一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備及應(yīng)用，以羧甲基纖維素（CMC）為載體，通過羧甲基纖維素的親水基和疏水基熊果酸自組裝形成納米粒子CMC?UA·NPs，它可以負(fù)載雙氫青蒿素疏水藥物，制備具有核殼結(jié)構(gòu)的納米粒子CMC?UA(DHA)·NPs，核是雙氫青蒿素（DHA），殼是載有熊果酸（UA）的自組裝層。本發(fā)明的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的納米粒子形貌為球型，粒徑較為均一，大小在20nm?50nm之間，分散性好，載藥量高，有穩(wěn)定的包封率，生物相容性好，毒性小，具有緩釋功能的一種新型的水溶性納米藥物，可抑制多種癌細(xì)胞的生長，使癌細(xì)胞凋亡。本發(fā)明屬于生物制藥和納米技術(shù)領(lǐng)域，核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備，操作方便，制備技術(shù)工藝周期短，成本低，有很大的工業(yè)化前景。
【專利說明】
-種自組裝的核亮結(jié)構(gòu)納米藥物的制備及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物制藥和納米技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及藥物遞送系統(tǒng)，具體設(shè)及一種自組裝 的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 簇甲基纖維素鋼（Sodium carboxymethylcellulose，簡稱CMC-Na)是一種天然高 分子化合物纖維素簇甲基化的衍生物，又名纖維素膠，是陰離子型線性高分子，由D-化喃 葡萄糖通過β-α一4)-巧鍵結(jié)合而成。CMC-化無毒無味，具有優(yōu)良的水溶性、粘膠性、乳化 性、擴(kuò)散性好、抗過酶性和很好的穩(wěn)定性，適合做藥物載體。
[0003] 熊果酸(Ursolic acid,簡稱UA)又名烏索酸、烏蘇酸，是一種五環(huán)Ξ祗類化合物， 化學(xué)分子式為C30化0〇3,廣泛存在于熊果、女貞、白花蛇舌草、山植、烏梅、夏枯草、接骨木、批 把和蘋果等天然藥用植物和果實(shí)中，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡、抗突變、保肝、 調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等多種生物活性，經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸對多種腫瘤具有抑制作用，如熊果酸 能夠誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞調(diào)亡，可W通過p53介導(dǎo)誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞調(diào)亡，抑制肺 癌A549及SPCA1細(xì)胞株的增殖，對?-388和心1210白血病細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性作用，熊果 酸同時(shí)對胃癌、卵巢癌、TSCCA人舌鱗癌、食管癌、皮膚癌、膜腺癌、骨髓癌、結(jié)腸癌、宮頸癌、 乳腺癌、白血病等具有顯著的抑制增殖作用。
[0004] 雙氨青葛素(D化y化oartemisinin，簡稱DHA)是一種青葛素類藥物中活性較強(qiáng)的 衍生物，是由青葛素經(jīng)四氨棚鋼還原而成，具有獨(dú)特的過氧橋結(jié)構(gòu)、DHA具有良好的吸收性、 排泄和代謝迅速、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，它作為一種有效的抗追疾藥被廣泛應(yīng)用于臨床，其抗追疾 是青葛素的4~8倍，近年研究發(fā)現(xiàn)，DHA不但可W抗追疾，還具有抗腫瘤特性，如可誘導(dǎo)前列 腺癌PC-3細(xì)胞的調(diào)亡，人骨肉瘤143B、U-20S調(diào)亡，抑制人卵巢癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)人肺腺癌 A549細(xì)胞調(diào)亡，對人肺鱗癌細(xì)胞株YTMLC有抑制作用，抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞侵襲遷移，誘 導(dǎo)干癌癌細(xì)胞SMMC-7721調(diào)亡，抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖，同時(shí)對人結(jié)腸癌HCT116細(xì) 胞、肺癌SPC-A-1、乳腺癌、宮頸癌、骨髓瘤、骨髓系白血病細(xì)胞系K562和化60等多種癌細(xì)胞 具有抑制增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞調(diào)亡作用。
