SonoVue超聲造影技術(shù)在診治腫瘤血管生成擬態(tài)中的檢查指標的制作方法
【專利摘要】SonoVue超聲造影技術(shù)在診治腫瘤血管生成擬態(tài)中的檢查指標屬于臨床腫瘤血管超聲檢查的技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)上升時間、達峰時間和平均渡越時間，這些超聲檢查指標可用于腫瘤血管生成擬態(tài)的臨床診斷與治療，為臨床上早期無創(chuàng)診斷腫瘤血管生成擬態(tài)提供依據(jù)，有助于臨床診斷患者腫瘤的惡性程度及其血供模式特點，并為藥物選擇或手術(shù)治療提供診斷依據(jù)。
【專利說明】
SonoVue超聲造影技術(shù)在診治腫瘤血管生成擬態(tài)中的檢查 指標
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于臨床腫瘤血管超聲檢查的技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及為臨床上早期無創(chuàng)診斷腫瘤 血管生成擬態(tài)提供檢查指標，有助于臨床診斷患者腫瘤的惡性程度及其血供模式特點，并 為藥物選擇或手術(shù)治療提供診斷依據(jù)。
【背景技術(shù)】：
[0002] 血管在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中起了重要作用。血管不僅為腫瘤細胞提供氧氣和營養(yǎng)物 質(zhì)、運走有毒代謝產(chǎn)物，還為腫瘤細胞轉(zhuǎn)移提供血行通道。腫瘤血管研究始于1971年， Folkman首次將血管與腫瘤聯(lián)系，并預見性的提出"抗腫瘤血管治療"理論。此后，隨著腫瘤 基礎(chǔ)研究的進行，腫瘤血管分類更加細化，具體包括：內(nèi)皮性血管化V)、血管生成擬態(tài)(VM)、 馬賽克血管(MV)、淋己管(LV)。目前，研究比較多的是內(nèi)皮性血管和血管生成擬態(tài)。
[0003] 1999年Maniotis等在研究人眼底黑素瘤時發(fā)現(xiàn)了一種新型的血供管道，它由腫瘤 細胞圍成、內(nèi)襯W細胞外基質(zhì)。說青綠血管造影技術(shù)聯(lián)合共聚焦激光掃描顯微鏡發(fā)現(xiàn)該管 道中有紅細胞流動，表明它是一種功能性管道。運種血供管道的發(fā)生不依賴內(nèi)皮細胞，卻可 W模擬內(nèi)皮性血管的功能，故稱之為血管生成擬態(tài)。血管生成擬態(tài)的發(fā)生過程不需要內(nèi)皮 細胞參與，但它卻可W與內(nèi)皮性血管發(fā)生銜接，運有助于腫瘤微循環(huán)網(wǎng)絡的快速構(gòu)建。此 夕h血管生成擬態(tài)與血液僅有一層細胞外基質(zhì)相隔，腫瘤細胞更容易穿透細胞外基質(zhì)發(fā)生 血液轉(zhuǎn)移?？梢?，血管擬態(tài)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。臨床回顧性研究發(fā)現(xiàn)，肝 細胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、卵巢癌、星型細胞瘤、前列腺癌等腫瘤組織均存在血管生成擬態(tài)。此 夕h血管生成擬態(tài)還與腫瘤的惡性程度、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力、患者生存期及不良預后密切相 關(guān)。目前臨床上除了手術(shù)后病理組織切片染色外，還沒有無創(chuàng)性診斷血管生成擬態(tài)的有效 方法。
[0004] 早期發(fā)現(xiàn)對腫瘤患者的治療方案選擇、治療終點結(jié)果至關(guān)重要。盡管現(xiàn)有多種腫 瘤早期診斷技術(shù)，如腫瘤標記物檢查、穿刺活檢病理檢查、核磁共振成像、計算機斷層掃描 和放射性核素掃描等，但由于副作用大、敏感性低、檢查成本高等缺點，運些技術(shù)在腫瘤早 期診斷中并沒有發(fā)揮預期的作用。而SonoVue超聲造影(Conhast-enhanced U1 trasound) 是當前用于評價實質(zhì)性器官血流灌注情況的主要診斷技術(shù)之一。SonoVue超聲造影使用的 是SonoVue微泡造影劑。Sono化e造影劑是一種內(nèi)含六氣化硫惰性氣體的憐脂微泡，穩(wěn)定性 好，在低聲壓作用下振而不破，有很好的諧波特性。另外，Sono化e造影劑粒徑約為2-5μπι，與 紅細胞直徑相當，它是一種很好的血池造影劑，僅存在于血管內(nèi)而不進入組織間隙，可W準 確地反應組織的血流灌注狀態(tài)。將超聲造影儀和SonoVue造影劑相結(jié)合，可W動態(tài)、清晰地 顯示實質(zhì)性器官中的微細血管及血流灌注狀況，據(jù)此對組織器官病變情況進行定性診斷。 此外，超聲造影還具有無創(chuàng)性、安全性、實時性、檢查費用較低等多個優(yōu)點。
