程度差異、發(fā)病先后順序差異、個體PD特征差異。
【附圖說明】
[0012] 圖1為實施例的Kurlan量表對全體動物綜合結(jié)果圖；
[0013] 圖2為實施例的化pa量表對全體動物綜合結(jié)果圖；
[0014] 圖3為實施例的化nadian量表對全體動物綜合結(jié)果圖；
[0015] 圖4為實施例的化Q量表對全體動物綜合結(jié)果圖；
[0016] 圖5為實施例的第一只動物各評分量表對比分析圖；
[0017] 圖6為實施例的第二只動物各評分量表對比分析圖；
[0018] 圖7為實施例的第Ξ只動物各評分量表對比分析圖；
[0019] 圖8為實施例的第四只動物各評分量表對比分析圖；
[0020] 圖9為實施例的第五只動物各評分量表對比分析圖；
[0021 ]圖10為實施例的第六只動物各評分量表對比分析圖。
【具體實施方式】
[0022] 結(jié)合實施例說明本發(fā)明的【具體實施方式】。
[0023] 本發(fā)明動物模型的制備
[0024] -、材料與方法
[0025] 1.選取試驗動物：
[0026] 選取健康青年恒河猴(川西雜猴亞種）10只，體重3.5-5.化g，年齡3.5-4.5歲，見表 1，并將其隨機分為模型組(n = 6)和對照組(n = 4)。提前1月適應(yīng)性單籠喂養(yǎng)，任其自由飲水 進食。動物由國家實驗雜猴種源基地（四川雅安）（動物使用許可證:SCXK(川）：2013-105)提 供。實驗中對動物的處置符合中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意 見》的規(guī)定。
[0027] 表1:各試驗雜猴基本資料
[002引
[0029] 2動物處理：
[0030] 模型組采取肌肉注射方式施用MPTP，根據(jù)敏感性不同，施用劑量從最小劑量 0.2mg/kg開始，逐漸加大劑量至0.5mg/kg，當動物出現(xiàn)活動量減少、運動遲緩、震顫之后，每 1-3天施用一次MPTP(間隔天數(shù)根據(jù)個體情況而定），直至出現(xiàn)穩(wěn)定的臨床癥狀，最后一周通 過經(jīng)靜脈注射的方法施用MPTP，W鞏固臨床癥狀。對照組給予同等劑量生理鹽水。
[0031] 具體給藥細節(jié)見表2。
[0032] 表2.造模具體方案
[0033]
[0034] 3.陽性藥評價方案:于MPTP最后一次給藥后第4周開始進行左旋多己陽性藥評價 實驗。餐前30min，口服(隱藏于澄汁中）飼喂左旋多己（左旋多己/卡比多己= 12/3mg/kg，卡 比多己作為外周脫簇酶抑制劑，抑制左旋多己在外周降解），每日2次，共4周。
[0035] 4.行為學(xué)觀察方案:從檢疫馴化期開始至處死動物前，均全天無人攝像監(jiān)控動物； 每日在喂食、喂水期間人為觀察并實時記錄動物行為學(xué)異常情況;每日人為刺激動物，評價 神經(jīng)功能受損情況:試圖用純形鐵棒觸摸每只動物的臉、四肢，并作好記錄。建模階段，每日 于2個固定時間段評價動物行為學(xué)表現(xiàn)，7天結(jié)果作為一個統(tǒng)計點；陽性藥評價階段，2天結(jié) 果作為一個統(tǒng)計點。
[0036] 模型成功的判定方法：當模型出現(xiàn)活動量減少、運動遲緩、震顫、肌肉強直時，判定 模型成功;當全部動物出現(xiàn)靜止性震顫時，且其余震顫穩(wěn)定時，停止施用MPTP。
[0037] 最佳行為學(xué)評價方案篩選辦法:將目前常用行為學(xué)評分量表，見表3中各評價指標 的進行對比分析，并將各指標同時用于造模期、模型穩(wěn)定期、治療期的評價，挑選出能靈敏 反應(yīng)動物臨床表現(xiàn)的評價指標及評價方法，將其作為化Q量表成員之一;另外根據(jù)動物實際 表現(xiàn)，適當增設(shè)部分評價方法及指標，用于構(gòu)成化Q量表。
[00；3 引
[0039] 表4靈長類帕金森病綜合行為學(xué)評分量(SLQ評分量表）
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 注:可用0.25，0.5分評價，最大程度反應(yīng)動物實際臨床情況。
[0044] 二、結(jié)果
[0045] 2.1.建模結(jié)果順利完成恒河猴的造模實驗，全部動物經(jīng)過不同劑量、不同時間注 射MPTP后，成模率為100%，均表現(xiàn)出震顫、行動遲緩、運動啟動困難、表情減少、姿勢僵硬等 典型臨床癥狀，還表現(xiàn)出嗜睡、打哈欠、便秘、發(fā)聲減少或不能發(fā)聲等非典型癥狀，且運些非 典型癥狀與PD病人非典型臨床癥狀一致。