[0005] 癌癥已成為危害人類生命健康的最主要疾病，臨床主要通過藥物治療的手段治療 癌癥，然而許多抗癌藥物如UA多為難溶于水，口服給藥體內(nèi)吸收差，體外釋放度小，難于透 皮吸收，生物利用度較差，運(yùn)些都限制了UA在藥學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，因此，解決其水溶性的 問題、增加藥物穩(wěn)定性、提高對癌細(xì)胞的緩釋殺傷能力是UA臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。
[0006] 目前，高分子膠束藥物載體一般采用線性高分子膠束，不需要改變藥物分子的結(jié) 構(gòu)就能實(shí)現(xiàn)了藥物的遞送及緩釋功能，使藥物可W穿過生物屏障傳輸至組織細(xì)胞，并能輸 送多種不同性質(zhì)的藥物。但很多高分子膠束納米藥物存在膠束穩(wěn)定性差，增溶效果不明顯， 藥物釋放率低等問題，未能實(shí)現(xiàn)藥物的大量遞送及緩釋功能，限制其在臨床方面的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的 制備方法，CMC-UA在水介質(zhì)中可自組裝形成納米膠束，W解決UA的水溶相差，生物利用度低 等問題，而且避免大量使用化學(xué)試劑，造成的試劑回收困難，使用簇甲基纖維素為藥物載 體，解決高分子膠束納米藥物的穩(wěn)定性差，藥劑包封率不高，不完全釋放和突釋情況。本發(fā) 明具有制備工藝簡單，抗腫瘤活性強(qiáng)，載藥量高，藥效顯著提高，毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)。
[0008] -種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物制備的技術(shù)方案如下： 所述的自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備，W簇甲基纖維素鏈段為載體，簇甲基纖維 素的簇基與熊果酸的徑基通過醋鍵相連，所述自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物前體具有如下結(jié) 構(gòu)：
式中，所述簇甲基纖維素鏈段的重均分子量為2000~300000。
[0009] 所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備方法，其納米粒子中UA的載藥量為 0.01%-40%，納米粒子的質(zhì)量百分比0.01%-95%，納米粒子半徑10-200nm。
[0010] 本發(fā)明所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備方法，包括W下步驟： (1) 取一定量的簇甲基纖維素鋼，緩慢加入20%硫酸溶液中，攬拌均勻，出現(xiàn)白色絮狀沉 淀，反應(yīng)化，離屯、沉淀，去除上清液，去離子水多次洗涂沉淀，反復(fù)離屯、，至pH=7.0，冷凍干 燥，獲得簇甲基纖維素白色粉末A; (2) ?。?)中簇甲基纖維素，緩慢加入含10ml化晚的50ml圓底燒瓶中，并超聲10-30min， 攬拌溶解化，然后在溶液中加入激活劑1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、催化劑4-二甲氨基化晚(DMAP)，攬拌30min，加入一定量的熊果酸，35°C下水浴反應(yīng) 4她，并通氮?dú)猓懦龇磻?yīng)生成的水； (3) 對(2)中反應(yīng)后的藥物進(jìn)行純化，向反應(yīng)后的混合物中加入3倍體積的乙酸沉淀，振 蕩均勻，離屯、去上清液，再將化晚加入到沉淀物中，充分溶解，加入3倍體積乙酸沉淀，攬拌 均勻，離屯、去上清液，重復(fù)操作Ξ次，將最終的沉淀于乙酸中洗涂多次，離屯、，收集沉淀，置 于8W)a MWC0的半透膜里，在PBS溶液中透析2地，每隔化換一次PBS液，透析膜內(nèi)的透析液冷 凍干燥，收集固體粉末B; (4) 取一定質(zhì)量(3)中的冷干物溶于20ml二甲基亞諷，溶解比，逐滴滴入高速攬拌的PBS 溶液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透析膜中的透析液 冷凍干燥，得白色粉末C;向（3)中冷干物加入雙氨青葛素，溶于二甲基亞諷，溶解化，逐滴滴 入高速攬拌的PBS溶液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透 析膜中的透析液冷凍干燥，得白色粉末D。
[0011] 優(yōu)選地，步驟（1)所述的簇甲基纖維素鋼與20%硫酸溶液固液比為1:15~l:50(g/ ml)； 優(yōu)選地，步驟(2)所述的簇甲基纖維素與化晚的固液比為1:20~l:100(g/ml); 優(yōu)選地，步驟(2 )所述的UA與邸C、DMAP的摩爾比為1:2:0.2; 優(yōu)選地，步驟(2)所述的CMC與UA的反應(yīng)溫度為20~40°C，反應(yīng)時(shí)間為36~60h; 優(yōu)選地，步驟(3)所述的反應(yīng)溶液與乙酸的體積比為l:3(v/v)，透析過程每化換一次 ro幻夜； 優(yōu)選地，步驟(4)所述的粉末B與雙氨青葛素的摩爾比為1:0.1~1:1; 優(yōu)選地，步驟(4)所述的粉末B在水介質(zhì)中進(jìn)行自組裝性能的納米顆粒體系，即得到所 述的抗癌核殼結(jié)構(gòu)的納米藥物； 優(yōu)選地，（1)-(4)所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備具有緩釋功能。
