科羅索酸的醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種科羅索酸的醫(yī)藥用途。本發(fā)明的科羅索酸可用于制備防治肺癌的藥物和保健品。
【專利說(shuō)明】
科羅索酸的醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥保健品領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種科羅索酸的醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cell,CSC)是腫瘤中具有自我更新能力并能產(chǎn)生異質(zhì) 性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞，在腫瘤組織中比例約在0.1-2%之間。CSC的概念于2001年提出，至今已 在多種組織中得到證實(shí)，包括白血病、肺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤等。
[0003] 腫瘤干細(xì)胞與成體干細(xì)胞相似，具有分化和自我復(fù)制能力。它與成體干細(xì)胞的分 化和自我復(fù)制不同之處在于，腫瘤干細(xì)胞的自我復(fù)制能力是一種不受限的自我生長(zhǎng)。
[0004] 腫瘤干細(xì)胞能夠不斷地進(jìn)行自我更新、分化，表現(xiàn)為具有很強(qiáng)的致瘤性，僅需少量 腫瘤干細(xì)胞即可形成腫瘤，而一般腫瘤細(xì)胞需要大量細(xì)胞才能形成腫瘤。腫瘤干細(xì)胞形成 腫瘤的能力是其他腫瘤細(xì)胞的百倍W上。運(yùn)是腫瘤干細(xì)胞區(qū)別于普通腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)之 〇
[0005] 放化療藥物為臨床腫瘤治療的常用手段。但是傳統(tǒng)放化療治療只能殺死腫瘤細(xì) 胞，而對(duì)腫瘤干細(xì)胞則沒(méi)有明顯地抑制作用，并且在一定程度上還會(huì)富集腫瘤干細(xì)胞。運(yùn)是 導(dǎo)致患者在放化療后，易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因?；赪上因素，抑制腫瘤干細(xì)胞增殖的 藥物研發(fā)才是腫瘤藥物開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的旨在提供一種科羅索酸的新的醫(yī)藥用途。
[0007] 具體地說(shuō)，本發(fā)明的第一方面是提供了科羅索酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物 或前藥在制備預(yù)防或治療人肺支氣管癌化650的藥物或保健品中的應(yīng)用。
[000引本發(fā)明的第二方面是提供了科羅索酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制 備預(yù)防或治療人大細(xì)胞肺癌H460的藥物或保健品中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的第Ξ方面是提供了科羅索酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制 備抑制肺癌腫瘤干細(xì)胞增殖的藥物或保健品中的應(yīng)用。
[0010] 在一優(yōu)選例中，所述肺癌腫瘤干細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌H1650腫瘤干細(xì)胞。
[0011] 本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得W詳盡描述。通過(guò)下文W及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。
【附圖說(shuō)明】
[0012] 圖1是科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌各種病理類型細(xì)胞增殖48小時(shí)的影響（圖la:人肺 支氣管癌細(xì)胞H1650 ;圖lb:肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1;圖Ic:肺腺癌A549;圖Id:人大細(xì)胞肺癌 H460);
[0013] 圖2是科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌化650克隆形成的影響；
[0014] 圖3是科羅索酸對(duì)化650腫瘤干細(xì)胞球體形成的影響；
[0015] 圖4是科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌化650中TGF/Smad信號(hào)通路核移位的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0016] 本發(fā)明人通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，意外地發(fā)現(xiàn)科羅索酸能夠顯著性地抑制非小細(xì)胞肺癌的 增殖W及抑制非小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞的增殖。故而，該化合物可用于制備預(yù)防或治療非 小細(xì)胞肺癌的藥物或保健品。
[0017] 如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所知，本發(fā)明的科羅索酸(Corosolic acid),又名化-徑基熊 果酸（2-alpha-hyh(Myursolic acid)，其具有如下結(jié)構(gòu)通式：
[001 引
[0019]分子式：〔3地48〇4，分子量：472.71
[0020] 本發(fā)明還包括上述化合物的相應(yīng)的所有藥學(xué)上可W接受的鹽、水合物或前藥。運(yùn) 些鹽可W由化合物中帶正電荷的部分(例如，胺基)與具有相反電性的帶負(fù)電荷(例如，Ξ氣 醋酸)形成;或者由化合物中帶負(fù)電荷的部分(例如，簇基)與正電荷(例如，鋼、鐘、巧、儀)形 成?；衔锟蒞含有一個(gè)非芳香性的雙鍵，具有一個(gè)或多個(gè)不對(duì)稱中屯、。所W，運(yùn)些化合物 可W作為外消旋的混合物、單獨(dú)的對(duì)映異構(gòu)體、單獨(dú)的非對(duì)映異構(gòu)體、非對(duì)映異構(gòu)體混合 物、順式或反式異構(gòu)體存在。所有運(yùn)些異構(gòu)體都是可預(yù)期的。所述的"科羅索酸的前藥"通常 指一種物質(zhì)，當(dāng)用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ┯煤?，可在受試者體內(nèi)進(jìn)行代謝或化學(xué)反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成科羅 索酸或其鹽。