[0005] 超聲造影用于臨床腫瘤診斷的主要理論依據(jù)是實質(zhì)性組織的血管分布情況、血流 特點、灌注特點和血管形態(tài)，主要觀察內(nèi)容是造影劑的增強時相、增強水平、分布特征及增 強模式。時間強度曲線(TIC)可W反映超聲造影過程中組織的血流灌注情況，其中超聲造影 定量參數(shù)主要包括上升時間(RT)、達峰時間（TTP)、峰值強度（IMAX)、平均渡越時間(mTT) W 及時間-強度曲線下面積(AUC)等，它們可W從不同角度反應組織器官的血液灌注情況。目 前，超聲造影只能對腫瘤組織的整體血供情況進行評價，尚不能對腫瘤組織中內(nèi)皮性血管 和血管生成擬態(tài)進行定性區(qū)分和定量分析，運在很大程度上限制了 SonoVue超聲造影在腫 瘤良惡性診斷中的開發(fā)和應用。
[0006] 經(jīng)過調(diào)研，未見SonoVue超聲造影技術(shù)在診治腫瘤血管生成擬態(tài)中檢查指標的相 關(guān)文獻報道（自CNKI、維普中國期刊網(wǎng)），因此運塊研究領(lǐng)域尚處于空白階段。

【發(fā)明內(nèi)容】
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[0007] 本發(fā)明提供了 SonoVue超聲造影技術(shù)在診治腫瘤血管生成擬態(tài)中的檢查指標，包 括上升時間、達峰時間和平均渡越時間，運些檢查指標可用于腫瘤血管生成擬態(tài)的臨床診 斷與治療。
【附圖說明】
[0008] 圖1為小鼠腫瘤超聲造影圖（A:小鼠腫瘤常規(guī)超聲；B:彩色多普勒超聲；C、D: Sono化e超聲造影檢測）。
【具體實施方式】：
[0009] 實施例1:
[0010] 1.1肥2瘤源鼠的制備
[0011]從-80°C超低溫冰箱取出凍存的小鼠 H22細胞株，水浴溫度39°C下快速解凍，在無 菌條件下用生理鹽水稀釋細胞懸液，光學顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至2 X 107-4 X 107個/ mL。用ImL注射器吸取0.3mL細胞稀釋液接種到ICR小鼠腹腔，常規(guī)飼養(yǎng)，制成肥2瘤源鼠。 [001^ 1.2肥2荷瘤小鼠模型的制備
[0013] H22瘤源鼠飼養(yǎng)7d后，選取腹部隆起明顯的小鼠，脫頸處死。剔除有血性腹水的瘤 源鼠。在無菌條件下用剪刀剖開小鼠腹部皮膚，在腹膜上剪一小桐，然后用ImL無針頭注射 器抽取腹水，將所得腹水置于冰浴的離屯、管中。用無菌生理鹽水稀釋，光學顯微鏡下計數(shù)， 調(diào)整細胞濃度至2X107-4X107個/mL。兩人配合，一人負責吸取細胞稀釋液，一人綁定小鼠 并接種。小鼠右側(cè)蔽窩皮下，每只小鼠接種〇.2mL細胞稀釋液，接種量為4X 106-8 X 106個/ 只。接種過程中注意進針位置和角度，避免細胞稀釋液漏出。
[0014] 1.3小鼠腫瘤的超聲造影檢查
[001引接種后第3d，根據(jù)小鼠右側(cè)蔽窩皮膚隆起情況，剔除造模失敗的小鼠。然后于小鼠 接種H22腫瘤后的第6、9、12、15(1共4個時間點，分別隨機挑選5只小鼠到無錫市人民醫(yī)院超 聲醫(yī)學科進行超聲造影。超聲造影之前，提前用脫毛液將小鼠右側(cè)蔽窩腫瘤部位毛發(fā)去掉， 避免在超聲時產(chǎn)生影像噪音。
[0016] 儀器及設(shè)備:Philips iU22超聲診斷儀，1化5探頭行常規(guī)檢查，9L3探頭行超聲造 影。
[0017] 造影條件設(shè)置:機械指數(shù)M10.10,聚焦點位于腫瘤正上方。所有造影參數(shù)設(shè)置在研 究過程中均保持不變。