[0012] 本發(fā)明所述的抗癌高分子膠束的自組裝采用本領(lǐng)域熟知的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行。
[0013] 本發(fā)明將UA與親水線性聚合物CMC鍵接，所得的CMC-UA鍵合物自組裝制備納米粒 子，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，制作工藝簡單，實(shí)現(xiàn)藥物的水溶性和緩釋功能，并具有較高載藥量。
[0014] 本發(fā)明制備的抗癌高分子膠束納米藥物的粒徑在10-50nm，粒徑較均一，有利于在 腫瘤部位的富集，提高藥物的緩釋功能，減少對正常細(xì)胞的毒副作用。
[0015] 相對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有W下有益效果： 本發(fā)明的自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物生物相容性好，毒副作用低，CMC與UA鍵合的同 時(shí)，自組裝過程還包裹DHA，增大了載藥量，聯(lián)合UA和DHA共同作用于腫瘤部位，在腫瘤部位 的弱酸環(huán)境中，納米藥物的納米粒子解聚，暴露出受體結(jié)合位點(diǎn)，W達(dá)到誘導(dǎo)腫瘤調(diào)亡的目 的。本發(fā)明的制備方法簡單，自組裝過程無需大量有機(jī)溶劑，只需在水介質(zhì)中形成納米粒 子，納米粒子穩(wěn)定，粒徑小，有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0016] 圖1為合成高分子化合物CMC-UA的核磁圖 圖2為納米粒子的透射電鏡形貌圖。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0018] 實(shí)施例1、一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備方法： (1)簇甲基纖維素鋼酸化 取一定量的簇甲基纖維素鋼(分子量10000~30000)，緩慢加入20%硫酸溶液中，攬拌均 勻，出現(xiàn)白色絮狀沉淀，反應(yīng)化，離屯、沉淀，去除上清液，去離子水多次洗涂沉淀，反復(fù)離屯、， 至抑=7.0，冷凍干燥，得到簇甲基纖維素。
[0019] (2)高分子藥物合成 ?。?)中簇甲基纖維素〇.2g，緩慢加入含10ml化晚的50ml圓底燒瓶中，并超聲10- 30min，攬拌溶解化，然后在溶液中加入0.4g激活劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺 鹽酸鹽(EDC)、0. (Mg催化劑4-二甲氨基化晚(DMAP)，攬拌30min，加入ο.4g的熊果酸，35°C下 水浴反應(yīng)4她，并通氮?dú)?，排出反?yīng)生成的水。
[0020] (3)藥物的純化 對(2)中反應(yīng)后的藥物進(jìn)行純化，向反應(yīng)后的混合物中加入3倍體積的乙酸沉淀，振蕩 均勻，離屯、去上清液，再將化晚加入到沉淀物中，充分溶解，加入3倍體積乙酸沉淀，攬拌均 勻，離屯、去上清液，重復(fù)操作Ξ次，將最終的沉淀于乙酸中洗涂多次，離屯、，收集沉淀，置于 8kDa MWCO的半透膜里，在PBS溶液中透析24h，每隔化換一次PBS液，透析膜內(nèi)的透析液冷凍 干燥，收集固體粉末。
[0021] (4)藥物的自組裝 取一定質(zhì)量(3)中的冷干物溶于20ml二甲基亞諷，溶解化，逐滴滴入高速攬拌的PBS溶 液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透析膜中的透析液冷 凍干燥，得白色粉末A;向（3)中冷干物加入雙氨青葛素，溶于二甲基亞諷，溶解比，逐滴滴入 高速攬拌的PBS溶液中，攬拌，納米粒子溶液在PBS溶液中透析12h，每4h換一次透析液，透析 膜中的透析液冷凍干燥，得白色粉末B。
[0022] (5)載藥量及粒徑大小測定 取7份0.1 g CMC于20ml圓底燒瓶中，加入10ml化晚，分別加入10%、20%、30%、40%、50〇/〇、 80%、90%的UA于燒瓶中，反應(yīng)4她，同步驟(2)(3 )操作，將純化后的7個(gè)不同樣品取等量1 Omg， 溶于0.5ml DMS0，攬拌30min后，逐滴加入5ml PBS溶液中，劇烈攬拌，透析12h，透析液用紫 外分光光度計(jì)在波長210nm處測得吸光度，計(jì)算載藥量，剩余納米溶液超聲lOmin，測得粒徑 大小為20~40nm，分散指數(shù)(PDI)為0.159。