[0021] 本發(fā)明的科羅索酸可通過(guò)本領(lǐng)域的常規(guī)方法從大花紫薇中提取獲得，或者利用市 售原料，通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)中傳統(tǒng)的化合物合成方法合成獲得。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)現(xiàn) 有公知技術(shù)可W合成本發(fā)明的化合物。合成的化合物可W進(jìn)一步通過(guò)柱色譜法、高效液相 色譜法或結(jié)晶等方式進(jìn)一步純化。
[0022] 合成化學(xué)改造、保護(hù)官能團(tuán)方法學(xué)(保護(hù)或去保護(hù))對(duì)合成應(yīng)用化合物是很有幫助 的，并且是現(xiàn)有技術(shù)中公知的技術(shù)，如R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts.Protective Groups in Organic Synthesis ,Ed., John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette,ed..Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1995)中都有公開(kāi)。
[0023] 本發(fā)明的科羅索酸可W單獨(dú)使用或W藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作 為活性成分的本發(fā)明的科羅索酸及可藥用載體。較佳地，本發(fā)明的藥物組合物含有0.1~ 99.9%重量百分比的作為活性成分的本發(fā)明的科羅索酸。"可藥用載體"不會(huì)破壞本發(fā)明的 科羅索酸的藥學(xué)活性，同時(shí)其有效用量，即能發(fā)揮藥物載體作用時(shí)的用量對(duì)人體無(wú)毒。
[0024] 所述可藥用載體包括但不限于:軟憐脂、硬脂酸侶、氧化侶、離子交換材料、自乳化 藥物傳遞系統(tǒng)、吐溫或其他表面活化劑、血清蛋白、緩沖物質(zhì)如憐酸鹽、氨基乙酸、山梨酸、 水、鹽、電解質(zhì)如硫酸鹽精蛋白、憐酸氨二鋼、憐酸氨鐘、氯化鋼、鋒鹽、娃酸儀、飽和脂肪酸 部分甘油醋混合物等。
[0025] 其他常用的藥物輔料如粘合劑（如微晶纖維素）、填充劑(如淀粉、葡萄糖、無(wú)水乳 糖和乳糖珠粒）、崩解劑(如交聯(lián)PVP、交聯(lián)簇甲基淀粉鋼、交聯(lián)簇甲基纖維素鋼、低取代徑丙 基纖維素）、潤(rùn)滑劑(如硬脂酸儀）W及吸收促進(jìn)劑、吸附載體、香味劑、甜味劑、賦形劑、稀釋 劑、潤(rùn)濕劑等。
[0026] 本發(fā)明的科羅索酸W及其藥物組合物可按本領(lǐng)域常規(guī)方法制備并可W通過(guò)腸道 或非腸道或局部途徑給藥?？诜苿┌z囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑、丹劑、 膏劑等;非腸道給藥制劑包括注射液等；局部給藥制劑包括霜?jiǎng)①N劑、軟膏劑、噴霧劑等。 優(yōu)選為口服制劑。
[0027] 本發(fā)明的科羅索酸W及其藥物組合物的給藥途徑可W為口服、舌下、經(jīng)肌肉或皮 下、靜脈、尿道、陰道等。
[0028] 本發(fā)明的科羅索酸可W保健品的形式使用。所述保健品包括有效量的本發(fā)明的科 羅索酸及其他保健品領(lǐng)域常規(guī)的添加劑，例如增溶和改善口昧的物質(zhì)，如增加甜味的甜味 劑;抗氧化的抗氧化劑;做成各種劑型所需的藥學(xué)上允許的載體、賦形劑等。含有本發(fā)明的 科羅索酸的保健品可W被制成各種形式，例如飲料、顆粒劑、片劑、膠囊等形式，W便于服 用。
[0029] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，運(yùn)些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按 重量計(jì)。
[0030] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中 所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0031] 本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺蒞任意組合。本專利說(shuō)明書(shū)所掲 示的所有特征可與任何組合物形式并用，說(shuō)明書(shū)中所掲示的各個(gè)特征，可W任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說(shuō)明，所掲示的特征僅為均等或相似 特征的一般性例子。
[0032] 實(shí)施例1科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌增殖的抑制作用
[0033] 選擇4種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株(肺細(xì)支氣管肺泡癌H1650,人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞H460， 肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1，人肺腺癌細(xì)胞A549)對(duì)科羅索酸的體外抗腫瘤活性進(jìn)行測(cè)試，使用含 10%胎牛血清的DMM培養(yǎng)基(含lOOU/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素），37°(：、5%0)2條件下過(guò) 夜培養(yǎng)，每周傳代兩次。采用Μ?Τ法檢測(cè)科羅索酸對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