[0018] 超聲造影劑:Sono化e造影劑(意大利布萊柯公司），實驗開始前加入注射用生理鹽 水5mL振搖后形成微泡混懸液，現(xiàn)配現(xiàn)用。
[0019] 超聲造影步驟如下：
[0020] (1)清醒狀態(tài)下將小鼠用膠帶固定在泡沫板上，使其呈仰邸位，固定好小鼠四肢和 嘴部，W防小鼠在造影過程中亂動或傷人。
[0021] (2)造影前用常規(guī)超聲探測腫瘤部位，測量皮下腫瘤的長、寬、厚Ξ個徑線。用彩色 多普勒確定血液流入的大血管，觀察腫瘤內(nèi)部的回聲、血供和壞死情況。
[0022] (3)使用O.lmL醫(yī)用注射器接5號半頭皮靜脈針，經(jīng)小鼠尾靜脈注射0.02mL造影劑。 造影劑注入的同時開始錄像，觀察造影劑在瘤內(nèi)的流動情況，直至造影劑消散，結(jié)束錄像， 存儲造影全過程供脫機分析。
[0023] (4)將做完超聲造影的小鼠帶回實驗室，經(jīng)脫頸處死，剝?nèi)∧[瘤，稱重。先用生理鹽 水將腫瘤表面的血液洗凈，后用10%甲醒進行固定，W備進行實施例5的實驗。
[0024] 1.4超聲造影圖像分析
[0025] (1)將超聲造影錄像WDIC0M格式從化ilips iU22超聲診斷儀導出，刻盤備用。
[0026] (2)將DIC0M格式造影錄像導入Sonoliver軟件，根據(jù)造影劑強度選定感興趣的時 間段。
[0027] (3)參考常規(guī)超聲圖像，在超聲造影圖像中依次選擇異常區(qū)（腫瘤區(qū)）和正常區(qū)（對 照區(qū)）為感興趣區(qū)（region of interesting，R0I)，盡量避開因皮膚、分界線而產(chǎn)生的高亮 區(qū)。
[00%] (4)進行運動補償，消除造影過程中因小鼠亂動或探頭移動而產(chǎn)生的噪音。
[0029] (5)定量分析獲得原始的時間強度曲線(TIC)，擬合時間強度曲線，每只小鼠重復 分析Ξ次，擬合度(quality of fit,Q(F)>75%為有效數(shù)據(jù)。
[0030] (6)導出包括上升時間（RT)、達峰時間（ΤΤΡ)、最大峰值強度（IMAX)、平均渡越時間 (mTT)等定量參數(shù)的EXC化文件和包括時間強度曲線的JPG文件，保存整個數(shù)據(jù)處理過程。
[0031] 1.5腫瘤組織包埋與切片制作
[0032] 具體實驗步驟如下：
[0033] (1)洗掉腫瘤內(nèi)部的甲醒:將腫瘤從10%甲醒固定液中取出，流水沖洗化。
[0034] (2)梯度酒精脫水:70%乙醇過夜，80%乙醇化，90 %乙醇20min，一道次95%乙醇 20min，二道次 95% 乙醇 20min，一道次 100% 乙醇 30min，二道次 100% 乙醇 30min。
[0035] (3)二甲苯透明：一道次100%二甲苯20min，二道次100%二甲苯20min。
[0036] (4)組織浸蠟:蠟缸左盒60°C浸40min，蠟缸右盒60°C浸40min。
[0037] (5)組織包埋:使用塑料包埋盒和配套不誘鋼包埋盒底座，65 °C蠟液包埋。
[0038] (6)切片：用切片機制作4-6WI1石蠟切片。
[0039] (7)攤片:40°C恒溫水浴鍋攤片，剔除展片不完全、組織有裂縫的切片。
[0040] (8)貼片:60°C恒溫鼓風干燥箱，將切片豎立放置到切片架上，4-5h貼片。
[0041] (9)切片保存:組織貼牢的切片室溫放置過夜，4°C保存。
[0042] 1.6腫瘤組織切片的CD31免疫組化-PAS雙染
[0043] 具體實驗步驟如下：
[0044] (1)烤片:60°C恒溫鼓風干燥箱，30min。
[0045] (2)二甲苯脫蠟：一道次100%二甲苯lOmin，二道次100%二甲苯15min，S道次 100% 二甲苯 20min。
[0046] (3)梯度酒精水化：100%乙醇lOminaOO%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇 5min，80 %乙醇5min，70 %乙醇5min。去離子水浸洗水化5min，Ξ次。
[0047] (4)抗原修復:巧樣酸修復液提前預熱，90-100°C水浴20min。修復完畢后，將浸有 組織切片的巧樣酸修復液自然冷卻至室溫。PBS浸洗5min，Ξ次。
[004引（5)過氧化物酶滅活：向組織滴加3%過氧化氨，避光反應15min，反應溫度37°C。 PBS浸洗5min，四次。