[0023] (6)釋藥量的測定 取lOmg CMC-UA，加入0.5ml DMS0,攬拌30min后，逐滴加入5ml PBS溶液中，將溶液轉(zhuǎn)入 透析袋中，透析去除DMS0，冷凍干燥，得到白色粉末C，將粉末C溶于PBS液，配成Img/ml溶液， 裝入透析袋中，至于裝有200ml PBS溶液500ml燒杯中，水浴下輕微攬拌，調(diào)節(jié)溫度為37°C。
[0024] (7^EM檢測：取(3)中純化藥物A、B不同質(zhì)量于5ml二甲基亞諷中，攬拌比，取0.5ml 溶液，緩慢滴入高速攬拌的PBS液中，分別攬拌15、25、35、45、55min，取不同時(shí)間、不同濃度 的溶液20μ1，滴到200目篩網(wǎng)上，得到的納米粒子最佳分散配比為2:l(mg/ml)，攬拌時(shí)間為 35min〇
[0025] 實(shí)施例2、一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備方法： 在本實(shí)例中，通過與實(shí)施例1相同的合成方法及步驟，改變簇甲基纖維素鋼分子量為 30000~90000,測得粒徑大小為30~70nm，分散指數(shù)(PDI)為0.177。
[00%]實(shí)施例3、一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備方法： 在本實(shí)例中，通過與實(shí)施例1相同的合成方法及步驟，改變簇甲基纖維素鋼分子量為 90000~150000,測得粒徑大小為50~90nm，分散指數(shù)(PDI)為0.149。
[0027]實(shí)施例4、一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備方法： 在本實(shí)例中，通過與實(shí)施例1相同的合成方法及步驟，改變簇甲基纖維素鋼分子量為 150000~250000,測得粒徑大小為60~120nm，分散指數(shù)(PDI)為0.199。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備及應(yīng)用，其特征在于，以羧甲基纖維素鏈段 為載體，羧甲基纖維素的羧基與熊果酸的羥基通過酯鍵相連，所述自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米 藥物前體具有如式I所示的結(jié)構(gòu)：式中，所述羧甲基纖維素鏈段的重均分子量為2000~300000。2. 如權(quán)利要求1所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備，其特征在于，步驟如 下： (1) 將一定量的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)與20%硫酸溶液以固液比1:15~1:50(g/ml) 混合，室溫下反應(yīng)，然后用去離子水洗至中性，冷凍干燥，獲得羧甲基纖維素白色粉末A; (2) 取一定量的步驟（1)中的羧甲基纖維素粉末溶于吡啶，羧甲基纖維素與吡啶的固液 比1: 20~1:100(g/ml)，加入激活劑1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)， 催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)，熊果酸，水浴下反應(yīng)，反應(yīng)溫度為20~40°C，反應(yīng)時(shí)間為36 ~60h; (3) 將步驟(2)中得到的反應(yīng)混合物加乙醚沉淀（l:3，v/v)，離心洗滌，洗滌后的沉淀用 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)透析，透析液冷凍干燥，得到淡黃色粉末B; (4) 將步驟(3)中粉末B和雙氫青蒿素溶于二甲基亞砜，并滴入PBS溶液中，所得溶液透 析，透析過程每2h換一次PBS液，然后冷凍干燥得到所述自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物。3. 如權(quán)利要求1、2所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備，其特征在于，步驟 (2)所述的UA與EDC、DMAP的摩爾比為1:2:0.2。4. 如權(quán)利要求1、2所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備，其特征在于，步驟 (4)所述的粉末B與雙氫青蒿素的摩爾比為1:0.1~1:1。5. 如權(quán)利要求1、2、3、4所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備，其特征在于，其 納米粒子中UA的載藥量為0.01%-40%，納米粒子的質(zhì)量百分比0.01%-95%，納米粒子半徑20-100nm〇6. 如權(quán)利要求1、2、3、4所述的一種自組裝的核殼結(jié)構(gòu)納米藥物的制備具有穩(wěn)定的粒徑 大小，緩釋功能。
【文檔編號】A61P35/00GK105879051SQ201610382878
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月2日
【發(fā)明人】雷建都, 劉彥雪, 何靜, 王璐瑩, 劉靜
【申請人】北京林業(yè)大學(xué)