[0046] 2.2.陽性藥左旋多己治療效果口服飼喂左旋多己后30-60min內(nèi)，試驗猴活動量明 顯增多、興奮性增強，出現(xiàn)自發(fā)活動增多，攀爬增多等明顯好轉(zhuǎn)癥狀。上述情況在治療后1.5 小時，逐漸消失，2小時后幾乎全部消失。
[0047] 2.3.行為學(xué)觀察結(jié)果經(jīng)過嚴密的綜合對比分析，我們總結(jié)出一套完整的、準確、靈 敏反應(yīng)臨床實際情況的靈長類帕金森病綜合評分量表，即SLQ評分量表，詳細評分細則見表 4,各評分量表評價指標對比分析結(jié)果見表4。從表3,4可W看出，SLQ量表包括運動功能和生 活能力兩部分，SLQ量表評價指標幾乎包含了所有評分量表，各指標所占比重處于各大量表 范圍內(nèi)；評分等級更加明朗，更有利于區(qū)分動物間的微小差距。
[004引 2.4. SLQ量表優(yōu)勢分析Kurlan量表、Papa量表、Canadian量表及化Q量表單個量表 分析結(jié)果見圖1~圖4,單只動物各評分量表對比分析結(jié)果見圖5~圖10。從見圖1~圖4可W 看出，4種評分量表的PD得分曲線整體變化趨勢基本一致，Canadian量表稍差;在造模階段， SLQ量表所得曲線變化趨勢與Kur Ian量表幾乎一致，但在造模早期階段，SLQ量表更為敏感； 在藥效評價階段，SLQ量表所得曲線變化趨勢與化pa量表幾乎一致，但化Q量表評分結(jié)果更 能反應(yīng)動物實際情況，即動物PD癥狀由重到輕的順序為:M6>M4>M1>M5>M3>M2。圖5~圖10顯 示，SLQ量表評分曲線變化趨勢與化pa量表、Canadian量表特別是Kurlan量表一致，但化pa 量表、Canadian量表無法準確反映病情稍輕動物(M5、M3、M2)的實際臨床表現(xiàn)，即評分與正 常組無顯著差異性。因此，本發(fā)明的綜合評分量表不僅適用于造模階段，特別是造模早期， 而且適用于藥效評價階段的行為學(xué)評估。
[0049]綜上，本發(fā)明的綜合評分體系不僅內(nèi)容全面，且靈敏性、準確性強于目前已用的各 評分量表，能靈敏的評價造模各階段、藥效評價各階段的行為學(xué)變化，能夠作為一種行為學(xué) 評分標準用于靈長類PD模型研究。
【主權(quán)項】
1. 靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，其特征在于，包括以下步驟:建立恒河猴 ro動物模型：給恒河猴肌肉注射MPTP，每天一次，根據(jù)個體敏感性差異，劑量為0.2-0.5mg/ kg，直至出現(xiàn)典型、穩(wěn)定的ro臨床癥狀;在注射MPTP期間，每天于2個固定時間段對恒河猴進 行行為學(xué)評價，將一周的評分均值作為該周的最后得分。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，其特征在于，所述 的行為學(xué)評價方法，包括綜合行為學(xué)評分量表即SLQ評分量表，通過動態(tài)監(jiān)測模型進展，結(jié) 合動物發(fā)病實際情況，對比SLQ評分量表，綜合分析。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，其特征在于，所述 的行為學(xué)評價方法，采用全天攝像、人工描計、人為刺激的方式。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，其特征在于，所述 的在陽性藥效評價期間，每天于2個固定時間段對恒河猴進行行為學(xué)評價，統(tǒng)計分析每2天 的行為學(xué)得分均值，連續(xù)動態(tài)評價治療效果。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的靈長類帕金森病模型行為學(xué)評價優(yōu)化方法，其特征在于，所述 的行為學(xué)評價方法，需3人在互不影響的環(huán)境下獨立完成，且三人評價結(jié)果吻合度需^ 90% 〇
【文檔編號】A61K31/4418GK105878240SQ201610214177
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月7日
【發(fā)明人】羅啟慧, 史良琴, 陳正禮, 劉衡, 李立科, 黃超, 劉文濤, 方靜, 唐麗, 曾文, 龔立
【申請人】四川農(nóng)業(yè)大學(xué)