[0034] 實(shí)驗(yàn)方法(MTT法）：收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用含0.05%抓TA的0.25 %膜酶消化，重 懸并計(jì)數(shù)。W每孔5X103個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24小時(shí)后吸取上清液，加入含 不同濃度科羅索酸(μΜ/L)的培養(yǎng)液2(Κ)化繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20y L，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱37 °C繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清，每孔加入DMS0 15化L，室溫混勻10分鐘， 用酶標(biāo)儀在570nm下檢測(cè)。利用Graphpad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析細(xì)胞死亡率，計(jì)算ICso。
[0035] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌中各種病理亞型的細(xì)胞株增殖具有抑制 作用，且呈劑量依賴性(如圖1所示）。半數(shù)抑制濃度(IC50)值詳見(jiàn)表1。
[0036] 表1科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株的半數(shù)抑制濃度(μΜ/L)
[0037] _
[0038] 實(shí)施例2科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞平板克隆形成的影響
[0039] 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)是測(cè)定單個(gè)細(xì)胞增殖能力的有效方法之一?；驹硎菃蝹€(gè)細(xì) 胞在體外持續(xù)增殖6代W上，其后代所組成的細(xì)胞群體，成為克隆(集落）。通過(guò)克隆形成實(shí) 驗(yàn)，可對(duì)單個(gè)細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行分析。此方法可用于有效評(píng)價(jià)藥物的抑癌能力。
[0040] 實(shí)驗(yàn)方法（克隆形成實(shí)驗(yàn)）：取處于指數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含0.05%EDTA的 0.25%膜酶消化，重懸并計(jì)數(shù)。利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為60個(gè)/ml,取5ml加入到60mm 培養(yǎng)皿中，細(xì)胞均勻分布，鋪滿培養(yǎng)皿表面。細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜后，棄去培養(yǎng)基，加入含不同濃度 科羅索酸(μΜ/L)的培養(yǎng)基。一般培養(yǎng)10-12天，觀察是否有克隆形成W及克隆大小。經(jīng)過(guò)固 定和吉姆薩染色，在顯微鏡下進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)。每團(tuán)細(xì)胞數(shù)大于20個(gè)時(shí)作為一個(gè)克隆，即可計(jì) 數(shù)。
[0041] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌H1650細(xì)胞克隆形成具有抑制作用，且呈 濃度依賴性，與Μ?Τ實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致(如圖2所示）。
[0042] 實(shí)施例3科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌中腫瘤干細(xì)胞球體形成的影響
[0043] 腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是指一小群特定的腫瘤發(fā)生細(xì)胞，在特定 的腫瘤組織中具有很強(qiáng)的自我更新和增殖分化能力。雖然數(shù)量很少，但是卻具有很強(qiáng)的致 瘤作用。運(yùn)類細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的根源，也是腫瘤對(duì)放化療耐受的根本原 因。腫瘤干細(xì)胞與干細(xì)胞具有很多相似的特性，能夠進(jìn)行自我更新。但是由于腫瘤干細(xì)胞缺 少干細(xì)胞的自我更新調(diào)控和定向分化能力，腫瘤干細(xì)胞能夠不斷地分裂形成腫瘤細(xì)胞，導(dǎo) 致細(xì)胞數(shù)目不斷增加，腫瘤組織不斷變大。由于腫瘤干細(xì)胞由于具有自我更新、增殖的能 力，能夠在不貼壁、無(wú)血清的培養(yǎng)條件下成球，因此可通過(guò)腫瘤干細(xì)胞成球?qū)嶒?yàn)，評(píng)價(jià)藥物 的抑癌能力。
[0044] 實(shí)驗(yàn)方法(球體形成實(shí)驗(yàn)）：取指數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含0.05%抓TA的0.25% 膜酶消化，重懸并用PBS清洗2-3次，去除培養(yǎng)基中所含血清。細(xì)胞重新懸浮于DMEM培養(yǎng)基 (含EGF 20ng/ml，bFGF2 20ng/ml，Vitamin B27，100U/ml青霉素，100μg/ml鏈霉素），進(jìn)行培 養(yǎng)。按照每孔1500個(gè)細(xì)胞的數(shù)量接種到未處理的6孔板中，第二天開(kāi)始進(jìn)行藥物處理(μΜ/ L)，共處理7-10天，根據(jù)球體形成的數(shù)量來(lái)評(píng)價(jià)藥物對(duì)腫瘤干細(xì)胞球體形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié) 果表明，科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌Η1650中腫瘤干細(xì)胞球體形成具有抑制作用，且呈濃度依 賴性，明確了科羅索酸對(duì)肺癌腫瘤干細(xì)胞增殖的抑制作用。