[0049] (6)BSA封閉：滴加博±德試劑盒BSA封閉液，反應20min，反應溫度37°C。
[0050] (7)-抗解育：用 PBS按 1:40 比例稀釋一抗Anti-CD31antibody，4°C 保存。甩去 BSA 封閉液，滴加一抗，4 °C冰箱過夜。
[0化1 ] (8)回收一抗:室溫平衡30min，回收一抗。PBS浸洗5min，五次。
[0化2] (9)二抗解育:博±德試劑盒二抗溶液解育20min，解育溫度37°C ePBS浸洗5min，四 次。
[0053] (lO)SABC解育：博±德試劑盒SABC溶液解育20min，解育溫度37°CePBS浸洗5min， 四次。
[0化4] (11 )DAB顯色:將DAB顯色液A液和B液等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用。暗室內(nèi)，滴加 DAB顯色 液，避光反應l-2min。顯微鏡下鏡檢，及時用水終止反應。PBS浸洗5min，兩次。
[0055] (12)PAS-A液染色：雷根生物A液，避光解育Imin，及時用水終止反應。流水沖洗 7min，PBS 浸洗 5min，一次。
[0056] (13)PAS-B液染色：雷根生物B液，避光解育Imin，及時用水終止反應。流水沖洗 "Zmin。
[0057] (14)蘇木素復染:將4°C保存的蘇木素提前室溫平衡，浸染Imin，及時用水終止反 應。流水沖洗反藍7min。
[0058] (15)鹽酸酒精分化:分化5秒，及時用水終止反應。流水沖洗反藍7min。
[0059] (16)鏡檢:觀察染色深淺程度，判斷是否需要重新染色或分化。
[0060] (17)梯度酒精脫水：70%乙醇5111111，80%乙醇5111111，90%乙醇5111111，95%乙醇 lOmin，一道次 100% 乙醇 20min，一道次 100% 乙醇 30min。
[0061 ] (18)二甲苯透明：一道次 20min，二道次 20min。
[0062] (19)封片：中性樹膠封片。鏡檢:觀察有無氣泡，是否需要重新封片。
[0063] 1.7血管生成擬態(tài)、內(nèi)皮性血管計數(shù)分析
[0064] 血管計數(shù)參照Weidner法進行。先在低倍鏡（100X )下觀察整個切片，選取血管生 成擬態(tài)密度最高的熱點區(qū)域，然后在高倍鏡(200X)下拍攝10張不同的熱點區(qū)域照片。最后 用Image-Pro Plus 6.0軟件統(tǒng)計每張照片的血管生成擬態(tài)數(shù)目，結(jié)果WMean±SD表示。血 管生成擬態(tài)入選標準:首先，CD31抗體染色陰性-PAS染色陽性是先決條件。其次，管腔封閉 且內(nèi)有紅細胞。最后，管腔周圍無明顯壞死和炎癥浸潤。
[00化]1.8數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析
[0066]采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析，所有結(jié)果均WMean±SD表示。相關(guān)性 分析采用化arson檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣 本t檢驗。WP<0.05和P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。
[0067] 1.9實驗結(jié)果
[0068] 1.9.1肥2荷瘤小鼠的二維超聲和Sono化e超聲造影檢查結(jié)果
[0069] 如圖1.A所示，在造影前先用常規(guī)超聲探測腫瘤部位，測量并記錄小鼠 H22腫瘤的 長、寬、厚Ξ個徑線。然后，用彩色多普勒選取血液流入的大血管，大體觀察腫瘤內(nèi)部的血 供、壞死情況，如圖1.B所示。最后，Sono化e造影劑注入同時開始錄像，觀察造影劑在瘤內(nèi)的 流動情況，直至造影劑消散時，結(jié)束錄像并存儲。如圖1.C所示，參考常規(guī)超聲圖像，在超聲 造影圖像中依次選擇異常區(qū)（腫瘤區(qū)，綠圈標記)和正常區(qū)（對照區(qū)，黃圈標記)為感興趣區(qū) (R0I)，避開因皮膚、分界線而產(chǎn)生的高亮區(qū)。如圖1.D所示，通過定量分析獲得原始的時間 強度曲線（圖1.D中的上圖），擬合時間強度曲線（圖1.D中的下圖）。從圖中可W獲得上升時 間(RT)、達峰時間(TTP)、最大峰值強度(IMAX)、平均渡越時間(mTT)等定量參數(shù)。