[0045] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與腫瘤細(xì)胞中ΜΤΤ實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，表明科羅索酸是 通過(guò)抑制腫瘤干細(xì)胞增殖來(lái)達(dá)到抗癌的作用(如圖3所示）。
[0046] 實(shí)施例4科羅索酸對(duì)非小細(xì)胞肺癌中TGF-iVSmad信號(hào)通路的影響
[0047] 凡事有兩面性，人有善惡同在。在癌癥的發(fā)生發(fā)展中，也存在著運(yùn)么一個(gè)亦正亦邪 的細(xì)胞因子，那就是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子e(TGF-i3)"TGF-i3在腫瘤形成的早期發(fā)揮抑制作用，是通 過(guò)抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、抑制炎癥因子來(lái)實(shí)現(xiàn)。相對(duì)于TGF-β的抑癌作用，TGF-β的 促癌作用多發(fā)生在癌癥形成過(guò)程的后期，主要表現(xiàn):促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的 免疫逃逸，W及促進(jìn)血管的生成，加劇腫瘤患者病程的發(fā)展，是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的主要 因素之一。在腫瘤干細(xì)胞研究中TGF-β能夠調(diào)控腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物CD133,具體表現(xiàn)在激活 Smad3能夠富集CD133+亞群細(xì)胞。因此，在腫瘤后期有效抑制TGF-iVSmad信號(hào)通路的激活，將 會(huì)有效抑制腫瘤的增殖、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。
[004引在TGF-e/Smad信號(hào)通路中，活化的I型TGF-β受體催化Smad2/3憐酸化，繼而Smad2/ 3與Smad4形成多聚體，進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)祀基因轉(zhuǎn)錄。且非小細(xì)胞肺癌中Π 、虹期患者的 TGF-f3、Smad2/3水平也與肺癌的預(yù)后、轉(zhuǎn)移有相關(guān)性。因此復(fù)合物Smad2/3/4是TGF-β信號(hào)下 游關(guān)鍵的蛋白祀點(diǎn)。
[0049] 實(shí)驗(yàn)方法:取指數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，用含0.05%抓TA的0.25%膜酶消化，重懸并 計(jì)數(shù)。將5X106個(gè)細(xì)胞接種100mm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)過(guò)夜后，棄去培養(yǎng)基，加入含不同濃度科羅索 酸(μΜ/L)的培養(yǎng)基。分別處理8、15、30分鐘和1、2、4小時(shí)，采用細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽 提試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司）提取蛋白，WBCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技 術(shù)有限公司）進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)(Western Blot)，上樣量25yg<3SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)移到NC膜，W5%脫脂奶粉封閉后，加入一抗（Smad2，Smad3，Smad4(l:1000)， Hi stone (1:2000 )，CST公司）解育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1: 2000，Santa Cruz )，解育1小時(shí)，化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)蛋白水平變化。
[0050] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，科羅索酸能夠有效減低腫瘤細(xì)胞中Smad2/3/4蛋白復(fù)合體的核移 位水平，進(jìn)而達(dá)到抑制TGF-iVSmad信號(hào)通路的作用，干預(yù)腫瘤細(xì)胞的增殖調(diào)控，從而達(dá)到抗 癌的目的(如圖4所示）。
[0051] 本發(fā)明所設(shè)及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神 之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對(duì)其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請(qǐng) 所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 科羅索酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制備預(yù)防或治療人肺支氣管癌 Hl 650的藥物或保健品中的應(yīng)用。2. 科羅索酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制備預(yù)防或治療人大細(xì)胞肺癌 H460的藥物或保健品中的應(yīng)用。3. 科羅索酸或其藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或前藥在制備抑制肺癌腫瘤干細(xì)胞增殖的 藥物或保健品中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于，所述肺癌腫瘤干細(xì)胞為非小細(xì)胞肺癌H1650 腫瘤干細(xì)胞。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK105878253SQ201610401922
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】劉俊, 許錦文, 凌霜
【申請(qǐng)人】上海中醫(yī)藥大學(xué)