[0070] 1.9.2血管生成擬態(tài)密度與Sono化e超聲造影定量參數(shù)的相關(guān)性分析
[0071] 本研究借助肥2荷瘤小鼠模型，設(shè)置多個時間點，通過病理學染色和顯微鏡計數(shù)獲 得血管生成擬態(tài)的變化規(guī)律，結(jié)果如表1所示。隨小鼠肥2腫瘤生長，腫瘤組織中的血管生成 擬態(tài)密度呈先增加后穩(wěn)定狀態(tài)，血管生成擬態(tài)形成最早出現(xiàn)在H22腫瘤接種后第6d，在小 鼠 H22腫瘤接種后的第6-9d呈明顯上升趨勢，表明血管生成擬態(tài)形成均比較活躍。存在血管 新生就意味著腫瘤組織嚴重缺氧，小鼠肥2腫瘤在接種后第l-9d瘤重增加速度較緩，正好驗 證了運一點。小鼠 H22腫瘤接種后第9-15d血管密度上升趨勢變緩，表明腫瘤組織的缺氧情 況得到改善，即單位面積內(nèi)微血管所供給的血液足W維持腫瘤細胞的生存生長。小鼠 H22月中 瘤接種后第9-15d，小鼠瘤重增加速度明顯加快，正好驗證了運一點。
[0072] 表1小鼠肥2腫瘤血管生成擬態(tài)密度的實驗結(jié)果
[0073]
[0074] 峰值強度（IMAX)是指腫瘤中造影劑的最高強度，反映腫瘤某個截面的血管密度。 上升時間（RT)是指腫瘤中造影劑由上升支10 % IMAX到上升支90 % IMAX所需要的時間。達峰 時間（TTP)是指腫瘤中造影劑注入到100 % IMAX所需要的時間。上升時間（RT)和達峰時間 (TTP)共同反映腫瘤造影劑的流入速度。平均渡越時間（mTT)是指腫瘤中造影劑由上升支 50 % IMAX到下降支50 % IMAX所需要的時間，反映造影劑的洗脫速度。H22荷瘤小鼠超聲造影 定量參數(shù)的分析結(jié)果如表2所示。
[0075] 表2 H22荷瘤小鼠超聲造影定量參數(shù)的分析結(jié)果
[0076]
[0077] 經(jīng)統(tǒng)計學分析與P檢驗，結(jié)果如表3所示，研究發(fā)現(xiàn)小鼠肥2腫瘤中的血管生成擬態(tài) 密度與上升時間、達峰時間、平均渡越時間呈顯著正相關(guān)關(guān)系。
[0078] 表3血管生成擬態(tài)密度與Sono化e超聲造影定量參數(shù)的相關(guān)性分析
[0079]
[0080] 兩個變量相關(guān)性的顯著程度，*為P<0.05，**為P<0.01
[0081] 本發(fā)明是結(jié)合最佳實施例進行描述的，然而在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容后，本領(lǐng) 域技術(shù)人員能領(lǐng)會在公開的實施例中作許多改變也可獲得相同或類似的結(jié)果，而不超出本 發(fā)明的構(gòu)思、精神和范圍。更具體地說，顯然有些化學和生理性的相關(guān)試劑可替代本文所公 開的試劑而得到相同或類似的結(jié)果。所有類似的取代和修飾對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然 都認為是本發(fā)明的精神、范圍和構(gòu)思及權(quán)利要求范圍內(nèi)的，即所有上述運些等價形式和所 有對工藝參數(shù)的改進和變動都同樣屬于本發(fā)明的權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. SonoVue超聲造影技術(shù)在診治腫瘤血管生成擬態(tài)中的檢查指標。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，這些檢查指標包括上升時間、達峰時間和平均渡越時間。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述，上升時間、達峰時間和平均渡越時間作為腫瘤血管生成擬態(tài)的 檢查指標用于臨床診斷與治療。
【文檔編號】A61K49/22GK105879064SQ201610216415
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月8日
【發(fā)明人】邱麗穎, 馮磊, 王旭, 蔡維維, 劉艷玲, 侯豹
【申請人】江南大學